CN116785413A - Trpm7的激酶结构域m7ck在制备ad治疗药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及TRPM7的激酶结构域M7CK在制备阿尔茨海默病治疗药物中的应用。本发明首次提出M7CK在制备AD治疗药物中的应用，包括构建能有效过表达TRPM7的1299‑1863位序列的M7CK的pAAV2/9‑M7CK质粒或病毒，用于制备AD治疗药物；本发明利用AAV2/9‑M7CK在原代海马神经元内过表达AAV2/9‑M7CK对于Aβ毒性具有保护作用；将AAV2/9‑M7CK注射进入AD模型小鼠脑内海马组织可有效改善学习记忆功能受损、恢复突触密度并降低淀粉样蛋白沉积，且在AD患者早期和晚期都具有保护作用。因此，AAV2/9‑M7CK对阿尔茨海默病患者的基因治疗中具有应用前景。

Description

TRPM7的激酶结构域M7CK在制备AD治疗药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及TRPM7的激酶结构域M7CK蛋白在制备阿尔茨海默病治疗药物中的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是一种影响广泛的神经退行性疾病，在我国60岁以上的人群中，发病人数高达约1000万人。根据世界卫生组织报告，2021年全球约有5500万阿尔茨海默病患者，预计到2030年该数字将达到7800万。其发病机制及其复杂，主要病理表现为脑内神经突触的丢失、淀粉样蛋白沉积、神经纤维缠结等。临床表现为进行性记忆和认知功能衰退、语言功能、人格改变以及日常活动困难等。给患者本人及其家庭乃至整个社会都带来极大的精神和经济负担。迄今为止，尚无有效根治方案。目前阿尔茨海默病药物开发的重要靶点之一是针对淀粉样蛋白的沉积。因此通过靶向淀粉样蛋白的清除来改善阿尔茨海默病相关的突触丢失以及认知功能损伤等病理特征，具有极大应用前景。

TRPM7是M型瞬时受体电位家族的一员，是一种在各种细胞类型中广泛表达的二价离子通道蛋白，它同时包含6次跨膜的通道结构域和C端的激酶结构域(M7CK)，其N端和C端均指向细胞质。TRPM7可以选择性通过二价阳离子，例如钙离子、镁离子、锌离子，对于维持细胞内外离子稳态以及调节下游信号通路具有重要作用，它在多种神经细胞中表达，例如海马、大脑皮层、小脑、脑干等。TRPM7的激酶端(TRPM7 cleaved kinase fragments，M7CK)可以被切割后独立存在，并参与调节染色质重塑、突触可塑性等重要的细胞过程。其独特的双结构域意味着它可能参与多种细胞功能。已有研究表明TRPM7通过多种方式参与到包括阿尔茨海默病在内的神经退行性疾病中。但部分研究认为抑制TRPM7可作为一种治疗策略，而另外一部分研究认为激活TRPM7可能具有保护作用。2005年研究发现一种TRPM7的错义突变能够改变细胞对于镁离子的敏感度从而影响镁离子稳态，进而造成神经退行性疾病的发生。2010年研究发现与家族性阿尔茨海默病相关的早老素蛋白突变型会抑制TRPM7的通道功能。2017年研究发现药理激活TRPM7的通道功能能够通过激活自噬来促进Aβ的清除。迄今为止，没有有关TRPM7的激酶结构域M7CK对于阿尔兹海默病有保护作用的研究。

发明内容

本发明目的是提供TRPM7的激酶结构域M7CK在制备阿尔茨海默病治疗药物中的应用。

本发明研究表明，TRPM7的激酶端(M7CK)可以被切割后独立存在，并参与调节染色质重塑、突触可塑性等重要的细胞过程。本发明首先通过小鼠模型，构建能有效过表达TRPM7的1299-1863位序列的M7CK的AAV2/9-M7CK腺相关病毒。证明原代海马神经元过表达TRPM7的1299-1863位序列的M7CK对于Aβ诱导的突触毒性有显著保护作用，而且，构建的AAV2/9-M7CK腺相关病毒能够有效恢复5XFAD小鼠的学习记忆功能受损，恢复突触密度，降低Aβ水平。

