CN116782920A - 用于治疗病毒感染的神经毡蛋白和血管紧张素转化酶2融合肽 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及融合蛋白组合物以及减少和治疗病毒感染的和方法。所述融合蛋白包括：多肽，所述多肽包含神经毡蛋白的bl结构域或bl结构域的衍生物或片段；血管紧张素转化酶2的ACE2结构域或ACE2结构域的衍生物或片段；和/或免疫球蛋白结构域。bl结构域和ACE2结构域都能够结合至病毒的外壳蛋白，所述病毒选自由以下组成的组：疱疹病毒科(herpesviridae)、乳头瘤病毒科(papillomaviridae)、冠状病毒科(coronaviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、披膜病毒科(togaviridae)、博纳病毒科(bornaviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、丝状病毒科(filoviridae)、正黏病毒科(orthomyxoviridae)、副黏病毒科(paramyxoviridae)、肺病毒科(pneumoviridae)和逆转录病毒科(retroviridae)。在一些实施方式中，bl结构域或其衍生物或片段和/或(ACE2)结构域可用于特异性结合COVID‑19颗粒的S蛋白。

Description

用于治疗病毒感染的神经毡蛋白和血管紧张素转化酶2融 合肽
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年7月31日提交的美国临时申请第63/059915号的权益和优先权，其公开内容的全文通过引用并入本文。
序列
本申请通过引用并入标题为“268824-494885_ST25.txt”(980KB)的序列表全文，所述序列表于2021年7月30日下午12:21创建，并以电子方式随本申请提交。
技术领域
本公开涉及融合蛋白组合物以及减少和治疗病毒感染的方法，更具体而言，涉及多肽，所述多肽包括神经毡蛋白1(神经毡蛋白-1，NRP1)结构域、神经毡蛋白2(NRP2)结构域和血管紧张素转化酶2(ACE2)结构域和/或免疫球蛋白结构域的组合，可用于特异性结合病毒颗粒的外壳蛋白，如COVID-19病毒的S蛋白。
背景技术
2019年，冠状病毒病(COVID-19)是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severeacute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)引起的一种传染病。截至2020年7月27日，188个国家和地区报告了超过1610万例病例，导致超过64.7万人死亡。
常见症状包括发烧、咳嗽、疲劳、呼吸短促、嗅觉丧失和味觉丧失。虽然大多数病例症状轻微，但一些病例发展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distresssyndrome，ARDS)，这可能是由细胞因子风暴、多器官衰竭、感染性休克和血栓引起的。从接触到出现症状的时间通常为5天左右，但可为2到14天。
病毒主要在人与人之间的密切接触中传播，最常见的是通过咳嗽、打喷嚏和讲话产生的小飞沫传播。飞沫通常会落到地面或表面，而不会在空气中长距离传播。传播也可能通过能够在空气中停留更长时间的较小飞沫发生。不太常见的情况是，人们可通过触摸受污染的表面，然后触摸他们的脸而感染。所述病毒在症状出现后前3天内最具传染性，尽管在症状出现之前也可会传播，没有症状的人也可传播。标准的诊断方法通过鼻咽拭子的实时逆转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription polymerase chainreaction，rRT-PCR)进行。
目前，没有针对COVID-19的疫苗或特定抗病毒治疗。管理包括症状治疗、支持性护理、隔离和实验措施。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)于2020年1月30日宣布，COVID-19疫情为国际关注的突发公共卫生事件，于2020年3月11日宣布COVID-19为大规模流行的疾病。
发明内容
在一些方面，本公开提供一种多肽，所述多肽包含：神经毡蛋白的b1结构域或b1结构域的衍生物或片段；和免疫球蛋白结构域，其中，所述b1结构域能够结合至选自由以下组成的组病毒的外壳蛋白：疱疹病毒科(herpesviridae)、乳头瘤病毒科(papillomaviridae)、冠状病毒科(coronaviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、披膜病毒科(togaviridae)、博纳病毒科(bornaviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、丝状病毒科(filoviridae)、正黏病毒科(orthomyxoviridae)、副黏病毒科(paramyxoviridae)、肺病毒科(pneumoviridae)和逆转录病毒科(retroviridae)。
在其他方面，本公开提供一种多肽，所述多肽包含：血管紧张素转化酶2的ACE2结构域或其衍生物或片段；和免疫球蛋白结构域，其中，所述ACE2结构域能够结合选自由以下组成的组病毒的外壳蛋白：疱疹病毒科、乳头瘤病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、披膜病毒科、博纳病毒科、布尼亚病毒科、丝状病毒科、正黏病毒科、副黏病毒科、肺病毒科和逆转录病毒科。
在仍其他方面，本公开提供一种多肽，所述多肽包含：神经毡蛋白b1结构域或其衍生物或片段；和血管紧张素转化酶2的ACE2结构域或其衍生物或片段，其中，所述b1结构域和ACE2结构域各自能够与选自由以下组成的组的病毒的外壳蛋白结合：疱疹病毒科、乳头瘤病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、披膜病毒科、博纳病毒科、布尼亚病毒科、丝状病毒科、正黏病毒科、副黏病毒科、肺病毒科和逆转录病毒科。
在还其他方面，本公开提供一种多肽，所述多肽包含：神经毡蛋白b1结构域或其衍生物或片段；血管紧张素转化酶2的ACE2结构域或其衍生物或片段；和免疫球蛋白结构域，其中，所述b1结构域和ACE2结构域各自能够结合至选自由以下组成的组的病毒的外壳蛋白：疱疹病毒科、乳头瘤病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、披膜病毒科、博纳病毒科(、布尼亚病毒科、丝状病毒科、正黏病毒科、副黏病毒科、肺病毒科和逆转录病毒科。
本发明这些方面的实施方式涉及多肽，所述多肽包含两个或更多个结构域的组合，所述两个或更多个结构域包括：神经毡蛋白的b1结构域或其衍生物或片段；血管紧张素转化酶2的ACE2结构域或其衍生物或片段；和免疫球蛋白结构域，可以包括一个或多个以下任选的特征。在一些实施方式中，b1结构域或其衍生物或片段包含SEQ ID NO:SEQ ID NO:3(NRP1 b1)或SEQ ID NO:11(NRP2b1)的氨基酸序列。在一些实施方式中，b1结构域或其衍生物或片段包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方式中，多肽能够结合冠状病毒科病毒的外壳蛋白。在一些实施方式中，多肽能够结合COVID-19的外壳蛋白。在一些实施方式中，外壳蛋白是COVID-19的S蛋白。在一些实施方式中，与未突变的b1结构域相比，b1结构域或其衍生物或片段包含增加对COVID-19的S蛋白的亲和力的突变。在一些实施方式中，b1结构域或其衍生物或片段在选自由E319和K351组成的组的位置处。在一些实施方式中，b1结构域包含SEQ ID NO:SEQ ID NO.4(NRP1 b1 E319A)和SEQ ID NO.5(NRP1 b1K351A)中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，多肽包含多个b1结构域或其衍生物或片段。在一些实施方式中，b1结构域或其衍生物或片段进一步包含接头、神经毡蛋白的b2结构域或其组合。在一些实施方式中，b1结构域或其衍生物或片段选自由SEQ ID NO:SEQ ID NO:7-SEQ IDNO:14组成的组。在一些实施方式中，ACE2结构域或其衍生物或片段包含选自由SEQ ID NO:SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39组成的组的序列。在一些实施方式中，多肽包含多个ACE2结构域或其衍生物或片段。在一些实施方式中，ACE2结构域在选自由F28、D30和L79组成的组的位置处包含突变。在一些实施方式中，ACE2结构域、其衍生物或片段包含SEQ ID NO:40-SEQID NO:43的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽还包括位于b1结构域和ACE2结构域之间的接头。在一些实施方式中，接头选自由SEQ ID NO:44-40组成的组。在一些实施方式中，免疫球蛋白结构域包含Fc结构域。在一些实施方式中，免疫球蛋白结构域基本上由Fc结构域组成。在一些实施方式中，与野生型Fc结构域相比，Fc结构域包含降低ADCC的突变。在一些实施方式中，所述突变位于如通过KABAT编号所确定的第N297位。在一些实施方式中，与野生型Fc结构相比较，Fc结构域包含一个或多个增加对FcRn的亲和力的突变。在一些实施方式中，突变位于选自由如通过KABAT编号所确定的T307、E380和N434或其组合组成的组的位置。在一些实施方式中，与野生型Fc结构域相比，Fc结构域包含降低对Fcγ受体亚型的亲和力的突变。在一些实施方式中，突变位于选自由如通过KABAT编号所确定的L324和L325或其组合组成的组的位置。在一些实施方式中，Fc结构域选自由人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4和人IgA组成的组。在一些实施方式中，Fc结构域包含选自由SEQ ID NO:23-31组成的组的氨基酸序列。在一些实施方式中，Fc结构域序列包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在一些实施方式中，多肽具有选自由以下组成的组的构型：(b1)、IgG1 WT、ACE2-1多肽；(b1b2)、IgG1(T307A/E380A/N434A)、ACE2-2多肽；(b1b1)-(G4S)*2-(b1b1)、IgG1(N297A)、ACE2-3多肽；(b1b2)-(G4S)*2-(b1b2)、IgG1(L324A/L325A)、ACE2-4多肽；具有b1(E319A)的(b1b2)-(G4S)*2-(b1b2)、IgG1(N297A/T307A/E380A/N434A)、ACE2-5多肽；和具有b1(K351A)的(b1b2)-(G4S)*2-(b1b2)、IgG1(L324A/L325A/T307A/E380A/N434A)、ACE2-6多肽。在一些实施方式中，多肽包含选自由SEQ ID NO:88-110组成的组的氨基酸序列。在一些实施方式中，b1结构域连接到Fc结构域的C-末端。在一些实施方式中，b1结构域连接到Fc结构域的N-末端。在一些实施方式中，ACE2结构域连接到Fc结构域的C-末端。在一些实施方式中，ACE2结构域连接到Fc结构域的N-末端。在一些实施方式中，多肽进一步包含信号肽。在一些实施方式中，信号肽包含SEQ ID NO:51。
在一些方面，本公开提供一种制备本文公开的多肽的方法，所述方法包括在宿主细胞中重组表达编码多肽的核酸载体。
在一些方面，本公开提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的多肽和药学上可接受的赋形剂。
在一些方面，本公开提供一种减少COVID感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文公开的多肽。
在一些方面，本公开提供一种治疗患有COVID感染的受试者的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文公开的多肽。
在一些方面，本公开提供一种预防COVID感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文公开的多肽。
在一些方面，本公开提供一种减少COVID感染症状的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文公开的多肽。
在一些方面，本公开提供一种减少COVID感染传播的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文公开的多肽。
此外，本公开描述一种重组多肽，其包含：(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)结构域或其片段，和(b)免疫球蛋白结构域；其中，相对于野生型NRP结构域，所述一个或多个突变NRP结构引起重组多肽与肝素或硫酸乙酰肝素的结合降低。
此外，本公开描述一种重组多肽，其包含：(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域、NRP b2结构域、或其片段，以及(b)Fc结构域；其中，一个或多个突变NRP b1结构域、NRP b2结构域、或其片段源自NRP1蛋白或NRP2蛋白；其中，一个或多个突变NRP b1结构域、NRP b2结构域、或其片段相对于SEQ ID NO:1中所示的野生型氨基酸序列，具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基取代：K373E、K351A、E319A、K358E、R513E、K514E、K516E、R513A、K514A、K516A、Y297A、S345A和Y353A；并且其中一个或多个氨基取代引起所述重组多肽与肝素或硫酸乙酰肝素的结合降低。
此外，本公开描述一种重组多肽，其包含：(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域(b1)、NRP b2结构域(b2)、或其片段；和(b)Fc结构域；其中(a)和(b)包含具有以下取向的构建体：b1-Fc；b1b1-Fc；b1b1b1-Fc；b1 Fc；b1b1b1-Fc；b1b2 Fc；b1b2 Fc；b1b2 Fc；b1b2 Fc；Fc-b1b2；Fc-b1b2；b1-Fc-b1；b1b1-Fc-b1；b1 Fc；b1b1-Fc；b1b1b1-Fc；b1 Fc；b1b1b1-Fc；b1 Fc；b1b1b1-Fc；b1b2Fc；b1b2 Fc；Fc-b1b2；Fc-b1b2；b1-Fc-b1；b1b1-Fc-b1；其中，所述一个或多个b1、b2、或其片段源自NRP1蛋白或NRP2蛋白；其中，相对于SEQ ID NO:1中所述的野生型氨基酸序列，所述一个或多个b1、b2、或其片段具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：K373E、K351A、E319A、K358E、R513E、K514E、K516E、R513A、K514A、K516A、Y297A、S345A和Y353A；并且其中所述一个或多个氨基取代引起所述重组多肽与肝素或硫酸乙酰肝素的结合降低。
此外，本公开描述一种重组多肽，其包含：(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)结构域或其片段；和(b)免疫球蛋白结构域；其中，所述重组多肽可操作地结合至具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，且X1和X2是任何氨基酸。
此外，本公开描述一种重组多肽，其包含：(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域(b1)、NRP b2结构域(b2)、或其片段；和(b)Fc结构域；其中所述一个或多个b1、b2、或其片段源自NRP1蛋白或NRP2蛋白；其中，所述重组多肽可操作地结合至具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，且X1和X2是任何氨基酸；并且其中所述病毒选自由以下组成的组：登革热(Dengue)；呼吸道合胞病毒(respiratory syncytialvirus，RSV)；汉坦病毒(Hantavirus)；EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)；EBV(未切割)；SARS-CoV-2 Wuhan；SARS-CoV-2 Wuhan(未切割)；SARS-CoV-2 UK；SARS-CoV-2 India；SARS-CoV-2 India(未切割)；HCoV-OC43；MERS-CoV；MERS-CoV(未切割)；单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)1；HSV 1(未切割)；甲型H5N1流感病毒(influenza A H5N1virus，IAV H5N1)；人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)；人偏肺病毒(HumanMetapneumovirus)和人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)。
此外，本公开描述一种重组多肽，其包含：(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域(b1)、NRP b2结构域(b2)、或其片段；和(b)Fc结构域；其中，所述一个或多个b1、b2或其片段源自NRP1蛋白或NRP2蛋白；其中所述重组多肽可操作地结合至具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，且X1和X2是任何氨基酸；并且其中所述病毒具有选自由以下组成的组的CendR基序：GTCTQSGERRREKR；KNTNVTLSKKRKRR；LTHKMIEESHRLRR ； VSFKPPPPPSRRRR ；VSFKPPPPPSRRRRGACVVY； CASYQTQTNSPRRAR；CASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLG；ASYQTQTNSHRRAR；ASYQTQTNSRRRAR；ASYQTQTNSRRRARSVASQSIIAY；GSGYCVDYSKNRRSR；LLEPVSISTGSRSAR；LLEPVSISTGSRSARSAIEDLLFDK；ERPRAPARSASRPRR；ERPRAPARSASRPRRPV；VLATGLRNVPQRKKR；PTTSSTSTTAKRKKR；IDMLKARVKNRVAR；AKRRVVQREKR；和AKRRVVQREKRAVGIGALFLG。
此外，本公开描述一种重组多肽或其药学上可接受的盐，所述重组多肽包含与SEQID NO:113-116、SEQ ID NO:121-122、SEQ ID NO:133-137、SEQ ID NO:148-149、SEQ IDNO:154、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:193-201中任一者所示的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
此外，本公开描述一种重组多肽或其药学上可接受的盐，所述重组多肽由与SEQID NO:113-116、SEQ ID NO:121-122、SEQ ID NO:133-137、SEQ ID NO:148-149、SEQ IDNO:154、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:193-201中任一者所示的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列组成。
此外，本公开描述一种重组多肽或其药学上可接受的盐，所述重组多肽由SEQ IDNO:113-116、SEQ ID NO:121-122、SEQ ID NO:133-137、SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:193-201中任一者所示的氨基酸序列组成。
此外，本公开描述在有需要的受试者中限制病毒感染发生、降低病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述组合物包括：(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)结构域或其片段，以及(b)免疫球蛋白结构域；其中，所述重组多肽可操作地结合至具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，且X1和X2是任何氨基酸。
此外，本公开描述一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、降低病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述组合物包括：(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域(b1)、NRP b2结构域(b2)、或其片段；和(b)Fc结构域；其中，所述一个或多个b1、b2、或其片段源自NRP1蛋白或NRP2蛋白；其中，所述重组多肽可操作地结合至具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，且X1和X2是任何氨基酸；且其中所述病毒选自由以下组成的组：登革热；呼吸道合胞病毒(RSV)；汉坦病毒；EB病毒(EBV)；EBV(未切割)；SARS-CoV-2 Wuhan；SARS-CoV-2 Wuhan(未切割)；SARS-CoV-2UK；SARS-CoV-2 India；SARS-CoV-2 India(未切割)；HCoV-OC43；MERS-CoV；MERS-CoV(未切割)；单纯疱疹病毒(HSV)1；HSV 1(未切割)；甲型H5N1流感病毒(IAV H5N1)；人乳头瘤病毒(HPV)；人偏肺病毒和人类免疫缺陷病毒(HIV)。
此外，本公开描述一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、降低病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述组合物包括：(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域(bl)、NRP b2结构域(b2)、或其片段；和(b)Fc结构域；其中，所述一个或多个b1、b2、或其片段源自NRP1或NRP2蛋白；其中，所述重组多肽可操作地结合至具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，且X1和X2是任何氨基酸；并且其中所述病毒具有选自由以下组成的组的CendR基序：GTCTQSGERRREKR；KNTNVTLSKKRKRR；LTHKMIEESHRLRR；VSFKPPPPPSRRRR；VSFKPPPPPSRRRRGACVVY；CASYQTQTNSPRRAR；CASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLG；ASYQTQTNSHRRAR；ASYQTQTNSRRRAR；ASYQTQTNSRRRARSVASQSIIAY；GSGYCVDYSKNRRSR；LLEPVSISTGSRSAR；LLEPVSISTGSRSARSAIEDLLFDK；ERPRAPARSASRPRR；ERPRAPARSASRPRRPV；VLATGLRNVPQRKKR；PTTSSTSTTAKRKKR；IDMLKARVKNRVAR；AKRRVVQREKR；和AKRRVVQREKRAVGIGALFLG。
此外，本公开描述一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、减少病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述重组多肽包含与SEQ ID NO:113-116、SEQ ID NO:121-122、SEQ ID NO:133-137、SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:154、SEQID NO:162和SEQ ID NO:193-201中任一者所示的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，所述氨基酸序列至少等同于。
此外，本公开描述一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、减少病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述重组多肽由与EQ ID NO:113-116、SEQ ID NO:121-122、SEQ ID NO:133-137、SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:154、SEQID NO:162和SEQ ID NO:193-201中任一者所示的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列组成。
此外，本公开描述一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、减少病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述重组多肽由SEQ ID NO:113-116、SEQ ID NO:121-122、SEQ ID NO:133-137、SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:154、SEQ IDNO:162和SEQ ID NO:193-201中任一者所示的氨基酸序列组成。
此外，本公开描述一种重组多肽或其药学上可接受的盐，其包含氨基酸序列，并进一步包含赋形剂，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:113-116、SEQ ID NO:121-122、SEQ ID NO:133-137、SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:193-201中任一者所示的氨基酸序列至少90％相同。
此外，本公开描述一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、减少病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的本发明重组多肽的组合物，其中所述病毒是属于以下科的病毒：星状病毒科(Astroviridae)；布尼亚病毒科(Bunyaviridae)；博纳病毒科(Bornaviridae)；楚病毒科(Chuviridae)；冠状病毒科(Coronaviridae)；黄病毒科(Flaviviridae)；丝状病毒科(Filoviridae)；汉坦病毒科(Hantaviridae)；戊肝病毒科(Hepeviridae)；疱疹病毒科(Herpesviridae)；内罗病毒科(Nairoviridae)；正黏病毒科(Orthomyxoviridae)；乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)；副黏病毒科(Paramyxoviridae)；泛布尼亚病毒科(Peribunyaviridae)；白纤病毒科(Phenuiviridae)；肺病毒科(Pneumoviridae)；痘病毒科(Poxviridae)；逆转录病毒科(Retroviridae)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)或披膜病毒科(Togaviridae)。
此外，本公开描述一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、减少病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的本发明重组多肽的组合物，其中所述病毒选自由以下组成的组：登革热；呼吸道合胞病毒(RSV)；汉坦病毒；EB病毒(EBV)；EBV(未切割)；HCoV-OC43；MERS-CoV；MERS-CoV(未切割)；单纯疱疹病毒(HSV)1；HSV 1(未切割)；甲型H5N1流感病毒(IAV H5N1)；人乳头瘤病毒(HPV)；人偏肺病毒和人免疫缺陷病毒(HIV)。
此外，本公开描述一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、减少病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的本发明重组多肽的组合物，其中所述病毒具有选自由以下组成的组的CendR基序：GTCTQSGERRREKR ； KNTNVTLSKKRKRR ；LTHKMIEESHRLRR ； VSFKPPPPPSRRRR ；VSFKPPPPPSRRRRGACVVY； CASYQTQTNSPRRAR；CASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLG；ASYQTQTNSHRRAR；ASYQTQTNSRRRAR；ASYQTQTNSRRRARSVASQSIIAY；GSGYCVDYSKNRRSR；LLEPVSISTGSRSAR；LLEPVSISTGSRSARSAIEDLLFDK；ERPRAPARSASRPRR；ERPRAPARSASRPRRPV；VLATGLRNVPQRKKR；PTTSSTSTTAKRKKR；IDMLKARVKNRVAR；AKRRVVQREKR；和AKRRVVQREKRAVGIGALFLG。
此外，本公开描述一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、降低病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述组合物包括：(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域(b1)、NRP b2结构域(b2)、或其片段；和(b)Fc结构域；其中，所述一个或多个b1、b2、或其片段源自NRP1蛋白或NRP2蛋白；其中，所述重组多肽可操作地结合至具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，且X1和X2是任何氨基酸；且其中所述病毒选自由以下组成的组：登革热；呼吸道合胞病毒(RSV)；汉坦病毒；EB病毒(EBV)；EBV(未切割)；HCoV-OC43；MERS-CoV；MERS-CoV(未切割)；单纯疱疹病毒(HSV)1；HSV 1(未切割)；甲型H5N1流感病毒(IAV H5N1)；人乳头瘤病毒(HPV)；人偏肺病毒和人免疫缺陷病毒(HIV)。
此外，本公开描述一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、降低病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述组合物包括：(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域(b1)、NRP b2结构域(b2)、或其片段；和(b)Fc结构域；其中，所述一个或多个b1、b2、或其片段源自NRP1或NRP2蛋白；其中，所述重组多肽可操作地结合至具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，且X1和X2是任何氨基酸；且其中，所述病毒具有选自由以下组成的组的CendR基序：GTCTQSGERRREKR；KNTNVTLSKKRKRR；LTHKMIEESHRLRR ； VSFKPPPPPSRRRR ；VSFKPPPPPSRRRRGACVVY；CASYQTQTNSPRRAR；CASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLG；ASYQTQTNSHRRAR；ASYQTQTNSRRRAR；ASYQTQTNSRRRARSVASQSIIAY；GSGYCVDYSKNRRSR；LLEPVSISTGSRSAR；LLEPVSISTGSRSARSAIEDLLFDK；ERPRAPARSASRPRR；ERPRAPARSASRPRRPV；VLATGLRNVPQRKKR；PTTSSTSTTAKRKKR；IDMLKARVKNRVAR；AKRRVVQREKR；和AKRRVVQREKRAVGIGALFLG。
此外，本公开描述一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、降低病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的本发明重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，其中所述病毒不是SARS-CoV-2。
此外，本公开描述一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、降低病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的本发明重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，其中所述病毒不是SARS-CoV-2Wuhan；SARS-CoV-2 Wuhan(未切割)；SARS-CoV-2 UK；SARS-CoV-2 India或SARS-CoV-2India(未切割)。
此外，本公开描述一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、降低病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的本发明重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，其中所述病毒是不属于冠状病毒科(Coronaviridae)病毒。
此外，本公开描述一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、降低病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的本发明重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，其中所述病毒是不属于Betacoronavirus属的病毒。
此外，本公开描述一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、降低病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的本发明重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，其中所述病毒是不属于Sarbecovirus亚属的病毒。
