CN116761632A - 用于增强靶向治疗剂的治疗效果的基于抗体的缀合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含用于治疗癌症的抗体、接头以及包含PEO和PPO的嵌段共聚物的缀合物，以及进一步包含低分子量化合物的缀合物。该缀合物具有优异的癌细胞靶向能力，并且可以通过增加抗体的半衰期来有效地增加癌细胞，因此可以有效地用于治疗癌症。
Description
技术领域
本发明涉及能够增强靶向治疗剂的治疗效果的缀合物，所述缀合物包含抗体、接头和嵌段共聚物，所述嵌段共聚物包含聚(环氧乙烷)(PEO)和聚(环氧丙烷)(PPO)，以及低分子化合物进一步结合到上述缀合物的缀合物。
背景技术
由于传统的化疗是治疗癌症的基本方法之一，并且在抗癌临床试验中使用的大多数化疗抗癌剂的益处是它们靶向细胞周期的能力，因此毒性取决于癌细胞的增殖程度。此外，化疗抗癌剂通常以接近最大耐受剂量使用以获得临床治疗效果，并且使用各种药物的治疗已经成为癌症治疗的标准治疗疗法。然而，抗癌剂只杀死快速增殖的细胞，不能区分正常细胞和肿瘤细胞或肿瘤组织。由于这些缺点，发生了全身毒性和细胞毒性，并且长期治疗可能导致对抗癌剂的耐药性，因此迫切需要细胞毒性药物仅靶向并杀死癌细胞的改进疗法。
与细胞毒性药物不同，与肿瘤细胞表面特定抗原结合的单克隆抗体是一种替代治疗疗法，可降低全身毒性，因为单克隆抗体与肿瘤特异性结合。事实上，已经通过表达图谱研究鉴定了优先或专门在癌细胞表面表达的抗原，并且可以设计和生产与肿瘤相关抗原特异性结合的单克隆抗体。以分子水平的药物形式进行的某种形式的靶向治疗通过阻断与致癌作用和肿瘤生长有关的信号来阻止癌细胞增殖。癌细胞靶向治疗方法有望成为比现有方法更有效的方法，同时不会伤害正常细胞。这种单克隆抗体正在持续开发中，并且已经有了美国食品药品监督管理局(FDA)批准的治疗剂。批准的单克隆抗体的实例包括利妥昔单抗(rituximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、贝伐单抗(bevacizumab)、伊普利单抗(ipilimumab)等。
然而，只有少数抗体对癌症治疗有用，因为大多数抗体在杀死癌细胞方面不是非常有效。为了有效使用基于抗体的靶向抗癌剂，需要通过单次注射诱导有效的癌细胞杀伤，并在长时间内以强结合力保持抗原-抗体结合。
发明内容
技术问题
在这些情况下，本发明人已经对一种方法进行了研究，该方法可以通过诱导基于抗体的靶向抗癌药，只需单次注射就能有效地杀死癌细胞，并在长时间内以强结合力保持抗原-抗体结合，从而有效地使用。
结果，本发明人制备了一种缀合物，其中接头和包含PEO和PPO的嵌段共聚物与选择性结合癌细胞中过表达的靶向因子的单克隆抗体连接，并证实了这种缀合物可以在体内保留更长时间，并通过与细胞膜的相互作用诱导比现有治疗剂更好的抗癌效果。
此外，本发明人额外制备了一种缀合物，其中低分子量化合物缀合到上述缀合物的一端，并证实了额外制备的缀合物克服了单克隆抗体的局限性和低分子量化合物的局限性，并且由于包含PEO和PPO的嵌段共聚物的协同效应，可以诱导更好的抗癌效果，从而完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供一种用于治疗癌症的基于抗体的缀合物，其具有增强的体内半衰期和治疗效果，以及包含该缀合物的用于治疗癌症的药物组合物。
技术解决方案
为了实现该目的，本发明的一个方面提供了一种缀合物，其包含：(a)用于治疗癌症的抗体；(b)通过共价键与抗体连接的接头；和(c)嵌段共聚物，所述嵌段共聚物包含通过共价键与接头连接的PEO和PPO。
如本文所用，术语“用于癌症疗法的抗体”是指用于治疗癌症的抗体，并且可以根据抗体的来源区分为动物来源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
动物来源抗体是通过将抗原注射到非人动物中产生的抗体，嵌合抗体是其中诱导最大免疫原性的动物来源抗体的恒定区被人抗体的恒定区替换的抗体。
人源化抗体是这样一种抗体，其中除了互补决定区(CDR)序列(其为抗原结合位点)之外，动物来源抗体的其余部分的序列被人抗体序列取代，从而消除动物来源抗体的免疫原性。
此外，人抗体是通过人抗体文库的噬菌体展示技术选择针对特定抗原的抗体，然后将相应的抗体基因导入小鼠而产生的抗体。
此外，用于治疗癌症的抗体可以根据其作用机制分为受体靶向抗体和免疫检查点抑制剂或免疫检查点阻断剂。
受体靶向抗体是一种与癌细胞表面的特定受体特异性结合的抗体。根据本发明的示例性实施方案，特定受体可以选自由表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2(HER2)和血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)组成的组。
免疫检查点抑制剂通过阻止癌细胞的程序性死亡配体1(PD-L1)与T细胞的PD-1结合来维持T细胞的免疫功能。
表皮生长因子受体(EGFR)是一组调节细胞生长、分裂和死亡的细胞膜受体。表皮生长因子受体(EGFR)是170kDa的1型膜蛋白，已知由于该受体的扩增和表达，其在各种类型的肿瘤(实体瘤，如肺癌、头颈部肿瘤、结肠直肠癌、胰腺癌和乳腺癌)中过表达。表皮生长因子受体在其中过表达的肿瘤组织往往更具侵袭性、更具转移性、对抗癌疗法更具抗性，因此预后更差。为了克服这一点，已经使用靶向表皮生长因子受体的抗体进行了靶向治疗。抗体与表皮生长因子受体结合以抑制表皮生长因子的结合，从而抑制癌细胞的信号传导和生长以治疗癌症。
西妥昔单抗是一种嵌合抗体，它与细胞表面的表皮生长因子受体(EGFR)结合，干扰配体的结合，从而抑制受体活化，增加受体在细胞内的内化，并降低受体的表达。结果，西妥昔单抗将细胞周期阻滞在G0-G1，诱导Rb基因的去磷酸化，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，并抑制血管生成因子(如VEGF)的产生。
人表皮生长因子受体2(HER2)是一种酪氨酸磷酸化的生长因子受体，分子量为185kDa，存在于细胞表面。尽管HER2分子中没有配体结合位点，但HER2与其他受体(如EGFR、HER3和HER4)形成二聚体。受体-配体缀合通过各种细胞信号通路表现出诸如细胞增殖、细胞存活、转移和血管生成的效应。HER2在各种癌症类型中过表达，例如20-30％的乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肺癌和前列腺癌。其过表达进一步增强了促进细胞存活、增殖、血管生成和转移的功能。
曲妥珠单抗是一种人源化抗体，是一种靶向HER2蛋白的细胞外结构域位点的重组人单克隆抗体，是第一个获得FDA批准的此类抗体。通过抑制HER2过表达的肿瘤细胞中的信号通路并抑制细胞内G1/S细胞周期，诱导了细胞凋亡，并增加了对抗癌剂如铂类药物、紫杉烷、阿霉素和环磷酰胺的易感性。此外，当抗体与HER2的细胞外区域结合时，HER2受体减少。
程序性死亡配体1(PD-L1)是一种40kDa的1型跨膜蛋白，是一种在癌细胞中大量表达的蛋白。PD-L1通过与存在于T细胞表面的PD-1受体相互作用来发挥规避免疫细胞攻击的作用。它们的相互作用同时减少调节细胞的细胞凋亡，并减少淋巴结中抗原特异性T细胞的增殖，使癌细胞规避抗癌免疫反应。
阿维单抗(avelumab)是一种人抗体，是一种免疫检查点抑制剂，是一种靶向癌细胞中过表达的PD-L1的人单克隆抗体。这种抗体通过阻止T细胞的PD-1和癌细胞的PD-L1的相互作用来激活癌细胞中形成的免疫抑制环境。阿维单抗的优势在于，通过阻断PD-L1蛋白(其作为免疫检查点)的活性可以表现出抗癌症的效果，其中无论何种类型的癌症都表达PD-L1。已知阿维单抗对非小细胞肺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、肾癌、肝细胞癌等有效。
血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)在血管和淋巴内皮细胞中表达，并与VEGF-A、VEGF-E等结合，以促进血管增殖和血管内皮细胞迁移。
