CN116770394A - 蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离‑在线成像分析装置及方法，所述装置用于蛋白质电泳分离和在线检测；所述装置包括：开放式电泳槽，包括：上缓冲液室，设于开放式电泳槽上部；下缓冲液室，设于开放式电泳槽下部；紫外光源，用于激发凝胶内蛋白条带以产生荧光信号；CCD成像检测机构，包括：滤光片，设置于CCD成像检测机构最前端；紫外镜头，设置于滤光片和CCD感光芯片之间；CCD感光芯片，与主机相连；主机，与CCD感光芯片相连在线成像。与现有技术相比，本发明的装置具有实时监测凝胶电泳蛋白迁移过程、无需后处理直接获取凝胶电泳图谱、自动实现目标蛋白定量检测、试剂少实验过程简便等多种优点。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白丙烯酰胺凝胶电泳技术领域，尤其是涉及一种蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置及其方法。
背景技术
目前用于蛋白质分离最常用的技术是平板聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gelelectrophoresis,PAGE)电泳，但是传统的PAGE电泳分析装置和方法存在许多问题极大的限制了其应用场景：一、操作繁琐、试剂损耗大且耗时的凝胶后处理染色流程，电泳完成后需要将PAGE凝胶剥离，然后放入蛋白固定液中固定4-6小时，之后使用染色剂对凝胶进行染色2-4小时，最后还需对染色后的凝胶放入脱色液中进行脱色处理，期间需不断更换脱色液，耗时2-4小时(常胜合,舒海燕,秦广雍,et al.凝胶电泳蛋白质染色方法研究进展[J].河南农业科学,2006,(5):8-12.)；二、无法在线成像分析，传统的电泳槽是全封闭结构，且凝胶前置玻璃为普通玻璃，紫外光无法穿透两者，电泳槽外壳和前置普通玻璃极大的影响了光学信号采集，因此对于凝胶内蛋白检测必须在电泳完成后取出，进行染色，染色后的蛋白条带还需借助专业的成像扫描仪进行成像，之后还得使用图像处理软件才能分析蛋白条带的灰度值；三、分辨率低，凝胶内蛋白无时无刻不在进行无序的布朗运动，电泳停止后，凝胶内蛋白立即发生扩散，在取出凝胶至固定的过程，条带发生扩散导致分辨率下降；四、数据无法溯源，传统的电泳平台是个人操作并整理实验数据，数据来源不可控，存在数据造假、挪用等可能性。五、无法进行定量检测，目前的染色技术对于蛋白条带的分析无法做到蛋白质质量的定量检测，其染色程度只能在一定程度上反映蛋白的量无法准确的体现条带内蛋白质的质量(林方养,杨耀东,万婕,et al.几种SDS-PAGE凝胶电泳染色方法的比较[J].安徽农业科学,2014,42(08):2295-6.)。
针对传统凝胶电泳的不足，研究并开发一种电泳分离-在线检测装置显得尤为重要。研究人员发现绝大多数蛋白质本身存在荧光基团，荧光基团在紫外的激发下会发射出荧光，而蛋白质在紫外激发下发射的荧光光强是与蛋白质的质量呈正相关的(Li,Q.,Seeger,S.Autofluorescence Detection in Analytical Chemistry and Biochemistry[J].Applied Spectroscopy Reviews,2010,45(1):12-43.)。因此对于蛋白质激发荧光光强的检测是一个十分具有前景的蛋白质无标记定量检测技术。但是紫外激发蛋白的荧光光强较弱，易受环境干扰，特别是目前传统的平板PAGE电泳系统所使用的材料在紫外激发下也会产生荧光干扰检测。传统的凝胶电泳与紫外激发蛋白的荧光光强的检测方法无法兼容。因此目前缺少将紫外激发的蛋白荧光成像与PAGE电泳相结合关键技术和核心部件，阻碍了其实际的应用和发展。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题而提供一种蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置及其方法，设计一种开放式电泳槽，能够实时监测凝胶电泳蛋白迁移过程、无需后处理直接获取凝胶电泳图谱、自动实现目标蛋白定量检测、试剂少实验过程简便等多种优点。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明的第一个目的是提供一种蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置，所述装置用于蛋白质电泳分离和在线检测；