附图说明
以下附图作为示例提供，并不旨在限制本发明的范围。
图1A的示意图除了示出SARS-CoV-2刺突蛋白结合并允许病毒进入的机制之外，还示出ACE2受体和功能。
图1B的示意图示出SARS-CoV-2病毒颗粒的抗体中和。
图1C是SARS-CoV-1和SARS-CoV-2进入位点以及相应症状和感染组织的比较图。
图2A的示意图示出用于中和SARS-CoV-2病毒的多肽。
图2B的示意图示出具有sNRP1(b1)、sACE2(ACE2)、接头和免疫球蛋白(Fc)结构域的多肽，可以有效地结合一种或多种SARS-CoV-2病毒颗粒。
图2C表示SARS-CoV-2病毒刺突蛋白上的Furin切割位点，其相应地结合b1 NRP1结合区。
图3A的示意图示出使用NRP1和/或ACE2受体的SARS-CoV-2胞饮感染。
图3B示出抗体构建体如何中和并调理SARS-CoV-2病毒。
图3C是针对SARS-CoV-2治疗的当前疫苗和/或治疗性多肽治疗的拟议机制。
图3D是SARS-CoV-2治疗中公开的多肽疗法的拟议机制。
图4提供了本发明中公开的示例性N1-Fc多肽构建体的示意图。
图5提供了本发明中公开的示例性N1-Fc-ACE2多肽构建体的示意图。
图6是对应于结合S1/S2刺突蛋白(A)的ACE2肽和结合hu-b1b2-His(B)的S蛋白CendR的孔的相对荧光单位(RFU)的图。
图7是使用相对荧光单位(RFU)测定的HuN1abHuIgG与SARS-CoV-2刺突蛋白结合的图。
图8描绘了示出接种了51个SARS-CoV-2斑块形成单位(plaqueforming unit,PFU)的仓鼠的平均每日体重的图。三组包括：无病毒对照；接种51 PFU的仓鼠；和接种51PFU并用15mg/kg的化合物1(SEQ ID NO:122)腹膜内注射处理的仓鼠。误差条显示标准偏差(standard deviation，SD)。
图9描绘了图示出接种了510个SARS-CoV-2斑块形成单位PFU的仓鼠的平均日体重的图。三组包括：无病毒对照；接种510PFU的仓鼠；和接种510PFU并用15mg/kg的化合物1(SEQ ID NO:122)或SAD-S35腹膜内注射处理的仓鼠。误差条显示标准偏差(SD)。
图10描绘呼吸周期的图示，显示用于计算呼吸参数的各测量值，以供本研究中各组之间的比较。描述单个呼吸周期，显示用于计算(增强暂停)Penh呼吸参数的各测量值。此图中，PEF是呼吸的峰值呼气流量(peak expiratory flow)；PIF是呼吸的峰值吸气流量(peak inspiratory flow)；Te是呼吸的呼气部分时间；Tr是呼出65％呼吸量所需的时间。
图11描绘呼吸循环的单次呼气部分，显示相对于呼气总时间Te的峰值呼气流量时间。
图12描绘呼吸循环的单次呼气部分，显示呼出50％总呼气量的时间。
图13描述51PFU治疗组中仓鼠的体积描记数据的Log Penh结果。数据以平均值+一个标准误差表示。
图14描绘510PFU治疗组中仓鼠的体积描记数据的Log Penh结果。数据以平均值+一个标准误差表示。
图15描绘51PFU治疗组中仓鼠的体积描记数据的自然对数(ln)Penh结果。数据以平均值+一个标准误差表示。
图16描述510PFU治疗组中仓鼠的体积描记数据的In Penh结果。数据以平均值+一个标准误差表示。
图17描绘了51PFU治疗组中仓鼠的体积描记数据的平方根EF50结果。数据以平均值+一个标准误差表示。
图18描绘了510PFU治疗组中仓鼠的体积描记数据的平方根EF50结果。数据以平均值+一个标准误差表示。
图19是从用H&E染色的石蜡组织切片的放大倍数为4X的显微照片，所述切片获自属于培养基接种对照组的仓鼠。无炎症。红色尺寸条＝150μM。
图20是用H&E染色的石蜡组织切片的放大倍数为4X的显微照片，所述切片获自51PFU处理的臂中的仓鼠。存在由巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞和中性粒细胞组成的几个慢性活动性炎症区域；参见例如放大40倍的插图(A)。红色尺寸条＝150μM，40X，且绿色尺寸条为50μM。
图21是用H&E染色的石蜡组织切片的放大倍数为4X的显微照片，所述切片得自属于510PFU SARS-CoV-2接种对照组的仓鼠。存在由巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞和中性粒细胞组成的几个慢性活动性炎症区域；例如，请参见放大40倍的插图(A)。红色尺寸条＝150μM，40X，绿色尺寸条为50μM。
图22是用H&E染色的石蜡组织切片的放大倍数为4X的显微照片，所述切片得自通过腹膜内注射用51PFU和SEQ ID NO:122(15mg/kg)处理的仓鼠。红色尺寸条＝150μM，40X，绿色尺寸条为50μM。
图23是用H&E染色的石蜡组织切片的放大倍数为4X的显微照片，所述切片得自通过腹膜内注射用510PFU和SEQ ID NO:122(15mg/kg)处理的仓鼠。红色尺寸条＝150μM，40X，绿色尺寸条为50μM。
图24是用H&E染色的石蜡组织切片的放大倍数为4X的显微照片，所述切片得自通过腹膜内注射用510PFU和SAD35(15mg/kg)处理的仓鼠获。红色尺寸条＝150μM，40X，绿色尺寸条为50μM。
图25描绘用构建体处理并用1500PFU SARS-CoV-2攻击的仓鼠的以克计的体重随时间变化的曲线图。此图中，1＝SEQ ID NO:122；2＝SEQ ID NO:154；且3＝SEQ ID NO:192。误差条显示标准偏差(SD)。
图26描绘的图示出从咽拭子或BAL提取的核衣壳基因拷贝/μL RNA检测到的病毒滴度。此图中，1＝SEQ ID NO:122；2＝SEQ ID NO:154；且3＝SEQ ID NO:192。误差条显示标准偏差(SD)。
图27描绘的图示出从嗅球提取的SARS-CoV-2拷贝/μLRNA。此图中，1＝SEQ ID NO:122；2＝SEQ ID NO:154；且3＝SEQ ID NO:192。误差条显示标准偏差(SD)。
图28描绘的图示出组中EF50(mL/sec)随时间的变化。此图中，1＝SEQ ID NO:122；2＝SEQ ID NO:154；且3＝SEQ ID NO:192。误差条显示标准偏差(SD)。
图29描绘的图示出组中Penh随时间的变化。此图中，1＝SEQ ID NO:122；2＝SEQID NO:154；且3＝SEQ ID NO:192。误差条显示标准偏差(SD)。
图30描绘的图示出组中Rpef随时间的变化。此图中，1＝SEQ ID NO:122；2＝SEQID NO:154；且3＝SEQ ID NO:192。误差条显示标准偏差(SD)。
图31描绘的图示出，组中干扰素γ(IFNy)水平(pg/mL)随时间的变化。此图中，1＝SEQ ID NO:122；2＝序列号：154；和3＝SEQ ID NO:192。误差条显示标准偏差(SD)。
图32描绘了的图示出，随着时间推移，仓鼠中SARS-CoV-2感染期间血管紧张素1-7(Ang 1-7)水平的细胞因子分析结果。此图中，1＝SEQ ID NO:122；2＝SEQ ID NO:154；且3＝SEQ ID NO:192。误差条显示标准偏差(SD)。
图33描绘了的图示出，随着时间推移，仓鼠中SARS-CoV-2感染期间血管紧张素II水平的细胞因子分析结果。此图中，1＝SEQ ID NO:122；2＝SEQ ID NO:154；且3＝SEQ IDNO:192。误差条显示标准偏差(SD)。
图34描绘了的图示出，随着时间推移，仓鼠中SARS-CoV-2感染期间血管紧张素II与Ang 1-7的比率的图。此图中，1＝SEQ ID NO:122；2＝SEQ ID NO:154；且3＝SEQ ID NO:192。误差条显示标准偏差(SD)。
图35示出福尔马林固定的H&E染色仓鼠肺在4X放大倍数下的显微照片。实验结束时第7天显示支气管肺炎的证据。图A＝媒体控制；图B＝病毒控制；图C＝SEQ ID NO:122；图D＝SEQ ID NO:154；图E＝SEQ ID NO:192。注意强烈的蓝色炎症区域，包括巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞。尺寸条＝1mm。
图36描绘显示图35中提供的组织切片中炎症评分的直方图，使用以下方案进行评分：(a)损伤分布：无＝0，局灶＝1，多灶＝2，弥漫＝3；(b)炎症强度：无＝0，轻度(2-3个炎性细胞厚)＝1，中度(炎性细胞＝3-20个细胞厚)，重度(炎性>20个细胞厚)；(c)小血管血栓形成：无＝0，存在＝1。治疗组与对照组之间无显著差异(Wilcoxon秩和检验(Wilcoxon RankSum text))。
图37描绘B1.351进展期间每天摄入的所有K18ACE2小鼠的体重。株SARS-CoV-2感染。在以下四个臂中用SARS-CoV-2B1.351攻击的K18-ACE2小鼠的体重：臂(1)：以SEQ IDNO:113(15mg/kg)进行病毒接种，施用组n＝13；臂(2)：以1.2mg/kg结合SARS-CoV-2刺突蛋白的抗体进行病毒接种，所述抗体具有包含SEQ ID NO:189中所列氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:190中所列的氨基酸序列的轻链(抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体)，施用组n＝13；臂(3)：细胞培养基鼻内对照，IP盐水施用组n＝6；臂(4)：用IP盐水接种病毒，施用组n＝6。第4天，第1组和第4组接种病毒的小鼠开始出现疾病的临床症状，少数小鼠死于病毒感染，其余小鼠在研究结束后第7天全部患病。此图中，1＝SEQ ID NO:113；2＝抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体。
图38示出在B1.351株SARS-CoV-2感染进展期间每天服用的所有K18ACE2小鼠的临床评分。此图中，1＝SEQ ID NO:113；2＝抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体。
图39描绘的图示出在B1.351株SARS-CoV-2感染进展期间每天服用的所有K18ACE2小鼠的血清纤维蛋白降解产物。此图中，1＝SEQ ID NO:113；2＝抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体。
图40描绘的图示出B1.351株SARS-CoV-2感染后的研究结束时获取的K18ACE2小鼠中的D-二聚体水平。尽管治疗组的SEQ ID NO:113和抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体的平均D-二聚体血清水平似乎有所降低，但平均值与安慰剂和病毒对照组在统计学上没有差异(使用Tukey多重比较的单向ANOVA)。此图中，1＝SEQ ID NO:113；2＝抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体(包含SEQ ID NO:189中所列氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：190中所列的氨基酸序列的轻链)。
图41示出本发明的构建体分子的肝素结合亲和力分布。(A)是SEQ ID NO:113；(B)是SEQ ID NO:121，(C)是SEQ ID NO:122；(N)是SEQ ID NO:191；(O)是SEQ ID NO:121；(G)是SEQ ID NO:128；(L)是SEQ ID NO:129；(M)是SEQ ID NO:154；(D)是SEQ ID NO:135；(E)是SEQ ID NO:136；(F)是SEQ ID NO:137；(H)是SEQ ID NO:114；(I)是SEQ ID NO:115；(J)是SEQ ID NO:116；(K)是SEQ ID NO:133。
图42示出本发明的构建体的表达。顶部灰色部分表示神经毡蛋白b1结构域，通过已知为G4S接头的短肽序列连接到额外(双串联显示)的神经毡蛋白b1结构域和由恒定重链(CH2和CH3)组成黑色IgG Fc干。
图43示出人体肽中PiTou评分的累积分布。
图44示出病毒肽中PiTou评分的累积分布。
图45示出细菌肽中PiTou评分的累积分布。
图46示出已知病毒切割位点处的PiTou评分。
图47示出了优先PiTou评分分布。
具体实施方式
定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。因此，以下术语旨在具有以下含义：
如说明书和权利要求中所使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。
如本文所用，所公开的多肽的“施用”包括使用任何合适的制剂或施用途径，例如，如本文所述，向受试者递送本公开的多肽或组合物，或其前药或其他药学上可接受的衍生物。
如本文所用，当在两个或多个项目的列表中使用时，术语“和/或”是指可以单独使用所列项目中的任何一个，或者可以使用所列两个或更多项目的任何组合。例如，如果组合物描述为包含组分A、B和/或C，则该组合物可以单独包含A；单独包含B；单独包含C；包含A和B的组合；包含A和C的组合；包含B和C的组合；或包含A、B和C的组合。
如本文所用，“治疗(treatment和treating)”在本文中可互换使用，并指获得有益或期望结果的方法，包括但不限于治疗益处。治疗益处意味着根除或改善正在治疗的潜在疾病。此外，通过消除或改善与潜在疾病相关的一种或多种生理症状，从而在患者中观察到改善，从而实现治疗益处，尽管患者仍可能患有潜在疾病。术语“治疗(treat)”，在其所有动词形式中，在本文中用于表示缓解、缓解、预防和/或管理受试者的至少一种病症症状。
本文所用的“受试者(subject)”可指任何受病毒感染的动物，例如哺乳动物，如实验动物、农场动物、宠物等。在一些实施例中，动物是灵长类动物，优选是人类。如本文所用，术语“受试者”和“患者(patient)”可互换使用。术语“受试者”和“患者”是指动物(例如，鸟，如鸡、鹌鹑或火鸡，或哺乳动物)，特别是“哺乳动物”，包括非灵长类动物(例如牛、猪、马、羊、兔、豚鼠、大鼠、猫、狗和老鼠)和灵长类(例如，猴子、黑猩猩和人类)，更具体地说是人类。在一个实施方式中，受试者是非人动物，例如农场动物(例如，马、牛、猪或羊)或宠物(例如，狗、猫、豚鼠或兔子)。在优选实施方式中，受试者是“人”。
如本文所用，术语“融合”是指合并具有相同或不同功能或结构的两个分子，融合方法可包括能够将肽结合到蛋白质、小分子药物、纳米颗粒或脂质体的任何物理、化学或生物方法。优选地，所述融合可由接头肽介导，例如，所述接头肽可与抗体轻链可变区(Fc)片段的C-末端融合。
术语“疾病(disease)”、“障碍(disorder)”和“病症(condition)”在这里可以互换使用，以指代病毒介导的医学或病理病症。
本文中使用的术语“生物样品”包括但不限于细胞培养物或其提取物；从哺乳动物获得的生物筛选材料或其提取物；血液、唾液、尿液、粪便、精液、眼泪或其他体液或其提取物。
如本文所用，“感染的多重性”或“MOI””是感染剂(例如噬菌体或病毒)与感染目标(例如细胞)的比率。例如，当涉及接种有传染性病毒颗粒的一组细胞时，感染的多重性或MOI是沉积在孔中的传染性病毒颗粒数量除以该孔中存在的目标细胞数量所定义的比率。
如本文所用，术语“SARS-CoV-2病毒复制的抑制”包括病毒复制量的减少(例如减少至少10％)和病毒复制的完全停止(即病毒复制量减少100％)。在一些实施方式中，SARS-CoV-2的复制至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少90％或至少95％得到抑制。
如本文所用，“病毒滴度(或滴度)”是病毒浓度的量度。滴定测试可采用连续稀释法，从分析程序中获得近似定量信息，分析程序本质上只评估为阳性或阴性。滴定度对应于仍然产生阳性读数的最高稀释因子；例如，前8次连续两倍稀释中的阳性读数转化为1:256的滴度。一个具体的实例是病毒滴度。为了测定效价，可以制备几种稀释液，例如10-1、10-2、10-3……10-8。仍然感染细胞的病毒的最低浓度是病毒滴度。
如本文所用，术语“治疗(treat、treatmen和treating)”等在本文中通常指获得所需的药理学和/或生理学效果。该效果可以是完全或部分预防疾病或其症状的预防性的，和/或可以是治疗性的。本文所用的“治疗”包括对受试者，特别是人类疾病的任何治疗，包括：(a)防止受试者出现疾病或症状，该受试者可能易患疾病或症状但尚未被诊断为患有该疾病或症状；(b)抑制疾病症状，即阻止其发展；或(c)缓解疾病症状，即引起疾病或症状的消退。需要治疗的人包括已经被诊断患有疾病(如病毒感染)的人，以及需要预防疾病的人。因此，术语“治疗”指治疗性治疗和预防性治疗。例如，治疗性治疗包括减少或改善疾病(例如，病毒)介导的病症的进展、严重程度和/或持续时间，其由一种或多种疗法(例如一种或多种治疗剂如本公开的多肽或组合物)的施用产生。
在特定实施方式中，治疗性治疗包括改善病毒介导的病症的至少一个可测量的物理参数。在其他实施方式中，治疗性治疗包括通过物理上例如稳定可识别症状、生理上通过例如稳定物理参数或两者来抑制病毒介导的病情的进展。在其他实施方式中，治疗性治疗包括减少或稳定病毒介导的感染。抗病毒药物可以在社区环境中用于治疗已经感染COVID-19的人，以减轻症状的严重程度并减少他们生病的天数。
本文中使用的术语“预防(prophylaxis)”或“预防性使用(prophylactic use)”和“预防性治疗(prophylactic treatment)”是指旨在预防而非治疗或治愈疾病的任何医疗或公共卫生程序。如本文所使用的，术语“预防(prevent、prevention和preventing)”是指在未患病但已经或可能接近患者的受试者中，降低获得或发展特定病症的风险，或减少或抑制复发或所述病症。术语“化学预防”是指使用药物，例如小分子药物(而不是“疫苗”)来预防疾病。
如本文所用，预防性使用包括在检测到暴发的情况下的用途，在许多严重病毒(如COVID-19)并发症高危人群密切接触的地方(如医院病房、日间护理中心、监狱、疗养院等)，防止感染的蔓延或传播。还包括在需要SARS-CoV-2保护的人群中使用接种疫苗，但是这些人在感染后未得到保护(例如，由于免疫系统较弱)，或这些人无法获得疫苗，或由于副作用而无法接种疫苗。还包括在接种疫苗后的2周内使用，因为在此期间疫苗仍然无效。预防性使用还可包括治疗未感染SARS-CoV-2或认为不具有高并发症风险的人，以减少感染SARS-CoV-2并将其传染给与其密切接触的高风险人员(例如，医护人员、养老院工作人员等)的几率。
如本文所用，“有效量”是指足以引发期望的生物反应的量。在本发明中，期望的生物反应是抑制病毒(例如SARS-CoV-2)的复制，减少病毒的数量或者减少或改善病毒感染的严重程度、持续时间、进展或发作，防止病毒感染的进展，防止与病毒感染相关的症状的复发、发展、发作或进展，或者增强或改善用于对抗病毒感染的另一疗法的预防或治疗效果。给受试者施用化合物的精确量将取决于施用方式、感染类型和严重程度以及受试者的特征，例如一般健康、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。本领域技术人员将能够根据这些和其他因素确定合适的剂量。当与其他抗病毒药物联合施用时，例如，当与抗病毒药物联合用药时，第二种药物的“有效量”将取决于所用药物的类型。合适的剂量对于经批准的药剂是已知的，并且可由本领域技术人员根据受试者的病情、所治疗的病情类型和所使用的本文所述多肽的量进行调整。在未明确注明量的情况下，应假定为有效量。例如，本文所述的化合物可以以约0.01至100mg/kg体重/天的剂量范围给予受试者用于治疗或预防性治疗。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指代氨基酸残基的聚合物。
术语“减少/降低(reduce)”或该词的其他形式，如“减少/降低(reducing或reduction)”，通常指事件或特征的降低(例如，一种或多种病征，或一种蛋白质与另一种蛋白质的结合)。应理解，这通常与一些标准或期望值相关，换言之，是相对的，而并不总是需要参考标准值或相对值。在一些实施例中，在“降低风险”或“降低严重程度”的上下文中使用的术语“降低”是指降低感染特定疾病或病毒的风险；或降低给定疾病或病毒的症状的严重性和/或频率和/或症状的消除。
术语“减少的/降低的(reduced)”，如在“减少的结合”的上下文中所使用的，是指一个分子与另一个分子的亲和力降低。例如，在一些实施方式中，蛋白质、结构域或基序可以以给定的亲和力特异性结合到特定靶，例如肽、多肽、蛋白质、碳水化合物、糖类、多糖、糖胺聚糖或其任何表位；并且，减少所述结合是指所述蛋白质、结构域或基序对靶的亲和力的降低。测量结合亲和力是本领域公知的。在一些实施方式中，一个分子对其特异性结合的另一个分子的亲和力由解离常数(KD或Kd)表征。
“亲和力”是指分子的单个结合位点与其结合目标或伙伴(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和强度。分子对其目标的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示，这是解离速率常数和缔合速率常数的比值(分别为koff和kon)。简言之，结合相互作用的强度或亲和力可以用相互作用的解离常数(KD)表示，其中较小的KD表示较大的亲和力。所选多肽的结合性能可以使用本领域众所周知的方法量化。其中一种方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和分离的速率，其中这些速率取决于复合物伙伴的浓度、相互作用的亲和力以及同样影响两个方向速率的几何参数。因此，“开速率常数”(Kon)和“关速率常数”(Koff)均可以通过计算浓度和实际缔合和解离速率来确定。(参见Nature 361:186-87(1993))。Koff/Kon的比率能够消除所有与亲和力无关的参数，并且等于解离常数KD。(一般而言，参见Davies etal.(1990)Annual Rev Biochem 59:439-473)。
因此，只要速率常数的比率保持不变，当量亲和力可以包括不同的速率常数。亲和力可以通过本领域已知的成熟方法(包括本文所述的方法)测量。因此，在一些实施方式中，“减少的结合”是指相应相互作用的亲和力降低。相反，“增加的结合”是指相应相互作用的结合亲和力增加。
在一些实施方式中，当平衡结合常数(KD)＜1时，本发明的重组多肽可以特异性结合至表位。在一些实施方案中，当平衡结合常数(KD)＜100nM时，本发明的重组多肽可以特异性结合至表位。在一些实施方案中，当平衡结合常数(KD)＜10nM时，本发明的重组多肽可以特异性结合至表位。在一些实施方案中，当平衡结合常数(KD)为＜100pM至约1pM时，本发明的重组多肽可以特异性结合至表位，如通过诸如表面等离子体共振(Surface PlasmonResonance，SPR)、Octet测定法或本领域技术人员已知的类似测定法所测得的。在一些实施方式中，KD可为10-5M或更小(例如10-6M或更小、10-7M或更小、10-8M或更小、10-8M或更小、10-l0M或更小、10-11M或更小、10-12M或更小、10-13M或更小、10-14M或更小、10-15M或更小或10-16M或更小)。
在一些实施方式中，与对照相比，重组多肽中的结合可以减少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。例如，在具有减少的肝素或硫酸乙酰肝素结合的重组多肽中，与对照相比，重组多肽中的结合可以减少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
“衍生/获得”或“获得自/得自/衍生自/源自”是指从已知的和/或起源的肽、多肽、蛋白质或多核苷酸获得肽、多肽或蛋白质或多核酸。因此，如本文所用，术语“获得自/得自/衍生自/源自”包括但不限于：从起源来源(例如生物体)；合成或重组产生的蛋白质或多核苷酸来源，与来自已知的/起源的(例如NRP1或NRP2)的蛋白质或多核苷酸相同、实质上相关或由其修饰；或由已知/来源的蛋白质或多核苷酸或其片段制成的蛋白质或多核苷酸来源。如本文所用，术语“实质上相关”是指蛋白质可能已通过化学、物理或其他手段(例如序列修饰)修饰。
因此，“衍生/获得”可指直接或间接从已知的和/或起源的蛋白质或多核苷酸获得蛋白质或多核酸。例如，在一些实施方式中，“衍生的/获得的”可以指，通过观察已知的/起源的蛋白质或多核苷酸的序列并制备具有类似于、至少部分类似于已知的和/或起源的蛋白质或多核苷酸的序列的蛋白质或多核苷酸，从已知的和/或者起源的蛋白质或核苷酸获得蛋白质或多核酸。在其他实施方式中，“衍生/获得”可以指，通过从与已知的蛋白质或多核苷酸相关的生物体中分离蛋白质或多核酸，从已知的和/或起源的蛋白质或多核苷酸中获得蛋白质或多核苷。本领域技术人员已知从已知的蛋白质或多核苷酸“衍生/获得”蛋白质或多核酸的其他方法。
在一些实施方式中，在蛋白质(例如，“源自生物体的蛋白质”)的上下文中，“衍生/获得”描述一种条件，在所述条件下，蛋白质最初在生物体中鉴定，并通过从生物体中分离或通过合成或重组手段从生物体中复制。
“赋形剂”是指与本发明的活性成分一起(例如，同时)或在本发明的活性成分之后配制的任何药理学上无活性的天然或合成成分或物质。在一些实施方式中，赋形剂可以是任何添加剂、佐剂、粘合剂、膨松剂、载体(carrier)、涂层、稀释剂、崩解剂、填料、助凝剂、润滑剂、防腐剂、载剂(vehicle)或其组合，赋形剂可以与本发明的重组多肽一起施用，并且或者赋形剂可以用制备本的组合物。赋形剂包括本领域已知的无毒且不与组合物的其他成分相互作用的任何此类材料。在一些实施方式中，当制备用于使组合物膨胀的组合物(因此通常称为膨胀剂、填料或稀释剂)时，赋形剂可与重组多肽一起配制。在其他实施方式中，赋形剂可用于增强最终剂型中的活性成分，例如促进吸收和/或溶解。在其他实施方式中，赋形剂可用于提供稳定性或防止污染(例如，微生物污染)。在其他实施方式中，赋形剂可用于赋予组合物物理性能(例如，呈干燥颗粒或干燥可流动粉末物理形式的组合物)。对赋形剂的引用包括一种或多种此类赋形剂。合适的药物赋形剂描述于Remington's PharmaceuticalSciences,by E.W.Martin，其公开内容的全文通过引用并入本文。
“同源”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中每个DNA分子的位置被腺嘌呤占据，则分子在该位置处是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共享的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。因此，在一些实施方式中，术语“同源”是指两个多肽分子之间或两个核酸分子之间的序列相似性。当两个比较序列中的某个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中每个DNA分子的某个位置被腺嘌呤占据，则分子在该位置处是同源的。两个序列之间的同源性是两个序列共享的匹配或同源位置的数量的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个是匹配的或同源的，那么这两个序列是60％同源的。例如，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。
术语“同源性”，在用于核酸时，是指某种程度的互补性。可能存在部分同源性，或完全同源性，因此，完全同源性是相同的。“序列同一性”是指两种或多种核酸之间的相关性度量，并以总比较长度的百分比表示。同一性计算考虑了那些在各自较大序列中相同且处于相同相对位置的核苷酸残基。
“同一性”是指通过比较序列确定的两个或多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。术语“同一性”还指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，视情况而定，由此类序列串之间的匹配确定。“同一性”和“相似性”可以通过本领域普通技术人员已知的无数方法中的任何一种来容易地计算，包括但不限于：Computational MolecularBiology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,vonHeinje,G.,Academic Press,1987和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.andDevereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991以及Carillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)，上述文献公开内容的全文通过引用并入本文。此外，确定同一性和相似性的方法已编入公开可用的计算机程序中。例如，在一些实施方式中，确定两个序列之间的同一性和相似性的方法包括但不限于GCG程序包(Devereux,J.,etal.,Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.et al.,J.Molec.Biol.215:403-410(1990))。BLAST X程序可从NCBI和其他来源公开获得(BLAST Manual,Altschul,S.,et al.,NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894；Altschul,S.,et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))，上述文献公开内容的全文通过引用并入本文。
“突变/突变体(mutant)”是指具有改变、变异或修饰(例如，在核苷酸序列或氨基酸序列中)的生物体、DNA序列、多核苷酸、氨基酸序列、肽、多肽或蛋白质，突变导致与突变体进行比较的所述生物体和/或序列不同于天然存在生物体或野生型生物体、野生型序列和/或参考序列。在一些实施方式中，这种改变、变异或修饰可以是一个或多个核苷酸和/或氨基酸替换或修饰(例如，缺失或添加)。在一些实施方式中，一个或多个氨基酸替换或修饰可以是保守的；本文中，“突变/突变体”中的这种保守的氨基酸替换和/或修饰不会实质上减少突变体相对于其非突变体形式的活性。例如，在一些实施方式中，在与具有公开和/或要求保护的序列的肽相比时，“突变/突变体”具有一个或多个保守氨基酸替换，如SEQ IDNO.所示。
“可操作地”是指被使用的能力、做某事的能力和/或完成某种功能或实现某种结果的能力。例如，在一些实施方式中，“可操作地”是指多核苷酸、DNA序列、RNA序列或其他核苷酸序列或基因编码肽、多肽和/或蛋白质的能力。例如，在一些实施方式中，多核苷酸可用于编码蛋白质，这意味着多核苷酸包含赋予其产生蛋白质的能力的信息(例如，通过转录mRNA，mRNA又被翻译成蛋白质)。
“野生型(Wild type)”或“WT”是指生物体、多核苷酸序列和/或多肽序列的表型和/或基因型(即外观或序列)，如在其自然发生的状态或条件下发现和/或观察到的。
在本说明书中，除非上下文另有要求，否则“包含/包括/含有(comprise)”一词或或其变形例如“comprises”或“comprising”理解为，暗示包括所述步骤或元素或整数或步骤组或元素组或整数，但不排除任何其他步骤或元素组、整数或元素组。
本文所提及的所有专利申请、专利和印刷出版物的全文通过引用并入本文，就如每个单独的出版物、专利或专利申请具体且单独地表明通过引用全文引入。此外，本文引用的所有专利申请、专利和印刷出版物的全文通过引用并入本文，但任何定义、主题排除或拒绝承认除外，且所并入的材料与本文的明确公开不一致的情况除外，在不一致的情况下，以本公开中的语言为准。
SARS-CoV-2病毒粒子颗粒模型背景和机制
严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)在体内引发免疫反应，导致血管通透性增加、内皮炎症反应增加、一氧化氮(NO)水平降低和血管生成受损。SARS-CoV-2细胞因子风暴导致的内皮功能障碍可导致多器官衰竭，所述器官包括心脏和肾脏。年龄、高血压和/或肥胖等共病因素会加剧SARS-CoV-2的影响。在许多SARS-CoV-2严重病例中，严重急性呼吸综合征发生在肺泡和肺内皮，其中COVID-19包括血管渗漏、凝血和炎症。SARS-CoV-2是一种呼吸道病毒，与最初的SARS病毒、H1N1或其他类型的病毒(如埃博拉或登革热)不同，它能够感染血管细胞并在体内循环，这些病毒会损伤内皮细胞，但不会感染肺部。
如图1A所示，SARS-CoV-2病毒可通过将其刺突蛋白(SARS-S)附着于细胞表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)细胞受体而进入并感染人类细胞。一旦刺突蛋白与ACE2受体结合，SARS-CoV-2病毒就可以进入病毒外壳破裂的细胞，释放RNA进入宿主细胞，在宿主细胞内复制并产生更多病毒粒子颗粒。在SARS-CoV-2感染期间，ACE2受体分解血管紧张素II、控制血压和阻断器官损伤的能力会受到严重抑制。
参照图1B，可用于帮助中和SARS-CoV-2感染传播的已知机制之一是抗体中和。如图1B所示，抗体或免疫球蛋白构建体可结合SARS-CoV-2颗粒，以通过赋予空间干扰、衣壳稳定和/或结构变化来阻断其与细胞ACE2细胞受体的连接。在某些情况下，抗体、多肽或免疫球蛋白构建体可以聚集到一个以上的SARS-CoV-2颗粒上，以进一步阻止病毒内化到细胞中。在SARS-CoV-2颗粒与一种或多种抗体偶联的这些情况下，相应的大颗粒可通过吞噬作用进入细胞，在细胞内，结合的SARS-CoV-2颗粒被中和。
基于冠状病毒的病理学，在对COVID-19患者进行尸检的过程中，几乎每个器官均能发现血栓，科学家起初认为冠状病毒是一种血管疾病。如果COVID-19实际上是一种血管疾病，人们认为最好的抗病毒治疗可能实际上不是传统的抗病毒疗法。如上所述，可以理解SARS-CoV-1和SARS-CoV-2均通过ACE2细胞受体进入细胞。基于SARS-CoV-2感染患者的额外症状和感染组织的增加，认为与流感病毒A和SARS-CoV-1相比，一个或多个额外的进入位点可以解释微血栓的患病率和肺部血管生成的数量。参考图1C，提供了一个流程图，该流程图概述了除ACE2受体之外神经毡蛋白-1(NRP-1)作为使SARS-CoV-2进入细胞的手段的用途，可以解释，观察到的其他病症，例如血管疾病、血凝块、血管新生、AKI和糖尿病，以及额外感染的组织，如心脏、肾脏和血管内皮层，其中也经常观察到味觉/嗅觉的丧失。
最近的研究表明，神经毡蛋白1促进SARS-CoV-2细胞进入，并提供进入中枢神经系统的可能途径。另外还注意到，神经毡蛋白1是SARS-CoV-2感染的宿主因子。现在参照图2A，显示SARS-CoV-2病毒的可溶性结构域利用神经毡蛋白1受体的b1b2结构域和可溶性ACE2受体的结合能力。通过设计免疫球蛋白的Fc结构域以提供双诱饵可溶性蛋白，这一相应的融合多肽可以有效地结合一种或多种SARS-CoV-2病毒粒子颗粒的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或至少6种不同的刺突蛋白。如图2B所示，并在此更详细地解释，示例性融合多肽可包括sNRP1(b1)、sACE2(ACE2)、接头和免疫球蛋白(Fc)结构域，其可有效结合一种或多种SARS-CoV-2病毒粒子颗粒的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或至少6种不同的刺突蛋白。