因此，本发明提供的TRPM7的激酶结构域M7CK可用于阿尔茨海默病治疗药物。M7CK序列为SEQ ID NO.1所示。

进一步地，本发明还涉及构建的能有效过表达TRPM7的1299-1863位序列的M7CK的pAAV2/9-M7CK质粒或病毒。所述pAAV2/9-M7CK质粒的序列为SEQ ID NO.2所示。

进一步地，本发明还涉及AAV2/9-M7CK病毒的包装，所述包装包括但不限于适用于AAV病毒的包装方式。

具体地，本发明将包装后的AAV2/9-M7CK病毒试剂采用脑立体定位注射入脑内。比如注射入脑内海马区。

进一步地，将包装后的AAV2/9-M7CK注射进入5月龄5XFAD小鼠海马，然后在其不同年龄：6月龄、10月龄、15月龄时进行行为学测试，观察5XFAD小鼠的学习记忆受损情况。

注射后，取特定月龄的5XFAD小鼠海马神经元组织分别进行免疫荧光染色检测和ELISA检测，并与未给药的相同月龄5XFAD小鼠海马神经元组织对比，分析海马内突出密度和Aβ水平的变化情况。

另外，将包装后的AAV2/9-M7CK病毒试剂感染体外培养的原代海马神经元，并用Aβ处理48小时，并与Aβ处理组相比，观察制剂是否能恢复Aβ诱导的突触丢失。

本发明与现有技术相比，具有以下主要的优点：

其一，本发明在阿尔茨海默病患者脑组织以及阿尔茨海默模型小鼠海马样本的实验中观察到了显著的TRPM7下调。

其二，本发明利用AAV2/9-M7CK病毒对原代海马神经元进行TRPM7的1299-1863位的M7CK序列的过表达，对于Aβ造成的突触损伤具有保护作用。

其三，本发明利用AAV2/9-M7CK病毒对5XFAD小鼠进行基因治疗显著改善了其学习记忆功能损伤，恢复突触密度，减少Aβ淀粉样斑块，减少不可溶性Aβ1-42和Aβ1-40，减缓阿尔茨海默病病程。

其四，本发明制备的AAV2/9-M7CK腺相关病毒在阿尔茨海默病患者的基因治疗中有极大的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中western blot分析阿尔茨海默病病人海马、12月龄5XFAD和15月龄APP/PS1小鼠海马内的TRPM7表达水平。显示阿尔茨海默病病人海马内TRPM7水平比对照组人脑海马显著减少、15月龄APP/PS1和12月龄5XFAD小鼠海马内的TRPM7表达水平均比同龄野生型小鼠显著下调。

图2为实施例3中过表达M7CK并用Aβ处理的原代海马神经元synaptophysin/PSD95免疫荧光信号示意图以及统计结果。显示Aβ处理能够显著降低原代海马神经元突触密度(synaptophysin/PSD95 puncta数目)，而过表达M7CK后，突触密度显著增加。

图3为实施例4中在5月龄WT以及5XFAD小鼠海马内注射AAV2/9-M7CK或者AAV2/9-EGFP，然后在6/10/15月龄使用新物体识别实验，认知墙实验以及Y迷宫实验测试其学习记忆功能。

图4为实施例4中对6/10/15月龄小鼠的行为实验测试结果。显示，过表达M7CK能够恢复6/10/15月龄5XFAD小鼠的新物体识别能力，还能改善6月龄5XFAD小鼠在认知墙实验中的学习曲线，并显著改善10/15月龄5XFAD小鼠在Y迷宫中的空间记忆水平。

图5为实施例4中对老年5XFAD小鼠海马注射AAV2/9-M7CK前后分别进行新物体识别测试的实验结果。显示，注射M7CK之前，14月龄的5XFAD小鼠不具有新物体识别的能力，过表达M7CK以后，5XFAD小鼠的新物体识别指数显著上升。

图6为实施例4中对过表达M7CK的15月龄5XFAD小鼠海马内synaptophysin以及PSD95的免疫荧光染色示意图以及统计结果。显示，与同龄野生型小鼠相比，5XFAD小鼠海马CA1区的synaptophysin以及PSD95标记的突触密度显著下调，而过表达M7CK能够显著恢复了突触密度。