雷莫芦单抗(ramucirumab)是一种人抗体，是一种VEGFR2拮抗剂，阻断配体结合，并从而抑制受体活化，用于治疗结肠直肠癌、非小细胞肺癌和胃癌。
如本文所用，术语“接头”是指将用于靶向癌症的抗体连接到聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)(PEO-PPO-PEO)嵌段共聚物上的物质。根据本发明的示例性实施方案，接头可以选自由马来酰亚胺、琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺酯组成的组，并且可以优选为马来酰亚胺或琥珀酸酐。
如本文所用，术语“包含PEO和PPO的嵌段共聚物(在下文中称为PEO-PPO嵌段共聚物)”是指交替包含聚环氧丙烷嵌段和聚环氧乙烷嵌段的共聚物。
根据本发明的示例性实施方案，PEO-PPO嵌段共聚物可以是PEO-PPO-PEO嵌段共聚物，其是交替包含聚环氧丙烷嵌段和聚环氧乙烷嵌段的三元共聚物。
根据本发明的示例性实施方案，PEO-PPO嵌段共聚物可选自由泊洛沙姆68、泊洛沙姆124、泊洛沙姆127、泊洛沙姆184、泊洛沙姆185、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407组成的组。优选地，PEO-PPO-PEO嵌段共聚物可以是泊洛沙姆188或泊洛沙姆407/>
在本发明中，用于治疗癌症的抗体和接头，以及接头和PEO-PPO-PEO嵌段共聚物可以各自通过共价键连接。共价键可以选自由酰胺键、羰基键、酯键、硫酯键、磺酰胺键和氨基甲酸酯键组成的组。
在本发明的示例性实施方案中，所述缀合物可以通过以下方法制备：首先结合接头和PEO-PPO嵌段共聚物，然后进一步结合用于靶向癌症的抗体，或者首先结合靶向癌症的抗体和接头，并结合PEO-PPO嵌段共聚物。
此外，根据本发明的示例性实施方案，缀合物还可以在其一端包含低分子量化合物，并且优选地，低分子量化合物可以结合到PEO-PPO嵌段共聚物的末端。
在本发明中，低分子量化合物可以是抗癌剂或光敏剂，抗癌剂可以是细胞毒性抗癌剂，并且光敏剂可以选自由二氢卟吩(chlorins)、菌绿素(bacteriochlorins)、卟啉、卟啉烯(porphycenes)和酞菁组成的组。例如，内消旋四氨基苯基卟啉、锌原卟啉、原卟啉和血卟啉可以用作卟啉光敏剂，铝酞菁可以用作酞菁光敏剂。
根据本发明的示例性实施方案，二氢卟吩光敏剂可以是二氢卟吩e6。如上所述，二氢卟吩e6可以结合到PEO-PPO嵌段共聚物的末端。
本发明人证实，靶向癌症的抗体、接头和PEO-PPO嵌段共聚物连接在一起的缀合物增强了抗体靶向癌细胞以诱导有效细胞凋亡的能力，并增加了抗体本身的体内半衰期。此外，他们证实了可以有效地杀死癌细胞，因为除了上述效果之外，进一步结合低分子量化合物的缀合物由于光敏剂而表现出杀死癌细胞的效果。
因此，本发明的另一个方面提供了一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含所述缀合物作为有效成分。由于用于治疗癌症的抗体-接头-PPO嵌段共聚物缀合物或用于治疗癌症的抗体-接头-PEO-PPO嵌段共聚物-低分子量化合物缀合物用作药物组合物中的有效成分，因此将省略对两者之间重叠内容的描述，以避免说明书的过度复杂化。
除了活性成分之外，本发明的药物组合物还可以包括药学上可接受的载体。在这种情况下，药学上可接受的载体是在配制过程中通常使用的载体，其实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、金合欢橡胶(acacia rubber)、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等，但不限于此。此外，除了上述组分之外，药学上可接受的载体可以进一步包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。
根据所需的方法，本发明的药物组合物可以口服或胃肠外(例如，静脉内、皮下或腹膜内，或局部施加)施用。当本发明的活性成分被配制成用于口服施用的制剂如片剂、胶囊、咀嚼片、粉剂、液体和悬浮剂时，其可以包括粘合剂(如阿拉伯橡胶、玉米淀粉、微晶纤维素或明胶)、赋形剂(如二磷酸钙或乳糖)、崩解剂(如海藻酸、玉米淀粉或马铃薯淀粉)、润滑剂(如硬脂酸镁)、甜味剂(如蔗糖或糖精)以及调味剂(如薄荷、水杨酸甲酯或水果香料)。
本发明的药物组合物以药学有效量施用。在本发明中，“药学有效量”是指足以以适用于医学治疗的合理益处/风险比率治疗疾病的量，并且有效剂量水平可以根据包括患者疾病类型、疾病严重程度、药物活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径、排泄率、治疗周期和同时使用的药物在内的因素以及医学领域公知的其他因素来确定。根据本发明的药物组合物可以作为单独的治疗剂施用或与其他治疗剂联合施用，可以与相关技术中的治疗剂相继或同时施用，并且可以以单剂量或多剂量施用。考虑到所有上述因素，以能够获得最大效果而没有任何副作用的最小量施用组合物是重要的，并且该量可以由本领域技术人员容易地确定。
有益效果
包含用于治疗癌症的抗体、接头以及包含PEO和PPO的嵌段共聚物的缀合物，以及进一步包含低分子量化合物的缀合物具有优异的癌细胞靶向能力，并且可以通过增加抗体的半衰期来有效地杀死癌细胞，因此可以有效地用于治疗癌症。
附图说明
图1显示了确认根据本发明的示例性实施方案的马来酰亚胺-普朗尼克F68(Mal-PF68)的1H-NMR光谱的结果。
图2显示了确认根据本发明的示例性实施方案的马来酰亚胺-普朗尼克F127(Mal-PF127)的1H-NMR光谱的结果。
图3显示了确认根据本发明的示例性实施方案的琥珀酰-普朗尼克F68(Suc-PF68)的1H-NMR光谱的结果。
图4显示了确认根据本发明的示例性实施方案的琥珀酰-普朗尼克F127(Suc-PF127)的1H-NMR光谱的结果。
图5显示了确认根据本发明的示例性实施方案的马来酰亚胺-聚乙二醇2k的1H-NMR光谱的结果。
图6显示了确认根据本发明的示例性实施方案的马来酰亚胺-聚乙二醇6k的1H-NMR光谱的结果。
图7显示了通过MALDI-TOF/MS光谱确认西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68(CTX-Mal-PF68)的分子量的结果。
图8显示了通过MALDI-TOF/MS光谱确认曲妥珠单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68(TRA-Mal-PF68)和曲妥珠单抗-琥珀酰-普朗尼克F68(TRA-Suc-PF68)的分子量的结果。
图9显示了通过MALDI-TOF/MS光谱确认阿维单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68(AVE-Mal-PF68)和阿维单抗-琥珀酰-普朗尼克F68(AVE-Suc-PF68)的分子量的结果。
图10显示了通过MALDI-TOF/MS光谱确认雷莫芦单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68(RAM-Mal-PF68)的分子量的结果。
图11显示了西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68/F127缀合物(CTX-Mal-PF68/PF127)(A)、曲妥珠单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68/F127缀合物(TRA-Mal-PF68/PF127)(B)、阿维单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68/F127缀合物(AVE-Mal-PF68/PF127)(C)和雷莫芦单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68/F127缀合物(RAM-Mal-PF68/PF127)(D)的圆二色性的测量结果。