现在参照图2C，SARS-CoV-2在Ser680与产生Furin切割位点的ARG685之间具有四(4)个氨基酸插入(PRRA)。SARS-CoV-2的Furin切割暴露了已知与神经毡蛋白-1(NRP1)和/或神经毡蛋白-2(NRP2)b1结合位点结合的C-端基序RXXR-OH(C-端R规则)。
因此，在设计可有效减少和治疗病毒感染(如SARS-CoV-2病毒)的治疗剂时，本文设计了包含神经毡蛋白-1(NRP1)结构域、神经毡蛋白-2(NRP2)结构域和血管紧张素转化酶2(ACE2)结构域的组合或其组合的融合肽，特别是COVID-19颗粒的S蛋白。在一些实施方式中，这些融合肽进一步包含免疫球蛋白结构域，例如，和源自人免疫球蛋白的Fc结构域。
参照图3A，使用NRP1受体和/或ACE2受体说明SARS-CoV-2病毒的胞饮作用感染。在每一种情况下，SARS-CoV-2病毒都是通过细胞膜上的小囊泡出芽而引入细胞的，在酸性环境中病毒外壳可以受到破坏，RNA释放进入宿主细胞，在宿主细胞中复制并产生更多的病毒粒子颗粒。
现参照图3B，提供了一个图示的示意图，其示出所公开的多肽如何中和和调理SAR-CoV-2病毒粒子颗粒。在步骤1中，多肽(A)和病原体(B)在血液中自由循环和漫游(roam)。在步骤2中，所公开的多肽可以与病原体结合，并且可以以不同的形式结合，例如调理(2a)、中和(2b)和凝集(2c)。在步骤3中，吞噬细胞(C)接近病原体，其中b1和/或ACE2结构域(任选地与所公开多肽的Fc区(D)偶联)与吞噬细胞上的受体(E)之一结合。最后，在步骤4中，病原体在被摄入时吞噬作用发生。
目前提出的减少和治疗SAR-CoV-2病毒感染的机制如图3C所示。在这种机制中，将提供治疗性抗体和/或疫苗，将产生可与SAR-CoV-2病毒结合并引发吞噬作用的抗体。这种方法的问题是，SAR-CoV-2病毒粒子颗粒可以选择性地结合NRP1受体并通过CendR-NRP1介导的胞饮作用感染细胞。SAR-CoV-2病毒可能通过CendR-NRP1介导的胞饮作用机制在体内保持活性，这可能导致治疗不彻底和/或难以有效治疗患者。
或者，如图3D所示，使用本文公开的多肽的拟议治疗可以弥补图3C中概述的机制的缺陷。例如，多肽——其包含神经毡蛋白的b1结构域或b1结构域的衍生物或片段，以及包含血管紧张素转化酶2的ACE2结构域或ACE2结构域的衍生物或片段——会靶向SAR-CoV-2病毒进入细胞的CendR-NRP1和ACE2介导的胞饮作用机制。通过消除SAR-CoV-2病毒进入细胞的机制，并通过吞噬作用有效中和病毒的影响，可以为患者提供完整有效的治疗。
SARS-CoV-2的神经毡蛋白中和
神经毡蛋白大致由五个结构域组成，从N端开始，a1结构域和a2结构域分类为CUB结构域，且Ig样C2型信号蛋白与之结合。特别是，这一位点与丛蛋白形成复合物，并起到增加与信号素丛蛋白结合力的作用。b1结构域和b2结构域分类为FV结构域/VII结构域，VEGF家族配体或第3类信号蛋白配体的C-末端与其结合。特别地，在这一部分中，存在肝素能够结合的位点，这有助于具有许多(+)电荷残基的配体的结合。此外，MAM诱导寡聚化，跨膜结构域(transmembrane domain，TM)使神经毡蛋白能够固定在细胞表面上，并且在胞浆结构域中，存在能够结合至突触后致密区95(Postsynaptic density 95)、Disk large、Zonaoccludens 1(PDZ)结构域的位点。
上述四个胞外结构域(a1、a2、b1和b2)决定了多个配体对NRP1/2的结合特异性，且最后一个胞外结构域与跨膜结构域一起与NRPs及其共受体之间的二聚或寡聚有关。VEGF和Sema3家族配体都通过C-末端R/K-x-R/K序列基序特异性结合到NRP1/2的b1结构域中的VEGF结合区，其中x代表任何氨基酸。事实上，所有已知的蛋白质和与NRP1-b1结构域中的配体结合袋结合的肽共享序列基序。NRP1结合配体和肽中的这一基本序列基序必须在C-端暴露以结合NRP1，在最后的C-端残基对Arg(或很少是Lys)有严格要求；这一要求称为“C-端规则”(C-end rule，CendR)。
多种病毒在其衣壳蛋白中具有CendR基序，并可能发生蛋白水解切割，以暴露CendR基序而具有感染性，大多数病毒包膜糖蛋白需要蛋白水解切割才能介导病毒进入宿主细胞。在许多情况下，病毒利用细胞胰蛋白酶样内蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶样内蛋白酶来达到这个目的。虽然枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶如furin需要多碱性切割位点，但胰蛋白酶样蛋白酶也识别单基基序，并在单个精氨酸或赖氨酸残基后切割。Furin介导的裂解已被描述为由多种进化多样的病毒家族编码的包膜糖蛋白，所述病毒家族包括疱疹病毒科(Herpesviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、博纳病毒科(Bomnaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、正黏病毒科(Orthomyxoviridae)、副黏病毒科(Paramyxoviridae)、肺病毒科(Pneumoviridae)和逆转录病毒科(Retroviridae)。
最近，研究人员观察到NRP1促进了SARS-CoV-2在细胞培养实验中感染细胞的能力。他们的发现还表明，与NRP1结合的是S1多肽。S1多肽是当SARS-CoV-2的刺突蛋白被切割和激活时形成的1至2个多肽。其包含符合C-端规则(CendR)的序列。
此外，Nrp1和Nrp2的b1b2结构域包含能够C-末端Sema3F和VEGF结合的结构决定簇。完整的b1b2结构域充当NRP1中的VEGF165、P1GF-2和肝素结合位点，肝素是通过与受体和配体物理相互作用调节VEGF165和P1GF-2与NRP1相互作用的关键成分。
b1结构域内VEGF结合袋的突变改变了与VEGF165A的结合亲和力。b1结构域的Y297A/S346A/Y353A突变不能与VEGF结合。b1结构域的E319A突变对VEGFA与肝素的结合亲和力更强，而b1结构域T349A和K351A突变对含有/或不含肝素的VEGFA的结合亲和力较弱。
神经毡蛋白，一种跨膜糖蛋白，分为两种类型：神经毡蛋白-1(NRP1；人NRP1氨基酸序列提供为SEQ ID NO:1)和神经毡蛋白-1(NRP2；人NRP2氨基酸序列提供为SEQ ID NO:1(Kolodkin et al.1997)。神经毡蛋白-1和神经毡蛋白-2分别由923个氨基酸和931个氨基酸组成，显示出约44％的氨基酸序列同源性，并共享若干结构方向(structural aspect)和生物活性。神经毡蛋白-1和神经毡蛋白-2通常由胞外a1、a2、b1、b2和MAM结构域以及胞内PDZ结合结构域组成(Appleton et al.2007)。神经毡蛋白在正常细胞中表达非常弱，但在大多数肿瘤相关内皮细胞、实体瘤细胞和血液肿瘤细胞中过度表达(Grandclement,C.andC.Borg 2011)。神经毡蛋白通过与VEGF25家族配体结合，作为VEGF受体(VEGFRs)的共受体。特别是，NRP1作为VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3的共同受体，与各种VEGF配体结合，从而促进血管生成、细胞迁移、粘附和侵袭。另一方面，NRP2作为VEGFR2和VEGFR3的共受体，从而促进淋巴管生成和细胞粘附。此外，神经毡蛋白1和神经毡蛋白2作为丛蛋白家族受体的共受体，与分泌的3类信号蛋白配体(Sema3A、Sema3B、Sema3C、Sema3D、Sema3E、Sema3F、Sema3G)结合。由于神经毡蛋白在功能细胞中没有结构域，因此它本身没有活性，即使配体与之结合。众所周知，神经毡蛋白信号转导通过作为共受体的VEGF受体或丛蛋白共受体进行。Sema3以2:2:2的比例结合至神经毡蛋白和丛蛋白受体并起作用。然而，许多研究结果表明，神经毡蛋白蛋白可以单独进行信号转导，而不与VEGF受体或丛蛋白共受体相互作用。然而，这种信号转导的确切分子机制尚不清楚。
有报道称，即使仅针对神经毡蛋白，神经毡蛋白和共受体的活性也受到抑制。例如，据报道，抗神经毡蛋白1抗体仅与已知与VEGFR2和神经毡蛋白1结合的VEGF-A竞争性地结合神经毡蛋白1，并且具有抑制血管生成、细胞存活、迁移和粘附以及VEGFR2的作用(PanQ et al.2007)。据报道，抗神经毡蛋白-2抗体与已知结合VEGFR3和神经毡蛋白-2的VEGF-C竞争性地结合神经毡蛋白-2，并具有抑制淋巴管生成和细胞粘附的功能，这是VEGFR3的作用(Caunt M et al.2008)。
结合至神经毡蛋白1、神经毡蛋白2的V EGF配体家族和Sema3配体中的每一个的C-末端区域结合至神经毡蛋白1和神经毡蛋白2常见的b1结构域中的VEGF结合位点(所谓的精氨酸结合袋)(MW Parker et al.2012)。在这里，通过R/K-x-x-R/K(R＝精氨酸，K＝赖氨酸，且x＝任何氨基酸)的基序与精氨酸结合袋发生结合，该基序通常存在于神经毡蛋白结合配体的C-末端区域。当用偏离基序的氨基酸序列诱导突变时，配体对神经毡蛋白的结合亲和力降低或不与神经毡蛋白结合，从而失去其生物活性。特别是，C-末端区域中的阳离子精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)对于结合是必需的，因此当其被另一个氨基酸残基取代时，配体失去其对神经毡蛋白的结合亲和力，并失去其生物活性。因此，这种神经毡蛋白结合配体的C端区域中R/K-x-R/K基序的必要性被称为“C-端规则”(CendR)(Teesalu et al.2009)。含有C-末端规则序列的蛋白质或肽能够通过C-末端精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)残基与神经毡蛋白结合(Zanuy et al,201)。
VEGF配体和Sema3配体的C-末端区域通常具有R/K-x-R/K基序，因此大多数配体具有与神经毡蛋白1和神经毡蛋白2结合的性质，而不是选择性地与神经毡蛋白2和神经毡蛋白1中的任何一个结合。
除了与神经毡蛋白1和神经毡蛋白2结合的配体外，已经选择或设计并报道了许多与神经毡蛋白结合的肽。这些肽都具有R/K-x-R/K基序，因此似乎与神经毡蛋白1和神经毡蛋白2的b1结构域中的精氨酸结合口袋结合。此外，结合至神经毡蛋白1和神经毡蛋白2以增加共同施用药物的肿瘤组织渗透的iRGD肽(Sugahara et al.2010)和与抗体重链末端融合以增加抗体的肿瘤组织穿透的A22p肽(Shin et al.2014)也具有氨基酸序列，遵循CendR规则。
本文所用的神经毡蛋白结构域或其衍生物或片段包括b1结构域或衍生物或片段。表1提供了几个示例性神经毡蛋白结构域，但不限于全长NRP1和NRP2部分以及几个较小的结构域。
表1.神经毡蛋白结构域(SEQ ID NO:1-22)。
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免疫球蛋白
在一些实施方式中，本发明的多肽包含免疫球蛋白结构域。免疫球蛋白结构域可以源自任何哺乳动物的免疫球蛋白分子。在一个实施方式中，免疫球蛋白结构域源自人免疫球蛋白，并且可以源自选自由IgG、IgA和IgD抗体同种型组成的组的的免疫球蛋白同种型。在具体实施方式中，免疫球蛋白结构域源自IgG同种型。在另一个实施方式中，免疫球蛋白结构域源自选自由IgG1、IgG2和IgG4组成的组的IgG亚类。
作为能够增加所连接的生理活性多肽的半衰期的生物相容性材料，选择包括铰链区的IgG Fc区。
为了减少这种非预期效应子功能(effector function)，产生了人IgG4变体L235E或F234A/L235A和人IgG1变体L234A/L234A，所有这些都减少了炎性细胞因子的释放。另一种旨在降低效应子功能的早期方法是用N297A、N297Q和N297G等突变去突变N297处的糖基化位点。这种糖基化方法已被证明成功地消除了Fc与低亲和力FcyR和效应子功能(如CDC和ADCC)的相互作用。在四个IgG亚类中，每个亚类具有不同的引发免疫效应子功能的能力。例如，IgG1和IgG3认为比IgG2和IgG4更有效地招募补体。此外，IgG2和IgG4引发ADCC的能力非常有限。因此，一些研究人员采用了一种跨亚类方法来减少效应子功能。
已知FcRn可延长IgG的半衰期，明显的策略是调节FcRn-IgG相互作用以延长或缩短抗体半衰期。延长治疗性抗体的半衰期将有助于维持药物治疗水平并减少施用频率，而减少半衰期将是诊断测试或毒性控制的理想选择。
通过对FcRn结合至关重要的Fc区突变来延长抗体半衰期的尝试相对成功。然而，增加Fc与FcRn的结合并不一定会延长血清半衰期。事实上，在pH 6.0和pH 7.4下产生的显著增加结合的IgG1突变体没有增加血清半衰期，反而抵消了单独在pH 6.0下增强结合的益处。据信，pH 7.4时FcRn-IgG结合阻止IgG释放到循环中，而是将其转移到降解途径。此外，有人提出，pH 7.4下的解离速率在测定血清半衰期中同样重要或可能更重要。
在FcRn结合研究中先前对Fc突变进行的综合筛查中，N434A和T307A/E380A/N434A(AAA)与FcRn(人)的结合增加了3.4倍和11.8倍。使用基于细胞的测定，曲妥珠单抗的替代导致与FcRn(人)的结合增加1.3倍和3.3倍，在表达人FcRn转基因且内源性FcRnTg(hFcRn-Tg)缺乏的小鼠中，血清半衰期增加2.2倍和2.5倍。
结合病毒刺突蛋白的融合蛋白包括IgG Fc区，其包括铰链区，ACE2(血管紧张素转化酶2)片段，其包括刺突蛋白结合区，NRP(神经纤维蛋白)片段，该片段使用接头或通过直接融合的方法包括CendR结合区。
在一些实施方式中，本发明的多肽包含包含部分重链的免疫球蛋白结构域。在一个实施方式中，免疫球蛋白结构域包含片段可结晶(Fc)结构域，其包含抗体的铰链-CH2-CH3。在具体实施方式中，多肽包含免疫球蛋白结构域，其包含选自IgG1和IgG2亚类的Fc结构域。
在一些实施方式中，免疫球蛋白结构域包含修饰的Fc结构域。
例如，在某些实施方式中，可能优选对IgG受体和转运蛋白(FcRn)的Fc片段具有增加的亲和力。在成人中，FcRn在上皮组织中表达。FcRn能够通过细胞内和细胞间结合IgG的运输和再循环发挥不同的作用。抗体和其他含Fc的肽通过与FcRn结合而内化，并靶向细胞的酸性内体和溶酶体进行降解。因此，在某些实施方式中，多肽包含含有Fc结构域的免疫球蛋白结构域，其对FcRn的结合亲和力增加。在一个实施方式中，免疫球蛋白结构域包含选自由氨基酸序列SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29组成的组。
在其他实施方式中，可能需要降低一种或多种Fey受体的亲和力。在某些情况下，如HIV和登革热病毒，与Fey受体(FcyR)结合的病毒抗体复合物导致病毒与病毒特异性受体紧密接触，导致感染。因此，与抗体复合的病毒可能导致称为抗体依赖性增强(ADE)感染的现象。因此，在某些实施方式中，所述多肽包含免疫球蛋白结构域，其包含对一种或多种Fey受体的亲和力降低的Fc结构域。在一个实施方式中，免疫球蛋白结构域包含选自由SEQ IDNO:26和28组成的组的氨基酸序列。
在其他实施方式中，可能需要减少免疫球蛋白结构域引起的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在某些情况下，ADCC的过度激活可能导致细胞因子的不受控制的高释放，引发“细胞因子风暴(cytokine storm)”。在其他情况下，ADCC可能导致病毒粒子颗粒内化为易感目标细胞。因此，在一个实施方式中，所述多肽包含缺乏引发ADCC的免疫球蛋白结构域。在一个实施方式中，所述多肽包含免疫球蛋白结构域，其包含具有降低的ADCC的Fc结构域，例如包含N297A突变。在一个实施方式中，免疫球蛋白结构域包含选自由SEQ ID NO:25和27组成的组的氨基酸序列。
本文中使用的术语“重链”可解释为包括全长重链，其包括重链可变区结构域VH，其包括具有足以赋予抗原特异性的可变区序列的氨基酸序列和3个重链恒定区结构域CH1、CH2和CH3及其片段。此外，本文中使用的术语“轻链”可解释为包括全长轻链和其片段，该全长轻链包括轻链可变区结构域VL，VL包括具有足以赋予抗原特异性的可变区序列的氨基酸序列和轻链恒定区结构域CL。
此外，抗体片段可以是单体、二聚体或多聚体。
抗体包括单克隆抗体、非特异性抗体、非人抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFV)、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫键连接Fv(sdFV)和抗独特型(抗Id)抗体，以及这些抗体的表位结合片段，但不限于此。
单克隆抗体可以是IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。例如，单克隆抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgA1、IgA5或IgD型，并且可以是IgG2型。此外，抗体的轻链恒定区可以是L型或K型。
所述肽可与抗体的重链恒定区(Fc)片段结合，优选地与抗体的轻链恒定区片段的C-末端结合。该结合可以通过接头肽进行。
在一些实施方式中，本发明的多肽包含Fc结构域。
表2提供用于本文所述治疗多肽的几个示例性免疫球蛋白结构域。
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SARS-CoV-2的血管紧张素转化酶2中和
血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)相关羧肽酶，ACE2，是一种I型完整膜蛋白，约805个氨基酸，含有一个HEXH+E锌结合共有序列。ACE2是体细胞血管紧张素转化酶(ACE；EC 3.4.15.1)的密切同系物，是一种在肾素-血管紧张素系统中起重要作用的肽基二肽酶。ACE2序列包括N-端信号序列(氨基酸1至18)、潜在跨膜结构域(氨基酸740至763)和潜在金属蛋白酶锌结合位点(氨基酸374至378，HEMGH)。
发表了与含有RBD(残基306至527)的S蛋白片段结合的ACE2的晶体结构。与RBD直接接触的ACE2残基包括Q24、T27、K31、H34、E37、D38、Y41、Q42、L45、L79、M82、Y83、N90、Q325、E329、N330、K353和G354。比较结构分析表明，参与S蛋白结合的大多数ACE2关键残基位于N端背靠背α螺旋1和2上。为了确定这两个螺旋是否在与S蛋白的复合物中实际上保持稳定。
在本发明的一些实施方式中，公开了包含ACE2结构域的多肽。在一些实施方式中，ACE2结构域源自哺乳动物ACE2序列。在一个实施方式中，ACE2结构域是人ACE2序列(全长氨基酸序列，包括信号序列，在SEQ ID NO:32中提供)、其衍生物或片段，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸22-44。例如，在一个具体实施方式中，ACE2结构域包括氨基酸，所述氨基酸选自：EEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSS(SEQ ID NO:34)和IEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQ STLAQMYPLQEI(SEQ ID NO:35)。在另一个实施方式中，ACE2结构域进一步包含SEQ ID NO:32的氨基酸351-357。例如，在另一个实施方式中，ACE2结构域选自由以下组成的组：EEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSS(X)nLGKGDFR(SEQ ID NO:36)和IEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSA FLKEQSTLAQMYPLQEI(X)nWDLGKGDFR(SEQID NO:37)，
其中：
n＝0-30
X＝选自Gly、Ala、Ser、He、Leu和Val的任何氨基酸，或其任意组合。
在某些实施方式中，ACE2结构域可以被修饰，例如，含有氨基酸取代，以改变对病毒粒子颗粒的亲和力。在一个实施方式中，ACE2结构域在选自由F28、D30和L79组成的组的位置处包含氨基酸取代(基于全长人ACE2序列的氨基酸编号)。在一个实施方式中，ACE2结构域包括F28W取代。在另一个实施方式中，ACE2结构域包括D30A取代。在又一个实施方式中，ACE2结构域包括L79T取代。各ACE2结构域的非限制性实例包括但不限于：ACE2-1、ACE2-2、ACE2-3、ACE2-4、ACE2-5和ACE2-6。ACE2-1结构域包括α-螺旋1+β-片)-(G4S)*2-(α-螺旋1+β-片。ACE2-2结构域包括α-螺旋1+1α-螺旋2+β-片(G4S)*2-(α-螺旋+α-螺旋2+β-片)。ACE2-3包括具有F28W的ACE2-1。ACE2-4包括具有F28W的ACE2-2。ACE2-5包括具有D30A的ACE2-2，ACE2-6包括具有L79T的ACE2-2。
为了诱导特异性结合刺突蛋白的诱饵蛋白，分析了血管紧张素转化酶2(ACE2)、神经毡蛋白1(NRP-1)和神经毡蛋白2(NRP-2)的序列。代表性地，血管紧张素转化酶2、神经毡蛋白1和神经毡蛋白2的全序列选自PubMed Entrez蛋白质数据库。
表3提供了用于本文所述治疗多肽的几个示例性ACE2结构域。
表3.ACE2结构域(SEQ ID NO:32-45)。本文中“(X)n”表示X可以是选自Gly、Ala、Ser、He、Leu和Val或其任何组合的任何氨基酸；并且n＝0-30。
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接头部分
本发明的一个方面的特异性结合NRP1的肽可进一步包含接头肽。接头肽可包含或由1至50个氨基酸、4至20个氨基酸或4至10个氨基酸组成。此外，连接肽可以包含甘氨酸或丝氨酸或由甘氨酸或丝氨酸组成，并且可以包含(GGGGS)n的氨基酸序列或由其组成(其中n各自独立地为1至20之间的整数)，或者可以包含(GGGGS)2的氨基酸序列或由(GGGGS)2的氨基酸序列组成。
在本发明的一些实施方式中，具有与其结合的接头肽的肽可包含如下表4中提供的SEQ ID NO:46至52中任一项的氨基酸序列。
表4.接头结构域(SEQ ID NO：46-52)。
信号序列
信号序列可以位于肽的N-端，并可以使这些蛋白质在细胞膜外找到正确的位置。信号序列可以标记蛋白质，以通过细胞膜运输，从而从细胞中移除。信号肽可以起到促使细胞转移蛋白质的作用，通常转移到细胞膜上。在原核生物中，信号肽可以将新合成的蛋白质导向存在于质膜中的SecYEG蛋白质传导通道。
在本发明的一些实施方式中，信号序列可包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，如下文表5所示。
表5.信号序列结构域(SEQ ID NO：53)。
SEQ ID NO： 长度 序列
53 19 MGWSCIILFLVATATGVHS
免疫球蛋白ACE2构建体
在本发明的一个方面，多肽可包含：血管紧张素转化酶2的ACE2结构域或ACE2结构域的衍生物或片段；和免疫球蛋白结构域。这些多肽的ACE2结构域能够与病毒的外壳蛋白结合，所述病毒选自由以下组成的组：疱疹病毒科(herpesviridae)、乳头瘤病毒科(papillomaviridae)、冠状病毒科(coronaviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、披膜病毒科(togaviridae)、博纳病毒科(bomnaviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、丝状病毒科(filoviridae)、正黏病毒科(orthomyxoviridae)、副黏病毒科(paramyxoviridae)、肺病毒科(pneumoviridae)和逆转录病毒科(retroviridae)。表6提供示例性但不限于免疫球蛋白ACE2构建体的列表。
表6.免疫球蛋白ACE2构建体(SEQ ID NO:54-56)。
免疫球蛋白-神经毡蛋白构建体
在本发明的另一方面，多肽可包含：神经毡蛋白的b1结构域或b1结构域的衍生物或片段；和免疫球蛋白结构域。这些多肽的b1结构域能够与病毒的外壳蛋白结合，所述病毒选自由以下组成的组：疱疹病毒科(herpesviridae)、乳头瘤病毒科(papillomaviridae)、冠状病毒科(coronaviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、披膜病毒科(togaviridae)、博纳病毒科(bomaviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、丝状病毒科(filoviridae)、正黏病毒科(orthomyxoviridae)、副黏病毒科(paramyxoviridae)、肺病毒科(pneumoviridae)和逆转录病毒科(retroviridae)。在一些实施方式中，b1结构域可以包括全长NRP1或NRP2肽。在其他实施方式中，b1结构域或其衍生物或片段还包括一个或多个另外的b1结构域、或其衍生物、或片段；神经毡蛋白的一个或多个b2结构域或b2结构域的衍生物或片段，或其组合。参照图4，提供了这些多肽的各种示例性示意性设计，其中b1结构域或其衍生物或片段与免疫球蛋白结构域偶联。表7A概述了几种示例性构建体的一般结构和连接性，但不限于神经毡蛋白免疫球蛋白构建体(构建体编号12-36)或包括b1、接头和免疫球蛋白结构域的多肽。在一些实施方式中，多肽具有选自第12-36号构建体的构型。表7B提供了这些相同的示例性构建体或神经毡蛋白免疫球蛋白多肽的列表，包括b1、接头和免疫球蛋白结构域及其相应的肽序列。
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神经毡蛋白-免疫球蛋白ACE2构建体
在本发明的另一个方面，多肽可包含：神经毡蛋白的b1结构域或b1结构域的衍生物或片段；免疫球蛋白结构域；和血管紧张素转化酶2的ACE2结构域或ACE2结构域的衍生物或片段。这些多肽的b1b1结构域和ACE2结构域都能够与病毒的外壳蛋白结合，所述病毒选自由以下组成的组：疱疹病毒科(herpesviridae)、乳头瘤病毒科(papillomaviridae)、冠状病毒科(coronaviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、披膜病毒科(togaviridae)、博纳病毒科(bornaviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、丝状病毒科(filoviridae)、正黏病毒科(orthomyxoviridae)、副黏病毒科(paramyxoviridae)、肺病毒科(pneumoviridae)和逆转录病毒科(retroviridae)。参照图5，提供具有b1结构域或其衍生物或片段的多肽的多种示例性示意性设计，所述多肽与ACE2结构域或衍生物或片段偶联，所述衍生物或片段另外与免疫球蛋白结构域偶联。表8A概述了几种示例性但不限于神经毡蛋白免疫球蛋白ACE2构建体(构建体编号4-11和37-59)或多肽(包括b1、ACE2、接头和免疫球蛋白结构域)的一般结构和连接性。在一些实施方式中，所述多肽具有选自构建体4-11和37-59的构型。表8B提供了来自表8A的这些相同的示例性构建体的列表，包括神经毡蛋白免疫球蛋白ACE2多肽，包括b1、ACE2、接头和免疫球蛋白结构域及其相应的肽序列。
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神经毡蛋白-ACE2结构
在本发明的另一个方面，多肽可包含：神经毡蛋白的b1结构域或b1结构域的衍生物或片段；和血管紧张素转化酶2的ACE2结构域或ACE2结构域的衍生物或片段。这些实施方式中的b1结构域和ACE2结构域各自能够与病毒的外壳蛋白结合，所述病毒选自由以下组成的组：疱疹病毒科(herpesviridae)、乳头瘤病毒科(papillomaviridae)、冠状病毒科(coronaviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、披膜病毒科(togaviridae)、博纳病毒科(bornaviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、丝状病毒科(filoviridae)、正黏病毒科(orthomyxoviridae)、副黏病毒科(paramyxoviridae)、肺病毒科(pneumoviridae)和逆转录病毒科(retroviridae)。
在一些实施方式中，神经毡蛋白的b1结构域或b1结构域的衍生物或片段可选自包括SEQ ID NOS:1-22中的一个或多个，所述SEQ ID NOS:1-22偶联至血管紧张素转化酶2的ACE2结构域或ACE2结构的衍生物或片段的，所述ACE2结构或其衍生物和片段包括SEQ IDNO:32-43中的一个或多个。在一些实施方式中，b1结构域连接到ACE2结构域的C-末端。在其他实施方式中，b1结构域连接到ACE2结构域的N-末端。在另一些实施方式中，选自包括SEQID NOS:44-40中的一个或多个的接头可以连接在与一个或多个ACE2结构域融合的一个或者更多个b1结构域的任何组合之间。
在一些实施方式中，包含b1结构域或其衍生物或片段和ACE2结构域或衍生物或片段的神经毡蛋白ACE2多肽可用于鼻喷雾剂组合物中。
药物组合物
本文所述多肽可配制成药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂或载体。在一个实施方式中，本发明涉及包含上述本发明多肽和药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂或载体的药物组合物。在一个实施方式中，本发明是药物组合物，其包含有效量的本发明多肽或其药学上可接受的盐和药学上可的载体、稀释剂、佐剂或载体。药学上可接受的载体包括，例如，药物稀释剂、赋形剂或载体，其根据预期施用形式适当选择，并与常规药学实践一致。
“有效量”包括“治疗有效量”和“预防有效量”。术语“治疗有效量”是指在感染病毒感染(例如SARS-CoV-2)的患者中有效治疗和/或改善病毒感染的量。术语“预防有效量”是指有效预防和/或显著减少病毒感染爆发的机会或规模的量。
药学上可接受的载体可含有惰性成分，其不会过度抑制多肽的生物活性。药学上可接受的载体应该是生物相容的，例如无毒、非炎症、非免疫原性或在施用给受试者时没有其他不期望的反应或副作用。可采用标准药物制剂技术。
本文所用的药学上可接受的载体、佐剂或载体包括任何和所有溶剂、稀释剂或其他液体载体、分散剂或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，适用于所需的特定剂型。Remington's Pharmaceutical Sciences,Sixteenth Edition,E.W.Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1980)公开了用于配制药学上可接受的组合物的各种载体及其制备的已知技术。除非任何常规载体介质与本文所述的多肽不相容，例如通过产生任何不期望的生物效应或以有害的方式与药学上可接受的组合物的任何其他组分相互作用，否则其用途预期在本发明的范围内。如本文所用，短语“副作用”包括治疗(例如，预防剂或治疗剂)的不希望的和不利的影响。副作用总是不需要的，但不需要的影响并不一定是不利的。治疗(如预防剂或治疗剂)的不良反应可能是有害的、不舒服的或危险的。副作用包括但不限于发烧、寒战、嗜睡、胃肠毒性(包括胃和肠溃疡和糜烂)、恶心、呕吐、神经毒性、肾毒性、肾毒性(包括乳头状坏死和慢性间质性肾炎等病症)、肝毒性(包括血清肝酶水平升高)、骨髓毒性(包括白细胞减少症、骨髓抑制症、血小板减少症和贫血)、口干、金属味、妊娠期延长、虚弱、嗜睡、疼痛(包括肌肉疼痛、骨痛和头痛)、脱发、乏力、头晕、锥体外症状、贫血、心血管紊乱和性功能障碍。
可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、缓冲物质(如吐温80、磷酸盐、甘氨酸、山梨酸或山梨酸钾)、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质(如鱼精蛋白硫酸盐、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠或锌盐)、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯聚氧丙烯嵌段聚合物、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羊毛脂肪、糖如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末黄杨；麦芽；明胶；滑石；赋形剂如可可脂和栓剂蜡；油如花生油、棉籽油；红花油；芝麻油；橄榄油；玉米油和大豆油；二醇；例如丙二醇或聚乙二醇；酯如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂如氢氧化镁和氢氧化铝；褐藻酸；无热原水；等渗盐水；林格溶液；根据配方师的判断，该组合物中还可能存在乙醇和磷酸盐缓冲溶液，以及其他无毒兼容润滑剂，如月桂醇硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、涂层剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。
在一些实施方式中，本发明的组合物包含药学上可接受的盐。
术语“药学上可接受的盐”指的是使用相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐，这取决于本文所述化合物上发现的特定取代基。当本发明的化合物含有相对酸性官能团时，碱加成盐可以通过使这种化合物的中性形式与足量的所需碱接触而获得，所述碱可以是纯的或在合适的惰性溶剂中。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物含有相对碱性的官能度时，可以通过使这种化合物的中性形式与足量的所需酸(纯酸或在合适的惰性溶剂中)接触来获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括衍生自无机酸的那些，如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、单氢碳酸、磷酸、单氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、单氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等，以及衍生自相对无毒的有机酸的盐，丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、草酸、甲磺酸等。还包括氨基酸的盐，如精氨酸等，以及有机酸的盐，例如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等(参见例如Berge et al.,“Pharmaceutical Salts”,Journal of Pharmaceutical Science,1977,66,1-19)。本发明的某些特定化合物含有碱性和酸性官能团，这些官能团允许化合物转化为碱或酸加成盐。