图7为实施例4中对过表达M7CK的5XFAD小鼠海马内Aβ斑块的免疫组织化学染色示意图以及统计图，显示过表达M7CK的5XFAD小鼠海马内Aβ斑块显著下调。

图8为实施例4中对过表达M7CK的5XFAD小鼠海马内可溶性蛋白组分以及不可溶性蛋白组分中Aβ1-40以及1-42的ELISA定量结果。显示在5XFAD小鼠海马的不可溶性蛋白组分中，过表达M7CK显著下调了Aβ1-40以及1-42的浓度；在可溶性蛋白组分中，过表达M7CK显著下调了Aβ1-42的浓度。

图9为TRPM7蛋白结构示意图。

图10为pAAV2/9-EGFP质粒示意图。

图11为本发明主要实验流程与结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

阿尔茨海默病病人海马、阿尔茨海默病转基因模型(5XFAD和APP/PS1)小鼠海马内的TRPM7表达水平显著降低。

本发明采用western blotting方法观察到阿尔茨海默病病人海马内的TRPM7蛋白表达水平较对照组相比显著减少；进一步采用同样方法在12月龄5XFAD和15月龄APP/PS1小鼠海马内观察到TRPM7表达水平均比同龄野生型小鼠显著减少。

本实施例采用的阿尔茨海默病病人海马样本来自国家健康和疾病人脑组织资源库(浙江大学医学院中国脑库)。采用的5XFAD和APP/PS1(购于南京大学&南京生物医学研究所模式动物研究中心)都是广泛使用的阿尔茨海默病模型小鼠。本实施例中，westernblotting分析的方法如下：

取冻存的阿尔茨海默病病人海马组织、新鲜的5XFAD以及APP/PS1小鼠海马组织以及对照组的海马组织，置于EP管中，用含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液(100μL裂解液/10mg组织)提取蛋白，并用BCA试剂盒对蛋白浓度进行定量。蛋白中加入上样缓冲液，100℃5min使蛋白充分变性；在10％的SDS-PAGE胶中上样，上样量为20μg。开始电泳，电泳时间为上层胶：80V 30min，下层胶：120V 50min。将PVDF膜剪成与SDS-PAGE胶相同大小，放入甲醇中激活数秒，然后在4℃预冷后的转膜液中将胶块和PVDF膜夹在转印夹子的多层滤纸之间(胶对着黑色负极，膜对着红色正极)，恒压100V转膜70min；转膜结束后，将膜放入5％的脱脂奶粉制成的封闭液中封闭2小时，然后转移至用封闭液稀释的一抗(TRPM7抗体，Alomone，ACC-047，1：750；GAPDH抗体，Proteintech，1：10000)中过夜孵育，PBST洗三次，二抗孵育1.5小时，PBST洗三次。滴上新鲜配置的ECL显影液，在天能显影仪中显影，选择合适的曝光时间并保存图片；使用Image Pro Plus软件对条带进行光密度定量分析。以GAPDH为内参计算出TRPM7的相对表达量。

实施例2

构建能有效过表达TRPM7的1299-1863位序列的M7CK的AAV2/9-M7CK腺相关病毒。

载体构建：

(1)以小鼠海马cDNA为模板，以Forward-ggatcc atgtctcttcctcaaggtgat；

Reverse-accggt cgtaacatcagacgaacagaa为引物(引物两端包括两个酶切位点BamHI AgeI以及相应保护碱基)克隆TRPM7第1299-1863位，PCR反应体系如下：

