CN116785415A - 一种特异性针对免疫细胞激活/增殖刺激的产品、制备及应用 - Google Patents
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Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种针对免疫细胞激活/增殖刺激的产品、制备及其应用，所述产品能够特异性地刺激免疫细胞增殖，显著提高免疫细胞阳性率，同时，相比于现有技术中直接基于肿瘤抗原的激活方式，本申请肿瘤抗原和/或激活性抗体偶联在微球或磁珠等载体上，能够模拟膜表达靶抗原的肿瘤细胞去激活CAR‑T细胞并刺激其增殖的过程。
Description
技术领域
本申请涉及免疫技术领域，具体涉及一种针对免疫细胞激活/增殖刺激的产品、制备及其应用。
背景技术
工程化免疫细胞疗法，是一种将免疫细胞加以改造，让它们就能够识别疾病状态并做出适当反应，其中，基因工程T细胞也被称作“活药”，是抗癌领域的最新代表，尤其是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)，在复发性或难治性血液系统恶性肿瘤治疗过程中具有非常显著的效果。相较于普通T细胞，CAR-T细胞对于肿瘤细胞的杀伤效果更好，这与CAR(ChimericAntigen Receptor，简称CAR,通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)的结构相关。完整的CAR结构的是由一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA)结合区，一个胞外铰链区(Hinge area)，一个跨膜区(Transmembrane region)和一个胞内免疫受体酪氨酸活化基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)。CAR-T细胞膜表面的CAR和肿瘤细胞的靶抗原结合后，细胞内序列起到激活CAR-T细胞活性的作用，CAR-T分泌穿孔素穿孔素和颗粒酶杀死肿瘤细胞，也可以通过高表达TNF配体，诱导肿瘤细胞凋亡，还能改变肿瘤微环境，进一步增强其抗肿瘤活性。
CAR-T疗法的开发周期较长，关键工序多，其中T细胞的激活扩增步骤至关重要，影响后续T细胞的基因工程改造及治疗效果。目前市场上用于CAR-T细胞的激活和扩增，没有特异性的产品，常用都是T细胞激活和扩增的产品，比如上述CD3/CD28 T细胞激活磁珠、CD3/CD28抗体等。但这类通用产品对所有的T细胞都起到刺激作用，在慢病毒侵染后的CAR-T细胞扩增过程中效果不具备特异性，最终导致扩增后起治疗效果的CAR-T细胞比例不够高，回输到患者体内后，效果不佳。
现有技术虽已公开了直接基于肿瘤抗原(游离肿瘤抗原蛋白)或基于其他方式固定的肿瘤抗原对于免疫细胞(尤其是CAR-T细胞)的激活，比如现有技术中专利文献WO2018111340A1公开了基于存在于固定细胞表面上肿瘤特异性抗原进行特异性刺激CAR-T细胞，现有专利文献公开CN115397440A公开了基于半抗原标记的细胞刺激嵌合CAR-T细胞等，然而，现有的这些基于游离肿瘤抗原或细胞表面固定的肿瘤抗原激活免疫细胞的方式存在刺激细胞增殖效率低或操作复杂等问题，实践中仍需突破和改进。有鉴于此，提出本申请。
发明概述
针对上述技术问题，本申请通过锐意研究发现，本申请制备的特定结构的磁珠类产品对免疫细胞具有靶点特异性激活和刺激作用，可有效提高免疫细胞在总细胞中的占比。
基于此，本申请首要目的在于提供一种特异性针对免疫细胞(尤其CAR-T细胞)激活和增殖刺激的磁珠类产品，此类产品能够特异性地刺激免疫细胞增殖，提高免疫细胞的阳性率；其次，本申请的其他目的在于制备所述磁珠类产品的方法，以及所述产品在免疫细胞激活和增殖刺激中的应用。
本申请的具体技术方案如下：
本申请首先提出一种特异性针对免疫细胞激活/增殖刺激的产品，包含如下组分：
1)肿瘤抗原；
2)固体支持物；
其中，所述1)肿瘤抗原与2)固体支持物经偶联连接。
进一步的，所述肿瘤抗原包括肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原；
优选的，所述肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原可选自：CD19，PSCA，Claudin，CD123，MSLN，CD20，CEA癌胚抗原，FAP，CD133，EGFR，EGFRVIII，BCMA，PSMA，HER2，CA125，EphA2，C-met，L1CAM，VEGFR，CS1，ROR1，EC，NY-ESO-1，MUC1，MUC16，mesothelin，LewisY，GPC3，GD2，EPG，DLL3，CD99，5T4，CD22，CD30，CD33，CD138，CD171中的一种；更优选的，所述肿瘤抗原为CD19、BCMA或MSLN。
进一步的，所述激活性抗体为用于免疫细胞激活靶点的抗体；
进一步的，所述固体支持物材质包括但不限于金属、塑料、衍生化的塑料、衍生化的纤维素、聚丙烯酸、淀粉、葡聚糖、明胶、玻璃或硅等；
优选的，所述固体支持物材质为磁性或非磁性材料。
进一步的，所述固体支持物的形状包括但不限于：球状或其他形状。
进一步的，所述固体支持物的构型包括但不限于：微粒、珠子、试管、微孔滴定板、膜、支架分子滤纸、圆盘、胶乳等。
进一步的，所述固体支持物为有磁性或无磁性的固体支持物；优选的，所述固体支持物为为磁珠或微球，其包括但不限于：多聚糖氧化铁微球、PEG氧化铁微球或者二氧化硅等医学纳米微球等。
进一步的，所述磁珠或微球表面的活性基团包括但不限于：链霉亲和素、羟基、羧基、氨基或甲苯磺酰基等；
进一步的，所述磁珠或微球的粒径范围优选在10nm-20um之间。
进一步的，所述偶联连接包括但不限于如下任一方式：
a、基于生物素与亲和素反应进行偶联；
b、基于与His标签结合反应进行偶联；
c、基于Tosyl基团与氨基结合反应进行偶联；
d、基于抗体结合反应进行偶联；
优选的，所述偶联连接的方式是基于a、生物素与亲和素反应进行偶联；
更优选的，所述1)肿瘤抗原经生物素标记，所述2)固体支持物经亲和素标记；1)和2)通过生物素与亲和素反应形成偶联物。
进一步优选的，所述亲和素为链霉亲和素。
根据本申请的一些具体优选方式，上述所述产品是通过生物素化的肿瘤抗原与表面修饰链霉亲和素的超顺磁珠结合偶联而成。
具体的，所述产品示例性包括如下任一：
肿瘤抗原-生物素-亲和素-固体支持物(优选磁珠或微球)；
肿瘤抗原-生物素-链霉亲和素-固体支持物(优选磁珠或微球)；
进一步的，所述产品中可进一步包括激活性抗体；所述激活性抗体基于“生物素-亲和素偶联方式”，进一步偶联至上述连接有肿瘤抗原的固体支持物，或单独偶联至独立的固体支持物；
优选的，所述激活性抗体为用于免疫细胞激活靶点的抗体；更优选的，所述激活性抗体选自针对：CD3、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD27，CD28，4-1BB，OX40，GITR，CD30，MyD88，CD40，ICOS，BAFFR，HVEM，LFA-1，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，SLAMF7，NKp80，CD160，B7-H3，CD83的抗体中的一种；进一步优选的，所述激活性抗体为针对CD3、CD28和4-1BB的抗体。