因此，本发明的化合物可以盐的形式存在，例如与药学上可接受的酸。本发明包括这样的盐。此类盐的非限制性实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、丙酸盐、酒石酸盐(例如，(+)-酒石酸盐、(-)-酒石酸酯或其混合物，和季铵盐(例如甲基碘、乙基碘等)。这些盐可以通过本领域技术人员已知的方法制备。
化合物的中性形式优选通过使盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物来再生。化合物的母体形式在某些物理财产上可能与各种盐形式不同，例如在极性溶剂中的溶解度。
除了盐形式之外，本发明还提供了前药形式的化合物。本文所述化合物的前药是那些在生理条件下容易发生化学变化以提供本发明化合物的化合物。本文所述化合物的前药可在施用后在体内转化。此外，前药可在离体环境中通过化学或生化方法转化为本发明的化合物，例如，当与合适的酶或化学试剂接触时。
本发明的某些化合物可以以非溶剂化形式以及溶剂化形式存在，包括水合形式。通常，溶剂化形式等同于未溶剂化形式，并包含在本发明的范围内。本发明的某些化合物可以多种晶体或无定形形式存在。一般而言，所有物理形式对于本发明预期的用途都是等效的，并且意图在本发明的范围内。
施用方法
在一些实施方式中，本发明的组合物可以给需要的受试者服用。在一些实施方式中，本发明的组合物可以与一种或多种其他疗法共同施用。
术语“施用(“administration”或“administering”)是指向需要治疗的受试者提供本发明组合物的行为，例如多肽或其药学上可接受的盐的行为。
在一些实施方式中，本发明的组合物可按如下方式施用：口服施用、栓剂施用、局部接触、静脉内、肠外、腹腔内、肌肉内、病灶内、鞘内、鼻内或皮下施用，或向受试者植入缓释装置，例如微型渗透泵。因此，施用可以通过任何途径，包括胃肠外和经粘膜(例如，口腔、舌下、腭部、牙龈、鼻、阴道、直肠或经皮肤)。肠外施用包括静脉内、肌肉内、小动脉内、皮内、皮下、腹腔内、脑室内和。其他递送方式包括但不限于使用脂质体制剂、静脉输注、透皮贴剂等。
“联合施用”是指本文所述的组合物在施用其他疗法之前或之后同时施用。治疗药物可以单独施用，也可以联合施用给患者。联合施用是指同时或连续单独或组合施用各组分。因此，当需要时，制剂也可以与其他活性物质组合。如本文所用，“连续施用”包括两种药剂(例如本文所述的药剂)的施用不在同一天发生。
如本文所用，“同时施用”包括至少部分重叠的持续时间。例如，当同时施用两种组合物(例如，本文所述的任何组合物)时，它们的施用发生在特定的期望时间内。组合物的施用可以在同一天开始和结束。只要两种组合物在同一天服用至少一次，一种组合物的施用也可以先于第二种组合物的每天施用。类似地，只要两种药剂在同一天至少服用一次，一种组合物的施用可以超过第二种组合物的给予。组合物不必每天在同一时间服用，以包括同时服用。
如本文所用，“间歇施用”包括在一段时间内施用一种药剂(这可视为“第一施用期”)，随后是不服用或以较低维持剂量服用组合物的时间(可视为“停用期(off-period)”)，随后是再次施用组合物的时间段(可称为“第二施用期”)。通常，在第二阶段施用期间，药剂的剂量水平将与第一施用期间施用的剂量水平相匹配，但可以根据医学需要增加或减少。
根据所治疗感染的严重程度，上述多肽和药学上可接受的组合物可口服、直肠、肠外、腹腔内、阴道内、腹膜内、局部(如粉末、软膏或滴剂)、口腔、口服或鼻喷雾等方式给人和其他动物。
在本发明的一些实施方式中，当治疗受试者时，通过全身静脉注射(systemicintravenous，IV)或通过局部鼻内途径施用抑制剂，例如鼻内喷雾、计量吸入器、喷雾器或干粉吸入器。通过特定方法递送的制剂(例如，溶液、缓冲液和防腐剂，以及用于鼻内施用的液滴或颗粒大小)可以通过本领域公知的常规常规方法进行优化，气雾剂制剂可置于加压的可接受推进剂中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。
口服液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳剂、微乳、溶液、悬浮液、糖浆和药物。除了活性多肽之外，液体剂型可以含有本领域中常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺，油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨醇脂肪酸酯及其混合物。除了惰性稀释剂之外，口腔组合物还可以包括佐剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和调香剂。
可注射制剂，例如无菌可注射含水或含油悬浮液，可根据已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌注射制剂也可以是无菌注射溶液、悬浮液或乳剂，其在无毒的非肠道可接受的稀释剂或溶剂中，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的载体和溶剂包括水、林格溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外，无菌固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的固定油，包括合成单甘油酯或二甘油酯。此外，脂肪酸如油酸用于制备注射剂。
可注射制剂可进行灭菌，例如，通过细菌保持过滤器过滤，或在使用前将灭菌剂以无菌固体组合物的形式加入灭菌剂，该灭菌剂可溶解或分散在无菌水或其他无菌注射介质中。
为了延长本文所述多肽的作用，通常需要减缓皮下或肌肉注射对多肽的吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。然后，多肽的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率又可能取决于晶体大小和晶体形式。或者，通过将多肽溶解或悬浮在油载体中来实现胃肠外施用多肽形式的延迟吸收。通过在生物可降解聚合物(如聚乳酸聚乙交酯)中形成多肽的微胶囊基质来制备可注射的储库形式。根据多肽与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质，可以控制多肽释放速率。其他生物可降解聚合物的实例包括聚(邻酯)和聚(酸酐)。还通过将多肽包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳中来制备储库注射制剂。
直肠或阴道施用的组合物特别是栓剂，其在环境温度下为固体，但在体温下为液体。
口服固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉末和颗粒。在这种固体剂型中，多肽(即活性多肽)与以下成分混合：至少一种惰性的、药学上可接受的赋形剂或载体(例如柠檬酸钠或磷酸二钙)；和/或a)填料或填充剂(例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸)；b)粘合剂(例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、，聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；c)保湿剂，如甘油；d)崩解剂如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶液缓凝剂如石蜡；f)吸收促进剂如季铵化合物；g)润湿剂如，例如，十六醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸收剂如高岭土和膨润土粘土；和i)润滑剂如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂醇硫酸钠及其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包括缓冲剂。
类似类型的固体组合物也可以用作软胶囊和硬胶囊中的填料，使用乳糖或奶糖等赋形剂以及高分子量聚乙二醇等。片剂、片剂、胶囊、丸剂和颗粒的固体剂型可以用包衣和壳制备，例如肠溶包衣和药物制剂领域中众所周知的其他包衣。它们可以任选地含有遮光剂，也可以是其成分仅在肠道的某一部分释放或优先释放活性成分，可选地以延迟的方式。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。类似类型的固体组合物也可以用作软胶囊和硬胶囊中的填料，使用诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂。
活性多肽也可以是微胶囊形式，具有一种或多种赋形剂，如上所述。片剂、片剂、胶囊、丸剂和颗粒的固体剂型可以用包衣和壳制备，如肠溶包衣、控释包衣和药物制剂领域中众所周知的其他包衣。在这种固体剂型中，活性多肽可以与至少一种惰性稀释剂如蔗糖、乳糖或淀粉混合。如通常的做法，这种剂型还可以包括除惰性稀释剂之外的其他物质，例如压片润滑剂和其他压片助剂，如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型也可以包括缓冲剂。它们可以任选地包含遮光剂，并且也可以是这样的组合物，即它们仅或优选地在肠道的特定部分中，任选地以延迟的方式释放活性成分。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
本文所述多肽局部或经皮施用的剂型包括软膏、膏剂、乳膏、洗剂、凝胶、粉末、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴剂。活性组分在无菌条件下与药学上可接受的载体和可能需要的任何所需的防腐剂或缓冲剂混合。眼科制剂、耳滴剂和眼药水也被认为在本发明的范围内。此外，本发明设想使用透皮贴剂，其具有提供多肽到身体的受控递送的附加优点。这种剂型可以通过将多肽溶解或分配在适当的培养基中来制备。吸收促进剂也可用于增加多肽穿过皮肤的流量。可以通过提供速率控制膜或通过将多肽分散在聚合物基质或凝胶中来控制速率。
本文所述的组合物可以口服、肠外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻、颊、阴道或通过植入的储存器施用。本文中使用的术语“肠外”包括但不限于皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。具体地，所述组合物口服、腹膜内或静脉内施用。
本文所述组合物的无菌注射形式可以是含水或含油悬浮液。这些悬浮液可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌可注射制剂也可以是无菌可注射溶液或悬浮液，其在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的载体和溶剂包括水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可使用任何温和的固定油，包括合成单甘油酯或二甘油酯。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂，天然药学上可接受的油，如橄榄油或蓖麻油，尤其是其聚氧乙烯形式的油。这些油溶液或悬浮液还可含有长链醇稀释剂或分散剂，如羧甲基纤维素或类似的分散剂，它们通常用于配制包括乳剂和悬浮液在内的药学上可接受的剂型。其他常用的表面活性剂，如Tweens、Spans和其他乳化剂或生物利用度增强剂，它们通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其他剂型。
本文所述的药物组合物可以任何口服可接受的剂型口服施用，包括但不限于胶囊、片剂、水悬浮液或溶液。在口服片剂的情况下，常用的载体包括但不限于乳糖和玉米淀粉。润滑剂，例如硬脂酸镁，也通常被添加。对于胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服需要水性悬浮液时，活性成分与乳化剂和悬浮剂结合。如果需要，还可以添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。
或者，本文所述的药物组合物可以栓剂的形式用于直肠施用。这些可通过将药剂与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，该赋形剂在室温下为固体，但在直肠温度下为液体，因此将在直肠中熔化以释放药物。此类材料包括但不限于可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
本文所述的药物组合物也可以局部施用，特别是当治疗目标包括易于通过局部应用获得的区域或器官时，包括眼睛、皮肤或下肠道疾病。容易为这些区域或器官中的每一个制备合适的局部制剂。
可在直肠栓剂制剂(见上文)或合适的灌肠制剂中对下肠道进行局部应用。也可使用局部透皮贴剂。
对于局部应用，药物组合物可配制在含有悬浮或溶解在一种或多种载体中的活性成分的合适软膏中。用于局部施用本发明多肽的载体包括但不限于矿物油、液体凡士林、白色凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，药物组合物可以配制成含有悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受的载体中的活性组分的合适的洗剂或乳膏。合适的载体包括但不限于矿物油、山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡醇、2-辛基十二醇、苄醇和水。
对于眼科用途，药物组合物可配制成等渗、pH调节的无菌盐水中的微粉化悬浮液，或特别配制成等渗透、pH调节无菌盐水溶液，无论是否含有防腐剂，如苄基氯化铵。或者，对于眼科用途，药物组合物可以配制成软膏，例如凡士林。
药物组合物也可通过鼻气雾剂或吸入施用。此类组合物根据药物制剂领域中公知的技术制备，并可作为盐水溶液制备，使用苄醇或其他合适的防腐剂、增强生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其他常规增溶或分散剂。
本发明方法中使用的多肽可以单位剂型配制。术语“单位剂型”是指物理上离散的单位，适合作为接受治疗的受试者的单位剂量，每个单位含有预定量的活性物质，计算出所需的治疗效果，任选地与合适的药物载体结合。单位剂型可以是单个每日剂量或多个每日剂量中的一个(例如，每天约1至4次或更多次)。当使用多个每日剂量时，每个剂量的单位剂型可以相同或不同。
肺/鼻施用
对于肺施用，优选地，至少一种多肽组合物以有效到达肺或鼻窦的下气道的颗粒尺寸递送。根据本发明，本文公开的至少一种多肽可以通过本领域已知的用于通过吸入施用治疗剂的各种吸入或鼻装置中的任何一种来递送。这些设备能够将雾化制剂沉积在患者的鼻窦或肺泡中，包括计量吸入器、喷雾器、干粉发生器、喷雾器等。本领域还已知适用于指导多肽的肺部或鼻腔施用的其他装置。许多此类装置可使用适用于在气雾剂中分配多肽的施用制剂。这种气溶胶可以由溶液(水溶液和非水溶液)或固体颗粒组成。
像计量吸入器这样的计量吸入器通常使用推进剂气体，并且在吸气期间需要驱动(例如，参见WO 94/16970、WO 98/3588)。干粉吸入器，例如TURBUHALERTM(Astra)、/>(Glaxo)、/>(Glaxo)、SPIROSTM吸入器(Dura)，由Inhale Therapeutics销售的装置以及/>粉末吸入器(Fisons)，使用混合粉末的呼吸驱动(U.S.Pat.No.4,668,218Astra、EP 237507Astra、WO 97/25086Glaxo、WO 94/08552Dura、U.S.Pat.No.5,458,135Inhale、WO 94/06498Fisons，其全文通过引用并入本文)。喷雾器，例如AERXTM Aradigm、/>喷雾器(Mallinckrodt)和ACORN/>喷雾器，(Marquest Medical Products)(U.S.Pat.No.5,404,871Aradigm,WO 97/22376，其全文通过引用并入本文)，从溶液中产生气溶胶，而计量吸入器、干粉吸入器等产生小颗粒气溶胶。这些市售吸入装置的具体实例旨在代表适用于本发明实践的具体装置，而不旨在限制本发明的范围。
在一些实施方式中，通过干粉吸入器或喷雾器递送包含本文公开的至少一种多肽的组合物。用于施用本发明的至少一种多肽的吸入装置具有几个期望的特征。例如，通过吸入装置的输送有利地是可靠的、可重复的和准确的。吸入装置可任选地输送小的干燥颗粒，例如小于约10μm，优选约1μm-5μm，以获得良好的呼吸性。
可通过在压力下迫使至少一种多肽的悬浮液或溶液通过喷嘴来产生包含多肽组合物的喷雾。可以选择喷嘴尺寸和配置、施加压力和液体进料速率，以实现所需的输出和颗粒尺寸。电喷雾可以例如通过与毛细管或喷嘴进料连接的电场产生。有利地，由喷雾器递送的至少一种多肽的颗粒具有小于约10μm的粒径，在一些实施方式中，在约1μm至约5μμm的范围内，约2μm至约3μm。
具有至少一种适合与喷雾器一起使用的多肽的制剂通常包括水溶液中的多肽组合物，其浓度为每ml或每mg/gm溶液约0.1mg至约100mg至少一种多种肽，或其中的任何范围、值或分数。制剂可以包括试剂，例如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂，以及优选锌。制剂还可以包括用于稳定多肽组合物的赋形剂或试剂，例如缓冲液、还原剂、散装蛋白或碳水化合物。用于配制多肽组合物的散装蛋白质包括白蛋白、鱼精蛋白等。用于配制多肽组合物的典型碳水化合物包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。多肽组合物制剂还可包括表面活性剂，其可减少或防止在形成气溶胶时由溶液雾化引起的多肽组合物的表面诱导聚集。可以使用各种常规表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，以及聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。用量通常在制剂重量的0.001-14％之间。用于本发明目的的特别优选的表面活性剂是聚氧乙烯山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酸酯20等。本领域已知的用于多肽制剂的其他试剂，例如IL-23p19抗体或特定部分或变体，也可以包括在制剂中。
通过喷雾器施用多肽组合物
本发明的多肽组合物可通过喷雾器(例如喷射喷雾器或超声波喷雾器)施用。通常，在喷射喷雾器中，压缩空气源用于通过孔口产生高速空气射流。当气体膨胀到喷嘴之外时，产生了一个低压区，该低压区通过连接到液体储存器的毛细管抽取多肽组合物的溶液。来自毛细管的液体流在离开毛细管时被剪切成不稳定的细丝和液滴，形成气溶胶。可以采用一系列配置、流速和挡板类型，以实现给定喷射喷雾器的期望性能特性。在超声波雾化器中，高频电能用于产生振动机械能，通常采用压电换能器。该能量直接或通过耦合流体传递到多肽组合物的制剂，产生包括多肽组合物的气溶胶。有利地，由喷雾器递送的多肽组合物的颗粒具有小于约10μm的粒径，在一些实施方式中，在约1μm至约5μm的范围内，或在约2μm至约3μm的范围内。
适用于喷雾器的至少一种多肽的制剂，无论是喷射式还是超声式，通常包括每毫升溶液约0.1mg至约100mg的至少一个多肽的浓度。制剂可以包括试剂，例如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂，以及优选锌。所述制剂还可以包括用于稳定所述至少一种多肽组合物的赋形剂或试剂，例如缓冲液、还原剂、散装蛋白或碳水化合物。用于配制至少一种多肽组合物的散装蛋白质包括白蛋白、鱼精蛋白等。用于配制至少一种多肽的典型碳水化合物包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。所述至少一种多肽制剂还可以包括表面活性剂，所述表面活性剂可以减少或防止在形成气溶胶时由溶液雾化引起的至少一种肽的表面诱导聚集。可以使用各种常规表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，以及聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。用量通常在制剂重量的约0.001-4％之间。用于本发明目的的特别优选的表面活性剂是聚氧乙烯山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酸酯20等。本领域已知的用于多肽制剂(例如抗体蛋白)的其它试剂也可以包括在制剂中。
通过计量吸入器施用多肽组合物
在计量吸入器(metered dose inhaler,MDI)中，推进剂、本文公开的至少一种多肽和任何赋形剂或其他添加剂作为包括液化压缩气体的混合物包含在罐中。计量阀的致动以气雾剂的形式释放混合物，优选包含尺寸范围小于约10μm的颗粒，在一些实施方式中为约1μm至约5μm，或约2μm至约3μm。所需的气雾剂颗粒尺寸可通过采用本领域技术人员公知的各种方法制备的多肽组合物的配方来获得，包括喷射研磨、喷雾干燥、临界点冷凝等。优选的计量吸入器包括由3M或Glaxo制造并使用氢氟碳推进剂的吸入器。与计量吸入器装置一起使用的至少一种多肽的制剂通常包括含有至少一种作为悬浮液在非水介质中的精细粉末，例如在表面活性剂的帮助下悬浮在推进剂中。推进剂可以是用于此目的的任何常规材料，例如氯氟烃、氢氯氟碳化合物、氢氟碳化合物或碳氢化合物，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、四氯二氟乙醇和1,1,1,2-四氟乙烷、HFA-134a(氢氟烷-134a)、HFA-227(氢氟烃-227)等。优选地，推进剂是氢氟碳化合物。可以选择表面活性剂以稳定至少一种多肽作为推进剂中的悬浮液，保护活性剂免受化学降解等。合适的表面活性剂包括山梨醇三油酸酯、大豆卵磷脂、油酸等。在某些情况下，溶液气溶胶优选使用溶剂，如乙醇。本领域已知的用于多肽制剂的其他试剂也可以包括在制剂中。本领域的普通技术人员将认识到，本发明的方法可以通过经由本文未描述的装置肺部施用至少一种多肽组合物来实现。
联合疗法
在本发明的方法或药物组合物中，可单独使用多肽或其药学上可接受的盐或溶剂化物(例如水合物)或与其他合适的治疗剂(例如，抗病毒剂或疫苗)组合使用，从而达到有效量。当采用“联合疗法”时，可使用第一量的多肽或其药学上可接受的盐或溶剂化物(例如水合物)和第二量的其他合适的治疗剂(例如抗病毒剂或疫苗)来达到有效量。
在本发明的其他实施方式中，多肽和附加治疗剂各自以有效量(即，如果单独施用，则各自以治疗有效的量)施用。在另一个实施方式中，多肽和附加治疗剂各自以单独不提供治疗效果的量(亚治疗剂量)施用。在又一个实施方式中，多肽可以有效量施用，而附加治疗剂以亚治疗剂量施用。在又一个实施方式中，多肽可以亚治疗剂量施用，而另外的治疗剂例如合适的抗病毒治疗剂以有效量施用。
如本文所用，术语“联合”或“联合施用”可以互换使用，以指代使用一种以上的治疗(例如，一种或多种预防和/或治疗剂)。术语的使用不限制向受试者施用治疗(例如预防和/或治疗剂)的顺序。
联合施用包括以基本上同时的方式施用第一量和第二量的联合施用多肽，例如在单个药物组合物中，例如具有固定比例的第一量和第二量的胶囊或片剂，或在多个单独的胶囊或片中。此外，这种联合施用还包括以任一顺序顺序使用每种多肽。
在一些实施例中，本发明涉及通过抑制病毒在生物样品或患者中的复制来治疗病毒感染(例如，COVID-19)的组合治疗方法，或使用本发明的多肽或药物组合物来治疗或预防患者中的病毒感染的组合治疗的方法。因此，本发明的药物组合物还包括包含本发明的病毒复制抑制剂和显示抗病毒活性的抗病毒多肽的那些。
当联合施用涉及第一量的多肽和第二量的额外治疗剂的单独施用时，多肽的施用时间足够接近，以产生期望的治疗效果。例如，每次施用之间能够产生预期疗效的时间段可以从分钟到小时不等，并且可以根据每种多肽的财产来确定，例如效力、溶解度、生物利用度、血浆半衰期和动力学曲线。例如，多肽和第二治疗剂可以在各自约24小时内、各自约16小时内、各自约8小时内、各自约4小时内、各自约1小时内或各自约30分钟内以任何顺序施用。
更具体地，第一治疗(例如，预防或治疗剂，如本发明的多肽中的任何一种)可以在(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)施用，所述第一治疗施用伴随第二治疗施用，或者在第二治疗施用之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)向受试对象施用第二种治疗(例如预防或治疗药物，如抗病毒药物)。
据了解，第一量的多肽和第二量的额外治疗剂的联合施用方法可产生增强的或协同的治疗效果，其中所述组合效应大于单独施用所述第一量的多肽和所述第二量的附加治疗剂所产生的附加效应。
如本文所用，术语“协同”是指本发明的多肽与另一种治疗(例如，预防或治疗剂)的组合，其比治疗的附加效应更有效。治疗组合(例如预防剂或治疗剂的组合)的协同效应可允许使用较低剂量的一种或多种治疗和/或较不频繁地向受试者施用所述治疗。利用较低剂量的治疗(例如，预防剂或治疗剂)和/或较不频繁地施用所述治疗的能力可以减少与向受试者施用所述疗法相关的毒性，而不降低所述疗法在预防、管理或治疗疾病中的功效。此外，协同效应可导致药物在预防、管理或治疗疾病中的疗效提高。最后，组合疗法(例如，预防剂或治疗剂的组合)的协同效应可以避免或减少与单独使用任一疗法相关的不良或不希望的副作用。
当使用本发明多肽的联合治疗与疫苗结合时，可以施用两种治疗剂，使得每次施用之间的时间可以更长(例如几天、几周或几个月)。
可以使用合适的方法来评估药物相互作用，从而确定协同效应的存在。合适的方法包括，例如，Sigmoid Emax方程(Holford,N.H.G.and Scheiner,L.B.,Clin.Pharmacokinet.6:429-453(1981)),the equation ofLoewe additivity(Loewe,S.and Muischnek,H.,Arch.Exp.Pathol Pharmacol.114:313-326(1926))和中值效应方程(Chou,T.C.and Talalay,P.,Adv.Enzyme Regul.22:27-55(1984))。上面提到的每个方程可以与实验数据一起应用，以生成相应的图表，以帮助评估药物组合的效果。与上述方程相关的相应曲线分别为浓度效应曲线、等辐射热曲线和组合指数曲线。
可与本文所述多肽联合施用的具体实例包括Remdesivir、神经氨酸酶抑制剂(如奥司他韦和扎那米韦/>)、病毒离子通道(M2蛋白)阻断剂(如金刚烷胺/>和金刚乙胺/>)以及WO 2003/015798中所述的抗病毒药物，包括日本富山化学公司正在开发的T-705。(另见Ruruta et al.,AntiviralResearch,82:95-102(2009),“T-705(flavipiravir)and related compounds:Novelbroad-spectrum inhibitors of RNA viral infections.”)在一些实施方式中，本文所述的多肽可与传统流感疫苗共同施用。/>
示例性实施方式
在一些实施方式中，本发明包含重组多肽、基本上由重组多肽组成或由重组多肽组成，所述重组多肽包含：(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)结构域或其片段，和(b)免疫球蛋白结构域；其中相对于野生型NRP结构域，所述一个或多个突变NRP结构引起重组多肽与肝素或硫酸乙酰肝素的结合降低。
在一些实施方式中，重组多肽包含一个或多个源自NRP1蛋白或NRP2蛋白的突变NRP结构域。
在一些实施方式中，一个或多个突变NRP结构域是一个或多个突变b1结构域，或一个或多个突变b2结构域。
在一些实施方式中，相对于SEQ ID NO:1中所示的野生型氨基酸序列，所述一个或多个突变NRP结构域具有选自由以下组成的组的氨基取代：K373E、K351A、E319A、K358E、R513E、K514E、K516E、R513 A、K514A、K516A、Y297A、S345A和Y353A。
在一些实施方式中，一个或多个突变NRP结构域引起重组多肽与肝素的结合降低。
在一些实施方式中，一个或多个突变NRP结构域引起重组多肽与硫酸乙酰肝素的结合降低。
在一些实施方式中，免疫球蛋白结构域是Fc结构域。
在一些实施方式中，本发明包含重组多肽、基本上由重组多肽组成或由重组多肽组成，所述重组多肽包含：(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域、NRP b2结构域、或其片段，和(b)Fc结构域；其中所述一个或多个突变NRP b1结构域、NRP b2结构域、或其片段源自NRP1蛋白或NRP2蛋白；相对于SEQ ID NO:1中所示的野生型氨基酸序列，其中所述一个或多个突变NRP b1结构域、NRP b2结构域、或其片段具有选自由以下组成的组的氨基取代：K373E、K351A、E319A、K358E、R513E、K514E、K516E、R513A、K514A、K516A、Y297A、S345A和Y353A；并且其中所述一个或多个氨基取代引起所述重组多肽与肝素或硫酸乙酰肝素的结合降低。
在一些实施方式中，本发明包含重组多肽、基本上由重组多肽组成或由重组多肽组成，所述重组多肽包含：(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域(bl)、NRP b2结构域(b2)、或其片段；和(b)Fc结构域；其中，(a)和(b)包含具有以下取向的构建体：b1-Fc；b1b1-Fc；b1b1b1-Fc；b1 Fc；b1b1b1-Fc；b1b2 Fc；b1b2 Fc；b1b2 Fc；b1b2 Fc；Fc-b1b2；Fc-b1b2；b1-Fc-b1；b1b1-Fc-b1；b1 Fc；b1b1-Fc；b1b1b1-Fc；b1 Fc；b1b1b1-Fc；b1 Fc；b1b1b1-Fc；b1b2Fc；b1b2 Fc；Fc-b1b2；Fc-b1b2；b1-Fc-b1；b1b1-Fc-b1；其中，所述一个或多个b1、b2、或其片段源自NRP1或NRP2蛋白；其中，相对于SEQ ID NO:1中所示的野生型氨基酸序列，所述一个或多个b1、b2、或其片段具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：K373E、K351A、E319A、K358E、R513E、K514E、K516E、R513 A、K514A、K516A、Y297A、S345A和Y353A；并且其中所述一个或多个一个或多个氨基取代引起所述重组多肽与肝素或硫酸乙酰肝素的结合降低。
在一些实施方式中，本发明包含重组多肽、基本上由重组多肽组成或由重组多肽组成，所述重组多肽包含重组多肽包含：(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)结构域或其片段，以及(b)免疫球蛋白结构域；其中，所述重组多肽可操作地结合至具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，且X1和X2是任何氨基酸。
在一些实施方式中，重组多肽具有一个或多个突变NRP结构域或其片段，所述一个或多个突变NRP结构域或其片段源自NRP1蛋白或NRP2蛋白。
在一些实施方式中，一个或多个突变NRP结构域或其片段是一个或多个突变b1结构域或一个或更少个突变b2结构域。
在一些实施方式中，本发明包含重组多肽、基本上由重组多肽组成或由重组多肽组成，所述重组多肽包含：(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)结构域或其片段，和(b)免疫球蛋白结构域；其中所述重组多肽可操作地结合具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，X1和X2是任何氨基酸，其中所述病毒是属于以下域的病毒：双链DNA病毒域；单链DNA病毒域；核糖病毒域(Riboviria)或多DNA病毒域。
在一些实施方式中，病毒是属于以下界的病毒：班福病毒界；香港病毒界；正核糖核酸病毒界(Orthornavirae)；副核糖核酸病毒界(Pararnavirae)或称德病毒界(Shotokuvirae)。
在一些实施方式中，病毒是属于以下门的病毒：酶录转逆病毒门(Artverviricota)；Cossairicota；黄病毒门；阴性病毒门(Negarnaviricata)；核质病毒门(Nucleocytoviricotta)；Peplovicritota或Pisuvericota。
在一些实施方式中，病毒是属于以下纲的病毒：α-病毒超群纲(Alsuviricetes)；艾略特病毒纲(Ellioviricetes)，黄病毒超群纲(Flasuviricetes)，Hervivicicetes，流鲑索病毒纲(Insthoviricetes)；Monjivircetes；乳多空病毒纲(Papovaviricetes)，Pisonivircetes；Pokkesvicicetes；逆转录酶病毒纲(Revtraviricetes)或星马病毒纲。
在一些实施方式中，病毒是属于以下目的病毒：黄热病毒目；分节病毒目；布尼亚病毒目(Bunyavirales)；束衣病毒目(Chitovirales)；戊肝样病毒目(Hepelivirales)；疱疹病毒目(Herpesvirales)；荆楚病毒目(Jingchuvirales)；马尔特里病毒目(Martellivirales)；单股负链病毒目(Mononegavirales)；尼多病毒目(Nidovirales)；逆转录病毒目；星状病毒目(Stellavirales)或楚尔豪森病毒目(Zurhausenvirales)。
在一些实施方式中，病毒是属于以下科的病毒：星状病毒科(Astroviridae)；布尼亚病毒科(Bunyaviridae)；博纳病毒科(Bornaviridae)；楚病毒科(Chuviridae)；冠状病毒科(Coronaviridae)；黄病毒科(Flaviviridae)；丝状病毒科(Filoviridae)；汉坦病毒科(Hantaviridae)；戊肝病毒科(Hepeviridae)；疱疹病毒科(Herpesviridae)；内罗病毒科(Nairoviridae)；正黏病毒科(Orthomyxoviridae)；乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)；副黏病毒科(Paramyxoviridae)；泛布尼亚病毒科；白纤病毒科(Phenuiviridae)；肺病毒科(Pneumoviridae)；痘病毒科(Poxviridae)；逆转录病毒科(Retroviridae)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)或披膜病毒科(Togaviridae)。