图12A至12D显示了在用马来酰亚胺-普朗尼克缀合物、马来酰亚胺-聚乙二醇缀合物、西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克缀合物或西妥昔单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇缀合物处理不表达表皮生长因子受体(EGFR)的正常细胞系后证实细胞毒性的结果。
图13A和13B显示了在用马来酰亚胺-普朗尼克缀合物、西妥昔单抗或西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克缀合物处理表达EGFR的卵巢癌细胞系后证实细胞毒性的结果。
图14A至14D显示了在用马来酰亚胺-普朗尼克缀合物、马来酰亚胺-聚乙二醇缀合物、曲妥珠单抗-马来酰亚胺-普朗尼克缀合物或曲妥珠单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇缀合物处理不表达人表皮生长因子受体2(HER2)的正常细胞系后证实细胞毒性的结果。
图15A至15F显示了在用马来酰亚胺-普朗尼克缀合物和曲妥珠单抗-马来酰亚胺-普朗尼克缀合物处理表达HER2的乳腺癌细胞系后证实细胞毒性的结果。
图16A至16D显示了在用马来酰亚胺-普朗尼克缀合物、马来酰亚胺-聚乙二醇缀合物、阿维单抗-马来酰亚胺-普朗尼克缀合物或阿维单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇缀合物处理不表达程序性死亡配体1(PD-L1)的正常细胞系后证实细胞毒性的结果。
图17A至17F显示了在用马来酰亚胺-普朗尼克缀合物、阿维单抗或阿维单抗-马来酰亚胺-普朗尼克缀合物处理表达PD-L1的癌细胞系后证实细胞毒性的结果。
图18A至18D显示了在用马来酰亚胺-普朗尼克缀合物、马来酰亚胺-聚乙二醇缀合物、雷莫芦单抗-马来酰亚胺-普朗尼克缀合物或雷莫芦单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇缀合物处理不表达血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的正常细胞系后证实细胞毒性的结果。
图19A至19D显示了在用马来酰亚胺-普朗尼克缀合物、雷莫芦单抗或雷莫芦单抗-马来酰亚胺-普朗尼克缀合物处理表达PD-L1的癌细胞系后证实细胞毒性的结果。
图20A和20B显示了在用琥珀酰-普朗尼克缀合物、琥珀酰-聚乙二醇缀合物、曲妥珠单抗-琥珀酰-普朗尼克缀合物或曲妥珠单抗-琥珀酰-聚乙二醇缀合物处理表达HER2的乳腺癌细胞系后证实细胞毒性的结果。
图21A至21D显示了在用琥珀酰-普朗尼克缀合物、琥珀酰-聚乙二醇缀合物、阿维单抗-琥珀酰-普朗尼克缀合物或阿维单抗-琥珀酰-聚乙二醇缀合物处理表达PD-L1的癌细胞系后证实细胞毒性的结果。
图22显示了在用马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6、马来酰亚胺-聚乙二醇2K-二氢卟吩e6、西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6或西妥昔单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2k-二氢卟吩e6缀合物处理细胞后，通过流式细胞术证实缀合靶细胞中EGFR表达的存在或不存在的结果。
图23显示了在用马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6、马来酰亚胺-聚乙二醇2K-二氢卟吩e6、西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6或西妥昔单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2k-二氢卟吩e6缀合物处理细胞后，通过共聚焦激光扫描显微术证实缀合靶细胞中EGFR表达的存在或不存在的结果。
图24A和24B显示了在将阿维单抗-二氢卟吩e6、阿维单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2k-二氢卟吩e6或阿维单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6缀合物注射入小鼠后证实缀合物的体内行为的结果。
图25显示了当在小鼠中诱导癌症形成后注射西妥昔单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2k-二氢卟吩36或西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6缀合物时，缀合物在癌症组织中的行为。
图26A和26B显示了当在小鼠中诱导癌症形成后注射西妥昔单抗、西妥昔单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2k、西妥昔单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇6k、西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68或西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克127缀合物时，证实癌症组织大小变化的结果。
图27显示了在小鼠中诱导癌症形成后，注射西妥昔单抗、西妥昔单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2k、西妥昔单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇6k、西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68或西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克127缀合物，并证实每只小鼠中癌症组织大小变化的结果。
图28显示了证实西妥昔单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇/普朗尼克-二氢卟吩e6(A)或曲妥珠单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇/普朗尼克-二氢卟吩e6(B)的缀合物在水溶液中产生单线态氧的能力的结果。
图29A至29C显示了证实西妥昔单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇/普朗尼克-二氢卟吩e6缀合物本身在NIH-3T3(A)、SKOV-3(B)和A-2780(C)细胞中的细胞毒性的结果。
图30显示了证实西妥昔单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇/普朗尼克-二氢卟吩e6缀合物在NIH-3T3(A)、A-2780(B)和SKOV-3(C)细胞中的光动力学介导的细胞毒性证实的结果。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例更详细地描述一个或多个具体的示例性实施方案。然而，提供这些实施例仅用于示例性地解释一个或多个具体的示例性实施方案，并且本发明的范围不限于这些实施例。
实施例1：接头-普朗尼克缀合物的制备
1-1.马来酰亚胺-普朗尼克F68缀合物
将253mg 6-马来酰亚胺基己酸(Mal)、297mg二环己基碳二亚胺(DCC)和317mg丁基羟基甲苯(BHT)溶解在3ml二甲基甲酰胺(DMF)中。将1g普朗尼克68聚合物溶解在15ml二甲基甲酰胺中。各搅拌6小时后，将溶解有马来酰亚胺基己酸的溶液加入溶解有普朗尼克68聚合物的水溶液中，将所得混合物在室温下搅拌48小时。反应完成后，所得产物在40ml乙醚中结晶以进行纯化。弃去除沉淀物之外的上清液，在重结晶过程中再次加入乙醚，重结晶过程总共进行三次，以除去未反应的副产物。此后，通过在减压下干燥沉淀物获得马来酰亚胺-普朗尼克68粉末(Mal-PF68)。合成结果由核磁共振谱(1H-NMR)确认(图1)。