根据本申请的一些具体优选方式，所述产品还可示例性包括如下任一：
激活性抗体-生物素-链霉亲和素-固体支持物(优选磁珠或微球)；
肿瘤抗原和激活性抗体-生物素-链霉亲和素-固体支持物(优选磁珠或微球)。
进一步的，所述免疫细胞包括但不限于：T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、肥大细胞或巨噬细胞等。
在一些方式中，所述T淋巴细胞包括工程化的CAR-T细胞或TCR-T细胞等；
优选的，所述CAR-T细胞包括：自体型CAR-T细胞和通用型CAR-T细胞；更优选的，所述CAR-T细胞为二代、三代或四代CAR-T细胞。
本申请还提供一种装置，所述装置中包含上述任一所述的产品。
本申请还提供一种培养体系，所述体系中包括免疫细胞(尤其CAR-T细胞)和上述任一所述的产品。
本申请还提供一种上述产品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将肿瘤抗原与固体支持物混合，使肿瘤抗原偶联至固体支持物表面。
进一步的，所述偶联方式包括但不限于：通过偶联试剂直接进行偶联，或通过生物素与亲和素反应进行偶联，或通过与His标签结合反应进行偶联；或通过Tosyl基团与氨基结合反应进行偶联；或通过抗体结合反应(比如抗Fc抗体、抗his标签抗体)进行偶联。
优选的，所述偶联是通过生物素与亲和素的结合进行偶联，即通过生物素与亲和素的结合将带有生物素化(生物素标记)的抗原蛋白或抗体(比如肿瘤抗原)偶联在和素磁珠表面；或所述偶联可以是通过Co2+与His标签的结合将带有His标签抗原蛋白或抗体偶联至带有Co2+的磁珠表面；或所述偶联可以是通过Tosyl基团与氨基的结合将抗原蛋白或抗体直接偶联在Tosyl基团修饰的磁珠表面；或所述偶联可以是先将抗Fc标签的二抗偶联在磁珠表面，再通过带有Fc标签的抗原蛋白或抗体与磁珠表面的抗Fc段的二抗结合。
优选的，所述生物素为链霉亲和素。
进一步的，所述肿瘤抗原先进行生物素标记，获得生物素化的肿瘤抗原；所述固体支持物先进行表面链霉亲和素修饰，获得链霉亲和素的超顺磁珠。
进一步的，所述生物素化的肿瘤抗原是在重组表达中进行生物素标记；优选的，所述生物素标记是在肿瘤抗原重组表达过程中通过定点生物素化进行生物素标记；更优选的，所述定点生物素化是基于BirA酶标记方式进行。
在一些具体方式中，所述制备方法具体为：在肿瘤抗原重组表达过程中通过BirA酶标记方式定点生物素化进行生物素标记，将生物素化的肿瘤抗原与链霉亲和超顺素磁珠按合适比例混合，室温反应后洗涤磁珠，再加入生物素溶液于室温封闭，封闭后洗涤并重悬磁珠获得产品。
在一些更具体方式中，所述肿瘤抗原磁珠是分别使用生物素化的CD19蛋白、生物素化的BCMA蛋白或生物素化的MSLN蛋白与链霉亲和素磁珠(优选表面修饰链霉亲和素的超顺磁珠)偶联后制备的CD19-beads，BCMA-beads或MSLN-beads。具体制备方法为：将生物素化的重组蛋白与SA-beads按合适比例混合后，置于旋转摇床上于室温反应1小时；反应后使用无菌PBS洗涤磁珠3次，加入0.2mg/ml的生物素溶液于室温分别封闭1小时；封闭后使用无菌PBS洗涤磁珠3次，用含0.05％ HSA的无菌PBS重悬磁珠，4℃保存备用。其中，偶联后的磁珠产品的储存液为无菌的PBS或TBS溶液，也可加入一定比例的人血清白蛋白作为保护剂，范围在0.05％-0.5％。
进一步的，当所述产品还包括激活性抗体时，所述方法进一步包括基于上述类似的“生物素-亲和素偶联”方式，将激活性抗体进一步偶联至连接有肿瘤抗原的固体支持物上，或单独将激活性抗体偶联至独立的固体支持物。
进一步的，本申请还提供上述任一所述的产品在如下方面的任一应用：
1)在免疫细胞激活中的应用；
2)在免疫细胞扩增中的应用；
3)在免疫细胞增殖刺激中的应用；
4)在免疫细胞分化中的应用；
5)在免疫细胞表面标志物表达上调中的应用；
6)在免疫细胞诱导分泌细胞因子或细胞杀伤中的应用；
7)在诱导CAR-T细胞凋亡中的应用；
8)在制备针对恶性肿瘤或感染性疾病的药物中的应用。
优选的，所述免疫细胞为CAR-T细胞。
进一步的，所述应用包含在体外培养的步骤，因此某些方面，所述应用可在疾病治疗范畴之外。
本申请还提供一种免疫细细胞的体外培养方法，特征在于，将上述任一所述产品与免疫细(比如CAR-T细胞)进行混合的步骤。
本申请的有益技术效果：
本申请提供的特定偶联产品能够特异性地刺激免疫细胞(尤其CAR-T细胞)增殖，同时显著提高免疫细胞阳性率，增加免疫细胞在总细胞中的占比。是采用传统CD3/CD28磁珠方法两倍以上：CD3/CD28磁珠能够刺激T细胞增殖，但是进行CAR阳性率检测，CAR-T细胞占比并不高,仅为30％左右；本申请产品也能够有效地刺激T细胞增殖，但是CAR-T细胞占比明显较CD3/CD28抗体磁珠组高，分别为67％、72％、69％。
相比于现有技术中直接基于肿瘤抗原的激活方式，本申请肿瘤抗原和/或激活性抗体偶联在微球或磁珠等载体上，模拟膜表达靶抗原的肿瘤细胞去激活CAR-T细胞并刺激其增殖的过程。磁珠偶联的靶抗原与CAR-T细胞膜表面的CAR结合后，激活CAR-T细胞,刺激CAR-T细胞增殖，诱导因子分泌等。偶联肿瘤抗原或激活性抗体的磁珠产品，相较于游离的肿瘤抗原蛋白，刺激CAR-T细胞增殖效果更好。
此外，本申请通过定点生物素化的肿瘤抗原和/或激活性抗体与表面修饰链霉亲和素的磁珠结合，BirA酶标记方式定点生物素化方式属于定点标记，其不影响抗原蛋白或抗体本身的结构和生物学活性；抗原蛋白或抗体与磁珠的偶联是通过生物素与链霉亲和素的作用实现，生物素与链霉亲和素之间的亲和力高，结合反应几乎不可逆，获得磁珠产品性质更稳定；磁珠上链霉亲和素与定点标记在抗原蛋白或抗体上的生物素结合后，可形成一个连接磁珠与抗原蛋白或抗体的linker,空间位阻足够大，使得抗原蛋白或抗体在磁珠表面展示更充分，更易于识别CAR-T膜表面CAR结构；此外链霉亲和素为四聚体形式，理论上一个链霉亲和素能够结合四个生化素化的抗原蛋白或抗体，起到聚集作用，对此类磁珠产品的生物学活性起到放大作用。
附图说明
图1.磁珠类产品制备示意图；
图2.流式检测偶联效果；
图3.磁珠刺激CD19 CAR-T细胞增殖结果；
图4.流式检测磁珠加速稳定性的结果；
图5.CTG法检测磁珠加速稳定性的结果；
图6.流式检测磁珠偶联效率；
图7.CAR-T细胞CAR阳性率检测结果；
图8.磁珠刺激CAR-T细胞增殖情况；
图9.CAR-T阳性率检测结果。
发明详述
本申请公开了一种特异性针对免疫细胞激活和增殖刺激的磁珠类产品、制备和应用，本领域技术人员可以参考本文内容，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本申请内。本申请的制备方法及应用已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本申请内容、精神和范围内对本文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本申请技术。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本申请所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本申请而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