在一些实施方式中，病毒选自由以下组成的组：登革热(Dengue)；呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)；汉坦病毒(Hantavirus)；EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)；EBV(未切割)；SARS-CoV-2 Wuhan；SARS-CoV-2 Wuhan(未切割)；SARS-CoV-2UK；SARS-CoV-2 India；SARS-CoV-2 India(未切割)；HCoV-OC43；MERS-CoV；MERS-CoV(未切割)；单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)1；HSV 1(未切割)；甲型H5N1流感病毒(influenza A H5N1 virus，IAV H5N1)；人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)；人偏肺病毒(Human Metapneumovirus)和人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)。
在一些实施方式中，病毒具有选自由以下组成的组的CendR基序：GTCTQSGERRREKR；KNTNVTLSKKRKRR；LTHKMIEESHRLRR ； VSFKPPPPPSRRRR ；VSFKPPPPPSRRRRGACVVY； CASYQTQTNSPRRAR；CASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLG；ASYQTQTNSHRRAR；ASYQTQTNSRRRAR；ASYQTQTNSRRRARSVASQSIIAY；GSGYCVDYSKNRRSR；LLEPVSISTGSRSAR；LLEPVSISTGSRSARSAIEDLLFDK；ERPRAPARSASRPRR；ERPRAPARSASRPRRPV；VLATGLRNVPQRKKR；PTTSSTSTTAKRKKR；IDMLKARVKNRVAR；AKRRVVQREKR；和AKRRVVQREKRAVGIGALFLG。
在一些实施方式中，本发明包含重组多肽、基本上由重组多肽组成或由重组多肽组成，所述重组多肽包含：(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域(b1)、NRP b2结构域(b2)、或其片段；和(b)Fc结构域；其中，所述一个或多个b1、b2或其片段源自NRP1蛋白或NRP2蛋白；其中，所述重组多肽可操作地结合至具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，X1和X2是任何氨基酸；并且其中所述病毒选自由以下组成的组：登革热(Dengue)；呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)；汉坦病毒(Hantavirus)；EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)；EBV(未切割)；SARS-CoV-2 Wuhan；SARS-CoV-2Wuhan(未切割)；SARS-CoV-2 UK；SARS-CoV-2 India；SARS-CoV-2 India(未切割)；HCoV-OC43；MERS-CoV；MERS-CoV(未切割)；单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)1；HSV 1(未切割)；甲型H5N1流感病毒(influenza A H5N1 virus，IAV H5N1)；人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)；人偏肺病毒(Human Metapneumovirus)和人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)。
在一些实施方式中，本发明包含重组多肽、基本上由重组多肽组成或由重组多肽组成，所述重组多肽包含：(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域(b1)、NRP b2结构域(b2)、或其片段；和(b)Fc结构域；其中，所述一个或多个b1、b2或其片段源自NRP1蛋白或NRP2蛋白；其中，所述重组多肽可操作地结合至具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，且X1和X2是任何氨基酸；且其中所述病毒具有选自由以下组成的组的CendR基序：GTCTQSGERRREKR；KNTNVTLSKKRKRR；LTHKMIEESHRLRR ； VSFKPPPPPSRRRR；VSFKPPPPPSRRRRGACVVY； CASYQTQTNSPRRAR；CASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLG；ASYQTQTNSHRRAR；ASYQTQTNSRRRAR；ASYQTQTNSRRRARSVASQSIIAY；GSGYCVDYSKNRRSR；LLEPVSISTGSRSAR；LLEPVSISTGSRSARSAIEDLLFDK；ERPRAPARSASRPRR；ERPRAPARSASRPRRPV；VLATGLRNVPQRKKR；PTTSSTSTTAKRKKR；IDMLKARVKNRVAR；AKRRVVQREKR；和AKRRVVQREKRAVGIGALFLG。
在一些实施方式中，本发明包含重组多肽或其药学上可接受的盐、基本上由重组多肽或其药学上可接受的盐组成或由重组多肽或其药学上可接受的盐组成，所述重组多肽包含与表21中所列SEQ ID NO中任一者所示的氨基酸序列以如下比例相同的氨基酸序列：至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少997％、至少99.9％、至少99％或100％。
在一些实施方式中，本发明包含重组多肽或其药学上可接受的盐、基本上由重组多肽或其药学上可接受的盐组成或由重组多肽或其药学上可接受的盐组成，并且进一步包含赋形剂，所述重组多肽包含与表21中所列SEQ ID NO中任一者所示的氨基酸序列以如下比例相同的氨基酸序列：至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少997％、至少99.9％、至少99％或100％。
在一些实施方式中，本发明包含重组多肽或其药学上可接受的盐、基本上由重组多肽或其药学上可接受的盐组成或由重组多肽或其药学上可接受的盐组成，所述重组多肽包含与SEQ ID NO:113-116、SEQ ID NO:121-122、SEQ ID NO:133-137、SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:193-201中任一者所示的氨基酸序列以如下比例相同的氨基酸序列：至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少997％、至少99.9％、至少99％或100％。
在一些实施方式中，本发明包含重组多肽或其药学上可接受的盐、基本上由重组多肽或其药学上可接受的盐组成或由重组多肽或其药学上可接受的盐组成，并且进一步包含赋形剂，所述重组多肽包含与SEQ ID NO:113-116、SEQ ID NO:121-122、SEQ ID NO:133-137、SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:193-201中任一者所示的氨基酸序列以如下比例相同的氨基酸序列：至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少997％、至少99.9％、至少99％或100％。
在一些实施方式中，本发明包含重组多肽或其药学上可接受的盐、基本上由重组多肽或其药学上可接受的盐组成或由重组多肽或其药学上可接受的盐组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:113-116、SEQ ID NO:121-122、SEQ ID NO:133-137、SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:193-201中任一者所示的氨基酸序列至少90％相同。
在一些实施方式中，本发明包含重组多肽或其药学上可接受的盐、基本上由重组多肽或其药学上可接受的盐组成或由重组多肽或其药学上可接受的盐组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:113-116、SEQ ID NO:121-122、SEQ ID NO:133-137、SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:193-201中任一者所示的氨基酸序列至少90％相同。
在一些实施方式中，本发明包含重组多肽或其药学上可接受的盐、基本上由重组多肽或其药学上可接受的盐组成或由重组多肽或其药学上可接受的盐组成，所述重组多肽由SEQ ID NO:113-116、SEQ ID NO:121-122、SEQ ID NO:133-137、SEQ ID NO:148-149、SEQID NO:154、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:193-201中任一项所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，本发明包含、基本上由或由重组多肽或其药学上可接受的盐组成，所述重组多肽由SEQ ID NO:113-116、121-122、133-137、148-149、154、162和193-201中任一者所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，本发明包括一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、降低病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法、基本上由所述方法组成或由所述方法组成，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述组合物包括：(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)结构域或其片段，以及(b)免疫球蛋白结构域；其中，所述重组多肽可操作地结合至具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，且X1和X2是任何氨基酸。
在所述方法的一些实施方式中，一个或多个突变NRP结构域或其片段源自NRP1蛋白或NRP2蛋白。
在所述方法的一些实施方式中，一个或多个突变NRP结构域或其片段是一个或多个突变b1结构域，或是一个或多个突变b2结构域。
在所述方法的一些实施方式中，病毒是属于领域的病毒：所述病毒是属于以下域的病毒：双链DNA病毒域；单链DNA病毒域；核糖病毒域(Riboviria)或多DNA病毒域。
在所述方法的一些实施方式中，所述病毒是属于以下界的病毒：班福病毒界；香港病毒界；正核糖核酸病毒界(Orthornavirae)；副核糖核酸病毒界(Pararnavirae)或称德病毒界(Shotokuvirae)。
在所述方法的一些实施方式中，所述病毒是属于以下门的病毒：酶录转逆病毒门(Artverviricota)；Cossairicota；黄病毒门；阴性病毒门(Negarnaviricata)；核质病毒门(Nucleocytoviricotta)；Peplovicritota或Pisuvericota。
在所述方法的一些实施方式中，所述病毒是属于以下纲的病毒：α-病毒超群纲(Alsuviricetes)；艾略特病毒纲(Ellioviricetes)，黄病毒超群纲(Flasuviricetes)，Hervivicicetes，流鲑索病毒纲(Insthoviricetes)；Monjivircetes；乳多空病毒纲(Papovaviricetes)，Pisonivircetes；Pokkesvicicetes；逆转录酶病毒纲(Revtraviricetes)或星马病毒纲。
在所述方法的一些实施方式中，所述病毒是属于以下目的病毒：黄热病毒目；分节病毒目；布尼亚病毒目(Bunyavirales)；束衣病毒目(Chitovirales)；戊肝样病毒目(Hepelivirales)；疱疹病毒目(Herpesvirales)；荆楚病毒目(Jingchuvirales)；马尔特里病毒目(Martellivirales)；单股负链病毒目(Mononegavirales)；尼多病毒目(Nidovirales)；逆转录病毒目；星状病毒目(Stellavirales)或楚尔豪森病毒目(Zurhausenvirales)。
在所述方法的一些实施方式中，所述病毒是属于以下科的病毒：星状病毒科(Astroviridae)；布尼亚病毒科(Bunyaviridae)；博纳病毒科(Bornaviridae)；楚病毒科(Chuviridae)；冠状病毒科(Coronaviridae)；黄病毒科(Flaviviridae)；丝状病毒科(Filoviridae)；汉坦病毒科(Hantaviridae)；戊肝病毒科(Hepeviridae)；疱疹病毒科(Herpesviridae)；内罗病毒科(Nairoviridae)；正黏病毒科(Orthomyxoviridae)；乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)；副黏病毒科(Paramyxoviridae)；泛布尼亚病毒科；白纤病毒科(Phenuiviridae)；肺病毒科(Pneumoviridae)；痘病毒科(Poxviridae)；逆转录病毒科(Retroviridae)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)或披膜病毒科(Togaviridae)。
在所述方法的一些实施方式中，所述病毒选自由以下组成的组：登革热(Dengue)；呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)；汉坦病毒(Hantavirus)；EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)；EBV(未切割)；SARS-CoV-2 Wuhan；SARS-CoV-2Wuhan(未切割)；SARS-CoV-2 UK；SARS-CoV-2 India；SARS-CoV-2 India(未切割)；HCoV-OC43；MERS-CoV；MERS-CoV(未切割)；单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)1；HSV 1(未切割)；甲型H5N1流感病毒(influenza A H5N1 virus，IAV H5N1)；人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)；人偏肺病毒(Human Metapneumovirus)和人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus，HIV)。
在所述方法的一些实施方式中，所述病毒具有选自由以下组成的组的CendR基序：GTCTQSGERRREKR；KNTNVTLSKKRKRR；LTHKMIEESHRLRR ； VSFKPPPPPSRRRR ；VSFKPPPPPSRRRRGACVVY； CASYQTQTNSPRRAR；CASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLG；ASYQTQTNSHRRAR；ASYQTQTNSRRRAR；ASYQTQTNSRRRARSVASQSIIAY；GSGYCVDYSKNRRSR；LLEPVSISTGSRSAR；LLEPVSISTGSRSARSAIEDLLFDK；ERPRAPARSASRPRR；ERPRAPARSASRPRRPV；VLATGLRNVPQRKKR；PTTSSTSTTAKRKKR；IDMLKARVKNRVAR；AKRRVVQREKR；和AKRRVVQREKRAVGIGALFLG。
在一些实施方式中，本发明包括在有需要的受试者中限制病毒感染发生、降低病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法、基本上由所述方法组成或由所述方法组成，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述组合物包括：(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域(b1)、NRPb2结构域(b2)、或其片段；和(b)Fc结构域；其中，所述一个或多个b1、b2、或其片段源自NRP1蛋白或NRP2蛋白；其中，所述重组多肽可操作地结合至具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，且X1和X2是任何氨基酸；且其中所述病毒选自由以下组成的组：登革热(Dengue)；呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)；汉坦病毒(Hantavirus)；EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)；EBV(未切割)；SARS-CoV-2 Wuhan；SARS-CoV-2 Wuhan(未切割)；SARS-CoV-2 UK；SARS-CoV-2 India；SARS-CoV-2 India(未切割)；HCoV-OC43；MERS-CoV；MERS-CoV(未切割)；单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)1；HSV 1(未切割)；甲型H5N1流感病毒(influenza A H5N1 virus，IAV H5N1)；人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)；人偏肺病毒(Human Metapneumovirus)和人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)。
在一些实施方式中，本发明包括在有需要的受试者中限制病毒感染发生、降低病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法、基本上由所述方法组成或由所述方法组成，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述组合物包括：(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域(bl)、NRPb2结构域(b2)、或其片段；和(b)Fc结构域；其中，所述一个或多个b1、b2、或其片段源自NRP1或NRP2蛋白；其中，所述重组多肽可操作地结合至具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，且X1和X2是任何氨基酸；且其中，所述病毒具有选自表36和表37公开的任一CendR基序。
在一些实施方式中，本发明包括在有需要的受试者中限制病毒感染发生、降低病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法、基本上由所述方法组成或由所述方法组成，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述组合物包括：(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域(bl)、NRPb2结构域(b2)、或其片段；和(b)Fc结构域；其中，所述一个或多个b1、b2、或其片段源自NRP1或NRP2蛋白；其中，所述重组多肽可操作地结合具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，且X1和X2是任何氨基酸；且其中，所述病毒具有选自以下组成的组的CendR基序：GTCTQSGERRREKR；KNTNVTLSKKRKRR；LTHKMIEESHRLRR ； VSFKPPPPPSRRRR；VSFKPPPPPSRRRRGACVVY； CASYQTQTNSPRRAR；CASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLG；ASYQTQTNSHRRAR；ASYQTQTNSRRRAR；ASYQTQTNSRRRARSVASQSIIAY；GSGYCVDYSKNRRSR；LLEPVSISTGSRSAR；LLEPVSISTGSRSARSAIEDLLFDK；ERPRAPARSASRPRR；ERPRAPARSASRPRRPV；VLATGLRNVPQRKKR；PTTSSTSTTAKRKKR；IDMLKARVKNRVAR；AKRRVVQREKR；和AKRRVVQREKRAVGIGALFLG。
在一些实施方式中，本发明包括一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、减少病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法、基本上由所述方法组成或由所述方法组成，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述重组多肽包含与SEQ ID NO:113-116、SEQ ID NO:121-122、SEQ IDNO:133-137、SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:193-201中任一者所示的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明包括一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、减少病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法、基本上由所述方法组成或由所述方法组成，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述重组多肽由与SEQ ID NO:113-116、SEQ ID NO:121-122、SEQ IDNO:133-137、SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:193-201中任一者所示的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，本发明包括一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、减少病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法、基本上由所述方法组成或由所述方法组成，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述重组多肽由SEQ ID NO:113-116、SEQ ID NO:121-122、SEQ ID NO:133-137、SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:193-201中任一者所述的氨基酸序列组成。
实施例
本说明书中的实施例并非旨在限制本发明、也不应用于限制本发明；提供实施例仅为了说明本发明。
实施例1.构建体的设计和制备
本文设计了几种类型的表达载体。第一种类型的表达载体包含如表7A和表7B中所述的神经毡蛋白b1结构域和免疫球蛋白结构域(例如Fc结构域)。第二类表达载体包含血管紧张素转化酶2的ACE2结构域和免疫球蛋白结构域(例如Fc结构域)，如表6所述。第三种类型的表达载体包含神经毡蛋白b1结构域、血管紧张素转化酶2的ACE2结构域和免疫球蛋白结构域(例如Fc结构域)，如表8A和8B所述。
为了增加对特定病毒的刺突蛋白(如SARS-CoV-2)的结合亲和力，多肽(本文中也称为融合蛋白)可设计为包含一个或多个b1或神经毡蛋白结构域和/或一个或多个ACE2或血管紧张素转化酶2结构域。
为了增加对特定病毒(如SARS-CoV-2)刺突蛋白的结合亲和力，多肽(本文中也称为融合蛋白)可设计为b1或神经毡蛋白结构域突变和/或ACE2或血管紧张素转化酶2结构域突变。在一些实施方式中，b1或神经毡蛋白结构域中的突变可包括E319A突变。在一些实施方式中，ACE2或血管紧张素转化酶2结构域的突变可包括F28W、D30A、L79T突变。
为了降低与病毒刺突蛋白的结合亲和力，融合蛋白可设计为b1或神经毡蛋白结构域突变和/或血管紧张素转化酶2结构域突变。在一些实施方式中，神经毡蛋白片段的突变可包括b1结构域的Y297A/S346A/Y353A、T349A和K351A突变。
为了增加与FcRn的结合亲和力，可设计融合蛋白，使其在免疫球蛋白Fc结构域中发生突变。在一些实施方式中，免疫球蛋白结构域的突变可包括Fc结构域的N434A和T307A/E380A/N434A(AAA)突变。
为了降低Fc介导的效应子功能，多肽或融合蛋白可设计为具有免疫球蛋白Fc结构域的突变。在一些实施方式中，免疫球蛋白结构域中的这种突变可包括Fc结构域的L235E、F234A/L235A、N297A、N2976Q或N297G突变。在其他实施方式中，IgG2和IgG4的免疫球蛋白Fc结构域可用于降低融合蛋白的Fc介导的效应子功能。
为了减少抗体依赖性增强(antibody-dependent enhancement，ADE)，设计了一些免疫球蛋白Fc结构域突变的诱饵。在一些实施方式中，免疫球蛋白结构域中的突变可包括Fc结构域中L235E、F234A/L235A、N297A、N2976Q或N297G突变。在其他实施方式中，IgG2和IgG4的免疫球蛋白Fc结构域可用于降低融合蛋白的Fc介导的效应子功能。
人神经毡蛋白-1(UniProt ID:O14786，SEQ ID NO:1)和人神经毡蛋白-2(UniProtID:O60462，SEQ ID NO:2)用作神经毡蛋白片段的来源。使用人血管紧张素转化酶2(UniProt ID:Q9BYF1，SEQ ID NO:32)作为血管紧张素转化酶2片段的来源。人IgG变体用作免疫球蛋白Fc区的来源。表1-3中提供了这些序列的衍生物，包括氨基酸取代。
通常，蛋白质构建体的合成如下：表达构建体通过密码子优化的基因合成生成，并使用Not I和Hind III限制酶插入pcDNA3.4作为表达载体。构建的表达载体包括信号肽，且为了优化转录，Kozak序列有时包含在5’非翻译区中。将含有编码蛋白质构建体的基因的所得质粒转化为One ShotTM ToplO E.coli competent细胞，且使转化的细胞培养过夜。构建的质粒通过PureLinkTM HiPure Expi plasmid Megaprep kit(ThermoFisher Scientific,Waltham,Mass.)获得。
融合蛋白在CHO-S系统(ThermoFisher Scientific)中瞬时表达。根据制造商推荐的条件，单独表达蛋白质。简言之，用OPTIPROTM SFM和EXPIFECTAMINETM，以每mL的CHO-S培养物1∶1的轻链与重链比，制备共0.8μg质粒DNA。将该混合物以6×106个细胞/mL的活细胞密度和大于98％的活力加入CHO-S细胞。将细胞培养物在37℃、80％湿度、8％CO2下，在NalgeneTM Single-Use PETG Erlenmeyer Flasks中，在19mm轨道的125RPM摇动速度，培养过夜。第2天，培养物得到增强(EXPICHOTM增强子；ThermoFisher Scientific.)，并进料(EXPICHOTM进料，ThermoFisher Scientific.)并转移至32℃、80％湿度，5％的CO2下在19mm轨道的125RPM摇动速度下振动。第5天进行第2次进料，培养物回复至32℃，直到第12天收获。收获通过以4000×g离心20分钟完成。使用不对称聚醚砜(polyethersulfone，PES)0.22-μM过滤器组件(Nalgene)对澄清的上清液进行消毒。滤液储存在4℃，直到纯化。
所有抗体灭菌上清液使用MabSelect PRISMATM树脂纯(GE Healthcare LifeSciences)化在AKTApure(GE Healthcare Life Sciences)上纯化。使用50mM磷酸钠、150mMNaCl、pH 7.0缓冲液平衡树脂。然后将抗体上清液加载到柱中。用50mM磷酸钠、150mM NaCl、pH 7.0缓冲液洗涤树脂，直到色谱基线回到柱平衡水平。然后使用100mM乙酸钠、20％甘油、pH 3.0进行洗脱，并收集馏分。馏分立即用1M Tris(pH 9)中和。将在280nm波长下具有主要吸光度的馏分合并到Amicon 10kDa超滤装置中用于缓冲液交换。储存缓冲液(磷酸盐缓冲盐水)用于通过在Amicon浓缩器中进行7次半稀释离心来去除洗脱缓冲液。材料输送至SEC，然后在4℃下储存。
尺寸排阻色谱(Size exclusion chromatography，SEC)分析在装有二极管阵列紫外检测器WR的Agilent Infinity 1260 II Quatenary Pump高效液相色谱(highperformance liquid chromatographic，HPLC)系统上进行。将20个(10)μg抗体材料注射到TSKgel G3000SWXL，5μm，7.8mm ID x 30cm柱上。流动相为磷酸盐缓冲盐水，流速为1mL/min。在15分钟采集期间以1Hz采样率在波长220nm、280nm和330nm处检测抗体材料。
实施例2.体外测试
体外试验使用基于荧光的酶联免疫吸附试验(Fluorescence-based Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)确定基于人神经毛蛋白和血管紧张素转化酶2(ACE2)的人IgG Fc构建体与SARS-CoV-2刺突蛋白的结合性能。本文使用的ELISA法用于对所公开的神经毡蛋白-1/2(NP1或NP2)和ACE2人IgG Fc融合构建体的结合亲和力进行排序。还描述从刺突蛋白的SAR-CoV-2S1/S2界面鉴定的两种肽的结合，所述两种肽提供病毒经由N1和N2受体进入细胞。
荧光结合测定中使用的试剂和材料如下表9所示。所用仪器见表10。
表9.荧光结合分析用试剂。
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表10.荧光结合分析中使用的仪器。
实施例3.样品制备
所有蛋白质构建体和肽用PBS稀释至表11中列出的浓度。BSA在1x PBS中稀释至5％。
表11构建体和肽浓度
实施例4.制备板和加入样品
在实验1中，板1用200μL SARS-CoV-2Spike S1+S2 ECD His蛋白在孔A1至B10(深色阴影)中涂覆(见表12)，最终涂层量为0.66μg/孔，用hub1b2-His涂覆孔C1至D10，最终涂层为0.06μg/孔。将平板在5℃冰箱中培养过夜。第2天，所有测定制备均在室温下进行，但培养在37℃下进行。将板1从冰箱中取出，并通过将板在水槽上方弹动去除液体。所有孔用250μL 1x PBS冲洗3次。最后1次冲洗后，将板倒置在纸巾上，用力拍打，以去除剩余的多余液体。然后用200μL 5％BSA封闭所有孔，并在37℃下培养板1小时。培养后，除去液体，并如上所述洗涤孔。
将FITC标记的ACE2 a1肽(FITC-labelled ACE2 a1 peptide)在800μL PBS中进一步稀释至1.15μg/mL，同时将FITC标记的CendR肽(FITC-labelled CendR peptide)在800升PBS中也稀释至1.54μg/mL。向孔A2-A10、B2-B10、C2-C10和D2-D10中加入190μL1xPBS。向孔a1和B1中加入380μL ACE2 a1肽稀释液，同时向孔C1和D1中加入相同量的CendR肽(CendRpeptide)。然后，使用多通道移液器从每个第一孔(A1、B1、C1和D1)中移除190μL，并转移到下一列孔。仔细混合样本，以免污染相邻孔。对所有孔进行此操作，直至A10、B10、C10和D10完成。该过程使得A、B、C和D行中从第1列到第10列的每个孔稀释2倍(见表12)。丢弃第10列中最终稀释后剩余的190μL。
将板置于37℃培养箱中1小时。培养后，除去液体，如上所述洗涤并干燥板。
使用供应商建议的495nm激发和519nm发射条件，使用Varioskan-Lux多模荧光微板读取器立即测量每个孔的相对荧光单位(Relative Fluorescence Unit，RFU)，结果图表如图6所示。
如图6所示，图A显示ACE2肽与SAR-CoV-2病毒刺突蛋白结合的1:1结合关系，曲线拟合的R2值为0.9865。仍然参照图6，图B显示在研究中使用的剂量下CendR肽与SARS-CoV-2病毒刺突蛋白结合的1∶1结合关系，曲线拟合的R2值为0.9870。
在实验2中，板2(见表13)用200μL SARS-CoV-2Spike S1+S2ECD His protein在孔A1至Fl 0中涂覆，最终涂覆量为0.66μg/孔。将板在5℃冰箱中培养过夜。第2天，所有测定制备均在室温下进行，但培养在37℃下进行。将板2从冰箱中取出，并通过将板在水槽上方弹动去除液体。用250μL 1x PBS冲洗所有孔3次。最后1次冲洗后，将板倒置在纸巾上，用力拍打到，以去除剩余的多余液体。然后用200μL 5％BSA封闭所有孔，并在37℃下培养板1小时。培养后，除去液体，并如上所述洗涤孔。
NRP1ab huIgG Fc(D12A N1E)蛋白进一步稀释至1200μL PBS中的64μg/mL。向孔A2-A10、B2-B10和C2-C10中加入190μL1xPBS。向孔A1、B1和C1中加入380μL的NRP1ab-huIgGFc(D12A N1E)蛋白稀释液。然后，使用多通道移液器从每个第一个孔(A1、B1和C1)中移除190μL，并转移到下一列孔。仔细混合样本，以免污染相邻孔。对所有孔进行此操作，直至A10、B10、C10和D10完成。该过程使得A、B、C和D行中从第1列到第10列的每个孔稀释2倍(见表12)。丢弃第10列中最终稀释后剩余的190μL。
将平板置于37℃培养箱中1小时。培养后，除去液体，如上所述洗涤并干燥板。
FITC标记的抗人IgG稀释至在PBS中的3.1μg/mL，并将200μL该稀释液添加到板上除D-H行和第11列和第12列之外的所有孔中。将平板置于37℃培养箱中1小时。培养后，除去液体，如上所述洗涤并干燥板。
使用Varioskan-Lux多模荧光微板读取器(Varioskan Lux MultimodeFluorescence Microplate reader)，使用制造商建议的495nm激发和519nm发射条件，测量每个孔的相对荧光单元(RFU)，结果图表如图7所示。
参照图7，该图显示在本研究中使用的剂量范围内huN1ab-huIgG Fc构建体与SARS-CoV-2病毒刺突蛋白的1：1结合，曲线拟合的R2值为0.9966。需要注意的是，图中省略了41.5ng和0.7ng点，因为这两个点视为与曲线上其他数据点显著偏离的异常值。
上述方法也用于测定本文所述的各种多肽构建体对SARS-CoV-2 Spike S1+S2ECD-His的亲和力。
实施例5.基于细胞的分析