所述装置包括：一开放式电泳槽，用作凝胶电泳以及蛋白条带紫外检测支架，包括：一上缓冲液室，设于开放式电泳槽上部；一下缓冲液室，设于开放式电泳槽下部；一紫外光源，用于激发凝胶内蛋白条带以产生荧光信号；一CCD成像检测机构，用于电泳过程中捕获蛋白条带激发荧光信号以在线成像，包括：一滤光片，设置于CCD成像检测机构最前端；一紫外镜头，设置于滤光片和CCD感光芯片之间；一CCD感光芯片，与在线分析主机相连；一主机，与CCD感光芯片相连在线成像；所述凝胶为平板凝胶。
进一步地，所述开放式电泳槽的外壳由黑色吸光材料制备。
进一步地，所述开放式电泳槽的外壳由包括但不限于黑色PMMA、黑色PC、黑色PVC、黑色PP以及黑色PTFE等制备。
进一步地，所述上缓冲液室包括左右对称放置的正负电极以及前后对称放置的平板凝胶卡槽。
进一步地，所述平板凝胶卡槽包括固定楔子、平板结构；所述平板结构包括依次设置的石英前置玻璃、平板凝胶以及黑色背景板。
进一步地，所述黑色背景板的材料为包括但不限于，聚乙烯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯等材料。
进一步地，所述紫外光源为中心波长275nm-360nm的紫外线光源，为包括但不限于中心波长为275nm-360nm的LED、氚灯、汞灯、激光光源，包括但不限于点光源、线光源和面光源。
进一步地，所述紫外光源对称分布于开放式电泳槽中被检测面两侧；所述CCD成像检测机构设于开放式电泳槽一侧。
进一步地，所述滤光片为中心波长250 -360纳米，中心波长透过率大于80％的滤光片，半高宽为10nm-50nm。
进一步优选地，所述滤光片半高宽为10nm-40nm。
进一步地，所述紫外镜头的焦距35mm-39mm，光圈为F#5.6，工作距离150mm-10m，工作波长为250-380nm。
进一步地，所述CCD感光芯片于中心波长处量子转化效率大于40％。
本发明的第二个目的是提供一种采用上述的蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置的蛋白质电泳分离和在线检测的方法，该方法包括如下步骤：
步骤1)将制备好的平板凝胶安装于上缓冲液室的平板凝胶卡槽内，再将上缓冲液室垂直安装于下缓冲液室上，分别在上缓冲液室和下缓冲液室加入适量电极缓冲液，在平板凝胶的上样通道中分别加入待测样品，样品体积1-20μL；
步骤2)将上缓冲液室与电源的正负极连接将电源的正负极接入上缓冲液室相应的电极，打开电源，设置合适的电压，开始电泳，电压控制在50V/m–3000V/m，电泳时长20-40min；
步骤3)电泳过程中以及结束后，打开紫外光源，使用CCD成像检测机构可对电泳过程在线成像，通过主机观察电泳过程中蛋白条带，获取样品中蛋白质成分信息以及浓度信息。
本发明不仅能够实现PAGE蛋白电泳在线检测成像，还能实现对于蛋白条带的定量检测，且无需后续繁杂的样本处理过程。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下几个方面：
1)本发明提出的一种蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置及其方法，可以实现蛋白电泳过程实时在线检测，开放式电泳槽便于光学信号采集，在电泳过程中可随时观测蛋白条带情况，无需后续复杂耗时的凝胶固定、染色、脱色以及扫描成像。
2)本发明提出的一种蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置及其方法，分辨率高，在线检测避免了蛋白条带的胶内扩散，分离蛋白分辨率比离线染色方式更高。
3)本发明提出的一种蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置及其方法，可以实现蛋白的无标记检测，无需染色试剂，节约检测时间与成本。
4)本发明提出的一种蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置及其方法，装置高度集成自动化，蛋白分离与检测可由该装置自动实现，只需进行蛋白上样，后续蛋白电泳分离以及成像检测都可在计算机上完成，操作简便，1小时内即可完成蛋白的分离与检测。
5)本发明提出的一种蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置及其方法，实验数据可溯源，实验完成后结果自动上传至数据库，并同时记录实验员名字、实验时间等关键信息，无权限人员无法更改实验结果相关任何信息，实验数据来源可靠。