1-2.马来酰亚胺-普朗尼克F127缀合物
将169mg 6-马来酰亚胺基己酸、198mg二环己基碳二亚胺和212mg丁基羟基甲苯溶解在3ml二甲基甲酰胺中。将1g普朗尼克127聚合物溶解在15ml二甲基甲酰胺中。将各溶液搅拌6小时，并进行与实施例1-1中相同的过程，以获得马来酰亚胺-普朗尼克127粉末(Mal-PF127)。合成结果由核磁共振谱(1H-NMR)确认(图2)。
1-3.琥珀酰-普朗尼克F68缀合物的制备
将240mg琥珀酸酐(Suc)和260mg 4-二甲基氨基吡啶(DMAP)溶解在10ml二甲基亚砜(DMSO)中。将1g普朗尼克F68溶解在50ml二甲基亚砜中。将各溶液搅拌6小时，将溶解有琥珀酸酐的溶液加入溶解有普朗尼克68聚合物的水溶液中，然后将所得混合物在室温下搅拌24小时。反应完成后，溶液用透析膜(MWCO 3,500)透析2天进行纯化。此后，将溶解在水中的琥珀酰-普朗尼克F68冻干以获得最终粉末(Suc-PF68)。合成结果由核磁共振谱(1H-NMR)确认(图3)。
1-4.琥珀酰-普朗尼克F127缀合物的制备
将163mg琥珀酸酐(Suc)和179mg 4-二甲基氨基吡啶(DMAP)溶解在10ml二甲基亚砜(DMSO)中。将1g普朗尼克F127溶解在50ml二甲基亚砜(DMSO)中。此后，通过与实施例1-3中相同的方法获得最终粉末(Suc-PF127)。合成结果由核磁共振谱(1H-NMR)确认(图4)。
实施例2：抗体-接头-普朗尼克缀合物的制备
2-1.西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68、普朗尼克F127缀合物
为了除去盐，将西妥昔单抗(CTX)注射制剂通过具有0.1M PBS缓冲液(pH7.4)作为流动相溶剂的PD10柱，以除去赋形剂或添加剂。收集1ml所获得的物质，通过二辛可宁酸(BCA)方法定量抗体。仅从2mg Traut试剂中取出18μl，分散在4mg西妥昔单抗水溶液中，将抗体的氨基硫醇化1小时。1小时后，用PD10柱纯化以除去Traut试剂。此后，将1.13mg马来酰亚胺-普朗尼克F68(Mal-PF68)或1.63mg马来酰亚胺-普朗尼克F127(Mal-PF127)加入溶解有1mg西妥昔单抗的水溶液中，并将所得混合物在室温下搅拌4小时。反应完成后，将反应产物在Amicon Ultra(15ml，截留分子量尺寸：100,000Da)管中离心(14,000g，10分钟)以除去未反应的物质。最终产物(CTX-Mal-PF68和CTX-Mal-PF127)冷藏储存。
2-2.曲妥珠单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68、普朗尼克F127缀合物
以与实施例2-1中相同的方式从曲妥珠单抗(Tra)注射制剂中除去盐，将曲妥珠单抗的氨基硫醇化，然后除去Traut试剂。此后，将1.21mg马来酰亚胺-普朗尼克F68或1.75mg马来酰亚胺-普朗尼克F127加入溶解有1mg曲妥珠单抗的水溶液中，并将所得混合物在室温下搅拌4小时。反应完成后，将反应产物在Amicon Ultra管中离心(14,000g，10分钟)以除去未反应的物质。最终产物(Tra-Mal-PF68和Tra-Mal-PF127)冷藏储存。
2-3.阿维单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68、普朗尼克F127缀合物
以与实施例2-1中相同的方式从阿维单抗(AVE)注射制剂中除去盐，将阿维单抗的氨基硫醇化，然后除去Traut试剂。此后，将1.2mg马来酰亚胺-普朗尼克F68或1.72mg马来酰亚胺-普朗尼克F127加入溶解有1mg阿维单抗的水溶液中，并将所得混合物在室温下搅拌4小时。反应完成后，将反应产物在Amicon Ultra管中离心(14,000g，10分钟)以除去未反应的物质。最终产物(AVE-Mal-PF68和AVE-Mal-PF127)冷藏储存。
2-4.雷莫芦单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68、普朗尼克F127缀合物
以与实施例2-1中相同的方式从雷莫芦单抗注射制剂中除去盐，将雷莫芦单抗的氨基硫醇化，然后除去Traut试剂。此后，将1.2mg马来酰亚胺-普朗尼克F68或1.72mg马来酰亚胺-普朗尼克F127加入溶解有1mg雷莫芦单抗的水溶液中，并将所得混合物在室温下搅拌4小时。反应完成后，将反应产物在Amicon Ultra管中离心(14,000g，10分钟)以除去未反应的物质。最终产物(RAM-Mal-PF68和RAM-Mal-PF127)冷藏储存。
2-5.曲妥珠单抗-琥珀酰-普朗尼克F68、普朗尼克F127缀合物
以与实施例2-1中相同的方式从曲妥珠单抗注射制剂中除去盐，定量抗体并将1mg抗体溶解在0.5M MES缓冲液中。将0.031mg 1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺(EDC)、0.0188mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1.2mg琥珀酰-普朗尼克F68或1.9mg琥珀酰-普朗尼克F127在0.5M MES缓冲液中搅拌1小时。将该溶液加入溶解有抗体的溶液中，并将所得混合物在4℃下搅拌12小时。反应完成后，将反应产物在Amicon Ultra管中离心(14,000g，10分钟)以除去未反应的物质。最终产物(Tra-Suc-PF68和Tra-Suc-PF127)冷藏储存。
2-6.阿维单抗-琥珀酰-普朗尼克F68、普朗尼克F127缀合物的制备
以与实施例2-1中相同的方式从阿维单抗注射制剂中除去盐，定量抗体并将1mg抗体溶解在0.5M MES缓冲液中。此后，以与实施例2-5中相同的方式制备最终产物(AVE-Suc-PF68和AVE-Suc-PF127)，并冷藏储存。
实施例3：抗体-接头普朗尼克-光敏剂缀合物的制备
3-1.普朗尼克F68-二氢卟吩e6缀合物
在20ml烧瓶中，将110mg二氢卟吩e6(Ce6)、45mg二环己基碳二亚胺(DCC)和26mg4-二甲基氨基吡啶(DMAP)溶解在5ml二氯甲烷(DCM)中。将1g普朗尼克F68(PF68，8400g/mol)溶解在10ml二氯甲烷中。将各溶液搅拌6小时后，将两种溶液混合，在室温下搅拌48小时，并在45ml乙醚中结晶。弃去除沉淀物之外的上清液，在重结晶过程中再次加入乙醚，重结晶过程总共进行三次以除去未反应的副产物，然后在减压下干燥所得产物以获得粉末。将该粉末以20mg/ml的浓度再次溶解在甲醇中，并通过开口柱色谱纯化以获得合成的普朗尼克F68-二氢卟吩e6(PF68-Ce6)。
3-2.马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6缀合物
将23.2mg 6-马来酰亚胺基己酸(Mal)、27.2mg二环己基碳二亚胺(DCC)和29.1mg丁基羟基甲苯(BHT)溶解在2ml二甲基甲酰胺中。将200mg实施例3-1中获得的普朗尼克F68-二氢卟吩e6(PF68-Ce6)缀合物溶解在3ml二甲基甲酰胺中。将各溶液搅拌6小时后，将溶解有马来酰亚胺基己酸的溶液加入溶解有普朗尼克F68-二氢卟吩e6缀合物的水溶液中，并将所得混合物在室温下搅拌48小时。反应完成后，所得产物在45ml乙醚中结晶以进行纯化。弃去除沉淀物以外的上清液，在重结晶过程中再次加入乙醚，重结晶过程总共进行三次以除去未反应的副产物，然后在减压下干燥所得产物以获得最终粉末(Mal-PF68-Ce6)。
3-3.西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6缀合物
以与实施例2-1中相同的方式从西妥昔单抗注射制剂中除去盐，将西妥昔单抗的氨基硫醇化，然后除去Traut试剂。此后，将3.63mg在实施例3-2中制备的马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6(Mal-PF68-Ce6)加入溶解有1mg西妥昔单抗的水溶液中，并将所得混合物在室温下搅拌4小时。反应完成后，将反应产物在Amicon Ultra管中离心(14,000g，10分钟)以除去未反应的物质。最终产物(CTX-Mal-PF68-Ce6)冷藏储存。