细胞系开发-反式基因表达细胞系的载体克隆和工程
为了在基于细胞的检测系统中测试可能干扰SARS-CoV-2感染的各种疗法，用慢病毒(lentivirus，LV)改变HEK-293T和Vero E6细胞，以稳定地过表达ACE2、NRP1、TMPRSS2或三者的任何组合。表14列出内部开发的用于细胞慢病毒转导的质粒。
表14.用于细胞系发育的质粒列表。
试剂(质粒) 供应商
LV-ACE2-Zco Pinetrcee
LV-NRP1-Puro Pinetree
LV-TMPRSS2-Blast Pinetree
质粒发育
使用hACE2质粒(Addgene#1786)作为DNA模板，通过PCR扩增全长ACE2基因，并使用NheI和XhoI将其克隆到松树慢病毒质粒LV-IRES-Zeo中。使用pcDNA3.4-NRPl通过PCR扩增全长NRP1基因，该基因由Genewiz Inc.(Cambridge，MA)合成，并使用NheI和XhoI克隆到松树慢病毒质粒LV-2A-Puro中。使用TMPRSS2质粒(Addgene#53887)作为DNA模板通过PCR扩增全长TMPRSS2基因，并克隆到松树慢病毒质粒LV-2A-Blast中。慢病毒质粒中ACE2、NRP1和TMPRSS2的DNA序列由Sanger sequencing at Genewiz Inc.(Cambridge,MA)测序证实。
LV-ACE2的慢病毒包装。HEK-293T细胞中的LV-NRP1和LV-TMPRSS2
对于慢病毒包装，在6孔板的单个孔中以90％的汇合率(confluence)转染HEK-293T细胞。转染使用LIP OFECT AMINETM 3000(ThermoFisher Scientific)进行，每个孔使用3.6μg的pCMVδ质粒DNA(Pinetree)、2.4g的pVSV-g质粒DNA(Pinetree)以及5μg的LV-ACE2或LV-NRP1或LV-TMPRS2质粒DNA。转染后24小时，将培养基改为1.5ml OPTITEMTM培养基(GIBCOTM)，且在转染后48h和72h收获含有慢病毒的上清液。
LV-ACE2的慢病毒包装。HEK-293T细胞中的LV-NRP1和LV-TMPRSS2
对于慢病毒包装，在6孔板的单个孔中以90％的汇合率转染HEK-293T细胞。转染使用LIPOFECTAMINETM 3000(ThermoFisher Scientific)进行，每个孔使用3.6μg的pCMVδ质粒DNA(Pinetree)、2.4g的pVSV-g质粒DNA(Pinetree)以及5μg的LV-ACE2或LV-NRP1或LV-TMPRS2质粒DNA。转染后24小时，将培养基改为1.5ml OPTITEMTM培养基(GIBCOTM)，且转染后48小时和72小时收获含有慢病毒的上清液，使用45μm过滤器过滤并在-80℃下储存，直到进一步使用。
稳定的细胞系生成
为了产生HEK-293T、Vero E6或其他细胞系稳定表达的ACE2、NRP1、TMPRSS2或三种受体的组合，在病毒感染前24小时将细胞在其各自的完整生长培养基中接种到6孔板中。在感染当天，细胞应达到70-80％的汇合。用于转导的LV在冰上解冻，并在补充有聚胺或另一种转导增强添加剂的完整生长培养基中进行含有单个LV或多个LV的逐步稀释(1:10、1:50、1:100、1:500)。然后将稀释液添加到板孔中(每孔总体积1.5ml)。培养48-72小时后，取出培养基，用含有抗生素Blasticidin、Zeocin、Purmycin或Hygromycin的选择培养基代替。各个选择标志物的最佳浓度根据细胞系和培养条件而变化，并且在开始选择之前通过处理未转化的亲代细胞(杀伤曲线)来确定。选择细胞6至14天，或者至少只要对照(未转染)亲代细胞完全死亡。在选择过程中，每72小时更换包含相应选择剂的介质。一旦选择完成，抗生素浓度可以降低或完全去除。
稳定池生成后，可进行进一步的连续稀释，然后进行单细胞克隆扩增。为了确认足够的转基因表达，使用流式细胞术或蛋白质印迹分析稳定的池或单细胞克隆。
用SARS-CoV-2刺突蛋白(S)或VSV刺突G(对照)包装假型慢病毒
为了研究各种疗法干预SARS-CoV-2感染的效果，我们首先产生了复制缺陷型慢病毒，其假型为SARS-CoV-2刺突蛋白(S)或其突变型，缺少C-端19个氨基酸，预测其作为内质网滞留信号。平行包装带有VSV尖峰G的慢病毒假型，作为对照。SARS-CoV-2和VSV-G假型慢病毒都含有萤火虫荧光素酶和eGFP盒，它们在转导细胞中的CMV启动子下共表达。因此，即使对照和SARS-CoV-2掺入的病毒都是复制缺陷的，也可以通过检测eGFP荧光以及在感染细胞与含有荧光素的培养基培养后通过发光测量在显微镜下监测病毒进入靶细胞。用于假病毒包装的质粒列于表15中。
表15.假病毒包装的质粒列表。
为了产生足够量的SARS-CoV-2慢病毒假病毒，使用PEI作为转染剂的大规模包装方案如下：
第1天：
将HEK-293T细胞铺在具有约1.4x106个细胞的15cm平板上。
第2天：
15cm平板中的HEK-293T细胞应达到70-80％的汇合率，且在转染前2h应将培养基改为15ml预热的完全生长培养基。如表16或表17所示，将质粒DNA添加到5ml OptiMEM中。并行地，将1μl的10mM PEI(Sigma Aldrich#408727)与5ml的OptiMEM混合，并通过0.22μm过滤器过滤灭菌。然后将PEI/OptiMEM溶液滴加到5ml Opti-MEM/DNA混合物中，然后在室温下培养20分钟。培养后，将10ml PEI/OptiMEM/DNA混合物添加到每个15cm板中，注意不要破坏粘附的HEK-293T细胞，并在37C、5％CO2下培养过夜。
表16.SARS-CoV-2假病毒的包装。
试剂 每15cm板的量
OptiMEM 5mL
LV-Fluc-GFP-Puro 25μg
pCMV delta 18μg
pcDNA3.1-SARS-Spike 25μg
PEI(10mM) 1μL
OptiMEM 5mL
表17.VSV Spike G控制病毒的包装。
试剂 每15cm板的量
OptiMEM 5mL
LV-Flue-GFP-Puro 25μg
pCMV delta 18μg
pVSV-G 12μg
PEI(10mM) 1μL
OptiMEM 5mL
第3天：
早上：将培养基更换为20mL预热完全培养基；傍晚(转染后约24小时)：将培养液更换为11mL OptiMEM(收集培养基)。
第4天：
傍晚：收集含有假病毒的培养基，并加入11mL新鲜预热的收集培养基。收集的含病毒培养基应储存在4℃。
第5天：
傍晚：收集介质，并用第一次收集池。漂白并丢弃盘子。使用0.22μm过滤器和60mL注射器的注射器过滤器过滤含病毒的收集介质。
慢病毒载体的浓度和滴定
收集和过滤后，使用超速离心或按照供应商说明使用病毒沉淀溶液(例PEG-it，System Biosciences#LV825A-1)浓缩SARS-CoV-2刺突蛋白(S)或VSV刺突蛋白G(对照)假型慢病毒。浓缩慢病毒的滴定可以使用定量PCR、流式细胞术(本方案中使用的慢病毒载体表达GFP)或通过基于病毒RNA的相对载体颗粒数的测定来进行，如前所述。
实施例6.用于在存在或不存在治疗剂的情况下定量测量伪病毒转导 (pseudovirus transduction)的细胞测定。
第1天：细胞培养
将研究SARS-CoV-2慢病毒假病毒感染性的靶细胞，例如293T、293T-ACE2、293T-TMPRSS2、293T-NRP 1、293T-ACE2/TMPRSS2，用50μl完全培养基清洁底部96孔微孔板(ThermoFisher，Nunc#165305)，并在37℃下用5％CO2培养过夜。
第2天：病毒转导
在不存在或存在抗病毒疗法的情况下进行病毒转导：
在完整培养基中制备待测试的抗病毒剂系列稀释液。
·测试与SARS-CoV-2刺突蛋白S结合的试剂：
将5至25μL浓缩SARS-CoV-2假型慢病毒与等体积的系列稀释抗Spike治疗剂(例如抗Spike单克隆抗体、ACE2或NRP1诱饵受体构建体)预培养30分钟。培养后，向每个孔中加入10至40μL含有不同稀释的抗Spike治疗剂的病毒/抗体混合物。
·为了测试与靶细胞上表达的ACE2、NRP1、TMPRSS2或其他受体结合并预期参与病毒转导的试剂：
将5至25μL的系列稀释的抗受体治疗剂(例如抗ACE2mAb)添加到含有靶细胞的每个孔中并培养30分钟。培养后，向每个孔中加入等量的浓缩SARS-CoV-2假型慢病毒。
·含有相同数量靶细胞的对照孔不使用治疗剂或假病毒处理。
·VSV-G假型慢病毒含有萤火虫荧光素酶，eGFP盒可以以类似方式添加，并用作另一种对照。
按照上述方法处理后，在37℃下用5％的CO2培养平板。转导后48至72小时，可使用荧光显微镜观察和定量eGFP表达。为了发光读出，制备荧光素在完全培养基中的溶液，其中每孔加入50μL(最终浓度0.4mg/mL荧光素)，然后培养20至30分钟。通过在发光微板读取器(例如ThermoFisher Scientific Varioskan Lux Multimode Microplate Reader)上测量转导的细胞荧光素酶活性来确定转导效率。或者，可以通过流式细胞术和GFP阳性细胞的门控进一步测量转导效率。
实施例7.SARS-CoV-2基于Vero E6的体外感染性和细胞病变(cvtopathic)效应测 定
为了测试和分析供试品在Vero E66细胞中对复制活性SARS-CoV2病毒的抗病毒活性，可以进行体外抑制测定，以测试和分析本发明化合物在Vero E5细胞中对繁殖活性SARS-CoV2病毒的抗病毒活性。
方法
例如，生物研究信息中心(Biological Research Information Center，BRIC)的改良生物测定方案可用于测试本发明的抗病毒化合物。化合物，例如，可以是样品1-4中描述的那些(如下所述)；所有样品都可以是液体并且可溶于水。用于稀释样品1-3的溶剂可以是PBS，而用于样品4的溶剂可以为DMSO。细胞株可以是Vero E6细胞(ATCC)。病毒株可以是SARS-CoV-2(例如NCCP43326；来源于韩国CDC)。
细胞培养条件如下：细胞在37℃、95％湿度、5％CO2的培养箱中培养，每8小时监测一次。培养基和试剂：DMEM、10％FBS、1％Pen/Strep、1％L-谷氨酰胺200mM、1％丙酮酸钠100mM、非必需氨基酸。培养皿和细胞密度：细胞可在96孔板中以1xl04/孔培养，但如果未检测到稳定的病毒，细胞密度可能会发生变化。
使用本发明化合物的抗病毒测定可在以下情况下进行：由于作用机制不同于每种抗病毒化合物，因此寻找标准测定条件可能不可行。因此，化验条件可在个案基础上协调(例如，进入阻断剂、复制阻断剂等)。
病毒传播试验可使用超过102TCiD50/mL的活性病毒。
测试的化合物可在DMEM中连续稀释2-1至2-6。病毒可按如下方式稀释：SARS-CoV-2的滴度可在使用前测量，1.0mL病毒可在4℃ PBS中稀释10倍后使用。
处理条件可如下：移除96孔板中Vero E6细胞μ的培养基，并用100L PBS洗涤两次。接下来，可添加50μl连续稀释的供试品，并添加50μl病毒(102TCID50/ml)用于感染。
本发明化合物的抗病毒活性分析可如下评估：在感染后48至72小时监测细胞病变效应。RNA可以从感染的细胞中分离出来，qPCR分析用于估计病毒的残留量。
实施例8.感染性分析
感染性测定可按如下方式进行：首先，用于疗效评估的COVID病毒可能是通过SARS-CoV-2(例如，来源于韩国CDC)在Vero E6细胞中传代三次而适应的病毒。病毒(最低103TCID50/mL)可稀释10倍，接种到Vero E6细胞中，并同时用以下提供的各种浓度的化合物处理：
样品1：hNRP1ab hFc(包含a和b结构域的人NRP1片段，与人IgG1 Fc融合)；
样品2:hNRP1b1b2 his(包含b1b2结构域的人NRP1片段，在其C-末端融合至6x组氨酸标签)；
样品3:hNRP1b1b2 aaa-his(包含b1b2结构域的人NRP1片段，其包含Y297A/S346A/Y353A突变，其降低VEGF结合，在其C-末端融合至6x组氨酸标签)；和
样品4:Remdesvir(对照)。
雷德斯韦为该领域普通技术人员所熟知，其商品名为(Gileadsciences；CAS编号1809249-37-3)
样品处理后48小时至96小时可观察到细胞活力和形态。
细胞毒性结果：在任何测试物质的最高浓度下，均未观察到细胞毒性(数据未显示)。
感染性结果：在同时处理病毒培养液和试验制剂稀释剂的实验中，病毒处理组48小时后可观察到细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)。在样品1至3的所有稀释液中可能观察不到CPE，并且在接种后72小时以1.11μM的浓度在样品4中可能观察到CPE。
可在96小时对每个样品进行两次冷冻和解冻，以定量评估病毒增殖程度。对于样品1、2和3，最低稀释因子可以是0.00003μM，对于样品4，可以从观察到CPE的1.11μM孔中提取RNA，然后进行实时PCR。这些结果可以解释为在没有毒性的情况下显著抑制了病毒的感染和细胞内感染病毒的复制，可以认为有必要通过动物实验来阐明感染动物的治疗效果。
实施例9.动物试验
感染性测定可按如下方式进行：SARS-CoV-2分离株可在VeroE6细胞中，在含有0.3％牛血清白蛋白(BSA)和1μg的L-甲苯基酰胺-2-苯基乙基氯甲基酮处理的胰蛋白酶/mL的OptiMEM中繁殖，或在37℃时，在补充2％胎牛血清的最低必需培养基(MEM)中，在Vero 76细胞中繁殖。
SARS-CoV-2的所有实验可在增强型生物安全等级3(BSL3)遏制实验室或增强型BSL3遏制实验室中进行。
实验感染
本研究可使用一个月大的雌性叙利亚仓鼠和7-8个月大雌性叙利亚仓鼠。基线体重可在感染前测量。在氯胺酮-甲苯噻嗪麻醉下，每组4只仓鼠可通过鼻内(100μL)和眼内(10μL)途径的组合接种105.6PFU(110μL)或103PFU(110μL)SARS-CoV-2分离物。可在14天内每天监测体重。
对于病毒学和病理学检查，每组2只、4只或5只仓鼠可能通过鼻内和眼部途径感染105.6PFU(110μL)或103PFU(110μL)病毒；感染后3、6和10天，可杀死动物，并收集其器官(例如，鼻甲、气管、肺、眼睑、大脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、空肠、结肠和血液)。
对于再感染实验，每组三只仓鼠可μ通过鼻内和眼部途径的组合感染105.6PFU(110μL)或103PFU(110μL)SARS-CoV-2或PBS(模拟)。在感染后第20天，这些动物可以通过鼻内和眼内途径的组合再次感染105.6PFU的病毒。在再次感染后的第4天，可以杀死动物，并且可以通过VeroE6/TMPRSS2细胞中的菌斑测定来确定鼻甲、气管和肺中的病毒滴度。
对于被动转移实验，八只仓鼠可能通过鼻内和眼内途径的组合感染105.6PFU(110μL)或103PFU(110μL)SARS-CoV-2。可以在感染后第38天或第39天从这些感染的仓鼠身上采集血清样本，并将其合并。对照血清可从未感染的年龄匹配的仓鼠中获得。每组3只仓鼠可鼻内接种103PFU SARS-CoV-2。在感染后第1天或第2天，仓鼠可腹膜内注射感染后血清或对照血清(每只仓鼠2mL)。动物可在感染后第4天被杀死，鼻甲和肺中的病毒滴度可通过VeroE6/TMPRSS2细胞中的菌斑测定来确定。除经批准的方案外，所有仓鼠实验均可根据《动物实验的正确进行》(Proper Conduct of Animal Experiments)和相应指南进行。
实施例10.SEQ ID NO:122对仓鼠SARS-CoV-2的体内效力
方法
评估了SEQ ID NO:122对仓鼠SARS-CoV-2的体内效力。
本例包括6个臂，每组4只仓鼠。这些动物都是从Charles River实验室获得的雄性叙利亚金仓鼠，体重约60-70克。仓鼠从接种到第4天每天称重，第7天安乐死时再次称重。在驯化后的第0、2、4和7天，进行了20分钟的体积描记(plethysmography，PFT)记录，之后(在异氟醚麻醉下)从颈静脉或前腔静脉采集100μL血液。
在气管内病毒接种前第0天采集血液并进行体积描记术(PFT)。分别以133mg/kg和13.3mg/kg的剂量用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉动物，然后进行病毒攻击。使用气管内病毒接种物(SARS-CoV-2)进行病毒攻击，该接种物是严重急性呼吸综合征相关冠状病毒2(SARS-CoV-2)，分离物USA-WA1/2020，由51个菌斑形成单位(PFU)或510个PFU组成的50μL EMEM。对照组包括非病毒对照组，由50μL EMEM组成；以及由SAD-S35(抗SARS-CoV-2RBD中和抗体，人IgG1)组成的阳性对照(参见下文关于SAD-S335的信息)。
评估的六个臂如下：
臂(1)非病毒EMEM对照，随后在接种后12小时和24小时(PI)给予0.5mL PBS和250mM NaCl；
臂(2)51PFU，随后在12和24小时PI下给予0.5mL PBS和250mM NaCl；
臂(3)510PFU，随后在12小时和24小时PI时给予0.5mL PBS和250mM NaCl；
臂(4)51PFU，随后在12小时和24小时PI给予SEQ ID NO:122腹膜内注射(15mg/kg)；
臂(5)510PFU，随后在12小时和24小时PI时腹膜内注射SEQ ID NO:122(15mg/kg)；和
臂(6)510PFU，随后在12小时和24小时PI时腹膜内注射SAD-S35(15mg/kg)。
SAD-S35(抗SARS-CoV-2RBD中和抗体，人IgG1)用作阳性对照。SAD-S35是针对SARS-CoV-2刺突蛋白RBD结构域的特异性抗体。SAD-S35从SARS-CoV-2感染患者中分离，并从人293细胞(HEK293)中重组产生。SAD-S35可从ACROBiosystems(1Innovation Way，Newark，DE 19711；目录号SAD-S335)获得。
在体积描记术记录后的第7天，使用0.1mL IP(含戊巴比妥钠和苯妥英钠的安乐死溶液)对仓鼠实施安乐死，采集血液，用1.5mL PBS进行支气管肺泡灌洗，用1.5毫升10％中性缓冲福尔马林对肺进行充气，随后固定进行苏木精和伊红(H&E)染色。/>
动物体重用Excel绘制。Plethysography数据以本领域普通技术人员已知的啮齿动物病毒肺活量测定文献中公布的标准格式表示为log Penh、In Rpef和平方根EF50。
对使用Qiagen病毒RNA分离试剂盒从血液样本和支气管肺泡灌洗液(BAL)中分离的RNA进行RT-qPCR。针对SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白的CDC 测定引物/探针序列和条件用于ABI QuantStudio 3热循环仪。Promega-/>RT-PCR和病毒核衣壳的克隆标准用于定量基因组拷贝。
结果
在病毒接种过程中，51PFU盐水处理组的8号仓鼠死亡，在实验结束时，4号仓鼠(仅介质接种，PBS注射)的数据在非病毒组中被数字破坏，无法使用，这些对照组各有3只动物。所有其他组包括4只仓鼠。
各组之间未观察到明显的体重变化。图8和9。在最初的1-2天，所有组的PI都出现了较差的体重增加，而在非病毒对照组的第1天PI中出现了体重减轻。然而，在余下的研究中，所有动物的体重都继续增加。由于从第0天到第1天，非病毒对照组的体重增加发生了唯一的显著变化，因此两组之间未检测到因治疗或病毒接种引起的不良影响。
体积描记术
对全身体积描记图中3个计算参数的分析用于表征病毒感染和治疗对呼吸生理的影响。3个参数为增强暂停(Penh)；Rpef；和EF50。
增强暂停(Penh)是计算气道功能的无单位指数。金边计算根据以下公式进行：
其中，PEF是呼吸的呼气峰值流量(peak expiratory flow of breath)；PIF是呼吸的吸气峰值流量(peak inspiratory flow of breath)；Te是呼气部分的时间；Tr是呼出65％呼吸量所需的时间。Penh作为气道阻力的间接测量，并提供呼吸模式的非特异性评估。
Penh方程考虑了四个呼吸参数，包括：呼气峰值流量(PEF)；峰值吸气流量(PIF)；呼气部分时间(Te)；以及呼出65％呼吸量(Tr)所需的时间。Penh作为气道阻力的间接测量，并提供对呼吸模式的非特异性评估。
图10是呼吸周期的图形表示，显示了用于计算用于本研究中各组之间比较的呼吸参数的各种测量值。
“Rpef”量度呼气流量峰值(peak expiratory follow，PEF)与总呼气时间的比值。Rpef根据以下公式计算：
其中，PEF是呼气流量峰值；Te是总呼气时间。
当呼吸的末端部分因气道收缩而体积耗尽而受阻时，慢性阻塞性肺病和SARS-CoV-1感染的计算参数较低。图11。
EF50为50％体积时的流速(mL/秒)。EF50与Rpef相似，在呼气期间对气道收缩敏感；然而，呼气周期的后期检测呼气的变化。SARS-CoV-1的计算参数缩短，哮喘的计算参数延长。图12。
根据本领域技术人员在呈现此类数据时已知的常规方法，对3个计算参数进行数学转换：Penh到log Penh，Rpef到In Rpef，EF50到EF50的平方根。
来自51PFU治疗组和510PFU治疗的仓鼠组的体积描记数据的结果如图13和14所示。
51个PFU组的Log Penh数据表明，7天后，SEQ ID NO:122和未经治疗的臂均恢复到基线值，呼吸参数无残余显著变化。图13。在第2天，SEQ ID NO:122组比在第4天偏离最大的未治疗组与自身基线值的偏差更大，但这在统计学上不显著。在第7天，51个PFU处理组和未处理组之间存在显著差异(T检验，T＝3.998，p<0.01)，这意味着SEQ ID NO:122处理组继续返回基线，而未处理组在研究结束时从其基线值逐渐变化。
在第7天，SEQ ID NO:122治疗组和非病毒攻击对照组之间存在显著差异(T检验，T＝6.058，P<0.001)。在实验期间，非病毒对照组的log Penh参数保持相对不变。相比之下，510PFU攻击导致log Penh与基线的持续偏差在未治疗组中最大，在SEQ ID NO:122治疗组中较小，在SAD-S35抗体治疗组中甚至更小。SAD-S35治疗组和未治疗病毒组在第4天的logPenh之间存在显著差异(T检验，T＝2.544，P<0.05)，在510PFU攻击中，没有发现其他统计相关性。
在In Rpef数据中，510PFU激发显示了治疗效果比51PFU激发组更为显著。图15和16。与SEQ ID NO:122治疗的臂相比，未经治疗的51PFU攻击显示ln Rpef参数的持续变化，其正在返回基线值。在第4天，非病毒对照组和用SEQ ID NO:122治疗的51PFU组之间存在统计学显著差异(T检验，T＝2.75，P<0.05)。在第7天，无病毒对照组与未经治疗的51个PFU攻击组的ln Rpef之间存在统计学显着差异(T试验，T＝2.775，P<0.05)与未治疗组相比，治疗组(SEQ ID NO:122和SAD-S35)的值。Rpef在很大程度上源自呼气末期的变化，此时气道收缩减慢了呼气末期的时间。
检查的最终参数，EF50的平方根，在两个挑战组中，无论有无治疗，几乎没有变化。51个PFU和510个PFU挑战组中的任何一天都没有统计学上的显著差异。图17和18。该参数对SARS-CoV-2感染期间变化很小的过期初始部分敏感。
RT定量PCR(RT-qPCR)
肝素化血液在-80℃下储存之前，在PBS中稀释1:10。使用140μL从非病毒对照组、51PFU PBS处理组和510PFU PBS处理组中分离总RNA。将1微升分离的RNA进行病毒核衣壳的CDC RT-qPCR，并将结果与克隆标准进行比较。在任何样本中均未检测到SARS-CoV-2基因组拷贝，而对照组的功能如预期，因此未对其余样本进行测试。
组织学
从选自每个研究臂的代表性仓鼠的肺部获得的组织学切片如图19-24所示。在进行支气管肺泡灌洗后，在病毒或培养基攻击后7天固定组织切片并染色。与51PFU组中轻度中度慢性活动性炎症的少数区域(图20)相比，接种培养基的对照组中不存在炎症(图19)。在510PFU臂中观察到几个更严重的慢性活动性炎症区域。图21。
在51PFU和510PFU处理的组织中，炎症区域主要含有淋巴细胞和浆细胞，少量巨噬细胞含有细胞碎片和中性粒细胞。图20-21。很少见到终末细支气管上皮细胞的合胞体。
使用SEQ ID NO:122的治疗没有减少51PFU或510PFU臂的炎症面积。图22-23。同样，用SAD-S35抗体治疗并没有减少510PFU组的炎症大小或严重程度。图24。
支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage，BAL)的定量RT-PCR
第7天安乐死后，使用1mL PBS洗肺。从140μL BAL中分离总RNA，并在50μL中洗脱；由此，使用美国疾控中心实时逆转录PCR检测严重急性呼吸综合征冠状病毒2型的小组，对1μL进行SARS-CoV-2核衣壳基因的RT-qPCR(https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html).
RT-qPCR测定结果如下表所示。
表18.定量RT-PCR结果。组号对应于上述方法中描述的六个臂，并在治疗栏中概述。
在接种EMEM的对照组(第1组)中未检测到病毒。单因素方差分析未发现显著差异(F＝0.788，F临界值＝3.326，组内df＝5，组间df＝10)。缺乏统计差异是核衣壳基因拷贝数存在显著标准偏差的结果。一般来说，由于BAL中拷贝数的单一异常值，每组的标准误差大于或等于组平均值。挑战与挑战+治疗的单个单尾T检验比较未能证明每微升从BAL中分离的RNA的核衣壳拷贝数量存在显著差异。
讨论
在体积描记图数据中发现的用SEQ ID NO:122和SAD35治疗的有益效果似乎与组织学观察到的炎症程度无关。这可能有几个原因，包括：当未进行组织学评估时，药物在感染早期降低了炎症反应；药物治疗降低了呼气期间的气道阻力，减轻了一定程度的气道收缩，但对炎症没有影响；和/或治疗改变了支气管肺炎期间开始的早期纤维化的发展，从而允许更好的肺顺应性。
由于尚不清楚SEQ ID NO:122和SAD35在仓鼠体内的药代动力学，治疗的小但显著的有益效果可能已被减弱。如果这些治疗在仓鼠体内的半衰期较短，或者如果化合物的病毒复制的最低抑制浓度高于所达到的浓度，则SARS-CoV-2病毒复制可能暂时减慢或受损，不足以阻止随后的炎症反应。在体外阻断SARS-CoV-2病毒复制的SAD35 IgG抗体可能在肺泡空间中没有达到足够的水平，无法完全抑制病毒复制，因为这不是一种分泌抗体。
通过RT-qPCR分离的每微升RNA的SARS-CoV-2核衣壳基因靶的BAL液分析表明，PBS与SEQ ID no:122或SADS35处理的病毒攻击滴度之间没有显著差异。通常，每组中有一只仓鼠显示出高拷贝数，这在SEQ ID NO:122处理的动物中最为显著。
实施例11.VT116、VT114和VT130对仓鼠SARS-CoV-2的体内疗效
在本实施例中，体重95-100克的幼年雄性仓鼠提供购买的颈静脉导管，在进行1500PFU SARS-CoV-2气管内挑战后，通过静脉(intravenous，IV)施用SEQ ID NO:122、SEQID NO:154和SEQ ID NO:192进行治疗。
将攻击病毒稀释至100PFU/μL的浓度，每次气管内注射(intra-tracheal，IT)15μL。本实施例有五个臂(三种药物施用组各自n＝5，两个对照组n＝4)。每天监测仓鼠体重，确定临床疾病评分。在第0天、2天、4天和7天记录每只仓鼠的全身体积描记图(PFT)。从第0天、2天、4天和7天采集的血液中测定干扰素γ(IFNy)的血清水平。针对核衣壳基因的RT-qPCR在以下样本上进行：第2天和第4天采集的口咽拭子，第4天从每组一只仓鼠采集的支气管肺泡灌洗液(BAL)，第7天从其余仓鼠采集。还对从嗅球样品中提取的RNA进行RT-qPCR。
所有仓鼠在第7天被安乐死；使用1.5mL PBS进行支气管肺泡灌洗，然后固定肺部进行组织学检查，并解剖嗅球。病毒对照组给予IT病毒，并在SARS-CoV-2攻击后接受IV盐水注射。假感染对照组施用15μL DMEM IT，然后静脉注射盐水。
每种化合物的剂量为15mg/kg，其体积小于0.7mL。对照动物接受0.5mL的250mM生理盐水。这些化合物或盐水在IT病毒攻击后12小时、24小时和48小时静脉注射。
方法
在整个研究过程中，每天至少对所有仓鼠称重并观察一次。称重动物后，在第0天、2天、4天和7天进行PFT。第0天早上，称重并获得PFT后，用腹腔内氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉(分别为133mg/kg和13.3mg/kg)麻醉仓鼠。麻醉后，仓鼠的门牙悬挂在倾斜的板上，通过气管照明观察声门。接下来，在声门上放置5μL 2％利多卡因溶液30秒，然后放置IT18号导管。导管在气管中的位置通过观察导管开口处的冷冻牙科镜上的呼吸冷凝物来确认。确认导管位置后，使用100μL凝胶加载移液管尖端通过IT导管施用15μL含有1500PFU的病毒接种物或15μL用于非病毒对照的DMEM。移除凝胶加载头后，一毫升空气通过IT导管进入肺部，以帮助传播接种物，移除导管，让仓鼠从麻醉中苏醒。
病毒接种物是严重急性呼吸综合征相关冠状病毒2(SARS-CoV-2)，分离物USA-WA1/2020，从BEI资源(www.beiresources.org)获得。
仓鼠的颈静脉导管在每次操纵时(导管体积41μL)通过去除抗凝剂溶液(25％葡萄糖和500U/mL肝素)来维持；然后，在抽血或给予治疗后，用μ250L盐水冲洗导管并更换肝素葡萄糖溶液。
每次操纵仓鼠进行血液采集或物质注射时，都用异氟烷麻醉。给仓鼠称重，并在病毒接种后12小时、24小时和48小时通过颈静脉导管给予15mg/kg的给定治疗或盐水。在第0天、2天、4天和7天，采集体重后，记录20分钟的PFT；然后进行异氟醚麻醉并采集500μL血液用于分析选择的细胞因子。最后，在安乐死后(第2天和第4天)或BAL(第7天)进行咽拭子检查。五个研究组如下：
臂(1)施用IT的非病毒DMEM对照，然后静脉注射0.5mL盐水；
臂(2)非治疗对照，1500PFU SARS-CoV-2(WA-1)IT，随后静脉注射250mM NaCl；
臂(3)1500PFU，随后是15mg/kg的SEQ ID NO:122IV；
臂(4)1500PFU，随后是15mg/kg的SEQ ID NO:154IV；和
臂(5)1500PFU，随后是15mg/kg的SEQ ID NO:192IV；
对仓鼠实施安乐死，并在第4天和第7天采集样本。第4天，在记录体积描记术和体重后，使用0.1mL IP对每组一只仓鼠实施安乐死；剩余的仓鼠在接种后第7天实施安乐死。安乐死后，采集血液用于IFNy测定，解剖气管并插管，然后采集BAL并固定肺部。BAL收集包括将1.5mL盐水注入肺部，然后取出。从BAL中提取的RNA用于RT-qPCR以确定肺中SARS-CoV-2的相对数量。BAL收集后，通过气管插管用3mL 10％中性缓冲福尔马林扩张肺部，并进行石蜡包埋和H&E染色。此外，从大脑中解剖嗅球用于RNA提取和SARS-CoV-2检测。
PFT以鼠病毒肺活量测定法公布的标准格式表示为Penh、Rpef和EF50，并在上述示例中计算。将咽拭子(棉尖)置于175μL PBS中并转动15秒；接下来，140μL用于RNA提取。使用Qiagen病毒RNA分离试剂盒从咽拭子和BAL中提取RNA。使用Qiagen RNeasy和Qia碎纸机柱从嗅球中提取RNA。
本研究中使用的针对SARS-CoV-2病毒核衣壳的测定引物/探针序列和反应条件由CDC发布(见上文)。/>检测在ABI QuantStudio 3热循环仪上使用Promega/>RT-PCR进行。将引物产生的扩增子克隆到质粒pCR4中，并用作定量标准，以确定从拭子、BAL或组织中提取的1微升RNA中的基因组拷贝数。IFNy、肿瘤坏死因子α(TNFa)、血管紧张素II和血管紧张素1-7的细胞因子分析使用MyBioSource和GenroseScientific提供的试剂盒通过抗原捕获ELISA进行。
结果
任何实验组(或个体)均未出现明显的体重减轻。图25。
病毒滴度
从咽拭子或BAL中提取的核衣壳基因拷贝数/μL RNA检测到的病毒滴度在IT接种后第4天最高。图26。病毒对照组从第4天采集的咽拭子中洗脱的PFU的滴度标准偏差较大，范围为807-17158。第7天，对140μL BAL进行RT-qPCR，但此时所有组的拷贝数均为最小(<17PFU/μL)。每个复合治疗组在接种后第4天接种的样本中具有最大的病毒拷贝数，这些拷贝数低于病毒攻击的非治疗对照中检测到的拷贝数。图26。
此外，RT qPCR检测到除中等对照组外的所有组的大脑嗅球部分中存在SARS-CoV-2基因组。与未经处理的病毒对照相比，用化合物处理未导致RT-qPCR在从嗅球提取的RNA中检测到的病毒核衣壳基因拷贝数减少。图27。从VT116处理的仓鼠提取的RNA中拷贝数最多，其次是VT130处理的仓鼠、SEQ ID NO:122和病毒攻击未处理的对照。这是否代表大脑中具有传染性、复制能力的SARS-CoV-2尚未确定，但治疗组中更大的拷贝数值得注意。
在第7天，当从小鼠收集的BAL中检测不到SARS-CoV-2时，基因组出现在大脑的嗅球中(见下文)。
全身体积描记术
接种后第2天，化合物治疗组和病毒对照组之间的PFT测试结果存在显著差异(T检验，P<0.01SEQ ID NO:122和SEQ ID NO:154，P<0.05VT130)。图28-30。当比较各组时，第4天和第7天没有保留这种差异。第2天检测到的显著差异可能与试验化合物的施用有关，因为在单个动物中观察到对SEQ ID NO:192的单一不良反应。与对照组相比，治疗组的EF50值降低，与治疗组呼气50％的时间更短有关。图28。这种较短的持续时间在生理上与呼吸阻力降低、支气管收缩消失有关，这可能是对气道平滑肌的直接影响，也可能是减少肺部炎症的间接影响。
血浆细胞因子值
干扰素γ(Interferon-gamma，IFNy)水平在所有病毒接种组中增加，在病毒对照组第2天达到峰值，在SEQ ID NO:122处理组和SEQ ID NO:192组中达到峰值。图31。
SEQ ID NO:154治疗组的IFNy血浆水平在第4天达到峰值(500pg/mL血浆)。在SEQID NO:122组中，这些水平在第7天下降到接近基线，在SEQ ID NO：192组中，在第4天下降到了接近基线，然而在SEQ ID NO:192和SEQ ID NO:154组中，IFNy水平在第七天出现了反常的上升。这可能与SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:192治疗组第7天在仓鼠大脑中检测到的病毒基因组拷贝有关。在研究结束时，病毒对照组没有恢复到IFNy水平的基线值。还测量了肿瘤坏死因子α(TNFa)水平，但没有定论(数据未显示)。
通过研究，所有组中的血管紧张素1-7水平均下降，病毒对照组和培养基对照组之间的下降显著(T检验，双尾，p<0.05)。图32。接种后第2天，培养基对照组和所有其他组之间的下降具有统计学意义，但仅在第7天两个对照组中确定的水平之间。相比之下，在研究过程中，所有组的血管紧张素II水平都以类似的方式下降，但这些下降没有统计学意义。图33。
血管紧张素II(Ang II)参与血压调节，并通过2型血管紧张素转化酶(ACE2)转化为血管紧张素1-7，ACE2是SARS-CoV-2用于附着细胞的受体。高血压患者更容易受到冠状病毒的不良影响，因此我们认为对这些代谢产物进行检查是明智的。这些代谢产物的比率(Ang II/Ang 1-7)如图34所示，并且在对照组之间显著不同，在整个实验期间，处理组中的比率更接近培养基对照的比率。