除非在下文中另有定义，本申请具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本申请。
如本申请中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
本申请中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
术语“或更多”、“至少”、“超过”等，例如“至少一种”应当理解为包括但不限于至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或超过所述值。还包括其间任何更大的数字或分数。
相反地，术语“不超过”包括小于所述值的每个值。例如，“不超过100个核苷酸”包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1和0个核苷酸。还包括其间任何更小的数字或分数。
术语“多个”、“至少两个”、“两个或更多个”、“至少第二个”等应当理解为包括但不限于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多。还包括其间任何更大的数字或分数。
术语定义：
如本文使用的术语“免疫细胞”是指淋巴细胞和免疫系统的其他细胞，通常包括诸如T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、肥大细胞或巨噬细胞等。术语“免疫细胞”可与术语“免疫应答细胞”互换使用。T细胞和自然杀伤细胞是两种示例性免疫细胞。肿瘤浸润性淋巴细胞是另一种类型的示例性免疫细胞。肿瘤浸润性淋巴细胞是从外周血移动到肿瘤中的免疫细胞。这些淋巴细胞可以具有攻击肿瘤的能力。肿瘤浸润性淋巴细胞的功能可以在肿瘤环境中改变。在癌症治疗的情况下，从患者的肿瘤中去除肿瘤浸润性淋巴细胞，然后进行治疗(例如，与物质接触和/或在实验室中工程化)。治疗可有效活化淋巴细胞以提高靶向和破坏患者中的癌细胞的功效。
如本文使用的术语“T细胞”和“T淋巴细胞”可互换，并且在本文中同义使用。如本文所用，T细胞包括胸腺细胞、初始T淋巴细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助性(Th)细胞，例如T辅助性1(Th1)或T辅助性2(Th2)细胞。T细胞可以是辅助性T细胞(HTL；CD4+T细胞)、CD4+T细胞、细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、肿瘤浸润性细胞毒性T细胞(TIL；CD8+T细胞)、CD4+CD8+T细胞或T细胞的任何其他亚群。适用于特定实施方案的T细胞的其他例示性群体包括初始T细胞和记忆T细胞。还包括“NKT细胞”，是指一种细胞表面既有T细胞受体TCR，又有NK细胞受体的特殊T细胞亚群。NK T细胞包括NK1.1+细胞和NK1.1-细胞，以及CD4+细胞、CD4-细胞、CD8+细胞和CD8-细胞。NKT细胞上的TCR的独特之处在于它识别由MHC I样分子CD Id递呈的糖脂抗原。由于NKT细胞能够产生促进炎症或免疫耐受的细胞因子，因此它们可具有保护作用或有害作用。还包括“γ-δT细胞(γδT细胞)”，是指特化的群体，即在其表面上具有独特TCR的T细胞的小子集，并且与其中TCR由被命名为α-TCR链和β-TCR链的两种糖蛋白链组成的大多数T细胞不同，γδT细胞中的TCR由γ-链和δ-链组成。γδT细胞可以在免疫监视和免疫调节中起作用，并且被发现是IL-17的重要来源且诱导强烈的CD8+细胞毒性T细胞应答。还包括“调节性T细胞”或“Treg”，它们是指抑制异常或过度免疫应答并在免疫耐受中起作用的T细胞。Treg细胞通常是转录因子Foxp3阳性CD4+T细胞，并且还可以包括为产生IL-10的CD4+T细胞的转录因子Foxp3阴性调节性T细胞。
如本文使用的术语“免疫应答”定义为当免疫细胞(比如淋巴细胞)将抗原分子识别为异物并诱发形成抗体和/或活化淋巴细胞以移除抗原时发生的对抗原的细胞应答。
如本文使用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”指的是被工程化以在免疫效应细胞上表达和特异性地结合抗原的人工T细胞受体，是人工构建的杂合蛋白或多肽，其含有与T细胞信号传导结构域连接的抗体(scFv)的抗原结合结构域。CAR的特性可以包括它们能够以非MHC限制性方式将T细胞特异性和反应性重定向至所选靶标，从而利用单克隆抗体的抗原结合性质。非MHC限制性抗原识别赋予表达CAR的T细胞不依赖于抗原加工而识别抗原的能力，因此绕过了肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，CAR有利地不与内源性T细胞受体(TCR)的α链和β链二聚化。至于抗原，以肿瘤细胞表面抗原为例，常见的包括但不限于：CD19，PSCA，Claudin，CD123，MSLN，CD20，CEA癌胚抗原，FAP，CD133，EGFR，EGFRVIII，BCMA，PSMA，HER2，CA125，EphA2，C-met，L1CAM，VEGFR，CS1，ROR1，EC，NY-ESO-1，MUC1，MUC16，mesothelin，LewisY，GPC3，GD2，EPG，DLL3，CD99，5T4，CD22，CD30，CD33，CD138和CD171等。
如本文所用的术语“CAR-T细胞”，“CAR-T细胞”或“经CAR修饰的T细胞可互换使用，是指表达上述CAR的T细胞。该细胞可以经基因修饰以在其表面上稳定地表达抗体结合结构域，从而赋予不依赖MHC的新型抗原特异性。“CAR-T细胞”可以包括自体型“CAR-T细胞”和通用型“CAR-T细胞(UCAR-T细胞)”。
目前CAR的结构主要经历了第一代到第四代，比如第一代CAR含有一个胞内信号组分,能够识别靶抗原并激活T细胞，但因为无共刺激分子，不能转导增殖信号和诱导细胞因子产生，所以T细胞无法增殖而导致杀伤肿瘤效果不佳；第二代CAR增加了一个共刺激分子(比如CD28或4-1BB)或者可诱导共刺激分子，在没有外源性共刺激分子的情况下，T细胞也能持续增殖并释放细胞因子；第三代CAR包含了两个共刺激分子(比如CD28和4-1BB)，提高T细胞的杀伤能力；第四代CAR在此基础上将额外的分子原件插入到CAR中以表达功能性转基因蛋白，例如诸如白细胞介素基因的功能原件，可以提高杀伤能力，或者是调控开关、自杀基因，以提高CAR-T疗法的安全性和可控性。
如文中所用，术语“肿瘤抗原”是指细胞癌变过程中所表达的新生物或过量表达产物；根据肿瘤抗原特异性分为：肿瘤特异性抗原(TSA)和肿瘤相关抗原(TAA)。肿瘤特异性抗原(TSA)是指该类抗原系肿瘤细胞所特有，只表达于肿瘤细胞，而不存在于任何处于不同发育阶段的正常细胞；肿瘤相关抗原是指非肿瘤细胞所特有的抗原成分，也少量的存在于正常细胞，但在肿瘤发生的机体可异常表达。示例性的肿瘤特异性抗原(TSA)和肿瘤相关抗原(TAA)包括但不限于文中所述的：CD19，PSCA，Claudin，CD123，MSLN，CD20，CEA癌胚抗原，FAP，CD133，EGFR，EGFRVIII，BCMA，PSMA，HER2，CA125，EphA2，C-met，L1CAM，VEGFR，CS1，ROR1，EC，NY-ESO-1，MUC1，MUC16，mesothelin，LewisY，GPC3，GD2，EPG，DLL3，CD99，5T4，CD22，CD30，CD33，CD138或CD171。