3-4.曲妥珠单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6缀合物
以与实施例2-1中相同的方式从曲妥珠单抗注射制剂中除去盐，将曲妥珠单抗的氨基硫醇化，然后除去Traut试剂。此后，将2.72mg在实施例3-2中制备的马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6加入溶解有5mg曲妥珠单抗的水溶液中，并将所得混合物在室温下搅拌4小时。反应完成后，将反应产物在Amicon Ultra管中离心(14,000g，10分钟)以除去未反应的物质。最终产物(Tra-Mal-PF68-Ce6)冷藏储存。
3-5.阿维单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6缀合物
以与实施例2-1中相同的方式从阿维单抗注射制剂中除去盐，将阿维单抗的氨基硫醇化，然后除去Traut试剂。此后，将1.28mg在实施例3-2中制备的马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6加入溶解有2mg阿维单抗的水溶液中，并将所得混合物在室温下搅拌4小时。反应完成后，将反应产物在Amicon Ultra管中离心(14,000g，10分钟)以除去未反应的物质。最终产物(AVE-Mal-PF68-Ce6)冷藏储存。
对比实施例1：接头-聚乙二醇缀合物的制备
1-1.马来酰亚胺-聚乙二醇2K缀合物
将211mg 6-马来酰亚胺基己酸、247mg二环己基碳二亚胺和138mg NHS溶解在5ml二甲基甲酰胺中。将0.2g聚乙二醇2K聚合物溶解在10ml二甲基甲酰胺中。将各溶液搅拌4小时后，将溶解有马来酰亚胺基己酸的溶液加入溶解有聚乙二醇2K聚合物的水溶液中，并将所得混合物在室温下搅拌24小时。反应完成后，所得产物用40ml乙醚结晶以进行纯化。弃去除沉淀物之外的上清液，在重结晶过程中再次加入乙醚，重结晶过程总共进行三次，以除去未反应的副产物。此后，通过在减压下干燥沉淀物获得马来酰亚胺-聚乙二醇2k粉末(Mal-PEG2K)。合成结果由核磁共振谱(1H-NMR)确认(图5)。
1-2.马来酰亚胺-聚乙二醇6K缀合物
将70.3mg 6-马来酰亚胺基己酸、82.5mg二环己基碳二亚胺和40.6mg NHS溶解在5ml二甲基甲酰胺中。将0.2g聚乙二醇6K聚合物溶解在10ml二甲基甲酰胺中。将各溶液搅拌4小时后，将溶解有马来酰亚胺基己酸的溶液加入溶解有聚乙二醇2K聚合物的水溶液中，并将所得混合物在室温下搅拌24小时。反应完成后，所得产物在40ml乙醚中结晶以进行纯化。弃去除沉淀物之外的上清液，在重结晶过程中再次加入乙醚，重结晶过程总共进行三次，以除去未反应的副产物。此后，通过在减压下干燥沉淀物获得马来酰亚胺-聚乙二醇6K粉末(Mal-PEG6K)。合成结果由核磁共振谱(1H-NMR)确认(图6)。
对比实施例2：抗体-接头-聚乙二醇缀合物的制备
2-1.西妥昔单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2K、聚乙二醇6K缀合物
以与实施例2-1中相同的方式从西妥昔单抗注射制剂中除去盐，将西妥昔单抗的氨基硫醇化，然后除去Traut试剂。此后，将0.44mg马来酰亚胺-聚乙二醇2K或1.24mg马来酰亚胺-聚乙二醇6k加入溶解有3mg西妥昔单抗的水溶液中，并将所得混合物在室温下搅拌4小时。反应完成后，将反应产物在Amicon Ultra管中离心(14,000g，10分钟)以除去未反应的物质。最终产物(CTX-Mal-PEG2K和CTX-Mal-PEG6K)冷藏储存。
2-2.曲妥珠单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2K、聚乙二醇6K缀合物
以与实施例2-1中相同的方式从曲妥珠单抗注射制剂中除去盐，将曲妥珠单抗的氨基硫醇化，然后除去Traut试剂。此后，将0.75mg马来酰亚胺-聚乙二醇2k或2.1mg马来酰亚胺-聚乙二醇6k加入溶解有5mg曲妥珠单抗的水溶液中，并将所得混合物在室温下搅拌4小时。反应完成后，将反应产物在Amicon Ultra管中离心(14,000g，10分钟)以除去未反应的物质。最终产物(Tra-Mal-PEG2K和Tra-Mal-PEG6K)冷藏储存。
2-3.阿维单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2K、聚乙二醇6K缀合物
以与实施例2-1中相同的方式从阿维单抗注射制剂中除去盐，将阿维单抗的氨基硫醇化，然后除去Traut试剂。此后，将0.301mg马来酰亚胺-聚乙二醇2K或0.845mg马来酰亚胺-聚乙二醇6K加入溶解有2mg阿维单抗的水溶液中，并将所得混合物在室温下搅拌4小时。反应完成后，将反应产物在Amicon Ultra管中离心(14,000g，10分钟)以除去未反应的物质。最终产物(AVE-Mal-PEG2K和AVE-Mal-PEG6K)冷藏储存。
2-4.雷莫芦单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2K、聚乙二醇6K缀合物
以与实施例2-1中相同的方式从雷莫芦单抗注射制剂中除去盐，将雷莫芦单抗的氨基硫醇化，然后除去Traut试剂。此后，将0.301mg马来酰亚胺-聚乙二醇2K或0.845mg马来酰亚胺-聚乙二醇6K加入溶解有2mg雷莫芦单抗的水溶液中，并将所得混合物在室温下搅拌4小时。反应完成后，将反应产物在Amicon Ultra管中离心(14,000g，10分钟)以除去未反应的物质。最终产物(RAM-Mal-PEG2K和RAM-Mal-PEG6K)冷藏储存。
2-5.曲妥珠单抗-琥珀酰-聚乙二醇2K、聚乙二醇5K缀合物
以与实施例2-1中相同的方式从曲妥珠单抗注射制剂中除去盐，定量抗体并将1mg抗体溶解在0.5M MES缓冲液中。将0.031mg EDC、0.0188mg NHS和0.27mg琥珀酰-聚乙二醇2K或0.82mg琥珀酰-聚乙二醇5K在0.5M MES缓冲液中搅拌1小时。将该溶液加入溶解有抗体的溶液中，并将所得混合物在4℃下搅拌12小时。反应完成后，将反应产物在Amicon Ultra管中离心(14,000g，10分钟)以除去未反应的物质。最终产物(Tra-Suc-PEG2K和Tra-Suc-PEG6k)冷藏储存。
2-6.阿维单抗-琥珀酰-聚乙二醇2K、聚乙二醇5K缀合物
以与实施例2-1中相同的方式从阿维单抗注射制剂中除去盐，定量抗体并将1mg抗体溶解在0.5M MES缓冲液中。将0.031mg EDC、0.0188mg NHS和0.27mg琥珀酰-聚乙二醇2K或0.82mg琥珀酰-聚乙二醇5K在0.5M MES缓冲液中搅拌1小时。将该溶液加入溶解有抗体的溶液中，并将所得混合物在4℃下搅拌12小时。反应完成后，将反应产物在Amicon Ultra管中离心(14,000g，10分钟)以除去未反应的物质。最终产物(AVE-Suc-PEG2K和AVE-Suc-PEG6k)冷藏储存。
对比实施例3：抗体-聚乙二醇-光敏剂缀合物的制备
3-1.西妥昔单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2K-二氢卟吩e6缀合物
以与实施例2-1中相同的方式从西妥昔单抗注射制剂中除去盐，将西妥昔单抗的氨基硫醇化，然后除去Traut试剂。此后，将1.85mg马来酰亚胺-聚乙二醇2k-二氢卟吩e6加入溶解有1mg西妥昔单抗的水溶液中，并将所得混合物在室温下搅拌4小时。反应完成后，将反应产物在Amicon Ultra管中离心(14,000g，10分钟)以除去未反应的物质。最终产物(CTX-Mal-PEG2K-Ce6)冷藏储存。
3-2.曲妥珠单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2K-二氢卟吩e6缀合物