6)本发明提出的一种蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置及其方法，可以实现蛋白的瞬时定量检测，电泳分离完成后，通过紫外激发，利用高灵敏度的CCD感光芯片获取蛋白条带荧光图谱，然后使用图像处理技术，降低背景噪声，构建蛋白条带荧光强度与蛋白质量的标准曲线，实现了蛋白质定量检测。
附图说明
图1为本发明实施例中的蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置的结构示意图。
图2为本发明实施例中上缓冲液室结构示意图。
图3为本发明实施例中平板凝胶卡槽结构示意图。
图4为本发明实施例中光学检测光路示意图。
图5为本发明实施例分别使用普通前置玻璃和石英前置玻璃，对蛋白标准Marker成像结果对比。
图6为本发明实施例蛋白标准Marker、不同质量混合蛋白样品条带的荧光图谱与考马斯亮蓝染色蛋白条带对比结果，其中，本发明的在线成像，考马斯亮蓝染色。
图7为本发明实施例蛋白标准Marker中不同分子量蛋白的分离程度与考马斯亮蓝染色的分离程度对比结果，其中，本发明的在线成像，考马斯亮蓝染色。
图8为本发明实施例不同质量混合蛋白样品分离程度与考马斯亮蓝染色的分离程度对比结果，其中，本发明的在线成像，考马斯亮蓝染色。
图9为本发明实施例不同质量蛋白质与荧光强度的标准曲线图。
图中：1、主机；2、CCD感光芯片；3、紫外镜头；4、滤光片；5、紫外光源；6、上缓冲液室；7、下缓冲液室；8、电源；6.1、固定楔子；6.2、平板结构；6.2.1、石英前置玻璃；6.2.2、平板凝胶；6.2.3、黑色背景板；6.3、正负电极。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但绝不是对本发明的限制。本技术方案中如未明确说明的制备手段、材料、结构或组成配比等特征，均视为现有技术中公开的常见技术特征。
实施例
如图1～4所示，一种蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置和方法，包括主机1、CCD感光芯片2、紫外镜头3、滤光片4、紫外光源5、上缓冲液室6、下缓冲液室7、电源8、固定楔子6.1、石英前置玻璃6.2.1、平板凝胶6.2.2、黑色背景板6.2.3、正负电极6.3。具体连接关系如图所示。主机1与CCD感光芯片2相连，CCD感光芯片2、紫外镜头3、滤光片4组装在一起构成荧光感光组件，紫外光源5呈一定夹角照射上缓冲液室6的石英前置玻璃6.2.1表面，紫外光透过石英前置玻璃6.2.1作用在PAGE凝胶6.2.2上，上缓冲液室6放置于下缓冲液室7上，PAGE凝胶6.2.2制备于石英前置玻璃6.2.1与黑色背景板6.2.3之内，通过固定楔子6.1固定在上缓冲液室6的平板凝胶卡槽内，上缓冲液室6上的正负电极6.3与电源8连接。
本实施例中，所述紫外光源5为中心波长275nm的紫外线。
将配好的蛋白样品10μL上样到平板凝胶6.2.2的上样通道中，PAGE凝胶6.2.2固定在平板凝胶卡槽内，然后将上缓冲液室6垂直放置于下缓冲液室上，通过导线将打开电源8，调节电压至80V，进行电泳15分钟，然后将电压调整到120V，电泳20分钟后，打开紫外光源5，透过石英前置玻璃6.2.1照射PAGE凝胶6.2.2，上缓冲液室6上的正负电极6.3与电源8连接，打开电源8调节合适的电压进行蛋白质电泳分离，电泳期间可以打开紫外光源5对蛋白条带进行在线成像。
应用上述装置的蛋白电泳分离在线成像方法，具体包括如下步骤：
在上样通道内上样后，安装好开放式电泳槽，调节荧光感光组件使紫外镜头3正对开放式电泳槽的成像面；
打开电源8，设置电泳分离所需的电压，打开主机与CCD感光芯片2，调整合适的曝光时间，实时采集数据；
电泳过程中，打开紫外光源5即可对凝胶内蛋白条带进行紫外激发，蛋白在紫外激发下发射荧光，荧光信号被CCD感光芯片2收集，并在主机1中呈现相应的蛋白荧光条带图谱，实现对蛋白电泳分离过程的实时监测；
电泳结束后，获取最终的蛋白荧光条带图谱，利用图像处理技术降低背景噪声，获取蛋白荧光条带的灰度值，实现蛋白的定量检测。
如图5所示，普通前置玻璃阻碍紫外传播，凝胶内蛋白本征荧光无法被激发，成像系统无法观测到荧光图谱(图5a)；而本实施例中的石英前置玻璃透光性能优良，紫外穿透率高，紫外激发光能顺利到达凝胶内激发蛋白条带本征荧光，成像系统观测到蛋白荧光条带(图5b)。
如图6所示，对于红线框内的蛋白样品，荧光图谱灵敏度高于CBB染色。
如图7～8所示，该装置的分辨率明显优于CBB染色。
如图9所示，该装置能对蛋白条带进行定量分析，具备宽动态范围和低检测限。