PRIME STAR MAX 12.5μL；

引物F/R 1μL/1μL(0.2μM)；

cDNA 100ng；

ddH2O up to 25μL；

PCR反应条件：

98℃，5min；

98℃，10s；

55℃，15s；35Cycles

72℃，30s；

72℃，10min。

(2)PCR反应结束后，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，切割1.7kb左右的条带，根据胶回收试剂盒说明书来收集M7CK片段：在核酸显影仪中将目的条带所在位置的凝胶切碎，收集在一个EP管中，称重，加入PN溶液(1μL/mg胶块)，50℃水浴溶解，期间不断晃动，直到胶块全部溶解；将吸附柱预先加入500μL BL溶液，12000rpm，1min，弃掉收集管中的废液；将完全溶解的胶块溶液恢复室温后加入吸附柱，室温静置2min，12000rpm，1min，弃废液；加入PW600μL，静置4min，12000rpm，1min，弃废液，重复两次；空离心12000rpm，2min，开盖子晾干9min；将吸附柱放入新的EP管中，加入30μL ddH2O，静置2min，12000rpm，2min，将收集到的液体再次上柱，12000rpm，2min；使用光度计测量所得DNA片段的浓度和纯度。

(3)酶切M7CK片段以及载体pAAV2/9-EGFP(AAV2/92/9)，体系如下：

质粒3μg或者M7CK片段1μg；

BamHI 1μL；

AgeI 1μL；

10X CutSmart Buffer 5μL；

dd H2O up to 50μL；

37℃水浴1-2小时。

(4)65℃水浴20min灭活，加入上样缓冲液，琼脂糖凝胶电泳30min,120V，胶回收对应大小的片段和载体。

(5)连接：

10X连接酶buffer 2μL；

载体：50ng；

T4连接酶1μL；

目的基因片段(～50ng/μL)：up to 20μL。

(6)室温条件下(25℃左右)连接过夜。

(7)转化：取5μL连接产物加入刚从负八十冰箱取出的DH5感受态细胞50μL中，冰上静置半小时；42℃水浴热激45s后，立刻转移到冰上2min，此过程操作需要温和，不可摇动离心管；然后加入900μL无抗生素的LB培养基，37℃，150rpm摇床一小时使细菌复苏；4500rpm室温离心5min，弃900μL上清，将留下的100μL上清与底部菌体沉淀吹吸重悬，倒入含有氨苄抗生素的平板上，用酒精灯灭菌后恢复室温的玻璃棒将菌液涂抹均匀，将平板置于37℃培养箱直至液体被吸收后倒置平板，培养过夜。

(8)次日，使用10μL枪头挑取单克隆菌落，加入含有氨苄的液体培养基中，37℃，220rpm摇床8-12小时。然后取菌液500μL送去测序(生工)。如果测序正确，则取相应的菌液加入300mL培养瓶扩大培养12小时，然后按照质粒提取的步骤(Vazyme，#DC202-01)抽取质粒：将过夜培养的菌液转移至50mL离心管中，11000rpm，2min，弃上清；在菌体沉淀中加入P1溶液7.5mL，涡旋振荡混匀；继续加入P2溶液7.5mL，温和上下颠倒混匀，室温静置5min；加入P4溶液7.5mL，立刻颠倒8次左右，此时出现白色絮状沉淀，11000rpm，10min，吸取上清(避免吸到白色沉淀)至新的50mL圆底管中；加入0.1倍体积的内毒素去除剂，颠倒混匀，冰上静置5min，室温静置10min，颠倒混匀；11000rpm室温离心10min，取上层水相(含有DNA)于新管中，加入0.5倍体积异丙醇，分多次转入一个吸附柱中，11000rpm，1min，弃收集管中的废液；用10mL漂洗液PW，11000rpm，1min，弃废液，重复两次；11000rpm空离心3min；将吸附柱放入一个新的离心管中，在膜中间加入1mL ddH2O，室温静置3min，11000rpm离心3min；用光度计测量所得质粒的浓度和纯度。