以与实施例2-1中相同的方式从曲妥珠单抗注射制剂中除去盐，将曲妥珠单抗的氨基硫醇化，然后除去Traut试剂。此后，将0.949mg马来酰亚胺-聚乙二醇2k-二氢卟吩e6加入溶解有5mg曲妥珠单抗的水溶液中，并将所得混合物在室温下搅拌4小时。反应完成后，将反应产物在Amicon Ultra管中离心(14,000g，10分钟)以除去未反应的物质。最终产物(Tra-Mal-PEG2K-Ce6)冷藏储存。
3-3.阿维单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2K-二氢卟吩e6缀合物
以与实施例2-1中相同的方式从阿维单抗注射制剂中除去盐，将阿维单抗的氨基硫醇化，然后除去Traut试剂。此后，将0.764mg马来酰亚胺-聚乙二醇2K-二氢卟吩e6加入溶解有2mg阿维单抗的水溶液中，并将所得混合物在室温下搅拌4小时。反应完成后，将反应产物在Amicon Ultra管中离心(14,000g，10分钟)以除去未反应的物质。最终产物(AVE-Mal-PEG2K-Ce6)冷藏储存。
实验实施例1：抗体-接头-普朗尼克缀合物的MALDI-TOF分析
为了确认实施例2-1至2-6中制备的抗体-普朗尼克F68是否缀合，使用MALDI-TOF分析仪测量每个缀合物的分子量。
结果，测得西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68、曲妥珠单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68、阿维单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68和雷莫芦单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68的分子量为约161、157、155和156kDa，这是通过分别将西妥昔单抗(152kDa)、曲妥珠单抗(148kDa)、阿维单抗(147kDa)、雷莫芦单抗(147kDa)与马来酰亚胺-普朗尼克F68(8611g/mol)的分子量相加而获得的(图7、图8的A、图9的A和图10)。
此外，测得曲妥珠单抗-琥珀酰-普朗尼克F68和阿维单抗-琥珀酰-普朗尼克F68的分子量为约157kDa和156kDa，这是通过分别将曲妥珠单抗(148kDa)、阿维单抗(147kDa)与琥珀酰-普朗尼克F68缀合物(9033g/mol)的分子量相加而获得的(图8的B和图9的B)。
从图7至10中的结果，证实成功合成了基于抗体的普朗尼克缀合物。
实验实施例2：抗体-接头-普朗尼克缀合物的结构稳定性的评估
为了通过其二级结构证实实施例2-1至2-4中制备的抗体-马来酰亚胺-普朗尼克F68和抗体-马来酰亚胺-普朗尼克F127缀合物的结构稳定性，测量了圆二色性。构成单克隆抗体的免疫球蛋白G具有固有的二级结构，并且由于这种结构，其在202nm处具有正环状异色性(positive circular heterochromia)，在218nm处具有负值。因此，可以通过测量圆二色性来间接证实抗体结构是否被保持。
作为测量的结果，可以证实作为原始物质的单克隆抗体的二级结构在抗体-马来酰亚胺-普朗尼克缀合物中保持良好(图11)。
实验实施例3：抗体-接头-普朗尼克缀合物的癌细胞杀伤效力的证实
为了比较实施例2-1至2-6中制备的抗体-接头-普朗尼克F68和F127缀合物的效果与单独抗体的效果，在具有不同表皮生长因子受体表达水平的癌细胞中证实了自主杀伤能力。作为对比组(对比实施例2-1至2-6)，使用仅具有PEO嵌段的抗体-聚乙二醇2K、5K或6K缀合物。
3-1.西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68、普朗尼克F127缀合物
培养不表达表皮生长因子受体(EGFR)的L929和NIH3T3正常细胞以及表达EGFR的卵巢细胞系SKOV3细胞，并用西妥昔单抗(CTX)、西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68(CTX-Mal-PF68)或西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F127(CTX-Mal-PF127)处理细胞4小时。此后，用缓冲溶液洗涤细胞，并通过向其中加入干净的培养基进一步培养1天。
用MTT试剂处理培养的细胞，并进一步培养3小时，然后除去培养液和MTT试剂，并加入二甲基亚砜以溶解细胞中形成的甲瓒(formazan)。此后，在570nm处测量吸光度，以比较形成的甲瓒的量，并分析癌细胞的活力和细胞毒性。
作为分析的结果，证实了在L929和NIH3T3细胞(其为不表达EGFR的正常细胞)中，马来酰亚胺-普朗尼克缀合物(Mal-PF68和Mal-PF127)、马来酰亚胺-聚乙二醇缀合物(Mal-PEG2K和Mal-PEG6K)、西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克缀合物(CTX-Mal-PF68/PF127)和西妥昔单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇缀合物(CTX-Mal-PEG2K/PEG6K)本身是非细胞毒性的(图12的A至D)。
马来酰亚胺-普朗尼克缀合物(Mal-PF68/PF127)甚至在表达EGFR的卵巢癌细胞系中也是非细胞毒性的。然而，西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68(CTX-Mal-PF68)或西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F127(CTX-Mal-PF127)处理组比西妥昔单抗抗体(CTX)处理组具有更多的细胞凋亡(图13的A和B)。
通过上述结果可以看出，使用西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68或西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F127比单独使用西妥昔单抗抗体在癌症治疗方面可能更有效。
3-2.曲妥珠单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68、普朗尼克F127缀合物
培养不表达人表皮生长因子受体2(HER2)的L929和NIH3T3正常细胞和表达HER2的乳腺癌细胞系(HER2表达程度：MDA-MB-231<MCF-7<SK-BR3)，然后用不同浓度的曲妥珠单抗-马来酰亚胺-普朗尼克缀合物处理。此后，以与实验实施例2-1中相同的方式分析细胞的活力和细胞毒性。
结果，证实了在不表达EGFR的L929和NIH3T3细胞中，所有的马来酰亚胺-普朗尼克缀合物(Mal-PF68和Mal-PF127)、马来酰亚胺-聚乙二醇缀合物(Mal-PEG2K和Mal-PEG6K)、曲妥珠单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇(Tra-Mal-PEG2K和Tra-Mal-PEG6K)和曲妥珠单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇缀合物(Tra-Mal-PF68和Tra-Mal-PF127)都是非细胞毒性的(图14的A至D)。
此外，马来酰亚胺-普朗尼克(Mal-PF68和Mal-PF127)和马来酰亚胺-聚乙二醇(Mal-PEG2K和Mal-PEG6K)缀合物本身甚至在表达HER2的乳腺癌细胞系中也没有毒性(图15的A、C和E)。然而，由于发现与单独的曲妥珠单抗或曲妥珠单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇缀合物处理组相比，曲妥珠单抗-马来酰亚胺-普朗尼克缀合物处理组的细胞毒性增加，因此证实了有效的癌症治疗是可能的(图15的B、D和F)。此外，通过曲妥珠单抗-马来酰亚胺-普朗尼克缀合物的毒性与细胞系的HER2表达率成比例地增加，证实了抗原特异性治疗效果。
