CN116784253A - 一种鉴定癫痫动物模型皮层兴奋性异常的方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定癫痫动物模型皮层兴奋性异常的方法和应用，属于动物建模技术领域。本发明提供了一种检测皮层兴奋性异常的方法在检测癫痫动物模型的表型中的应用。本发明在构建得到动物模型后，进一步采用躯体感觉诱发电位的方法来检测其有无皮层兴奋性异常的表型，从而确认模型是否构建成功。本发明可用于皮层兴奋性异常(增高或降低)的检测，亦可用于验证相关药物或治疗的有效性。
Description
技术领域
本发明属于动物建模技术领域，具体涉及一种鉴定癫痫动物模型皮层兴奋性异常的方法和应用。
背景技术
癫痫作为神经系统中常见疾病，其具体的机制研究是神经病学基础研究的重点领域，目前所知动物模型种类众多，涉及C57小鼠、SD大鼠、wister大鼠、斑马鱼等，造模方法多种多样，包括化学点燃、物理点燃、人工外伤、高温诱导等。目前对于癫痫的发生机制所知甚少，甚至不同学者所认为的发病机制还存在显著异质性，因此构建得到的用以解释癫痫形成机制的动物模型种类多样，导致对于构建得到的模型是否能够真实体现癫痫发病机理，尚属未知。
因此，对于构建得到的模型进行检测，属于必要的步骤，但是现有资料中对于癫痫模型是否成功构建，并没有统一的标准。如常见的利用斑马鱼构建的癫痫模型，需要使用斑马鱼行为仪进行检测，根据斑马鱼幼鱼的活动量强度变化反映癫痫程度。又如中国专利CN201910244481.3(一种药物诱导癫痫模型的新方法)中，利用药物诱导后，需要经过脑电图检测动物脑电波、癫痫大鼠行为分级评估、大鼠原代海马神经元体外培养以及细胞给药并应用膜片钳技术进行大鼠原代海马神经元放电功能的测定后，才能确定最终得到的大鼠模型是否为癫痫模型。
已知，电生理信号是评估癫痫发生或皮层兴奋性增高及药物干预有效性的金标准，但是如何对动物模型进行对应的检测，成为了一项亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴定癫痫动物模型皮层兴奋性异常的方法和应用，采用躯体感觉诱发电位(somatosensory evokedpotential，SEP)的方法进一步检测构建动物模型有无皮层兴奋性异常的表型，来确定癫痫动物模型是否构建成功。
本发明提供了一种检测皮层兴奋性异常的方法在检测癫痫动物模型的表型中的应用。
优选的，所述检测皮层兴奋性异常的方法包括躯体感觉诱发电位。
本发明提供了一种癫痫动物模型的表型检测方法，包括以下步骤：将癫痫动物模型俯卧位固定头及四肢，经皮肤电刺激右后肢踝部胫后神经，记录针电极刺入颅顶Cz区皮下，参考针电极刺入鼻上方皮下；
引出的信号经滤波放大后，输入系统，根据输出的体感诱发电位测量波峰潜伏期，评估皮层兴奋性，根据皮层兴奋性确定是否为癫痫模型。
优选的，所述电刺激的参数为恒压方波，波宽0.1ms，频率3Hz，强度以引起后趾微动为度，在背部皮下针头接地。
优选的，将引出的信号经滤波放大后，输入电脑操作系统进行平均叠加，叠加次数1024次，分析时间为56ms，最后显示和打印体感诱发电位图形，测量其波峰潜伏期。
优选的，所述癫痫动物模型包括大鼠癫痫模型或小鼠癫痫模型。
有益效果：本发明提供了一种检测皮层兴奋性异常的方法在检测癫痫动物模型的表型中的应用，采用SEP的方法检测构建动物模型有无皮层兴奋性异常的表型，从而判断是否构建成功。本发明所述检测方法可很好的应用于大鼠或小鼠皮层兴奋性的检测，其检测值可作为抑制皮层兴奋性药物疗效的评价指标。
附图说明
图1为本发明实施例中家系的家系图；
图2为precutpCS-3G质粒图谱；
图3为利用sgRNA制备的RNA电泳结果图，图中sg1指EGE-STY-055-sgRNA1，sg2指EGE-STY-055-sgRNA12；
图4为打靶载体图谱；
图5为EGE-STY-055-L-GT-F/EGE-STY-055-L-GT-R的F0代PCR鉴定结果图；