术语“激活性抗体”是用于免疫细胞激活靶点的抗体；本领域知晓T细胞活化和增殖诱导需要两个信号：第一个信号是诸多免疫细胞表面都有的白细胞抗原肽(MHC分子)与T淋巴细胞表面的T细胞受体(TCR)、CD3等与抗原提呈细胞(APCs)表面特异结合产生的特异性抗原刺激信号，这个信号是后天特异形成的；第二个信号则是非特异性的共刺激信号，主要由APCs表面多对共刺激分子和T细胞的相应受体相互作用后产生(如：CD28、CTLA-4和CD80，CD86，4-1BB和4-1BBL，CD40和CD40L，PD-1和PD-L1等)，其中CD28是最为重要的共刺激分子，经这个信号的刺激之后，T细胞呈现完全活化的状态，从而分泌大量的细胞因子和表达细胞因子受体，履行杀伤能力。因此，本申请所述的激活性抗体即是针对上述两个信号的抗体，示例性的，所述激活性抗体包括但不限于针对CD3、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD27，CD28，4-1BB，OX40，GITR，CD30，MyD88，CD40，ICOS，BAFFR，HVEM，LFA-1，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，SLAMF7，NKp80，CD160，B7-H3，CD83的抗体中的一种。
如本文使用的“激活”或“刺激”意指诱导T细胞的生物状态变化，通过该变化，细胞(例如CAR-T细胞)的增殖/扩增水平增强，表达活化标志物或产生细胞因子等增多，对靶细胞具有增强的细胞毒性等。
如本文使用的术语“增殖”通常指细胞分裂(细胞的对称或不对称分裂)增加。
如本文使用的术语“扩增”通常指细胞分裂和细胞死亡的结果。
如本文使用的术语“分化”通常指降低细胞的效能或增殖或者使细胞进入发育更受限状态的方法。
如本文使用的术语“表达”通常指允许或引起基因或DNA序列中的信息产生，例如通过激活相应基因或DNA序列的转录和翻译中所涉及的细胞功能来产生蛋白质。DNA序列在细胞中或通过细胞表达以形成“表达产物”，诸如蛋白质。据称表达产物本身例如所得蛋白质也可以被细胞“表达”。表达产物可以表征为细胞内、细胞外或跨膜。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指能够非共价地、可逆地并以特异性方式结合对应抗原的免疫球蛋白家族的多肽。例如，天然存在的IgG抗体是一种包括通过二硫键互连的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的四聚体。每个重链包含重链可变区(在此缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链包含轻链可变区(在此缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH区和VL区可以进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的超变区，所述超变区散布有更保守的被称作框架区(FR)的区。每个VH和VL由按照以下顺序从氨基末端到羧基末端布置的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包含免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(Clq)。“抗体”包含但不限于单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼科抗体、嵌合抗体和抗独特型(抗Id)抗体(包含例如针对本公开的抗体的抗Id抗体)。抗体可以属于任何同种型/种类(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或子类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
根据抗体重链恒定区的氨基酸序列进行区分，将抗体可以分为5类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种同种型别可以进一步划分成亚类，如，IgG1、IgG2、IgG3和IgA1以及IgA2。对应于不同种类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。根据抗体轻链恒定区(CL)的不同可以划分κ和λ。在全长轻链和重链内，通常可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，且重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区。
如本文所用的术语“个体”、“患者”、“对象”或“受试者”可以互换使用，是指动物，包括作为患者的正在治疗疾病或预防疾病的人。本文所述的方法可以用于治疗属于任何分类的动物受试者。此类动物的示例包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于啮齿目(orderRodentia)的哺乳动物(诸如小鼠和仓鼠)和兔形目(order Logomorpha)的哺乳动物(诸如兔)。哺乳动物可以来自食肉目(order Carnivora)，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。所述哺乳动物可以来自偶蹄目(order Artiodactyla)，包括牛科动物(奶牛)和猪科动物(猪)，或者奇蹄目(order Perssodactyla)，包括马科动物(马)。哺乳动物可以是灵长目(order Primate)、四足猴目(order Ceboid)或猴目(order Simoid)(猴)，或者类人猿目(order Anthropoid)(人和猿)。在一个实施方案中，哺乳动物是人。
如本文使用的术语“抗肿瘤活性”指的是生物学活性，其可由肿瘤体积的减小、肿瘤细胞数目的减少、转移数目的减少、预期寿命的增加、或与癌性病症相关联的各种生理学症状的改善活性。
如本文使用的术语“癌症”定义是指一组疾病，其可定义为任何异常的良性或恶性新生长，这种异常的良性或恶性新生长不具有生理功能的组织的，由不受控制的通常快速的细胞增殖引起，并有可能侵入或扩散到身体的其他部位。多种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
如本文使用的术语“治疗”是指治疗性处理，其中治疗对象将减慢(减轻)非期望的生理改变或疾病，或者在治疗期间提供有益或期望的临床结果。有益或期望的临床结果包括症状的减轻、疾病程度的减弱、疾病的稳定(即，未恶化)状态、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及/或者缓解(不论是部分缓解还是完全缓解)，不论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可意指与受试者未接受治疗时的预期生存期相比延长生存期。需要治疗的那些受试者包括已经患有非期望的生理改变或疾病的那些受试者、以及倾向于患有生理改变或疾病的那些受试者。