组织病理学
除中等假接种对照组外，所有组中的仓鼠都有肺部病变，最好描述为慢性活动性多灶性支气管肺炎伴血管周围水肿。受影响的肺部区域有大量2型肺细胞增殖。在血管周围有局部强烈炎症的区域，很少发现小动脉血栓形成。采用以下方案对组织病理学损伤进行评分：(a)损伤分布：无＝0，局灶＝1，多灶＝2，弥漫＝3；(b)炎症强度：无＝0，轻度(2-3个炎性细胞厚)＝1，中度(炎性细胞＝3-20个细胞厚)，重度(炎性细胞>20个细胞厚)；(c)小血管血栓形成：无＝0，存在＝l。图35-36。
结论
在这项研究中，有几点值得注意。首先，病毒攻击后两天IFNy的初始峰值，在接种后第4天检测到的病毒载量峰值之前下降。在病毒复制过程中，IFNy水平通常会继续升高。第二，BAL中第7天每微升的病毒拷贝数减少到接近零，但在没有病毒的情况下，肺部的炎症程度仍然很高。第三，尽管BAL中的病毒拷贝数在第7天减少到接近零，但在动物的嗅球中检测到了病毒拷贝，尽管我们没有测试这些拷贝是否与感染性病毒有关或仅检测到病毒核酸。
与病毒对照组相比，用三种化合物中的任何一种治疗仓鼠都降低了IFNy水平(然而，由于群体规模小和个体之间测量的可变性，无法确定统计意义)。Plethysography数据显示，与培养基对照组和病毒对照组相比，SEQ ID NO:122和SEQ ID NO:192帮助仓鼠实现更接近正常的呼吸。最后，与病毒对照和SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:154相比，SEQ ID NO:192处理的仓鼠在第7天嗅球中的病毒滴度停留在较高值。当与病毒对照相比时，治疗组第4天的病毒滴度降低(当通过从SEQ ID NO:192治疗组中的单个异常值中去除数据进行校正时)。组织学上，治疗组和病毒对照组在肺部炎症的分布或严重程度上没有明显差异，这可能是由于即使在BAL中没有病毒的情况下，仍存在持续的炎症反应。由于正在进行的治疗侧重于干扰病毒进入细胞，因此炎症反应一旦开始似乎就与病毒的持续存在脱节，因此炎症一旦开始就不会受到治疗的影响。
最后，通过Ang II/Ang 1-7比值评估了血管紧张素II与血管紧张素1-7转换失衡的重要性，这是病毒最小或不再存在时肺部残余炎症的潜在原因。与病毒对照相比，用SEQID NO:122和更大程度上SEQ ID NO:192处理使该比率保持正常或改善；尽管肺部炎症没有明显减少。
实施例12.K18-ACE2小鼠研究
简介
体重在20-25克之间的幼年雌性K18-ACE2(JAX)小鼠通过腹膜内(IP)施用SEQ IDNO:113进行处理；结合SARS-CoV-2刺突蛋白的抗体，所述抗体具有包含SEQ ID NO:189中所列氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：190中所列的氨基酸序列的轻链(抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体)；或通过鼻内激发给予1250PFU SARS-CoV-2(菌株B1.351)后的盐水。在病毒攻击前12小时开始腹腔内(IP)施用，并在攻击后12小时和攻击后24小时继续施用。
在病毒攻击时，将化合物以50μL的体积与病毒混合，并在37℃下培养15分钟，然后在异氟醚麻醉下对小鼠进行鼻内施用。对于SEQ ID NO:113，由于化合物的浓度，鼻内施用的体积为83μL以达到15mg/kg。
评估了以下四个臂：
臂(1)：用SEQ ID NO:113(15mg/kg)施用组进行病毒接种，每组n＝13；
臂(2)：用抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体(1.2mg/kg)施用组进行病毒接种，每组n＝13；
臂(3)：细胞培养基鼻内对照，IP盐水施用n＝6；
臂(4)：接种IP盐水的病毒n＝6。
每天监测小鼠体重并评估客观的临床疾病评分。
按照以下计划对小鼠实施安乐死：施用后两小时的第0天；第1天、第2天和第4天：第1组n＝2；臂2n＝2、臂3n＝l和臂4n＝l。剩余的小鼠在第7天实施安乐死。
安乐死前，对小鼠进行称重并进行临床评分。在麻醉下采集血液。安乐死后，使用1mL无菌磷酸盐缓冲盐水进行支气管肺泡灌洗(BAL)，用1mL福尔马林吹入肺部并固定。
使用Qiagen RNeasy for Viral RNA从所有BAL样品中分离RNA，并进行定量，加热至60℃ 20分钟。使用MyBiosource的试剂盒测试血清中的小鼠纤维蛋白降解产物和D-二聚体。
结果
图37显示了四个臂中小鼠的体重。第4天，第1组和第4组接种病毒的小鼠开始出现疾病的临床症状，少数小鼠死于病毒感染，其余小鼠在研究结束后第7天全部患病。
当小鼠在第5天开始出现疾病迹象时，临床评分与体重的变化平行。图38。与WA-1株病毒相比，南非SARS-CoV-2变异株在体外和体内的传播速度较慢，导致临床疾病和体重下降的速度较慢。
当小鼠在第5天开始出现疾病迹象时，临床评分与体重的变化平行。与WA-1株病毒相比，南非SARS-CoV-2变异株在体外和体内的传播速度较慢，导致临床疾病和体重下降的速度较慢。
使用体重数据的混合模型统计分析，安慰剂对照组和病毒对照组之间以及安慰剂对照组与SEQ ID NO:113治疗小鼠之间存在显著差异(p<0.001)，尽管数据呈现出差异的趋势，但这项研究的时间更长了。
使用对临床评分数据的混合模型统计分析，在第6天，安慰剂对照组和病毒对照组之间(p<0.01)以及安慰剂对照组与SEQ ID NO:113治疗小鼠之间(p<0.05)存在显著差异。在第7天，以下组之间存在显著差异：安慰剂与病毒对照组(p<0.01)之间、安慰剂与SEQ IDNO:113(p<0.01)之间、SEQ ID NO:123与病毒对照(p<0.05)和SEQ ID NO:1013与抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体(p<0.05)之间，或在任何一天安慰剂与抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体治疗的小鼠之间。
表19.BAL RNA浓度(ng/μL)。表中示出从每只小鼠的BAL液中分离的RNA。
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微血栓
纤维蛋白降解产物(Fibrin degradation product，FDP)和D-二聚体用作微血栓的指标。在所有小鼠的血清中测量纤维蛋白降解产物和D-二聚体(发现死亡的小鼠除外)。图39-40。
表20.B1.351后研究结束时采集的K18ACE2小鼠的D-二聚体。株SARS-CoV-2感染。
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使用FDP数据和D-二聚体数据的混合模型统计分析，两组血清成分的测量结果均无显著差异。
结论
抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体对体重减轻和疾病的临床症状提供了一定的保护。SEQ ID NO:113的体重和临床评分与病毒感染的对照组没有显著差异。
当分析这些组的所有比较时，安慰剂和病毒对照组或SEQ ID NO:113和抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体治疗组之间的D-二聚体血清水平没有统计学差异。然而，D-二聚体图确实给人一种印象，即第8天实施安乐死的动物的SEQ ID NO:113和抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体平均值更接近安慰剂对照组，这表明每组中的小鼠数量可能不足，无法证明统计学意义。
实施例13.具有修饰肝素结合的NRP分子
神经皮素具有酸性多糖结合位点，与肝素或硫酸肝素相互作用，以增强神经皮素和VEGF的相互作用。酸性多糖结合位点位于b1和b2上，它们限定了一个连续的正电区域。
为了降低对酸性多糖(如肝素和硫酸乙酰肝素)的结合亲和力，设计了融合蛋白，使其具有神经毡蛋白片段突变(例如b1结构域的K358E、K373E和b2结构域的R513E、K514E、K516E)。
通过密码子优化的基因合成生成所有设计的蛋白质，并使用Not I和Hind III限制酶将其插入pcDNA3.4作为表达载体。构建的表达载体包括信号肽，并且为了优化转录，Kozak序列可以包含在5’非翻译区中。
为了获得用于转染的构建质粒的数量，将构建的质粒转化为One ShotTM Top10E大肠杆菌有适应力的细胞，然后培养过夜。构建的质粒通过PureLinkTM HiPure Expi plasmidMegaprep kit获得。
融合蛋白在CHO-S系统中瞬时表达(ThermoFisher Scientific Inc.)。这些蛋白按照供应商的说明单独表达。简言之，用OPTIPRO SFMTM和ExpiFectamineTM以每毫升CHO-S培养物1∶1轻链与重链的比例制备总共0.8μg质粒DNA。将该混合物以6x106个细胞/mL的活细胞密度和大于98％的活力加入CHO-S细胞。将细胞培养物在37℃、80％湿度、8％CO2的NalgeneTM Single-Use PETG Erlenmeyer锥形瓶中培养过夜，以125RPM的速度摇动，轨道为19mm。第二天，培养得到加强(ExpiCHOTM增强子；)ThermoFisher Scientific股份有限公司和增强(ExpiCHOTM增强子ThermoFisher Scientific Inc.)，并转移至32℃、80％湿度、5％CO2，以125RPM的速度震动，轨道为19mm。第5天进行第二次进料，培养物恢复至32℃，直到第12天收获。
通过以4000xg离心20分钟完成收获。使用不对称聚醚砜(PES)0.22-μM过滤器组件(Nalgene)对澄清的上清液进行灭菌。滤液在4℃下储存，直到第二天纯化。
所有抗体灭菌上清液使用MabSelect prismATM树脂(GE Healthcare LifeSciences)在(GE Healthcare Life Sciences)上纯化。使用50mM磷酸钠、150mM NaCl、pH 7.0缓冲液平衡树脂。然后将抗体上清液加载到柱中。
接着，用50mM磷酸钠、150mM NaCl、pH 7.0缓冲液洗涤树脂，直到色谱基线恢复到柱平衡水平。然后使用100mM乙酸钠、20％甘油、pH 3.0进行洗脱，并收集馏分。然后立即用1M Tris(pH 9)中和级分。
获得馏分后，进行离子交换色谱。用1M NaOH对阳离子交换色谱(CEX)柱(Capto SImpAct)或阴离子交换色谱(AEX)柱进行消毒并用MQ冲洗。用50mM NaAc pH 5.5(起始缓冲液)和50mM NaAc pH 5.5、1M NaCl(洗脱缓冲液)进行平衡，AEX的IM NaCl(洗脱缓冲液)。
CEX的起始缓冲液和洗脱缓冲液的pH有时为Na-pi pH 7.0；Bicine pH 8.0；和AEX的Tris 8.0、Tri 8.5；根据蛋白质的pI值确定。蛋白A纯化的抗体以1-2g抗体/mL树脂的浓度加载。然后用起始缓冲液洗涤该柱。然后使用25个柱体积的0-60％洗脱缓冲液梯度洗脱抗体产物。分别收集每个峰，并使用Ultra-15离心过滤装置以4000xg离心浓缩，然后将缓冲液换成PBS。
肝素结合
为了评估肝素结合，用1M NaOH对肝素亲和柱(HiTrap肝素HP)进行消毒，并用MQ冲洗。用pH 7.0的50mM磷酸钠(起始缓冲液)和pH 7.0的50mM磷酸钠、1M NaCl(洗脱缓冲液)进行平衡。本发明的构建体分子以1mg抗体/mL树脂的浓度加载。然后用起始缓冲液洗涤该柱。然后使用15个柱体积的100％洗脱缓冲液梯度洗脱本发明的构建体分子。下表列出了这些结构的概要。
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肝素结合结果
肝素亲和力结果总结如下表所示。一些测试的构建体不与肝素列结合。例如，SEQID NO:113、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:133显示无肝素结合。在上述构建体中，SEQ ID NO:113具有野生型的b1结构域，而其他SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:133包括至少一个假定的肝素结合位点突变。
除SEQ ID NO:133外，所有仅具有野生型b1结构域或b1b2结构域的构建体均显示与肝素结合。具有野生型b1b2结构域的构建体分子SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124和SEQID NO:125显示出比仅具有b1结构域的结构体更强的肝素结合。而且，单个b1结构域没有导致肝素结合，然而，增加b1结构域的数量导致肝素结合：因此表明b1结构域亲和力的增加可以与肝素相互作用。
表23.构建分子的肝素亲和力结果。表中，标题为“肝素结合亲和力曲线”列中的字母对应于图41中的字母。
实施例14.CendR诱饵序列
概述
评估受体结合域CendR基序，以显示和表征与CendR基序结合的神经毡蛋白-1b1-结构域抗体融合构建体，以及b1与病毒蛋白和/或CendR肽的结合。
本实施例中测试的构建体包含一个或多个识别结合结构域，其靶向神经毡蛋白-1b1结构域串联表达为人IgG Fc的n-端上的重组融合分子。图42。
不希望受到理论的束缚，假设本发明的构建体通过神经毡蛋白-1b1结构域结合SARS-CoV-2、呼吸道合胞病毒(RSV)和其他病毒病原体糖蛋白的CendR基序。而且，病毒识别结合域(RBD)靶向主要通过神经毡蛋白b1结构域与RBD切割的CendR基序(例如，RXXROH)的结合介导，所述病毒构建体在病毒粒子颗粒膜上的刺突蛋白上表达。神经毡蛋白-1是一种参与多种发育过程的细胞表面受体，包括轴突引导、血管生成和嗜异性细胞粘附。神经毡蛋白-1b1结构域与b2结构域一起形成串联凝血因子结构域的一部分，并且这两个结构域都属于称为F5/8C型的结构域家族或盘状结构域家族。神经毡蛋白-1b1结构域已被鉴定为与病毒刺突蛋白S1结构域结合的主要驱动因素，并可能有助于病毒的传染性。RBD结合b1结构域与人IgG Fc的重组融合激活适应性免疫系统，以参与并防止病毒病原体的传染性。神经毡蛋白-1b1结构域与其他神经毡蛋白外结构域一起介导配体的结合，包括信号蛋白、凝血因子V和VIII以及轴突引导提示中的VEGF，以及作为发育过程和其他生理活动的一部分的血管生成因子结合。
在Red 96系统(ForteBio)上使用生物层干涉法(Bio-LayerInterferometry,BLI)建立结合分析。本实施例的具体目的如下：(1)建立与病毒粒子颗粒的RBD-CendR基序结合的构建体分子；和(2)表征与RBD-CendR基序靶向重组病毒蛋白的构建体分子结合参数。
构建体分子与重组病毒蛋白的结合
为了评估构建体分子与病毒蛋白的结合，使用Octet red 96系统进行了BLI结合研究。简言之，将构建体固定在抗人Fc捕获(AHC)生物传感器上，并询问其是否与商业来源的重组病毒蛋白结合。使用BLI技术，评估了不同病毒与构建体的结合，并以单价形式评估了动力学和结合亲和力(平衡结合常数，KD)。此外，将不同病毒的CendR肽序列固定在链霉亲和素(SA)生物传感器上。这些研究旨在确定构建分子是否表现出广谱活性，以及构建分子对目标蛋白和肽的亲和力。
测试的结构分子如下表所示。
表24CendR研究中评估的构建体
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材料
下表提供了本实施例中使用的材料。
表25.CendR研究中使用的材料。
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CendR肽
下表提供了评估的CendR肽。
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使用Octet Red 96系统进行结合病毒蛋白和CendR肽的构建分子以及KD测定，如下所述。
构建与病毒蛋白结合的分子：方法
将不同浓度(0.55-1.56μg/mL)的1X动力学缓冲液(1X PBS pH 7.4，0.1％w/vBSA，0.002％v/v Tween-20)中的构建体分子固定在Anti-hIgG Fc生物传感器上，每个传感器的加载时间为180秒。基线后加载进行了60秒。接下来，在1X动力学缓冲液中制备25nM、50nM和100nM的重组病毒蛋白。通过在空白Anti-hIgG Fc生物传感器(无构建分子)上应用病毒蛋白来产生参照传感器。缔合(Ka)和解离(Kd)步骤各为300秒。使用Octet分析软件分析数据，应用1:1或2:1模型拟合，报告解离常数KD(M)。
构建与生物素化CendR肽结合的分子：方法
评估了具有SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:193中所列氨基酸序列的构建体。将CendR肽以不同浓度(0.05-0.μ65g/mL)的1X动力学缓冲液(如上所述)固定在链霉亲和素(streptavidin，SA)生物传感器上，每个传感器的加载时间为180秒。基线后加载进行了60秒。接下来，在1X动力学缓冲液中制备100nM具有SEQ ID NO:SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:193分子中所列氨基酸序列的构建体分子。参照传感器是通过在空白链霉亲和素生物传感器表面(无CendR肽)上应用构建体分子而产生的。缔合(Ka)和解离(Kd)步骤各为300秒。使用Octet分析软件分析数据，应用1∶1模型拟合，报告解离常数KD(M)。
结果
构建体分子与重组RSV F蛋白的结合
高亲和力结合RSV-F蛋白的构建体的影响增加了平台能够提供对抗RSV的治疗机制的可能性(见下表)。
表27.Vi-TRAP对各种病毒蛋白的单价结合动力学。
构建体分子与CendR肽的结合
下表显示了评估构建体分子结合CendR多肽的研究结果。
表28.构建体分子对各种病毒蛋白的单价结合动力学。表中，“+++”表示最强(顶层)结合信号；“++”指第二层结合；“+”表示最下层结合信号；“NB”表示无结合。
结论
本文所述研究的目的是建立构建体分子与重组RBD病毒蛋白和CendR肽的结合特性并确定其KD。基于所提供的数据，可以得出以下结论：(1)构建体分子以单价形式与RSV F蛋白高亲和力结合；和(2)具有SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:122和SEQ ID NO:154中所列氨基酸序列的构建体以八位体测定格式显示出广谱的病毒CendR基序。总之，这里提供的数据表明，本发明的构建体分子的生物学效应结合并可防止传染性。
实施例15.呼吸道合胞病毒(RSV)的ELISA检测
通过ELISA测试本发明构建体与呼吸道合胞病毒(RSV)F糖蛋白的结合亲和力，评估构建体分子。
试剂和材料
使用的试剂如下：lx DPBS(Corning，Corning，NY；Catalog No.21-031-CM)；Tween-20(100％)(Boston BioProducts,Ashland,MA；Catalog No.P-934)；洗涤缓冲液：PBST(0.02％ Tween-20，lx DPBS)；干奶粉(Research Products International，Mt.Prospect，IL；目录号M17200-1000.0)；RSV-F(氨基酸1-529)，(胞外域)蛋白(His标签)，ABIN2006856，(Antibodies-online,Inc,Limerick,PA)；抗人IgG HRP缀合物(Abeam,Cambridge,United Kingdom；Catalog No.ab6759)；TMB ELISA底物(高灵敏度)(Abeam,Cambridge,United Kingdom；Catalog No.ab171523)；ELISA STOP溶液(Invitrogen byThermoFisher Scientific,Waltham,MA；Catalog No.SS04)；和PierceTM 96孔高结合ELISA板(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA；Catalog No.15041)。
设备
使用以下设备进行ELISA测试：450nm 96孔SpectraMax M2e微孔板读取器(Molecular Devices，San Jose，CA)；Wellwash Versa微孔板清洗机(ThermoFisherScientific，Waltham，MA)；P20、P200、P1000和多通道移液管(Eppendorf)。
程序
根据以下步骤进行ELISA测试：
步骤1：板：使用多通道移液器将PBS中的100μL 3μg/mL RSV F蛋白滴在96孔高蛋白结合板的所有孔中；步骤2：在2-8C下培养板过夜；步骤3：用含0.05％Tween-20(PBST)的1x PBS洗涤板3x；步骤4：在所有平板上每孔加入200μL，加入5％的1xPBS干奶粉；步骤5：在室温下培养板1小时；步骤6：用含0.05％ Tween-20(PBST)的1x PBS洗涤板3x；步骤7：在柱(Column)8-12中加入100μL PBS；步骤8：在孔A1至H1中加入200μL(在PBS中为1μg/mL)每个构建体；步骤9：使用多通道移液器将100μL的每个构建体从柱(Col)1连续转移到柱11。丢弃第11栏中多余的100μL。仅保留柱12的PBS；步骤10：在室温下培养1小时；步骤11：用含0.05％Tween-20(PBST)的1x PBS洗涤板3x；步骤12：在PBS中以1：20000稀释度将200μL兔抗人IgG HRP添加到所有板上的所有孔中；步骤13：在室温下培养1小时；步骤14：用含0.05％Tween-20(PBST)的1x PBS洗涤板3x；步骤15：向所有孔中加入100μL TMB试剂；步骤16：在室温下培养15分钟；步骤17：向每个孔中加入100μL终止试剂；步骤18：读取ABS450的吸收。
ELISA测定结果如下表所示。
表29.ELISA结果。半数最大有效浓度(EC50)量以nM表示。
SEQ ID NO. EC50(nM)
122 23.3
154 185.2
203 69.71
192 53.86
128 42.47
129 592.6
204 91.47
205 39.19
206 22.72
193 749.2
207 17.07
208 1570
表30.通过Varioskan平板读数器(ThermoFisher)和SpectroMax测定的给定结构的半最大有效浓度(EC50)量。
实施例16.呼吸道合胞病毒(RSV)的结合分析
通过Red 96系统(ForteBio)评估构建体分子，测试本发明构建体与呼吸道合胞病毒(RSV)F糖蛋白的结合亲和力。
表31.构建体和RSV的结合结果。表中，“+++”表示最强(顶层)结合信号；“++”指第二层结合；“+”表示最下层结合信号；“NB”表示无结合。“↓”意指降低。“(E)”意指氨基酸被谷氨酸残基取代。
实施例17.SARS-CoV-2的ELISA测试
评估构建体，通过ELISA测试本发明构建体与SARS-CoV-2的结合亲和力。根据上述实施例15中描述的方法进行ELISA。
表32.ELISA结果。半最大有效浓度(ECso)量以nM表示。N项和C项分别表示N端和C端，“↑”意指增加。
实施例18.甲型H5N1流感病毒(IAV H5N1)的结合分析
通过Red 96系统(ForteBio)评估构建体分子，测试本发明构建体与IAVH5N1的结合亲和力。
表33.ND＝未测出。N-term和C-term分别表示N-端和C-端。“↓”意指降低，“(A)”意指氨基酸被丙氨酸残基取代。“(E)”意指氨基酸被谷氨酸残基取代。
实施例19.鉴定CendR的生物信息学方法
预测Furin裂解位点
Furin是一种保守的蛋白酶，切割“R-X-[KR]-R”基序，产生CendR肽。Furin是一个古老的基因家族，在所有脊椎动物和旁系动物中都有同源基因，可以追溯到动物和真菌的分化。
为了鉴定人、病毒和细菌蛋白质中的Furin裂解位点，以及随后本发明构建体靶向的CendR肽的形成，对鉴定的扩展共识序列进行了生物信息学评估。
为了鉴定Furin切割位点，评估了RefSeq肽数据库，包括以下记录：人：114,963条记录；病毒：477,258条记录；细菌：161,430,766条记录。此外，还使用了两个预测软件程序：Prop预测软件和PiTou-Furin切割位点计算预测工具。
ProP工具是一种神经网络，具有94.7％的灵敏度和83.7％的特异性。Prop的示例性描述提供于Duckert et al.，Prediction of proprotein convertase cleavage sitesProtein Eng Des Sei.2004 Jan；17(1)：107-12，其公开内容全文通过引用并入本文。
PiTou Furin切割位点计算预测工具(以下简称“PiTou”)是一种基于知识的工具，具有96.9％的敏感性和97.3％的特异性。PiTou基于131个已知的furin裂解位点；和4265个精氨酸位点，其中furin不裂解。Log(odds)分数根据furin结合位点和物理性质(如体积、电荷和疏水性)的profile Hmm提供。
PiToufurin切割位点计算预测工具的示例性描述提供于Tian et al.，Computational prediction of furin cleavage sites by a hybrid method andunderstanding mechanism underlying diseases.Sci Rep.2012；2：261，其公开内容全文通过引用并入本文。
RefSeq肽结果如下表所示。
表34.RefSeq肽结果
数据库 位点数(评分＞0) 不同肽的数量 数据库规模
人 101,892 50,046 115,140
病毒 117,993 80,359 477,258
细菌 60,546,480 42,054,923 161,430,766
图43-45分别显示了PiTou评分在人、病毒和细菌肽中的累积分布。图46显示了已知病毒切割位点的PiTou评分。已知的位点基于30种病毒，PiTou评分如下：90％＞5(99％)；75％＞7(99.9％)；图47显示了优先PiTou评分分布。
根据已知疾病、PiTou评分、分泌肽和保育，对新的预测目标进行了优先排序。人类已知疾病根据OMIM、ClinVar、GnomAD和MGI确定。细菌和病毒根据世界卫生组织(WHO)、RKI、Bode Science Center和Major Infectious Diseases 3rd Ed确定。
表35.PiTou评分In(odds)。
PTTou评分 Odds 概然性
0 1∶1 50％
2.3 10∶1 90％
4.6 100∶1 99％
6.9 1000∶1 99.9％
9.2 10000∶1 99.99％
11.5 100000∶1 99.999％
13.8 1000000∶1 99.9999％
分泌的肽基于DeepSig(一种神经网络，具有针对真核生物和细菌的单独模型)、Cell Ploc 2.0(不同蛋白质的预先计算亚细胞定位)和Spdb 5.1(Swiss Prot和EMBL条目中的信号肽数据库；Swiss-Prot&EMBL entries；see Choo，et al.2005)进行优先排序。
DeepSig的示例性描述提供于Savojardo et al.，DeepSig：deep learningimproves signal peptide detection in proteins.Bioinformatics.2018 May 15；34(10)：1690-1696，其公开内容全文通过引用并入本文。
Cell Ploc 2.0的示例性描述提供于Chou and Shen，Cell-PLoc：a package ofWeb servers for predicting subcellular localization of proteins in variousorganisms，Nat Protoc.2008；3(2)：153-62。2008；3(2)：153-62，，其公开内容全文通过引用并入本文。
Spdb 5.1的示例性描述提供于Choo et al.，2005，其公开内容全文通过引用并入本文。
表36.具有预测的furin裂解位点的评分最高的病毒蛋白。表中，标题为“蛋白”的列示出预测蛋白的NCBI登录号。标题为“评分”的栏显示PiTou分数。
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表37.具有预测的furin裂解位点的前62个最高评分的病毒蛋白。表中，标题为“蛋白质”列示出预测蛋白的NCBI登录号。标题为“评分”的列示出PiTou评分。
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实施例20.VEGF结合测定
为了评估本发明的构建体分子与VEGF165的结合：构建使用使用Octet red 96系统的BLI结合研究。简言之，将构建体固定在抗-人Fc捕获(Anti-Human Fc Capture，AHC)生物传感器上，并查询与已经商业来源化的重组VEGF165结合。使用BLI技术，对VEGF165的结合使用SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：154和SEQ ID NO：193以单价体形式查询，获得结合亲和力(平衡结合常数，KD)。
表38.VEGF结合测定中使用的材料和设备。
方法
使用Octet Red 96系统测定与VEGF165结合的本发明构建体分子以及相互作用的KD，同时测定KD。简言之，将分子以1.5μg/mL在1X Knietic Buffer或2X Knietic Buffer中固定到Anti-hIgG Fc生物传感器上，加载时间为120秒或180秒。基线后加载进行60秒。接下来，在1X或2X Knietic Buffer中制备50nM、25nM和12.5nM的重组病毒蛋白。通过在空白Anti-hIgG Fc生物传感器(无分子)上应用VEGF165产生参照传感器。缔合和解离步骤各为300秒。使用Octet分析软件分析数据，应用1：1或2：1模型拟合，报告解离常数KD(M)。
为了评估分子与VEGF165的结合：构建使用使用Octet red 96系统的BLI结合研究。简言之，将构建体固定在抗-人Fc捕获(AHC)生物传感器上，并查询与已经商业来源化的重组VEGF165结合。使用BLI技术，对VEGF165的结合使用SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：154和SEQID NO：209以单价体形式查询，获得结合亲和力(平衡结合常数，KD)。
结果
以单纳摩尔至亚纳摩尔亲和力结合VEGF165的构建体示出神经毡蛋白结构域与天然配体之间的天然相互作用。见下表。
表39.VEGF165结合测定结果。
SEQ ID NO. VEGF165结合KD(M)
122 6.3E-10
154 3.0E-09
193 1.6E-09
本实施例的目的在于确定天然配体VEGF165是否结合本发明构建体中存在的典型神经毡蛋白结合域。从上述结果中，可以得出以下结论：VEGF165结合至含有神经毡蛋白结构域的构建体分子，与已发表有关VEGF165与神经毡蛋白相互作用的文献一致；构建体分子对VEGF165的亲和力(KD)很强，范围从一位数纳米摩尔到亚纳米摩尔；并且，从这里提供的数据来看，构建体分子维持已经建立的VEGF165与神经毡蛋白结构域相互作用，并有助于建立利用自然发生的相互作用对抗病毒疾病的平台的治疗潜力。
本发明的范围不受本文描述的具体实施方式的限制。事实上，根据上述描述和附图，本领域技术人员将清楚本发明除了在本文中描述的那些之外的各种改变。这种改变旨在落入所附权利要求的范围内。还应理解，所有值均为近似值，并提供用于描述。

Claims (98)

1.一种多肽，所述多肽包含：
(a)神经毡蛋白的b1结构域或其衍生物或片段；和
(b)免疫球蛋白结构域；
其中，所述b1结构域能够结合病毒的外壳蛋白。
2.根据权利要求1的多肽，进一步包含血管紧张素转化酶2的ACE2结构域或其衍生物或片段。
3.一种多肽，其包含：
(a)血管紧张素转化酶2的ACE2结构域或其衍生物或片段；和
(b)免疫球蛋白结构域；
其中，所述ACE2结构域能够结合选自由以下组成的组的病毒的外壳蛋白：疱疹病毒科、乳头瘤病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、披膜病毒科、博纳病毒科、布尼亚病毒科、丝状病毒科、正黏病毒科、副黏病毒科、肺病毒科和逆转录病毒科。
4.根据权利要求3所述的多肽，进一步包含神经毡蛋白的b1结构域或其衍生物或片段。
5.一种多肽，其包含：
(a)神经毡蛋白的b1结构域或其衍生物或片段；和
(b)血管紧张素转化酶2的ACE2结构域或其衍生物或片段；
其中，所述b1结构域和ACE2结构域各自能够结合至病毒的外壳蛋白，所述病毒选自由以下组成的组：疱疹病毒科、乳头瘤病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、披膜病毒科、博纳病毒科、布尼亚病毒科、丝状病毒科、正黏病毒科、副黏病毒科、肺病毒科和逆转录病毒科。
6.根据权利要求5所述的多肽，进一步包含免疫球蛋白结构域。
7.根据权利要求1-2和4-6中任一项所述的多肽，其中，所述b1结构域或其衍生物或片段包含SEQ ID NO:SEQ ID No.3(NRP1b1)或氨基酸序列SEQ ID NO.11(NRP2 b1)的氨基酸序列。
8.根据权利要求1-2和4-7中任一项所述的多肽，其中，所述b1结构域或其衍生物或片段包含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的多肽，其中，所述多肽能够结合冠状病毒科病毒的外壳蛋白。
10.根据权利要求9所述的多肽，其中，所述多肽能够结合COVID-19的外壳蛋白。
11.根据权利要求10所述的多肽，其中，所述外壳蛋白为COVID-19的S蛋白。
12.根据权利要求1-2和4-11中任一项所述的多肽，其中，与未突变的b1结构域相比，所述b1结构域或其衍生物或片段包含增加对COVID-19的S蛋白的亲和力的突变。
13.根据权利要求12所述的多肽，其中，所述b1结构域或其衍生物或片段在选自由E319和K351组成的组的位置处包含突变。
14.根据权利要求13所述的多肽，其中，所述b1结构域包含SEQ ID NO:SEQ ID NO.4(NRP1 b1 E319A)和SEQ ID NO.5(NRP1b1K351A)中任一者的氨基酸序列。
15.根据权利要求1-2和4-14中任一项所述的多肽，其中，所述多肽包含多个b1结构域或其衍生物或片段。
16.根据权利要求1-2和4-15中任一项所述的多肽，其中，所述b1结构域或其衍生物或片段进一步包含接头、神经毡蛋白的b2结构域或其组合。
17.根据权利要求16所述的多肽，其中，所述b1结构域或其衍生物或片段选自由SEQ IDNO:SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.14组成的组。
18.根据权利要求2-17中任一项所述的多肽，其中，所述ACE2结构域或其衍生物或片段包含选自由SEQ ID NO:SEQ ID NO.38-SEQ ID NO.39组成的组的序列。