图6为EGE-STY-055-R-GT-F/EGE-STY-055-R-GT-R的F0代PCR鉴定结果图；
图7为EGE-STY-055-L-GT-F/EGE-STY-055-L-GT-R的F1代PCR鉴定结果图；
图8为EGE-STY-055-R-GT-F/EGE-STY-055-R-GT-R的F1代PCR鉴定结果图；
图9为F1代阳性大鼠Southernblot检测结果图；
图10为正确重组且没有随机插入的阳性F1代小鼠的基因型测序分析结果图；
图11为PKHD1L1 c.2602A>T点突变PKHD1L1+/-大鼠的癫痫易感性研究结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种检测皮层兴奋性异常的方法在检测癫痫动物模型的表型中的应用。
本发明所述检测皮层兴奋性异常的方法优选包括躯体感觉诱发电位(SEP)。本发明对所述癫痫动物模型的具体构建方法和动物类型并没有特殊限定，优选包括大鼠、小鼠或斑马鱼，本发明实施例中以SD大鼠为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明通过一个家族性成人肌阵挛癫痫(FAME)家系的致病性研究，初步证实PKHD1L1基因exon23:c.2602A>T杂合突变为该家系的致病突变，而后利用CRISPR/Cas9系统对PKHD1L1基因敲入exon.23:c.2602A>T点突变，从而构建得到PKHD1L1点突变大鼠。经检测，该家系中的癫痫发作患者电生理检查发现皮质兴奋性增高，抗癫痫药物治疗能有效控制发作，病程呈良性。同时构建得到的PKHD1L1基因点突变大鼠，与体重匹配的野生型大鼠相比，SEP潜伏期显著短，波幅有增高趋势，提示PKHD1L1+/-大鼠皮层兴奋性显著高于野生型大鼠。进一步验证了PKHD1L1+/-大鼠皮层兴奋性增高的特性，能较好的模拟FAME及其他癫痫患者的表型，可进一步应用于癫痫发病机制、新型抗癫痫药物的设计等多种研究场景。
本发明提供了一种癫痫动物模型的表型检测方法，包括以下步骤：将癫痫动物模型俯卧位固定头及四肢，经皮肤电刺激右后肢踝部胫后神经，记录针电极刺入颅顶Cz区皮下，参考针电极刺入鼻上方皮下；
引出的信号经滤波放大后，输入系统，根据输出的体感诱发电位测量波峰潜伏期，评估皮层兴奋性，根据皮层兴奋性确定是否为癫痫模型。
本发明所述电刺激的参数优选为恒压方波，波宽0.1ms，频率3Hz，强度以引起后趾微动为度，在背部皮下针头接地。本发明优选将引出的信号经滤波放大后，输入电脑操作系统进行平均叠加，叠加次数1024次，分析时间为56ms，最后显示和打印体感诱发电位图形，测量其波峰潜伏期。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种鉴定癫痫动物模型皮层兴奋性异常的方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一、致病突变基因的筛查
家系(图1)共五代30人，其中6人发病，均符合常染色体显性遗传特点。所有患者均有肌阵挛伴或不伴全身强直阵挛发作，伴或不伴肢体远端的细微震颤，癫痫发作均为成年起病，电生理检查发现皮质兴奋性增高，抗癫痫药物治疗能有效控制发作，病程呈良性。家系一所有患者均诊断明确，临床表型一致性好。经全基因组外显子测序结合连锁分析发现5名患者(6名患者中1名患者已死亡)都存在PKHD1L1基因exon23:c.2602A>T杂合突变，11名对照均为纯合子，存在共分离现象。
针对PKHD1L1基因在年龄、性别、地域、民族匹配的246例正常人群中进行筛查，发现该突变位点在正常人群中并不存在，从而在遗传学上初步证实PKHD1L1中的该位点为该家系的致病突变。
表1家系一患者临床资料