如本文使用的“治疗有效量”或“有效量”在本文中互换使用，是指在所需剂量和时间段有效实现期望的治疗结果的量。治疗有效量可根据以下因素变化：诸如个体的疾病状态、年龄、性别和重量，以及治疗剂或治疗剂组合在个体中引发期望的应答的能力。有效治疗剂或治疗剂组合的示例性指标包括，例如：患者健康状况的改善、肿瘤负荷的减少、肿瘤生长的遏止或减慢和/或癌细胞没有向身体其他部位转移的情况。
如本文使用的“给予”或“施用”药物给患者(以及该短语的语法等价物)是指直接施用，这可以是由医学专业人员对患者施用或可以是自我施用，和/或可能是开药行为的间接施用。例如，指导患者自行施用或为患者提供药物处方的医生正在向患者施用药物。比如，CAR-T细胞和免疫结合体的施用可以以任何方式进行，例如，通过肠胃外或非肠胃外施用，包括通过气溶胶吸入、注射、输注、摄取、输血、植入或移植。例如，本文所述的CAR-T细胞和免疫结合体可以经动脉、皮内、皮下、肿瘤内、髓内、结节内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射、或腹膜内施用于患者。在一个方面，本公开的免疫结合体通过i.v.注射施用。在一个方面，本公开的免疫结合体通过皮内注射或皮下注射施用于受试者。T细胞或NK细胞的免疫结合体可以被直接注射到例如肿瘤、淋巴结、组织、器官或感染部位中。基于自体型“CAR-T细胞”或通用型“CAR-T细胞”，施用可以是自体施用或非自体施用。例如，表达人CD19特异性CAR的免疫应答细胞可以从一名受试者获得，并且施用于相同的受试者或不同的相容受试者。
1、本申请的产品
本申请的原理是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原偶联在固体支持物上(比如微球或磁珠等载体)，模拟膜表达靶抗原的肿瘤细胞去激活免疫细胞(尤其CAR-T细胞)并刺激其增殖的过程。偶联的靶抗原与CAR-T细胞膜表面的CAR结合后，激活CAR-T细胞,刺激CAR-T细胞增殖，诱导因子分泌等。偶联肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原或激活性抗体的磁珠产品，相较于游离的肿瘤抗原蛋白，刺激CAR-T细胞增殖效果更好；相较于T细胞刺激的通用产品CD3/CD28抗体磁珠，能够更特异性地刺激抗原特异的CAR-T细胞。
因此，本申请所述的特异性针对免疫细胞激活/增殖刺激的产品包含如下组分：
1)肿瘤抗原；
2)固体支持物；
所述1)肿瘤抗原与2)固体支持物经偶联连接；
在一些实施方式中，所述肿瘤抗原包括肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原；
在一些优选实施方式中，所述肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原可选自：CD19，PSCA，Claudin，CD123，MSLN，CD20，CEA癌胚抗原，FAP，CD133，EGFR，EGFRVIII，BCMA，PSMA，HER2，CA125，EphA2，C-met，L1CAM，VEGFR，CS1，ROR1，EC，NY-ESO-1，MUC1，MUC16，mesothelin，LewisY，GPC3，GD2，EPG，DLL3，CD99，5T4，CD22，CD30，CD33，CD138，CD171中的一种；在一些具体实施例中，所述肿瘤抗原为CD19、BCMA或MSLN。
在一些实施方式中，所述固体支持物材质包括但不限于金属、塑料、衍生化的塑料、衍生化的纤维素、聚丙烯酸、淀粉、葡聚糖、明胶、玻璃或硅等。
在一些实施方式中，所述固体支持物的形状包括但不限于：球状或其他形状。
在一些实施方式中，所述固体支持物的构型包括但不限于：微粒、珠子、试管、微孔滴定板、膜、支架分子滤纸、圆盘、胶乳等。
在一些实施方式中，所述固体支持物为有磁性或无磁性的固体支持物。
在一些实施方式中，所述固体支持物为磁珠或微球，其包括但不限于：多聚糖氧化铁微球、PEG氧化铁微球或者二氧化硅等医学纳米微球等。
在一些优选的实施方式中，所述磁珠或微球带有的活性基团包括但不限于：链霉亲和素、羟基、羧基、氨基或甲苯磺酰基等；
在一些实施方式中，所述磁珠或微球的粒径范围优选在10nm-20um之间。
在一些实施方式中，所述偶联连接可通过本领域常见的偶联方式进行连接：不作限制，比如本申请中提及的如下各种方式：1)基于生物素与亲和素反应进行偶联；2)基于与His标签结合反应进行偶联；3)基于Tosyl基团与氨基结合反应进行偶联；或4)基于抗体结合反应进行偶联等。
在一些具体实施方式中，本申请通过生物素与亲和素的结合将带有生物素化(生物素标记)的抗原蛋白或抗体(比如肿瘤抗原)偶联在和素磁珠表面；通过Co2+与His标签的结合将带有His标签抗原蛋白或抗体偶联至带有Co2+的磁珠表面；通过Tosyl基团与氨基的结合将抗原蛋白或抗体直接偶联在Tosyl基团修饰的磁珠表面；通过先将抗Fc标签的二抗偶联在磁珠表面，再通过带有Fc标签的抗原蛋白或抗体与磁珠表面的抗Fc段的二抗结合。
根据本申请的一些具体实施方式，所述偶联连接优选采用基于生物素与亲和素反应进行偶联，该连接方式制备的偶联磁珠具有最优蛋白载量，最好刺激增殖和稳定性。
在此基础上，上述产品中，所述1)肿瘤抗原是经生物素标记，所述2)固体支持物经亲和素标记；两者通过生物素与亲和素反应形成偶联物。
在一些实施方式中，所述亲和素为链霉亲和素。
根据本申请的一些具体实施方式，本申请所述产品为是通过生物素化的肿瘤抗原与表面修饰链霉亲和素的超顺磁珠结合偶联而成。
具体的，所述产品示例性如下任一：
肿瘤抗原-生物素-亲和素-磁珠/微球；
肿瘤抗原-生物素-链霉亲和素-磁珠/微球。
在一些实施方式中，为进一步提升免疫细胞的激活或刺激效果，本领域可以进一步在产品添加其他刺激组分，比如包括激活性抗体；所述激活性抗体也基于“生物素-亲和素”偶联方式进行偶联，比如，可以进一步将激活性抗体偶联至上述连接有肿瘤抗原的固体支持物，或单独将激活性抗体偶联至独立的固体支持物。
在一些实施方式中，所述激活性抗体为用于免疫细胞激活靶点的抗体；更优选的，所述激活性抗体选自针对：CD3、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD27，CD28，4-1BB，OX40，GITR，CD30，MyD88，CD40，ICOS，BAFFR，HVEM，LFA-1，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，SLAMF7，NKp80，CD160，B7-H3，CD83的抗体中的一种；进一步优选的，所述激活性抗体为针对CD3、CD28和4-1BB的抗体。
具体的，所述产品示例性如下任一：
激活性抗体-生物素-链霉亲和素-磁珠或微球；
肿瘤抗原和激活性抗体-生物素-链霉亲和素-磁珠或微球。
在一些实施方式中，本申请所述的免疫细胞包括但不限于：T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、肥大细胞或巨噬细胞等。