AAV2/9病毒包装：将转染(VigoFect转染试剂)了辅助质粒以及目的质粒60小时后的293细胞(6个15cm培养皿)从培养箱取出，去除培养液，轻柔加入PBS洗涤一次，然后加入新的PBS(25mL/培养皿)并使用细胞刮刀将细胞收集在三个50mL管中；400g室温离心10min；去除上清，在每管沉淀中加入10mL盐溶液(150mM NaCl,20m M Tris-HCI)，震荡重悬细胞沉淀后收集在一个50mL管中；配置10％脱氧胆酸钠1.5mL(现配现用，工作浓度0.5％)全部加入30mL细胞悬液中，加入Benzonase核酸酶(工作浓度50U/mL)，37℃水浴裂解2小时；3000g4℃离心15min，取上清用0.45μm滤膜过滤除去细胞碎片；然后将肝素管(提前2小时从冰箱取出置于室温紫外下)连接至50mL注射器，用10mL盐溶液(150mM NaCl，20mM Tris-HCI)预平衡肝素管，需要注意避免管中有气泡；用注射器吸取含有病毒的液体(共30mL)，将注射泵调整为0.7mL/min，开始过柱；病毒过柱结束后，用注射器吸取20mL盐溶液(100mM NaCl，20mM Tris-HCI)漂洗柱子；用5mL注射器吸取1mL盐溶液(200mM NaCl，20mM Tris-HCI)漂洗柱子；再吸取1mL盐溶液(300mM NaCl，20mM Tris-HCI)漂洗柱子；吸取1.5mL(400mM NaCl，20mM Tris-HCI)，3mL(450mM NaCl，20mM Tris-HCI)，1.5mL(500mM NaCl，20mM Tris-HCI)洗脱病毒，将液体收集再15mL管中；0.22μm滤膜过滤病毒后加入Amicon Ultra 4mL过滤器中，2000g 4℃离心2min，直到管内液体少于200μL，3.5mL PBS冲洗2次，分装5μL每管，储存于-80℃；使用real-time quantitative PCR法对病毒滴度进行定量后稀释至大约3-5×10¹²genomes/ml；并且将病毒加入原代神经元或者注射进入小鼠大脑验证其感染效率。

实施例3

原代海马神经元过表达TRPM7的1299-1863位序列的M7CK对于Aβ诱导的突触毒性有显著保护作用。

本发明在体外培养的原代海马神经元培养至第7天时加入AAV2/9-M7CK或者AAV2/9-EGFP，第12天时加入Aβ，48小时后，通过免疫荧光染色技术观察到以synaptophysin和PSD95为标记的突触密度在Aβ组中显著下调，过表达M7CK的Aβ组突触密度得到了显著的恢复(图7)。因此过表达M7CK对于Aβ诱导的突触毒性有保护作用。

本实施例采用的方法如下：

原代海马神经元的培养：取刚出生3天内的小鼠幼崽，迅速剪断头部，剥离脑组织，置于冰上的解剖缓冲液中，在体视镜下将两侧海马组织小心分离出来，并尽量剥离其表面的血细胞；解剖完毕后将海马组织剪碎，避免撕扯；将剪碎的海马组织用解剖缓冲液洗三次；加入胰酶裂解液，37℃5min，期间温和震荡1-2次；解剖缓冲液洗一次；加入含有DNA酶的解离液，并用枪头反复吹打直至无明显组织块；4℃，1500rpm，15min；弃上清，用铺板培养基将沉淀重悬(400μL培养基/对海马)，将细胞悬液加入四孔板底部的玻片上(100μL细胞悬液/直径1.8mm孔，玻片需要预先用基质胶(用缓冲液稀释基质胶1:100)包被处理37℃，1小时)。在恒温培养箱中培养1.5-2小时后，细胞基本完成贴壁，此时加入1mL铺板培养基/孔，两天后换成无血清的培养基，半换液间隔为3-4天。

细胞免疫荧光染色以及神经元突触密度定量：培养在四孔板中(16mm孔，底部铺有细胞爬片)的神经元从培养箱中取出后，弃去培养液，迅速用PBS洗一遍，动作轻柔，然后加入4％PFA 1mL/孔，固定45min；PBS洗三次，5min/次；使用0.2％ PBS-Triton稀释的5％山羊血清室温摇床上封闭2小时，0.2mL/孔；使用封闭液将一抗稀释至所需浓度(synaptophysin，SYSY，101011，1：500；PSD95，SYSY，124003，1：200)，4℃冰箱摇床过夜孵育；PBS洗三次，5min/次；使用0.2％ PBS-Triton稀释的荧光二抗室温摇床孵育2小时；PBS洗三次，5min/次；将细胞爬片从孔底小心用镊子夹出，盖在滴有封片剂(含dapi染料)的玻片上，待封片剂晾干10min后，在爬片周围小心涂上指甲油。晾干。完成体外培养神经元的免疫荧光染色后，将玻片置于共聚焦显微镜下，使用60X油镜(同时数码放大3倍)进行拍摄。拍摄时应将神经元的胞体置于视野的边缘，然后对树突上的synaptophysin或者PSD-95信号进行拍摄，拍摄厚度为7μm，间隔1μm/层即可。计数时选择距离胞体10μm以外的树突上的synaptopphysin/PSD-95puncta数目，将每10μm的树突上的puncta数目作为树突密度。