二、EGE-STY-055基因(Gene ID:314917，本发明使用Pkhd1l1-201转录本ENSRNOT00000005958.7，NM_001034931，简称PKHD1L1基因敲入模式大鼠的制备
1、Cas9/sgRNA设计及构建
1.1Cas9/sgRNA的设计
基于sgRNA的设计原则，在5’靶位点和3’靶位点区域分别设计sgRNA：EGE-STY-055-sgRNA1(SEQ ID No.1)：GGTAGGCTAGACTTTAA
EGE-STY-055-sgRNA12(SEQ ID No.2)：GGAAAGTTGAGTGTTCCA。
1.2Cas9/sgRNA质粒的构建
按照sgRNA序列合成引物，通过退火聚合(65℃5min)的方式连入pCS-3G载体，连接产物(图2)转化后送样测序验证正确。
1.3sgRNA的RNA制备
将EGE-STY-055-sgRNA1和EGE-STY-055-sgRNA12连入带T7启动子质粒载体上并进行体外转录，得到进行显微注射的RNA(图3)。
1.4构建如图4所述的打靶载体。
1.5Cas9/sgRNA的显微注射
将Cas9/sgRNA及打靶载体显微注射到大鼠受精卵中，注射后F0大鼠出生情况如表2所示。
表2F0大鼠出生统计表
1.6F0代大鼠基因型检测
利用引物EGE-STY-055-L-GT-F/EGE-STY-055-L-GT-R(Mut：2662bp，WT：2650bp)以及EGE-STY-055-R-GT-F/EGE-STY-055-R-GT-R(Mut：2697bp，WT：2680bp)进行PCR鉴定，结果如图5和图6所示，通过PCR产物和测序表明，EY55-072和EY55-073等为阳性F0大鼠。
EGE-STY-055-L-GT-F(SEQ ID No.3)：tgcagatgttgtgagaaaagcaagaca
EGE-STY-055-L-GT-R(SEQ ID No.4)：ccagtcttgatgttttatagatacttcccc
EGE-STY-055-R-GT-F(SEQ ID No.5)：tccaatccatttatgtggatgccgtgt
EGE-STY-055-R-GT-R(SEQ ID No.6)：aggatgcttgaatctttcttctaagggg
RCR鉴定的程序：94℃预变性2min；98℃变性10s，67℃退火30s，68℃延伸1kb/min，15循环，每循环退火温度-0.7℃；98℃变性10s，57℃退火30s，68℃延伸1kb/min，25循环；68℃延伸10min。
1.7F1代大鼠基因型及Southern blot鉴定
选择F0代鼠尾基因型鉴定结果中阳性大鼠与野生型交配获得具有稳定基因型的F1代大鼠，交配结果如表3所示。
表3交配结果统计
1.7.1F1代基因型鉴定(引物设计如F0所示)：
引物设计原则与F0代基因型鉴定方法一样，部分鉴定结果如图7和图8所示，通过PCR鉴定和点突变位点测序结果，表明1EY55-025、1EY55-027、1EY55-029、1EY55-030、1EY55-031、1EY55-032、1EY55-034、1EY55-035、1EY55-036、1EY55-037和1EY55-038为F1代PCR阳性大鼠。
1.7.2F1代阳性大鼠Southernblot检测
提取上述PCR鉴定为阳性的F1代大鼠鼠尾DNA进行Southernblot以及测序检测，检测结果如图9所示，1EY55-025、1EY55-027、1EY55-029、1EY55-030、1EY55-031、1EY55-032、1EY55-034、1EY55-036、1EY55-037和1EY55-038为正确重组，且没有随机插入。
1.7.3对正确重组且没有随机插入的阳性F1代小鼠进行基因型分析
利用引物EGE-STY-055-R-GT-F和EGE-STY-055-L-GT-R进行PCR验证，并测序，结果如图10所示，mut/mut为纯合，mut/+为杂合，+/+为野生型。
三、对构建得到的PKHD1L1点突变大鼠的癫痫行为表型分析