在一些优选实施方式中，所述T淋巴细胞尤其包括工程化的CAR-T细胞或TCR-T细胞等；可以理解，所述CAR-T细胞可包括：自体型CAR-T细胞和通用型CAR-T细胞；优选的，所述CAR-T细胞为二代、三代或四代CAR-T细胞。
2、本申请产品的制备方法。
本申请上述产品的制备，包括如下步骤：
核心步骤在于，将肿瘤抗原与固体支持物混合，使肿瘤抗原偶联至固体支持物表面。
在一些实施方式中，所述偶联的方式包括但不限于：通过偶联试剂直接进行偶联，或通过生物素与亲和素反应进行偶联，或通过与His标签结合反应进行偶联；或通过Tosyl基团与氨基结合反应进行偶联；或通过抗体结合反应(比如抗Fc抗体、抗his标签抗体)进行偶联等。
根据本申请的一些具体实施方式，所述通过生物素与亲和素的结合将带有生物素化(生物素标记)的肿瘤抗原蛋白偶联在和素磁珠表面；所述偶联可以是通过Co2+与His标签的结合将带有His标签抗原蛋白或抗体偶联至带有Co2+的磁珠表面；所述偶联可以是通过Tosyl基团与氨基的结合将抗原蛋白或抗体直接偶联在Tosyl基团修饰的磁珠表面；所述偶联可以是先将抗Fc标签的二抗偶联在磁珠表面，再通过带有Fc标签的抗原蛋白或抗体与磁珠表面的抗Fc段的二抗结合。
在一些实施方式中，所述生物素尤其为链霉亲和素。
在一些实施方式中，所述肿瘤抗原先进行生物素标记，获得生物素化的肿瘤抗原；所述固体支持物先进行表面链霉亲和素修饰，获得链霉亲和素的超顺磁珠。
在一些实施方式中，所述生物素化的肿瘤抗原是在重组表达中进行生物素标记；优选的，所述生物素标记是在肿瘤抗原重组表达过程中通过定点生物素化进行生物素标记；更优选的，所述定点生物素化是基于BirA酶标记方式进行。
在一些具体方式中，所述制备方法具体为：分别使用生物素标记的肿瘤抗原与链霉亲和素磁珠按合适比例混合，室温反应后洗涤磁珠，再加入生物素溶液于室温封闭，封闭后洗涤并重悬磁珠，保存备用。
在本申请一些更具体的实施方式中，所述肿瘤抗原磁珠是分别使用生物素化的CD19蛋白、生物素化的BCMA蛋白或生物素化的MSLN蛋白与链霉亲和素磁珠(优选表面修饰链霉亲和素的超顺磁珠)偶联后制备的CD19-beads，BCMA-beads或MSLN-beads。具体制备方法为：将生物素化的重组蛋白与SA-beads按合适比例混合后，置于旋转摇床上于室温反应1小时；反应后使用无菌PBS洗涤磁珠3次，加入0.2mg/ml的生物素溶液于室温分别封闭1小时；封闭后使用无菌PBS洗涤磁珠3次，用含0.05％HSA的无菌PBS重悬磁珠，4℃保存备用。其中，偶联后的磁珠产品的储存液为无菌的PBS或TBS溶液，也可加入一定比例的人血清白蛋白作为保护剂，范围在0.05％-0.5％。
在本申请的一些具体实施方案中，使用制备的CD19-beads，BCMA-beads，MSLN-beads分别刺激CD19-CAR-T细胞，BCMA-CAR-T细胞和MSLN-CAR-T细胞。在携带CAR序列的慢病毒感染人T细胞3天后，按1:1比例加入偶联肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原或激活性抗体的微球产品刺激，分别在慢病毒转染3天后进行CAR-T阳性率检测；分别在加入CD19-beads，BCMA-beads，MSLN-beads的1-10天进行细胞增殖计数统计，第10天检测CAR-T细胞阳性率。
在一些实施方式中，当所述产品还包括激活性抗体时，所述方法进一步包括制备激活性抗体偶联固体支持物的步骤。比如，基于上述类似的“生物素-亲和素偶联”方式，将激活性抗体进一步偶联至连接有肿瘤抗原的固体支持物上，或单独将激活性抗体偶联至独立的固体支持物，可以理解上述两种偶联手段对于免疫细胞的激活上可能存在效果差异，但都不脱离本申请的核心技术原理，因此都在本申请的保护范围内。
3、本申请产品的应用
本申请的产品至少包括如下用途：
1)在免疫细胞激活中的应用；
2)在免疫细胞扩增中的应用；
3)在免疫细胞增殖刺激中的应用；
4)在免疫细胞分化中的应用；
5)在免疫细胞表面标志物表达上调中的应用；
6)在免疫细胞诱导分泌细胞因子或细胞杀伤中的应用；
7)在诱导免疫细胞凋亡中的应用；
8)在制备针对恶性肿瘤或感染性疾病的药物中的应用。
在获知本申请产品具有免疫细胞(比如CAR-T细胞)激活和增殖刺激用途时，本领域可预期，经诱导的免疫细胞的生物状态能够发生变化，通过该变化能够导致免疫细胞扩增水平增强，分化增强、甚至表达活化标志物或产生细胞因子等增多，对靶细胞具有增强的细胞毒性等等。同样，基于这些用途，本领域可以理解该产品在制备针对恶性肿瘤或感染性疾病的比如CAR-T细胞药物中的用途。
下面将结合实施例对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例
下面将结合附图对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实验材料和设备等
本申请实施例中使用的原材料及试剂，其中生物素化CD19蛋白(Cat.No.CD9-H82E9)、生物素化BCMA蛋白(Cat.No.BCA-H82E4)、生物素化MSLN蛋白(Cat.No.MSN-H82E7)、生物素化的人血清白蛋白(Cat.No.HSA-H82E3)PE标记CD19蛋白(Cat.No.CD9-HP2H3)PE标记BCMA蛋白(Biotinylated Human Serum Albumin Protein，Biotinylated HSA,Cat.No.BCA-HP2H2)、PE标记MSLN蛋白(Cat.No.MSN-HP2H5)均为北京百普赛斯生物股份有限公司产品；链霉亲和素超顺磁珠(Cat.No.SMB-B01)粒径为2μm，表面偶联链霉亲和素，每毫克磁珠能负载1000pmol的链霉亲和素；人血清白蛋白(human serum albumin,HSA，华北制药股份有限公司生物技术分公司，Cat.No.RA-EG002),采购自华北制药；CD19-CAR慢病毒，BCMA-CAR慢病毒，MSLN-CAR慢病毒均由北京百普赛斯生物股份有限公司分子实验室提供；人源CD3+T细胞(Cat.No.PB009-1F-C-5M)购自上海澳能生物技术有限公司；:T细胞培养基(Cat.No.170-076-306)，购自德国美天旎生物技术有限公司；人IL-2重组蛋白(Cat.No.IL2-H5215)，Anti-CD3/CD28抗体磁珠(Cat.No.MBS-C001)为北京百普赛斯生物股份有限公司产品；其它无机试剂均采购国药集团化学试剂有限公司。
本申请涉及偶联效率检测方法是流式检测(FACS)，主要使用的试剂是牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液、PE标记的CD19抗体、PE标记的BCMA抗体和PE标记的MSLN抗体，这些荧光抗体购买自Biolegend公司。
本申请涉及的CAR-T细胞阳性率检测的CAR-T细胞为自己构建获得，T细胞为健康人T细胞采购自上海澳能生物公司。
本申请采用的仪器和工具为：Milli-Q纯水系统(Millipore公司)，流式细胞仪(BD，Lyric)，磁性分离器(深圳博尔熙公司)，紫外分光光度计(UV-5100)，细胞计数仪(Thermo，Countess3)。