实施例4

本发明构建的AAV2/9-M7CK腺相关病毒能够有效恢复5XFAD小鼠的学习记忆功能受损，恢复突触密度，降低Aβ水平。

本发明通过小鼠脑立体定位技术将构建的AAV2/9-M7CK病毒注射进入5月龄5XFAD小鼠双侧海马，在6月龄、10月龄、15月龄时通过行为学分析(新物体识别，Y-迷宫，认知墙实验)发现过表达M7CK能够恢复5XFAD小鼠的学习记忆功能受损。

具体步骤如下：

制备AAV2/9-M7CK、AAV2/9-EGFP病毒(作为对照)分别注射进入5月龄的WT以及5XFAD小鼠双侧海马。实验分为4组：WT小鼠给予AAV2/9-EGFP；WT小鼠给予AAV2/9-M7CK；5XFAD小鼠给予AAV2/9-EGFP；5XFAD小鼠给予AAV2/9-M7CK。注射完成一个月后，开始进行行为实验。在6/10/15月龄的行为学实验结束后，将这些小鼠灌流后取脑进行冰冻切片。

海马脑立体定位注射：用2％异氟烷对小鼠进行麻醉；待小鼠成功麻醉后，用耳杆和鼻杆将小鼠脑袋牢牢固定；调节左右以及前后，使小鼠脑背侧处于同一水平面上；对小鼠脑部表面皮肤进行酒精擦拭消毒后用剪刀剪开皮肤，充分暴露头骨，用沾有碘伏的棉签擦去表面血迹；根据小鼠脑图谱中海马的位置，按照以下坐标进行钻孔，左右侧各钻2个孔；

CA1：AP＝-2.06mm，ML＝±1.4mm，DV＝1.4mm；

DG：AP＝-2.06mm，ML＝±1.4mm，DV＝2.0mm；

CA3：AP＝-2.06mm，ML＝±2.25mm，DV＝2.1mm；

钻孔结束后，将注射针缓慢插入对应坐标的脑区，按照1nl/s的速度开始注射，注射病毒的体积为300nl每个点，注射结束后留针10min再缓慢离针；缝合头皮，将小鼠置于温暖的环境中等待其从麻醉中苏醒。

新物体识别实验：实验开始前一周将小鼠由多只一笼分笼为单只一笼饲养，直到实验结束。实验装置由顶部悬挂摄像头的长宽高均为50厘米的无色无味不透明的箱体、连接摄像头的电脑、物体ABC组成；实验第一天上午9:00，将小鼠放入箱体(没有任何物体)中，任其自由探索10min适应环境。放入下一只小鼠之前需要用30％无味稀释洗手液清洁箱体，避免上一只小鼠留下的气味影响下一只小鼠的行为；实验第二天上午9:00，将小鼠再次放入同一箱体(没有物体)，任其自由探索5min；实验第三天上午9:00，在箱体底部等距放入相同的四个物体A，然后将小鼠放入，任其自由探索5min，此时实验者通过顶部摄像头观测并记录每一只小鼠对四个物体的探索次数和时间。第四天上午9:00，将物体A更换为新物体B，将小鼠放入该环境任其探索5min，该时段被称为24小时记忆测试。记忆测试阶段，新物体识别指数＝新物体探索次数/所有物体的探索次数×100％。