首先取3只雄性PKHD1L1点突变杂合子(PKHD1L1+/-)大鼠进行连续5天的记录观察自发癫痫，然而，没有观察到自发癫痫行为的发生。
随后，采用PTZ致痫模型，研究PKHD1L1+/-大鼠的癫痫易感性研究：各取10只雄性PKHD1L1+/-大鼠与周龄体重匹配的野生型(WT)大鼠，采用低于常规造模剂量的PTZ(40mg/kg)进行诱发癫痫发作，结果发现10只野生型大鼠中只有2只(20％)，而10只PKHD1L1+/-大鼠中却有7只(70％)被诱发出了4-5级的癫痫大发作，其达到的最大癫痫等级也显著高于WT组(见图11)。进一步的，在未达到4-5级的大鼠中追加注射PTZ(5mg/kg，每15分钟间隔)抑制达到发生癫痫大发作，统计发现WT所需PTZ的平均剂量也显著高于PKHD1L1+/-大鼠所需要的剂量。说明依据FAME家系基因组学发现的PKHD1L1c.2602A>T点突变构建的PKHD1L1+/-大鼠具有癫痫发作易感的特征。
四、对构建得到的PKHD1L1+/-大鼠，采用SEP的方法进一步检测其有无皮层兴奋性异常的表型。
具体方法如下：
将PKHD1L1+/-大鼠俯卧位固定头及四肢，经皮肤电刺激右后肢踝部胫后神经，刺激参数为恒压方波，波宽0.1ms，频率3Hz，强度以引起后趾微动为度，在背部皮下针头接地。记录针电极刺入颅顶Cz区皮下，参考针电极刺入鼻上方皮下。引出的信号经滤波放大后，输入电脑操作系统进行平均叠加，叠加次数1024次，分析时间为56ms，最后显示和打印体感诱发电位图形，测量其波峰潜伏期。各波以其极性和出现顺序命名如P1，P2，......N1，N2，其中P为正向波，N为负向波，数字表示出现波的顺序的编号。
结果如表4所示，PKHD1L1+/-大鼠组(MU)与体重匹配的野生型大鼠组组(WT)相比，SEP潜伏期显著短(10.17±1.17vs 12.32±1.65，P＝0.0071)，波幅有增高趋势(3.95±1.72vs 2.87±1.6，P＝0.1794)，提示PKHD1L1+/-大鼠皮层兴奋性显著高于野生型大鼠。进一步验证了PKHD1L1+/-大鼠皮层兴奋性增高的特性，能较好的模拟FAME及其他癫痫患者的表型。该大鼠模型可进一步应用于癫痫发病机制、新型抗癫痫药物的设计等多种研究场景。
表4WT组与MU组的SEP潜伏期与波幅值
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (6)
1.一种检测皮层兴奋性异常的方法在检测癫痫动物模型的表型中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述检测皮层兴奋性异常的方法包括躯体感觉诱发电位。
3.一种癫痫动物模型的表型检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将癫痫动物模型俯卧位固定头及四肢，经皮肤电刺激右后肢踝部胫后神经，记录针电极刺入颅顶Cz区皮下，参考针电极刺入鼻上方皮下；
引出的信号经滤波放大后，输入系统，根据输出的体感诱发电位测量波峰潜伏期，评估皮层兴奋性，根据皮层兴奋性确定是否为癫痫模型。
4.根据权利要求3所述表型检测方法，其特征在于，所述电刺激的参数为恒压方波，波宽0.1ms，频率3Hz，强度以引起后趾微动为度，在背部皮下针头接地。
5.根据权利要求3所述表型检测方法，其特征在于，将引出的信号经滤波放大后，输入电脑操作系统进行平均叠加，叠加次数1024次，分析时间为56ms，最后显示和打印体感诱发电位图形，测量其波峰潜伏期。
6.根据权利要求3所述表型检测方法，其特征在于，所述癫痫动物模型包括大鼠癫痫模型或小鼠癫痫模型。
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-
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