3-3.阿维单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68、普朗尼克F127缀合物
培养L929和NIH3T3细胞系，它们是不表达程序性死亡配体1(PD-L1)的正常细胞，以及表达PD-L1的黑色素瘤、结肠直肠癌和肺癌细胞系(分别为B16F10、HCTE116和A549)，然后用阿维单抗-马来酰亚胺-普朗尼克缀合物处理。此后，以与实验实施例2-1中相同的方式分析细胞的活力和细胞毒性。
马来酰亚胺-普朗尼克(Mal-PF68和Mal-PF127)或马来酰亚胺-聚乙二醇缀合物(Mal-PEG2K和Mal-PEG6K)本身在不表达PD-L1的L929和NIH3T3细胞中是无毒的(图16的A和C)。证实了所有的阿维单抗-马来酰亚胺-普朗尼克(AVE-Mal-PF68和AVE-Mal-PF127)或阿维单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇(AVE-Mal-PEG2K和AVE-Mal-PEG6K)缀合物在低于10μl/ml的浓度下也是无毒的(图17的B和D)。
此外，马来酰亚胺-普朗尼克(Mal-PF68和Mal-PF127)和马来酰亚胺-聚乙二醇(Mal-PEG2K和Mal-PEG6K)缀合物本身甚至在表达PD-L1的乳腺癌细胞系中也是无毒的(图17的A、C和E)。然而，阿维单抗-马来酰亚胺-普朗尼克缀合物处理组在5μg/ml或更低的浓度下显示出毒性，与单独的阿维单抗抗体(AVE)或阿维单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇处理组相比，显示出细胞毒性的更大增加(图17的B、D和F)，并且由此证实了有效的癌症治疗是可能的。
3-4.雷莫芦单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68、普朗尼克F127缀合物
培养不表达血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的L929和NIH3T3正常细胞、胃癌细胞系(AGS)和非小细胞肺癌(HCC15)，然后用不同浓度的雷莫芦单抗-马来酰亚胺-普朗尼克缀合物处理。此后，以与实验实施例2-1中相同的方式分析细胞的活力和细胞毒性。
作为证实的结果，证实了在不表达VEGFR2的正常细胞中，马来酰亚胺-普朗尼克(Mal-PF68和Mal-PF127)和马来酰亚胺-聚乙二醇(Mal-PEG2K和Mal-PEG6K)缀合物是非细胞毒性的(图18的A和C)，以及雷莫芦单抗-马来酰亚胺-普朗尼克(RAM-Mal-PF68和RAM-Mal-PF127)和雷莫芦单抗-马来酰亚胺-聚乙烯(RAM-Mal-PEG2K和RAM-Mal-PEG6K)缀合物也都是无毒性的(图18的B和D)。
此外，马来酰亚胺-普朗尼克(Mal-PF68和Mal-PF127)和马来酰亚胺-聚乙二醇(Mal-PEG2K和Mal-PEG6K)缀合物甚至在表达VEGFR2的癌细胞系中也是非细胞毒性的(图19的A和C)。然而，与单独的雷莫芦单抗抗体(RAM)或雷莫芦单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇处理组相比，雷莫芦单抗-马来酰亚胺-普朗尼克缀合物处理组的细胞毒性进一步增加(图19中的B和D)，由此证实了有效的癌症治疗是可能的。
3-5.曲妥珠单抗-琥珀酰-普朗尼克缀合物
培养表达HER2的乳腺癌细胞系(SK-BR3)，然后用曲妥珠单抗-琥珀酰-普朗尼克缀合物处理，以与实验实施例2-1中相同的方式分析细胞的活力和细胞毒性。
结果，证实了在表达HER2的乳腺癌细胞系SK-BR3中，琥珀酰-普朗尼克缀合物(Suc-PF68和Suc-PF127)和琥珀酰-聚乙二醇(Suc-PEG2K和Suc-PEG5K)缀合物在低于50μg/ml的浓度下都没有毒性(图20的A)。相反，通过证实与单独的曲妥珠单抗处理组或曲妥珠单抗-琥珀酰-聚乙二醇缀合物处理组相比，曲妥珠单抗-琥珀酰-普朗尼克处理组的细胞毒性进一步增加，可以看出有效的癌症治疗是可能的(图20的B)。
3-6.阿维单抗-琥珀酰-普朗尼克缀合物
培养表达PD-L1的肺癌和结肠直肠癌细胞系(分别为A549和HCT116)，然后用阿维单抗-琥珀酰-普朗尼克缀合物处理。此后，以与实验实施例2-1中相同的方式分析细胞的活力和细胞毒性。
结果，证实了在表达PD-L1的癌细胞中，琥珀酰-普朗尼克(Suc-PF68和Suc-PF127)和琥珀酰-聚乙二醇(Suc-PEG2K和Suc-PEG5K)缀合物本身是非细胞毒性的(图21的A和C)。然而，阿维单抗-琥珀酰-普朗尼克缀合物(AVE-Suc-PF68/PF127)处理组在5μg/ml或更低的浓度下表现出毒性，与单独的阿维单抗抗体(AVE)或阿维单抗-琥珀酰-聚乙二醇(AVE-Suc-PEG2K/PEG5K)处理组相比，显示出细胞毒性的更大增加(图21的B和D)，并且由此证实了有效的癌症治疗是可能的。
实验实施例4：根据癌细胞受体的表达程度定量评估抗体-接头-普朗尼克-光敏剂缀合物的靶向能力
与作为对比组的西妥昔单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2k-二氢卟吩e6相比，根据具有不同水平的表皮生长因子受体(EGFR)表达的细胞，西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6缀合物的靶向能力被定量证实。
在分别培养NIH-3T3细胞(其为正常细胞且不表达EGFR)、A2780细胞(其为癌细胞且具有低水平的EGFR表达)和SKOV3细胞(其为癌细胞且具有高水平的EGFR表达)后，用抗体-接头-普朗尼克-荧光物质处理每种类型的细胞2小时。此后，用缓冲溶液洗涤细胞，并通过流式细胞仪分析对每种类型的细胞的靶向能力。
结果，由于NIH-3T3细胞不表达EGFR，并且不与抗体非特异性连接的缀合物(马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6和马来酰亚胺-聚乙二醇2K-二氢卟吩e6)流入细胞，与西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6(CTX-Mal-PF68-Ce6)或西妥昔单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2k-二氢卟吩e6(CTX-Mal-PEG2K-Ce6)缀合物处理组相比，在马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6(Mal-PF68-Ce6)或马来酰亚胺-聚乙二醇2K-二氢卟吩e6(Mal-PEG2K-Ce6)处理组中荧光信号增加(图22)。
在表达EGFR的A2780和SKOV3细胞中，与西妥昔单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2k-二氢卟吩e6处理组相比，西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6处理组显示增强的荧光，从而证实靶向能力增强(图22)。由此证实，与聚乙烯聚合物相比，西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68进一步增强了抗体的靶向能力。
根据上述结果，证实了抗体-马来酰亚胺-普朗尼克缀合物可以更有效地靶向具有表皮生长因子受体的癌细胞。
实验实施例5：根据癌细胞受体的表达程度(荧光强度)证实抗体-接头-普朗尼克-光敏剂缀合物的细胞靶向性
与西妥昔单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2k-二氢卟吩e6相比，根据具有不同水平的EGFR表达的细胞，西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6的细胞靶向性通过共聚焦激光扫描显微镜进行了视觉证实。