实施例1、偶联方式优化
1)His标签偶联：将80ug His标签CD19蛋白(Acrobiosystems,Cat.No.CD9-H52H2)和1mg的His tag结合微球(Life Technology，Cat.No.10103D)充分混合，在pH8.0的PBS体系中于室温反应1～2小时后，放入磁场中磁吸分离，弃掉上清液,使用PBS(pH7.4)清洗3次后，重悬于1ml的PBS(pH7.4)，获得CD19-His-beads,4℃存储备用。
2)Tosyl基团偶联：将80ug His标签CD19蛋白(Acrobiosystems,Cat.No.CD9-H52H2)和1mg的Tosyl标记超顺磁珠(苏州纳薇，Cat.No.MPHCT-300)充分混合，按厂家推荐的Tosyl基团与伯氨基反应的方法进行偶联，获得CD19-tosyl-beads，重悬于1ml的PBS(pH7.4)，4℃存储备用。
3)Fc标签偶联：先将抗人免疫球蛋白Fc段抗体(Acrobiosystems,Cat.No.IGG-AY69)偶联到Tosyl标记超顺磁珠上(方法按厂家推荐)，再加入Fc标签CD19蛋白(Acrobiosystems，Cat.No.CD9-H5251)室温反应1小时，通过抗人免疫球蛋白Fc段抗体与蛋白的Fc标签蛋白的结合把CD19蛋白偶联在磁珠上，获得CD19-mIgG-beads，重悬于PBS(pH7.4)，4℃存储备用。
4)Biotin-SA偶联：将80ug生物素化CD19蛋白(Acrobiosystems，Cat.No.和1mg的链霉亲和素超顺磁珠(Acrobiosystems，Cat.No.SMB-B01)充分混合，在pH8.0的PBS体系中于室温反应1小时后，放入磁场中磁吸分离，弃掉上清液，使用PBS(pH7.4)清洗3次后，重悬于1ml的PBS(pH7.4)，获得CD19-biotin-SA-beads(后面简称为CD19-beads)，4℃存储备用。
5)偶联效果比较：4种偶联方式获得的磁珠产品CD19-His-beads，CD19-tosyl-beads，CD19-mIgG-beads，CD19-biotin-SA-beads，分别计数后取相同数量的beads加入流式检测管(1x106/管)，然后加入PE标记的抗CD19抗体(1:100稀释，100ul/管)，室温孵育1小时，流式检测每种磁珠表面生物素化CD19蛋白的偶联丰度。检测结果(见图2)表明：不同的偶联方式获得的磁珠产品表面偶联的CD19蛋白量是不相同的，载量由高到低依次为CD19-biotin-SA-beads、CD19-tosyl-beads、CD19-mIgG-beads和CD19-His-beads，其中Biotin-SA偶联效果最好，His标签偶联效果最差。
6)刺激增殖活性比较：人源CD3+T细胞经Anti-CD3/CD28抗体磁珠激活48小时后，加入CD19-CAR慢病毒颗粒转染细胞；在慢病毒侵染72h后，磁吸去掉Anti-CD3/CD28抗体磁珠后将细胞以4×104/mL密度重新接种与96孔板中；分别加入不同浓度梯度磁珠产品刺激，37℃二氧化碳培养箱培养72小时，使用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞增殖。实验结果(见图3)见表明：4种磁珠产品均能刺激CD19 CAR-T细胞增殖；CD19-biotin-SA-beads刺激增殖效果最好；CD19-tosyl-beads、CD19-mIgG-beads两种磁珠刺激效果次之；CD19-His-beads刺激活性最低。
7)加速稳定性比较：4种偶联方式获得的磁珠产品CD19-His-beads，CD19-tosyl-beads，CD19-mIgG-beads，CD19-biotin-SA-beads，分别在37℃放置8、16、24、48小时进行样品保存加速实验；加速后样品通过PE标记的抗CD19抗体染色后流式细胞仪检磁珠表面有效CD19的量的变化，检测结果(见图4)表明CD19-biotin-SA-beads和CD19-tosyl-beads稳定性较好，加速48小时后荧光检测信号无变化，其余2种磁珠均在加速24小时活性有所降低，CD19-His-beads加速48小时与抗体的结合活性降低至32％；加速后样品通过CGT法检测其刺激CD19 CAR-T增殖活性的变化，检测结果(见图5)显示CD19-biotin-SA-beads和CD19-tosyl-beads稳定性较好，这与流式检测结果一致，而CD19-mIgG-beads和CD19-His-beads在37℃加速处理后活性明显降低。
实施例2、肿瘤相关抗原磁珠产品的制备
1)样品准备：按照产品COA要求，分别加入相应体积的无菌水重构生物素化CD19蛋白、生物素化BCMA蛋白、生物素化MSLN蛋白，用无菌PBS溶液稀释至浓度为80ug/mL；配置磷酸缓冲液(PBS,pH7.2)及含20％人血清白蛋白PBS的磁珠产品储存液备用。
2)重组蛋白与磁珠的偶联：分别取1mg链霉亲和素超顺磁珠置于1.5mL离心管内(终量)，无菌水清洗3次后离心弃上清，分别加入1mL的80ug/mL生物素化蛋白，置于旋转混匀仪上室温反应1h；磁吸移走上清保存，用于UV法测定上清液中剩余蛋白量；使用含1％HSA的PBS清洗磁珠产品3次，加入1mL磁珠产品存储液重悬磁珠产品，分别获得CD19-beads、BCMA-beads、MSLN-beads，4℃存储备用。
3)UV法检测偶联载量：分别取步骤2收集的CD19-beads、BCMA-beads、MSLN-beads的上清液进行剩余蛋白定量检测，每个待测样品取300uL，加入比色皿，无菌PBS作为空白对照；分别去每个待测样品300uL，加入比色皿，无菌PBS作为空白对照，读取各组待测样品的OD280数值；根据蛋白的A280吸光系数， 计算待测样品的浓度，测量结果见表1，CD19-beads的载量是29.5ug/mg,BCMA-beads的载量是34.6ug/mg、MSLN-beads的载量32.8ug/mg。
表1、生物素化蛋白偶联磁珠上清液检测数据
| 待测样品 | 偶联前原液 | 上清液 | 偶联载量 |
| CD19-beads | 80ug/mL | 50.5ug/mL | 29.5ug/mg |
| BCMA-beads | 80ug/mL | 45.4ug/mL | 34.6ug/mg |
| MSLN-beads | 80ug/mL | 47.2ug/mL | ug/mg |
4)流式细胞仪检测偶联率：分别取50uL的CD19-beads、BCMA-beads、MSLN-beads，HSA-beads置于1.5ml的离心管内，1x106 beads/管；流式buffer清洗磁珠产品1次，弃上清；分别加入PE标记的抗CD19抗体(1:100稀释，100ul/管)、抗BCMA抗体(1:100稀释，100ul/管)、抗MSLN磁抗体染色(1:100稀释，100ul/管)，室温避光孵育30min，磁吸弃上清液；流式Buffer清洗2次，加入200uL PBS溶液重悬磁珠产品，转移至流式管中，进行流式检测；流式分析结果显示3种生物素蛋白偶联效率为100％，且获得磁珠产品均一性很好，具体请见图6。
实施例3、肿瘤相关抗原磁珠产品的应用