蛋白标准Marker中不同分子量蛋白分辨率对比及混合蛋白样品分别率对比分别见表1和表2，对于蛋白标准marker，其不同的蛋白条带分子量差异较大，两者都成功将其分离，但在线成像装置的分辨率普遍由于CBB染色；对于混合蛋白样品，蛋白质分子量差异较小的情况下，在线成像分辨率达1.6，而CBB染色未能将其分离，分辨率仅为0.8，在线成像分辨率显著优于CBB染色。
表1蛋白标准Marker中不同分子量蛋白分辨率对比。
表2混合蛋白样品分辨率对比。
| 分辨率 | 在线成像 | CBB染色 |
| R1(Peak1-2) | 4.8 | 4.2 |
| R2(Peak2-3) | 1.6 | 0.8 |
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置，其特征在于，所述装置用于蛋白质电泳分离和在线检测；
所述装置包括：开放式电泳槽，用作凝胶电泳以及蛋白条带紫外检测支架，包括：
上缓冲液室(6)，设于开放式电泳槽上部；
下缓冲液室(7)，设于开放式电泳槽下部；
紫外光源(5)，用于激发凝胶内蛋白条带以产生荧光信号；
CCD成像检测机构，用于电泳过程中捕获蛋白条带激发荧光信号以在线成像，包括：
滤光片(4)，设置于CCD成像检测机构最前端；
紫外镜头(3)，设置于滤光片(4)和CCD感光芯片(2)之间；
CCD感光芯片(2)，与主机(1)相连；
主机(1)，与CCD感光芯片(2)相连在线成像；
所述凝胶为平板凝胶(6.2.2)。
2.根据权利要求1所述一种蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置，其特征在于，所述开放式电泳槽的外壳由黑色吸光材料制备。
3.根据权利要求1所述一种蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置，其特征在于，所述上缓冲液室(6)包括左右对称放置的正负电极(6.3)以及前后对称放置的平板凝胶卡槽。
4.根据权利要求3所述一种蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置，其特征在于，所述平板凝胶卡槽包括固定楔子(6.1)、平板结构(6.2)；
所述平板结构(6.2)包括依次设置的石英前置玻璃(6.2.1)、平板凝胶(6.2.2)以及黑色背景板(6.2.3)。
5.根据权利要求1所述一种蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置，其特征在于，所述紫外光源(5)为中心波长275nm-360nm的紫外线光源。
6.根据权利要求1所述一种蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置，其特征在于，所述紫外光源(5)对称分布于开放式电泳槽中被检测面两侧；
所述CCD成像检测机构设于开放式电泳槽一侧。
7.根据权利要求1所述一种蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置，其特征在于，所述滤光片(4)为中心波长250-360纳米，中心波长透过率大于80％的滤光片，半高宽为10nm-50nm。
8.根据权利要求1所述一种蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置，其特征在于，所述紫外镜头(3)的焦距35mm-39mm，工作距离150mm-10m，工作波长为250-380nm。
9.根据权利要求1所述一种蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置，其特征在于，所述CCD感光芯片(2)于中心波长处量子转化效率大于40％。
10.一种采用如权利要求1-9中任一项所述的蛋白丙烯酰胺凝胶电泳分离-在线成像分析装置的蛋白质电泳分离和在线检测的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
步骤1)将制备好的平板凝胶(6.2.2)安装于上缓冲液室(6)内，再将上缓冲液室(6)垂直安装于下缓冲液室(7)上，分别在上缓冲液室(6)和下缓冲液室(7)加入适量电极缓冲液，在平板凝胶(6.2.2)的上样通道中分别加入待测样品，样品体积1-20μL；
步骤2)将上缓冲液室(6)与电源(8)的正负极连接，打开电源(8)，设置合适的电压，开始电泳，电压控制在50V/m–3000V/m，电泳时长20-40min；
步骤3)电泳过程中以及结束后，打开紫外光源(5)，使用CCD成像检测机构可对电泳过程在线成像，通过主机(1)观察电泳过程中蛋白条带，获取样品中蛋白质成分信息以及浓度信息。
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