认知墙实验：本实验采用Noldus公司的PhenoTyper model 3000装置及全自动的记录分析软件。实验前一天晚上21:00，将小鼠放入PhenoTyper笼中适应11小时，禁食不禁水。上午8:00将给食器与笼子连通，并放入学习盒子，手动给予小鼠约10粒糖豆，然后开启视频跟踪软件，在此过程中，软件会实时跟踪小鼠在学习盒子中的穿梭次数，并根据以下规则给予糖豆奖励。若小鼠连续5次不间断从左洞进入学习盒子则给予一颗糖豆奖励。若小鼠在30次进洞中有24次是从左边洞进入，则可以视为小鼠达到了学会的标准，即80％正确率。根据小鼠在达到80％正确率时所需的进洞次数可以绘制出每组小鼠的学习曲线。实验前后需要对给食器中剩余的糖豆数目进行计数，并与软件自动计算出的给食数目作比较，一遍及时排查是否出现软件或者硬件故障情况。

Y迷宫实验：将小鼠分别放入Y字形迷宫中正中，任其自由探索8min，全程使用摄像头记录视频存档。将小鼠在此过程中进入Y迷宫三个臂(当小鼠后脚完全进入该臂时记为一次)的次序记录下来，小鼠每完成连续不重复地进入三个不同臂记为一个spontaneousalternation(例如ABC/BCA/CAB等)。自发转弯百分比＝连续进入三个不同的臂的组合数/进入臂的总次数-2×100％。该百分比越大说明小鼠的空间记忆能力越好。

小鼠脑片突触密度定量：用2％异氟烷对小鼠进行麻醉；待小鼠进入完全麻醉状态后，将其四肢固定在泡沫板上，剪开胸部皮肤充分暴露心脏，剪开右侧心耳，将注射器针尖插入左心室，先用预冷的20mL生理盐水灌流一次，再用20mL 4％ PFA灌流一次。灌流结束后，将小鼠脑组织小心剥离，泡于4％ PFA过夜后，相继转移至20％和30％的蔗糖溶液中直至脑组织脱水沉入管底；将脱水后的脑组织包埋在OCT包埋剂中，置于冰冻切片机中待其完全凝固于冻头上，开始进行冰冻切片。切片厚度为16μm。切好的脑片保存于PBS中，然后使用毛刷小心地贴在玻片上，室温晾干2-4小时直至切片牢牢粘在玻片上；用免疫组化笔在脑片周围涂封闭的圆圈，并晾干30min；在PBS中洗3次，5min/次；5％山羊血清(在0.2％Triton-PBS中)室温湿盒中封闭2小时；在封闭液中稀释一抗(synaptophysin，SYSY，101011，1：500；PSD95，CST，3450，1：200)，4℃孵育过夜；在PBS中洗3次，5min/次；0.2％Triton-PBS中稀释二抗(1:500)，室温孵育2小时；在PBS中洗3次，5min/次；使用防淬灭封片剂进行封片，并盖上盖玻片，边缘涂上指甲油使其固定；使用激光共聚焦显微镜进行拍摄。完成脑片免疫荧光染色后，将玻片置于共聚焦显微镜下，使用60X镜(同时数码放大3倍)进行拍摄。拍摄厚度为9μm，间隔1μm/层即可。所拍图片中信号最亮的三层合成为一层导出分辨率为1024*1024的tiff格式图片。使用Image Pro Plus对导出的图片进行puncta自动计数：首先对图片应用两次HiGauss增强滤镜；测量图片中大多数的典型puncta面积并设置合适的阈值范围(大于最大阈值的点将被分割；小于最小阈值的点将不被计数)；最后点击测量按钮即可得出该图片中的puncta数目。最后根据标尺计算出每1000μm²所含有的puncta数目作为突触密度指标。