19.权利要求2-18中任一项所述的多肽，其中，所述多肽包含多个ACE2结构域或其衍生物或片段。
20.根据权利要求2-20中任一项所述的多肽，其中，所述ACE2结构域在选自由F28、D30和L79组成的组的位置处包含突变。
21.根据权利要求20所述的多肽，其中，所述ACE2结构域、其衍生物或片段包含SEQ IDNO:SEQ ID NO.40-SEQ ID NO.43的氨基酸序列。
22.根据权利要求2-6和15-16中任一项所述的多肽，进一步包含位于所述b1结构域和所述ACE2结构域之间的接头。
23.根据权利要求22的所述的多肽，其中，所述接头选自由SEQ ID NO:44-50组成的组。
24.根据权利要求1-4和6-23中任一项所述的多肽，其中，所述免疫球蛋白结构域包含Fc结构域。
25.根据权利要求1-4和6-24中任一项所述的多肽，其中，所述免疫球蛋白结构域基本上由Fc结构域组成。
26.根据权利要求24和25中任一项所述的多肽，其中，与野生型Fc结构域相比，所述Fc结构域包含降低ADCC的突变。
27.根据权利要求26所述的多肽，其中，所述突变位于如通过KABAT编号所确定的第N297位。
28.根据权利要求24和25中任一项所述的多肽，其中，与野生型Fc结构相比较，所述Fc结构域包含一个或多个增加对FcRn的亲和力的突变。
29.根据权利要求28所述的多肽，其中，所述突变位于选自由如通过KABAT编号所确定的T307、E380和N434或其组合组成的组的位置。
30.根据权利要求24和25中任一项所述的多肽，其中，与野生型Fc结构域相比，所述Fc结构域包含降低对Fcγ受体亚型的亲和力的突变。
31.根据权利要求30所述的多肽，其中，所述突变位于选自由如通过KABAT编号所确定的L324和L325或其组合组成的组的位置。
32.根据权利要求18-21中任一项所述的多肽，其中，所述Fc结构域选自由人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4和人IgA组成的组。
33.根据权利要求32所述的多肽，其中，所述Fc结构域包含选自由SEQ ID NO:23-31组成的组的氨基酸序列。
34.根据权利要求32所述的多肽，其中，所述Fc结构域序列包含SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
35.根据权利要求2、4和6中任一项所述的多肽，其中，所述多肽具有选自由以下组成的组的构型：
i.(b1)、IgG1 WT、ACE2-1；
ii.(b1b2)、IgG1(T307A/E380A/N434A)、ACE2-2；
iii.(b1b1)-(G4S)*2-(b1b1)、IgG1(N297A)、ACE2-3；
iv.(b1b2)-(G4S)*2-(b1b2)、IgG1(L324A/L325A)、ACE2-4；
v.具有b1(E319A)的(b1b2)-(G4S)*2-(b1b2)、
IgG1(N297A/T307A/E380A/N434A)、ACE2-5；和
vi.具有b1(K351A)的(b1b2)-(G4S)*2-(b1b2)、
IgG1(L324A/L325A/T307A/E380A/N434A)、ACE2-6。
36.根据权利要求2、4和6中任一项所述的多肽，其中，所述多肽包含选自由SEQ ID NO:88-110组成的组的氨基酸序列。
37.根据权利要求1-2、4和6中任一项所述的多肽，其中，所述b1结构域连接到Fc结构域的C-末端。
38.根据权利要求1-2、4和6中任一项所述的多肽，其中，所述b1结构域连接到Fc结构域的N-末端。
39.根据权利要求2、3-4和6中任一项所述的多肽，其中，所述ACE2结构域连接到Fc结构域的C-末端。
40.根据权利要求2、3-4和6中任一项所述的多肽，其中，所述ACE2结构域连接到Fc结构域的N-末端。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的多肽，还包含信号肽。
42.根据权利要求41所述的多肽，其中，所述信号肽包含SEQ ID NO.51。
43.一种制备根据权利要求1-42中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括在宿主细胞中重组表达编码所述多肽的核酸载体。
44.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-42中任一项所述的多肽和药学上可接受的赋形剂。
45.一种减少COVID感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据权利要求1-42中任一项所述的多肽。
46.一种治疗患有COVID感染的受试者的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据权利要求1-42中任一项所述的多肽。
47.一种预防COVID感染的方法，包括向有需要的受试者施用根据权利要求1-42中任一项所述的多肽。
48.一种减少COVID感染症状的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据权利要求1-42中任一项所述的多肽。
49.一种减少COVID感染传播的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据权利要求1-42中任一项所述的多肽。
50.一种重组多肽，其包含：
(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)结构域或其片段，和
(b)免疫球蛋白结构域；
其中，相对于野生型NRP结构域，所述一个或多个突变NRP结构域引起重组多肽与肝素或硫酸乙酰肝素的结合降低。
51.根据权利要求50所述的重组多肽，其中，所述一个或多个突变NRP结构域源自NRP1蛋白或NRP2蛋白。
52.根据权利要求50所述的重组多肽，其中，所述一个或多个突变NRP结构域是一个或多个突变b1结构域，或是一个或多个突变b2结构域。
53.根据权利要求50所述的重组多肽，其中，相对于SEQ ID NO:1中所示的野生型氨基酸序列，所述一个或多个突变NRP结构域具有一个或多个选自有以下组成的组的氨基取代：K373E、K351A、E319A、K358E、R513E、K514E、K516E、R513A、K514A、K516A、Y297A、S345A和Y353A。
54.根据权利要求50所述的重组多肽，其中，所述一个或多个突变NRP结构域引起所述重组多肽与肝素的结合降低。
55.根据权利要求50所述的重组多肽，其中，所述一个或多个突变NRP结构域引起所述重组多肽与硫酸乙酰肝素的结合降低。
56.根据权利要求50所述的重组多肽，其中，所述免疫球蛋白结构域是Fc结构域。
57.一种重组多肽，其包含：
(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域、
NRPb2结构域、或其片段，和
(b)Fc结构域；
其中，一个或多个突变NRPb1结构域、NRPb2结构域，或其片段源自NRP1蛋白或NRP2蛋白；
其中，相对于SEQ ID NO:1中所述的野生型氨基酸序列，一个或多个突变NRPb1结构域、NRPb2结构域、或其片段具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基取代：K373E、K351A、E319A、K358E、R513E、K514E、K516E、R513A、K514A、K516A、Y297A、S345A和Y353A；和
其中，所述一个或多个氨基取代引起所述重组多肽与肝素或硫酸乙酰肝素的结合降低。
58.一种重组多肽，其包含：
(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域(bl)、NRPb2结构域(b2)、或其片段；和
(b)Fc结构域；
其中，(a)和(b)包含具有以下取向的构建体：b1-Fc；b1b1-Fc；b1b1b1-Fc；b1 Fc；b1b1b1-Fc；b1b2 Fc；b1b2 Fc；b1b2 Fc；b1b2 Fc；Fc-b1b2；Fc-b1b2；b1-Fc-b1；b1b1-Fc-b1；b1-Fc；b1b1-Fc；b1b1b1-Fc；b1-Fc；b1b1b1-Fc；b1-Fc；b1b1b1-Fc；b1b2-Fc；b1b2-Fc；Fc-b1b2；Fc-b1b2；b1-Fc-b1；b1b1-Fc-b1；
其中，所述一个或多个b1、b2、或其片段源自NRP1蛋白或NRP2蛋白；
其中，相对于SEQ ID NO:1中所示的野生型氨基酸序列，所述一个或多个b1、b2、或其片段具有一个或多个选自由以下组成的组的氨基取代：K373E、K351A、E319A、K358E、R513E、K514E、K516E、R513A、K514A、K516A、Y297A、S345A和Y353A；和
其中，所述一个或多个氨基取代引起所述重组多肽与肝素或硫酸乙酰肝素的结合降低。
59.一种重组多肽，其包含：
(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)结构域或其片段，和
(b)免疫球蛋白结构域；
其中，所述重组多肽可操作地结合至具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，且X1和X2是任何氨基酸。
60.根据权利要求59所述的重组多肽，其中，所述一个或多个突变NRP结构域或其片段源自NRP1蛋白或NRP2蛋白。
61.根据权利要求59所述的重组多肽，其中，所述一个或多个突变NRP结构域或其片段是一个或多个突变b1结构域或一个或多个突变b2结构域。
62.根据权利要求59所述的重组多肽，其中，所述病毒是属于以下域的病毒：双链DNA病毒域Duplodnaviria；单链DNA病毒域Monodnaviria；核糖病毒域(Riboviria)或多DNA病毒域Varidnaviria。
63.根据权利要求59所述的重组多肽，其中，所述病毒是属于以下界的病毒：班福病毒界；香港病毒界；正核糖核酸病毒界；副核糖核酸病毒界或称德病毒界。
64.根据权利要求59所述的重组多肽，其中，所述病毒是属于以下门的病毒：酶录转逆病毒门(Artverviricota)；Cossairicota；黄病毒门；阴性病毒门；核质病毒门；Peplovicritota或Pisuvericota。
65.根据权利要求59所述的重组多肽，其中，所述病毒是属于以下纲的病毒：α-病毒超群纲(Alsuviricetes)；艾略病毒纲(Ellioviricetes)；黄病毒超群纲(Flasuviricetes)；Hervivicicetes，流鲑索病毒纲(Insthoviricetes)；Monjivircetes；乳多空病毒纲(Papovaviricetes)，Pisonivircetes；Pokkesvicicetes；逆转录酶病毒纲(Revtraviricetes)或星马病毒纲Stelpaviricetes。
66.根据权利要求59所述的重组多肽，其中所述病毒是属于以下目的病毒：黄热病毒目；分节病毒目；布尼亚病毒目；束衣病毒目；戊肝样病毒目；疱疹病毒目；荆楚病毒目；马尔特里病毒目；单股负链病毒目；尼多病毒目；逆转录病毒目；星状病毒目或楚尔豪森病毒目。
67.根据权利要求59的重组多肽，其中，所述病毒是属于以下科的病毒：星状病毒科；布尼亚病毒科；博纳病毒科；楚病毒科；冠状病毒科；黄病毒科；丝状病毒科；汉坦病毒科；戊肝病毒科；疱疹病毒科；内罗病毒科；正黏病毒科；乳头瘤病毒科；副黏病毒科；泛布尼亚病毒科；白纤病毒科；肺病毒科；痘病毒科；逆转录病毒科；弹状病毒科或披膜病毒科。
68.根据权利要求59的重组多肽，其中，所述病毒选自由以下组成的组：登革热；呼吸道合胞病毒(RSV)；汉坦病毒；EB病毒(EBV)；EBV(未切割)；SARS-CoV-2Wuhan；SARS-CoV-2Wuhan(未切割)；SARS-CoV-2UK；SARS-CoV-2India；SARS-CoV-2India(未切割)；HCoV-OC43；MERS-CoV；MERS-CoV(未切割)；单纯疱疹病毒(HSV)1；HSV 1(未切割)；甲型H5N1流感病毒(IAV H5N1)；人乳头瘤病毒(HPV)；人偏肺病毒和人免疫缺陷病毒(HIV)。
69.根据权利要求59所述的重组多肽，其中，所述病毒具有选自由以下组成的组的CendR基序：GTCTQSGERRREKR；KNTNVTLSKKRKRR；LTHKMIEESHRLRR；VSFKPPPPPSRRRR；VSFKPPPPPSRRRRGACVVY；CASYQTQTNSPRRAR；CASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLG；ASYQTQTNSHRRAR；ASYQTQTNSRRRAR；ASYQTQTNSRRRARSVASQSIIAY；GSGYCVDYSKNRRSR；LLEPVSISTGSRSAR；LLEPVSISTGSRSARSAIEDLLFDK；ERPRAPARSASRPRR；ERPRAPARSASRPRRPV；VLATGLRNVPQRKKR；PTTSSTSTTAKRKKR；IDMLKARVKNRVAR；AKRRVVQREKR；和AKRRVVQREKRAVGIGALFLG。
70.一种重组多肽，其包含：
(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域(b1)、NRPb2结构域(b2)、或其片段；和
(b)Fc结构域；
其中，所述一个或多个b1、b2、或其片段源自NRP1蛋白或NRP2蛋白；
其中，所述重组多肽可操作地结合至具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，且X1和X2是任何氨基酸；和
其中，所述病毒选自由以下组成的组：登革热；呼吸道合胞病毒(RSV)；汉坦病毒；EB病毒(EBV)；EBV(未切割)；SARS-CoV-2Wuhan；SARS-CoV-2Wuhan(未切割)；SARS-CoV-2UK；SARS-CoV-2India；SARS-CoV-2India(未切割)；HCoV-OC43；MERS-CoV；MERS-CoV(未切割)；单纯疱疹病毒(HSV)1；HSV 1(未切割)；甲型H5N1流感病毒(IAV H5N1)；人乳头瘤病毒(HPV)；人偏肺病毒和人免疫缺陷病毒(HIV)。
71.一种重组多肽，其包含：
(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域(b1)、NRPb2结构域(b2)、或其片段；和
(b)Fc结构域；
其中，所述一个或多个b1、b2、或其片段源自NRP1蛋白或NRP2蛋白；
其中，所述重组多肽可操作地结合至具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，且X1和X2是任何氨基酸；和
其中所述病毒具有选自由以下组成的组的CendR基序：GTCTQSGERRREKR；KNTNVTLSKKRKRR；LTHKMIEESHRLRR；VSFKPPPPPSRRRR；VSFKPPPPPSRRRRGACVVY；CASYQTQTNSPRRAR；CASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLG；ASYQTQTNSHRRAR；ASYQTQTNSRRRAR；ASYQTQTNSRRRARSVASQSIIAY；GSGYCVDYSKNRRSR；LLEPVSISTGSRSAR；LLEPVSISTGSRSARSAIEDLLFDK；ERPRAPARSASRPRR；ERPRAPARSASRPRRPV；VLATGLRNVPQRKKR；PTTSSTSTTAKRKKR；IDMLKARVKNRVAR；AKRRVVQREKR；和AKRRVVQREKRAVGIGALFLG。
72.一种重组多肽或其药学上可接受的盐，所述重组多肽包含与SEQ ID NO:113-116、SEQ ID NO:121-122、SEQ ID NO:133-137、SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:154、SEQ IDNO:162和SEQ ID NO:193-201中任一者所示的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
73.一种重组多肽或其药学上可接受的盐，所述重组多肽由与SEQ ID NO:113-116、SEQID NO:121-122、SEQ ID NO:133-137、SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:193-201中任一者所示的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列组成。
74.一种重组多肽或其药学上可接受的盐，所述重组多肽由SEQ ID NO:113-116、SEQID NO:121-122、SEQ ID NO:133-137、SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:193-201中任一者所示的氨基酸序列组成。
75.一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、降低病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述组合物包含：
(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)结构域或其片段，和
(b)免疫球蛋白结构域；
其中，所述重组多肽可操作地结合至具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，且X1和X2是任何氨基酸。
76.根据权利要求75所述的方法，其中，所述一个或多个突变NRP结构域或其片段源自NRP1蛋白或NRP2蛋白。
77.根据权利要求75所述的方法，其中，所述一个或多个突变NRP结构域或其片段是一个或多个突变b1结构域，或是一个或多个突变b2结构域。
78.根据权利要求75所述的方法，其中，所述病毒是属于以下域的病毒：双链DNA病毒域；单链DNA病毒域；核糖病毒域或多DNA病毒域。
79.根据权利要求75所述的方法，其中所述病毒是属于以下界的病毒：班福病毒界；香港病毒界；正核糖核酸病毒界；副核糖核酸病毒界或称德病毒界。
80.根据权利要求75所述的方法，其中，所述病毒是属于以下门的病毒：酶录转逆病毒门；Cossairicota；黄病毒门；阴性病毒门；核质病毒门；Peplovicritota或Pisuvericota。
81.根据权利要求75所述的方法，其中，所述病毒是属于以下纲的病毒：α-病毒超群纲；艾略病毒纲；黄病毒超群纲；Hervivicicetes，流鲑索病毒纲；Monjivircetes；乳多空病毒纲；Pisonivircetes；Pokkesvicicetes；逆转录酶病毒纲或星马病毒纲。
82.根据权利要求75所述的方法，其中所述病毒是属于以下目的病毒：黄热病毒目；分节病毒目；布尼亚病毒目；分节病毒目；戊肝样病毒目；疱疹病毒目；荆楚病毒目；马尔特里病毒目；单股负链病毒目；尼多病毒目；逆转录病毒目；星状病毒目或楚尔豪森病毒目。
83.根据权利要求75所述的方法，其中，所述病毒是属于以下科的病毒：星状病毒科；布尼亚病毒科；博纳病毒科；楚病毒科；冠状病毒科；黄病毒科；丝状病毒科；汉坦病毒科；戊肝病毒科；疱疹病毒科；内罗病毒科；正黏病毒科；乳头瘤病毒科；副黏病毒科；泛布尼亚病毒科；白纤病毒科；肺病毒科；痘病毒科；逆转录病毒科；弹状病毒科；或披膜病毒科。
84.根据权利要求75所述的方法，其中，所述病毒选自由以下组成的组：登革热；呼吸道合胞病毒(RSV)；汉坦病毒(Hantavirus)；EB病毒(EBV)；EBV(未切割)；SARS-CoV-2Wuhan；SARS-CoV-2Wuhan(未切割)；SARS-CoV-2UK；SARS-CoV-2India；SARS-CoV-2India(未切割)；HCoV-OC43；MERS-CoV；MERS-CoV(未切割)；单纯疱疹病毒(HSV)1；HSV 1(未切割)；甲型H5N1流感病毒(influenza A H5N1 virus，IAV H5N1)；人乳头瘤病毒(HPV)；人偏肺病毒和人免疫缺陷病毒(HIV)。
85.根据权利要求75所述的方法，其中，所述病毒具有选自由以下组成的组的CendR基序：GTCTQSGERRREKR；KNTNVTLSKKRKRR；LTHKMIEESHRLRR；VSFKPPPPPSRRRR；VSFKPPPPPSRRRRGACVVY；CASYQTQTNSPRRAR；CASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLG；ASYQTQTNSHRRAR；ASYQTQTNSRRRAR；ASYQTQTNSRRRARSVASQSIIAY；GSGYCVDYSKNRRSR；LLEPVSISTGSRSAR；LLEPVSISTGSRSARSAIEDLLFDK；ERPRAPARSASRPRR；ERPRAPARSASRPRRPV；VLATGLRNVPQRKKR；PTTSSTSTTAKRKKR；IDMLKARVKNRVAR；AKRRVVQREKR；和AKRRVVQREKRAVGIGALFLG。
86.一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、降低病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者给药包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述组合物包括：
(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域(b1)、NRPb2结构域(b2)或其片段；和
(b)Fc结构域；
其中，所述一个或多个b1、b2或其片段源自NRP1蛋白或NRP2蛋白；
其中，所述重组多肽能够操纵以结合至具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，且X1和X2是任何氨基酸；和
其中所述病毒选自由以下组成的组：登革热；呼吸道合胞病毒(RSV)；汉坦病毒；EB病毒(EBV)；EBV(未切割)；SARS-CoV-2Wuhan；SARS-CoV-2Wuhan(未切割)；SARS-CoV-2UK；SARS-CoV-2India；SARS-CoV-2India(未切割)；HCoV-OC43；MERS-CoV；MERS-CoV(未切割)；单纯疱疹病毒(HSV)1；HSV 1(未切割)；甲型H5N1流感病毒(IAV H5N1)；人乳头瘤病毒(HPV)；人偏肺病毒和人免疫缺陷病毒(HIV)。
87.一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、降低病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述组合物包含：
(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域(bl)、NRPb2结构域(b2)、或其片段；和
(b)Fc结构域；
其中，所述一个或多个b1、b2、或其片段源自NRP1蛋白或NRP2蛋白；
其中，所述重组多肽可操作地结合至具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，且X1和X2是任何氨基酸；和
其中，所述病毒具有选自由以下组成的组的CendR基序：GTCTQSGERRREKR；KNTNVTLSKKRKRR；LTHKMIEESHRLRR；VSFKPPPPPSRRRR；VSFKPPPPPSRRRRGACVVY；CASYQTQTNSPRRAR；CASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLG；ASYQTQTNSHRRAR；ASYQTQTNSRRRAR；ASYQTQTNSRRRARSVASQSIIAY；GSGYCVDYSKNRRSR；LLEPVSISTGSRSAR；LLEPVSISTGSRSARSAIEDLLFDK；ERPRAPARSASRPRR；ERPRAPARSASRPRRPV；VLATGLRNVPQRKKR；PTTSSTSTTAKRKKR；IDMLKARVKNRVAR；AKRRVVQREKR；和AKRRVVQREKRAVGIGALFLG。
88.一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、减少病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述重组多肽包含与SEQ ID NO:113-116、SEQ ID NO:121-122、SEQ ID NO:133-137、SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:162和SEQ IDNO:193-201中任一项所示的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
89.一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、减少病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述重组多肽由与SEQ ID NO:113-116、SEQ ID NO:121-122、SEQ ID NO:133-137、SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:162和SEQ IDNO:193-201中任一项所述的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列组成。
90.一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、减少病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述重组多肽由SEQ ID NO:113-116、SEQ ID NO:121-122、SEQ ID NO:133-137、SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:193-201中任一项所示的氨基酸序列组成。
91.一种重组多肽或其药学上可接受的盐，所述重组多肽包含氨基酸序列，并进一步包含赋形剂，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:113-116、SEQ ID NO:121-122、SEQ ID NO:133-137、SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:193-201中任一者所示的氨基酸序列至少90％相同。
92.根据权利要求75所述的方法，所述病毒是属于以下科的病毒：星状病毒科；布尼亚病毒科；博纳病毒科；楚病毒科；冠状病毒科；黄病毒科；丝状病毒科；汉坦病毒科；戊肝病毒科；疱疹病毒科；内罗病毒科；正黏病毒科；乳头瘤病毒科；副黏病毒科；泛布尼亚病毒科；白纤病毒科；肺病毒科；痘病毒科；逆转录病毒科；弹状病毒科或披膜病毒科。
93.根据权利要求75所述的方法，其中所述病毒选自由以下组成的组：登革热；呼吸道合胞病毒(RSV)；汉坦病毒；EB病毒(EBV)；EBV(未切割)；HCoV-OC43；MERS-CoV；MERS-CoV(未切割)；单纯疱疹病毒(HSV)1；HSV 1(未切割)；甲型H5N1流感病毒(IAV H5N1)；人乳头瘤病毒(HPV)；人偏肺病毒和人免疫缺陷病毒(HIV)。
94.根据权利要求75所述的方法，所述病毒具有选自由以下组成的组的CendR基序：GTCTQSGERRREKR；KNTNVTLSKKRKRR；LTHKMIEESHRLRR；VSFKPPPPPSRRRR；VSFKPPPPPSRRRRGACVVY；CASYQTQTNSPRRAR；CASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLG；ASYQTQTNSHRRAR；ASYQTQTNSRRRAR；ASYQTQTNSRRRARSVASQSIIAY；GSGYCVDYSKNRRSR；LLEPVSISTGSRSAR；LLEPVSISTGSRSARSAIEDLLFDK；ERPRAPARSASRPRR；ERPRAPARSASRPRRPV；VLATGLRNVPQRKKR；PTTSSTSTTAKRKKR；IDMLKARVKNRVAR；AKRRVVQREKR；和AKRRVVQREKRAVGIGALFLG。
95.一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、降低病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述组合物包括：
(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域(b1)、NRPb2结构域(b2)、或其片段；和
(b)Fc结构域；
其中，所述一个或多个b1、b2、或其片段源自NRP1蛋白或NRP2蛋白；
其中，所述重组多肽可操作地结合至具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，且X1和X2是任何氨基酸；且
其中所述病毒选自由以下组成的组：登革热；呼吸道合胞病毒(RSV)；汉坦病毒；EB病毒(EBV)；EBV(未切割)；HCoV-OC43；MERS-CoV；MERS-CoV(未切割)；单纯疱疹病毒(HSV)1；HSV1(未切割)；甲型H5N1流感病毒(IAV H5N1)；人乳头瘤病毒(HPV)；人偏肺病毒和人类免疫缺陷病毒(HIV)。
96.一种在有需要的受试者中限制病毒感染发生、降低病毒感染风险、降低病毒感染严重程度或治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的重组多肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述组合物包括：
(a)一个或多个突变神经毡蛋白(NRP)b1结构域(b1)、NRPb2结构域(b2)、或其片段；和
(b)Fc结构域；
其中，所述一个或多个b1、b2、或其片段源自NRP1蛋白或NRP2蛋白；
其中，所述重组多肽可操作地结合至具有-Z1-X1-X2-Z2-(CendR)基序的病毒，其中Z1和Z2是精氨酸或赖氨酸，且X1和X2是任何氨基酸；且
其中，所述病毒具有选自由以下组成的组的CendR基序：GTCTQSGERRREKR；KNTNVTLSKKRKRR；LTHKMIEESHRLRR；VSFKPPPPPSRRRR；VSFKPPPPPSRRRRGACVVY；CASYQTQTNSPRRAR；CASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLG；ASYQTQTNSHRRAR；ASYQTQTNSRRRAR；ASYQTQTNSRRRARSVASQSIIAY；GSGYCVDYSKNRRSR；LLEPVSISTGSRSAR；LLEPVSISTGSRSARSAIEDLLFDK；ERPRAPARSASRPRR；ERPRAPARSASRPRRPV；VLATGLRNVPQRKKR；PTTSSTSTTAKRKKR；IDMLKARVKNRVAR；AKRRVVQREKR；和AKRRVVQREKRAVGIGALFLG。
97.根据权利要求92-99中任一项所述的方法，其中，所述病毒不是SARS-CoV-2。
98.根据权利要求92-99中任一项所述的方法，其中，所述病毒不是SARS-CoV-2Wuhan；SARS-CoV-2Wuhan(未切割)；SARS-CoV-2UK；SARS-CoV-2India或SARS-CoV-2India(未切割)。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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SE448277B (sv) 1985-04-12 1987-02-09 Draco Ab Indikeringsanordning vid en doseringsanordning for lekemedel
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AU4829593A (en) 1992-09-23 1994-04-12 Fisons Plc Inhalation device
NZ257056A (en) 1992-10-19 1996-08-27 Dura Pharma Inc Dry powder inhaler: housing with mixing chamber and impeller
DK0680451T3 (da) 1993-01-19 1999-07-19 Glaxo Group Ltd Aerosoldispenser samt fremgangsmåde ved dens fremstilling
GB9526100D0 (en) 1995-12-20 1996-02-21 Intersurgical Ltd Nebulizer
KR19990077014A (ko) 1996-01-03 1999-10-25 그레이엄 브레레톤 흡입 장치
US5921447A (en) 1997-02-13 1999-07-13 Glaxo Wellcome Inc. Flow-through metered aerosol dispensing apparatus and method of use thereof
BR0211900A (pt) 2001-08-14 2004-08-24 Toyama Chemical Co Ltd Método para inibição do desenvolvimento de vìrus e/ou virucida, análogos de nucleotìdeo de pirazina e de nucleosìdeo de pirazina, precursor do inibidor da polimerase de rna, inibidor da polimerase de rna, método para tratar pacientes infectados por vìrus, e, usos de um análogo de nucleotìdeo de pirazina ou um sal deste e de um análogo de nucleosìdeo de pirazina ou um sal deste
KR20170044691A (ko) * 2014-09-05 2017-04-25 알에스이엠, 리미티드 파트너쉽 염증을 치료 및 예방하기 위한 조성물 및 방법
KR102216566B1 (ko) * 2016-07-05 2021-02-17 (주) 아이벤트러스 종양 혈관형성을 억제하는 vegf 딥 블로커를 포함하는 암 치료용 조성물 및 이의 제조방법
JP7490925B2 (ja) * 2018-07-26 2024-05-28 エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド Ｎｒｐ２関連疾患を治療するための組成物および方法

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