1)CAR-T细胞的构建：将人源CD3+T细胞密度调整至1×106个/ml，接种于6孔细胞培养板；加入相同量的Anti-CD3/CD28抗体磁珠(磁珠与细胞的数量比例为1:1)刺激48小时；然后加入慢病毒颗粒转染细胞，48h后细胞取样，使用PE标记的相应的CAR靶点蛋白染色，进行流式检测CAR-T阳性率。实验结果表明CAR-T细胞构建成功，如图7所示，CD19 CAR-T细胞阳性率为33％，BCMACAR-T细胞阳性率为32％，MSLN CAR-T细胞阳性率为30％。
2)CAR-T细胞增殖检测：在慢病毒侵染72h后，将每种细胞悬液中的Anti-CD3/CD28抗体磁珠通过磁力分离器去除，以1×106/mL密度重新接种至24孔板中，体积1mL；按照磁珠与细胞的数量比为1:1的量，将CD19-beads、BCMA-beads、MSLN-beads磁珠分别加入各自对应的侵染慢病毒的细胞中，同时设置Anti-CD3/CD28抗体磁珠对照组、BSA-beads对照组；加入磁珠当天记为0天，之后每2天对所有组细胞进行计数，当密度超过2×106/mL时传代培养。实验结果表明CD3/CD28 beads、CD19-beads、BCMA-beads和MSLN-beads均能刺激相应的CAR-T细胞的增殖，体现了磁珠产品的增殖活性。具体结果见图8。
3)CAR-T阳性率检测：在加入肿瘤相关抗原磁珠(CD19-beads、BCMA-beads、MSLN-beads等)刺激后的第10天，取部分细胞进行CAR阳性率检测。实验结果表明CD3/CD28磁珠能够刺激CAR-T细胞增殖，但不能增加CAR-T细胞的CAR阳性率；而CD19-beads、BCMA-beads、MSLN-beads刺激CAR-T细胞10天后，显著的提高了CAR-T细胞的CAR阳性率。具体结果见图9。
前述对本申请的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本申请限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本申请的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本申请的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本申请的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (10)
1.一种特异性针对免疫细胞激活/增殖刺激的产品，其特征在于，所述产品包含如下组分：
1)肿瘤抗原；
2)固体支持物；
其中，所述1)肿瘤抗原与2)固体支持物经偶联连接；
所述肿瘤抗原包括肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原；
优选的，所述肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原可选自：CD19，PSCA，Claudin，CD123，MSLN，CD20，CEA癌胚抗原，FAP，CD133，EGFR，EGFRVIII，BCMA，PSMA，HER2，CA125，EphA2，C-met，L1CAM，VEGFR，CS1，ROR1，EC，NY-ESO-1，MUC1，MUC16，mesothelin，LewisY，GPC3，GD2，EPG，DLL3，CD99，5T4，CD22，CD30，CD33，CD138，CD171中的一种；更优选的，所述肿瘤抗原为CD19、BCMA或MSLN。
2.根据权利要求1所述的产品，其特征在于，所述偶联连接的方式包括但不限于如下任一方式：
a、基于生物素与亲和素反应进行偶联；
b、基于与His标签结合反应进行偶联；
c、基于Tosyl基团与氨基结合反应进行偶联；
d、基于抗体结合反应进行偶联。
3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述偶联连接的方式是基于生物素与亲和素反应进行偶联；
优选的，所述1)肿瘤抗原体经生物素标记，所述2)固体支持物经亲和素标记，所述1)和2)通过生物素与亲和素反应形成偶联物；
更优选的，所述偶联物结构如下：
肿瘤抗原-生物素-亲和素-固体支持物；
进一步优选的，所述亲和素为链霉亲和素。
4.根据权利要求1-3任一所述的的产品，其特征在于，所述产品中进一步包括激活性抗体；所述激活性抗体基于“生物素-亲和素”偶联方式，进一步偶联至上述连接有肿瘤抗原的固体支持物，或单独偶联至独立固体支持物；
优选的，所述激活性抗体为用于免疫细胞激活靶点的抗体；更优选的，所述激活性抗体选自针对：CD3、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD27，CD28，4-1BB，OX40，GITR，CD30，MyD88，CD40，ICOS，BAFFR，HVEM，LFA-1，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，SLAMF7，NKp80，CD160，B7-H3，CD83的抗体中的一种；进一步优选的，所述激活性抗体为针对CD3、CD28和4-1BB的抗体。
5.根据权利要求1-4任一所述的产品，其特征在于，所述固体支持物的材质包括但不限于金属、塑料、衍生化的塑料、衍生化的纤维素、聚丙烯酸、淀粉、葡聚糖、明胶、玻璃或硅；
优选的，所述固体支持物为磁性固体支持物，包括磁珠或微球；
更优选的，所述磁珠或微球的表面活性基团包括但不限于：链霉亲和素、羟基、羧基、氨基或甲苯磺酰基。
6.一种装置，其特征在于，所述装置中包含权利要求1-5任一所述产品。
7.一种培养体系，其特征在于，所述培养体系中包括免疫细胞和权利要求1-5任一所述产品。
8.权利要求1-5任一所述产品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将肿瘤抗原与固体支持物混合，使肿瘤抗原偶联至固体支持物表面；
优选的，所述肿瘤抗原先进行生物素标记，获得生物素化的肿瘤抗原；所述固体支持物先进行表面链霉亲和素修饰，获得链霉亲和素的超顺磁珠。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述生物素标记是在肿瘤抗原重组表达过程中通过定点生物素化进行生物素标记；
优选的，所述定点生物素化是基于BirA酶标记方式进行；
更优选的，所述制备的具体步骤包括：在肿瘤抗原重组表达过程中通过BirA酶标记方式定点生物素化进行生物素标记，将生物素化的肿瘤抗原与链霉亲和超顺素磁珠按合适比例混合，室温反应后洗涤磁珠，再加入生物素溶液于室温封闭，封闭后洗涤并重悬磁珠获得产品。
10.权利要求1-5任一所述的产品在如下方面的任一应用：
1)在免疫细胞激活中的应用；
2)在免疫细胞扩增中的应用；
3)在免疫细胞增殖刺激中的应用；
4)在免疫细胞分化中的应用；
5)在免疫细胞表面标志物表达上调中的应用；
6)在免疫细胞诱导分泌细胞因子或细胞杀伤中的应用；
7)在诱导免疫细胞凋亡中的应用；
8)在制备针对恶性肿瘤或感染性疾病的药物中的应用。
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Also Published As
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