淀粉样斑块免疫组化染色以及定量：将泡在PBS中的小鼠脑切片用毛刷小心地贴在玻片上，晾干2-3小时；在脑片周围用组画笔画圈，晾干半小时；PBS洗三次；使用0.3％PBS-Triton稀释的5％山羊血清室温摇床上封闭2小时，大约40μL/脑片；封闭液稀释的Aβ抗体(CST，9888S，1:1600)4℃过夜孵育；PBS洗三次，每次5min；PBS稀释生物素化的二抗(Vector Laboratories，PK-4000)至1:200，室温孵育30min；PBS洗三次，每次5min；PBS稀释ABC试剂(A试剂1:100；B试剂1:100，提前半小时配置)，室温孵育30min；PBS洗三次，每次5min；加上DAB试剂(现配现用)，观察显色情况(大约5-10min)，流水冲洗终止反应；封片剂封片并用指甲油将边缘固定，使用Olympus vs120显微镜10倍镜明场拍照；将图片导入Image Pro Plus软件，手动圈出海马区域作为目标区域(ROI)，并设置统一的取色标准(保证该取色标准可以覆盖所有Aβ斑块信号)，软件自动计算出Aβ信号所占的面积以及光密度。

AβELISA：可溶部分的Aβ蛋白提取方法与上述用于蛋白质免疫印迹实验的提取方法相同。RIPA裂解离心后的沉淀中加入5M盐酸胍(溶于50mM Tris-HCI，pH8.0)，室温摇床溶解4小时，12000rpm，4℃离心30min，此时几乎看不到沉淀，取上清即可作为不可溶部分；可溶部分的蛋白分别用试剂盒中的稀释缓冲液稀释100倍和50倍用于Aβ1-42和Aβ1-40的检测；不可溶部分的蛋白分别稀释20000倍和2000倍用于Aβ1-42和Aβ1-40的检测；将ELISA试剂盒(Wako，292-62301，298-62401)以及相关液体从4℃冰箱取出恢复室温一段时间；将一系列浓度的标准品以及待测样品分别加入ELISA板中(每个孔中的液体总体积均为100μL)，每个未知样品分别做3个复孔；用封口膜将ELISA板封起来，4℃过夜孵育；弃去ELISA板中的所有液体，然后用漂洗液(200μL/孔)清洗5次。每次清洗都需尽量倾倒干净孔中的液体(在吸水纸上完成拍板)；加入100μL/孔连接HRP的二抗。4℃冰箱孵育1小时；弃去ELISA板中的二抗，然后用漂洗液(200μL/孔)清洗5次；加入100μL/孔TMB溶液(尽量保证所有孔在短时间内完成加样)，室温避光孵育30min；加入终止液终止反应，读取450nm的吸光值(加入终止液后需要在30min内完成读数)；按照标准品浓度和对应的吸光度值绘制标准曲线，从而计算出未知样品中的Aβ1-42和Aβ1-40浓度。

因此，本发明首次观察到阿尔茨海默病患者大脑海马、5XFAD以及APP/PS1小鼠海马存在TRPM7表达减少。由于在小鼠原代海马神经元中，本发明利用AAV2/9-M7CK过表达TRPM7的激酶结构域M7CK对于Aβ诱导的突触毒性有保护作用；本发明还利用脑立体定位注射技术将AAV2/9-M7CK注射进入5XFAD小鼠海马实现海马内M7CK过表达，可以有效增加突触密度，减少淀粉样斑块，改善其学习记忆功能。这些结果显示针对M7CK的基因治疗，可以阻止阿尔茨海默病的进程，对阿尔茨海默病患者的治疗有巨大的应用前景与社会价值。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.TRPM7的激酶结构域M7CK序列在制备阿尔茨海默病治疗药物中的应用，所述M7CK序列为SEQ ID NO .1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括构建能有效过表达TRPM7的1299-1863位序列的M7CK的pAAV2/9-M7CK质粒或病毒，用于制备阿尔茨海默病治疗药物；所述pAAV2/9-M7CK质粒的序列为SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，对于构建的AAV2/9-M7CK病毒进行包装，所述包装为AAV病毒的包装方式。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将包装后的AAV2/9-M7CK病毒试剂采用脑立体定位注射入脑内，具体注射入脑内海马区。

5.一种基于TRPM7的激酶结构域M7CK序列构建的能有效过表达TRPM7的1299-1863位序列的M7CK的pAAV2/9-M7CK质粒或病毒，用于制备阿尔茨海默病治疗药物；所述M7CK序列为SEQ ID NO.1所示，所述pAAV2/9-M7CK质粒的序列为SEQ ID NO.2所示。