在分别培养NIH-3T3细胞(其为正常细胞且不表达EGFR)、A2780细胞(其为癌细胞且具有低水平的EGFR表达)和SKOV3细胞(其为癌细胞且具有高水平的EGFR表达)后，用抗体-接头-普朗尼克-荧光物质处理每种类型的细胞2小时。此后，用缓冲溶液洗涤处理过的细胞，并用4％多聚甲醛固定。
结果，证实了在NIH-3T3细胞(其为正常细胞)中，在引入西妥昔单抗之前和之后几乎没有检测到荧光信号(图23C)，并且在癌细胞中，与EGFR的表达水平成比例，在抗体引入之前和之后荧光信号显著不同。特别地，可以清楚地从视觉上证实，与A2780细胞相比，在引入西妥昔单抗后，具有最高EGFR表达水平的SKOV3细胞具有增加的荧光强度。此外，证实了与西妥昔单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2k-二氢卟吩e6(CTX-Mal-PEG2K-Ce6)处理组相比，西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6(CTX-Mal-PF68-Ce6)处理组中的荧光强度更强(图23的A和B)。
根据上述结果，证实了基于抗体的普朗尼克聚合物组合物可以更有效地靶向具有表皮生长因子受体的癌细胞。
实验实施例6：抗体-接头-普朗尼克-光敏剂缀合物的体内分布
在对雄性无胸腺裸鼠(BALB/c裸鼠，5周龄)基于二氢卟吩e6以1.78mg/kg的浓度静脉注射阿维单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6(AVE-Mal-PF68-Ce6)后，用荧光标记的生物体生物成像(FOBI，NeoScience，Suwon，韩国)设备采集荧光图像144小时，以证实缀合物的行为。作为对比组，使用阿维单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2k-二氢卟吩e6(AVE-Mal-Peg2K-Ce6)和阿维单抗-二氢卟吩e6(AVE-Ce6)缀合物。
作为证实的结果，与阿维单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2k-二氢卟吩e6和阿维单抗-二氢卟吩e6注射组相比，在阿维单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6注射组中可以在显著更长的时间内证实更强的荧光(图24的A)。在将在0时的荧光表示为1以便用数字表示荧光信号之后，作为根据每个时间段量化荧光信号的结果，证实在144小时时，在阿维单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6注射组中观察到的荧光是在阿维单抗-二氢卟吩e6或阿维单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2k-二氢卟吩e6注射组中观察到的荧光的约2.7倍(图24的B)。
根据上述结果，证实了抗体-马来酰亚胺-普朗尼克缀合物由于半衰期增加而在体内保留了更长的时间。
实验实施例7：抗体-接头-普朗尼克-光敏剂缀合物的体内癌症靶向能力的评估
向雄性无胸腺裸鼠(BALB/c裸鼠，5周龄)皮下注射1×107个ASPC-1癌细胞，然后当15天后癌的大小达到80mm3时，基于二氢卟吩e6以0.5mg/kg的浓度静脉注射西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6缀合物(CTX-Mal-PF68-Ce6)。此后，用荧光标记的生物体生物成像(FOBI，NeoScience，Suwon，韩国)设备采集癌组织的荧光图像120小时，以证实缀合物的行为。
作为证实的结果，与作为对比组的西妥昔单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2k-二氢卟吩e6(CTX-Mal-PEG2K-Ce6)注射组相比，在注射有西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68-二氢卟吩e6的小鼠的癌组织中观察到更强的光敏剂荧光。即使在对其进行定量的结果中，也证实荧光信号是对比组的约2倍(图25的A和B)。
根据上述结果，证实了由于基于抗体的普朗尼克聚合物组合物的增强的靶向能力，缀合物在癌组织中累积了更长的时间。
实验实施例8：抗体-接头-普朗尼克-光敏剂缀合物对体内癌细胞生长的抑制
向小鼠(BALB/c裸鼠，5周龄)皮下注射1x107个A431癌细胞，然后在15天后癌的大小达到200mm3时，基于二氢卟吩e6以0.5mg/kg的浓度静脉注射西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68或普朗尼克F127缀合物5次。此后，通过每2至3天测量一次癌组织的大小和重量来证实抑制癌细胞生长的效果。PBS、单独的西妥昔单抗和西妥昔单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2K和6K用作对比组。
作为证实的结果，可以看出在第一次静脉注射后，肿瘤在作为对照的PBS注射组中快速生长。证实了与对照相比，在西妥昔单抗(CTX)和西妥昔单抗-马来酰亚胺-聚乙二醇2K和6K注射组(CTX-Mal-PEG2K和CTX-Mal-PEG6K)中肿瘤生长较慢，而在西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F-68和F127注射组(CTX-Mal-PF68和CTX-Mal-PF127)中抑制了癌症生长(图26的A和图27)。由此证实，与聚乙烯聚合物相比，西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克F68和F127组进一步增强了抗体的靶向能力。此外，由于小鼠的体重没有显著变化，因此间接证实了在任何注射组中都没有毒性(图26的B)。
实验实施例9：分析抗体-接头-普朗尼克-光敏剂缀合物产生单线态氧的能力
使用对比实施例3中制备的抗体-聚乙二醇-光敏剂缀合物，通过荧光分光光度计(RF)分析实施例3中制备的西妥昔单抗/曲妥珠单抗-马来酰亚胺-普朗尼克-光敏剂缀合物产生单线态氧的能力。
制备与单线态氧反应以增加荧光的单线态氧绿色荧光探针(SOSG)溶液，其浓度为2μM，并将1ml该溶液与1ml缀合物样品混合。将波长为671nm的激光的强度设置为50mW/cm2，并且在以10秒的间隔用激光辐照混合样品的同时，在Ex 504nm和Em 525nm处测量SOSG的荧光。
作为测量的结果，通过证实包含普朗尼克的缀合物显示出比对比组更有效的光活性，可以看出产生单线态氧的能力优异(图28)。
实验实施例10：分析抗体-接头-普朗尼克-光敏剂缀合物产生单线态氧的能力
在具有不同水平的表皮生长因子受体(HER2)表达的癌细胞中证实了西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克-二氢卟吩e6缀合物杀死细胞的能力。
在分别培养NIH-3T3细胞(其为正常细胞且不具有表皮生长因子受体)、A2780细胞(其为癌细胞且具有低水平的表皮生长因子受体表达)和SKOV3细胞(其为癌细胞且具有高水平的EGFR表达)后，用西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克-二氢卟吩e6缀合物处理每种类型的细胞4小时。此后，用缓冲溶液洗涤细胞，并通过加入新的培养液进一步培养24小时。
用MTT试剂处理培养的细胞并培养3小时，然后除去培养液、MTT试剂等，并加入二甲基亚砜以溶解细胞中形成的甲瓒。此后，在570nm处测量吸光度，并比较形成的甲瓒的量，以分析每种类型的细胞的活力和基于西妥昔单抗的光敏剂组合物的细胞毒性。
结果，证实了尽管在NIH-3T3(其为正常细胞)中引入西妥昔单抗前后的细胞毒性没有大的差异(图30的A)，但癌症在引入抗体前后显示出与HER2表达水平成比例的大的细胞毒性差异(图30的B和C)。特别是，与A2780细胞相比，在引入西妥昔单抗后，表达最高表皮生长因子受体表达水平的SKOV3细胞表现出自身细胞毒性作用，即使它们没有被光辐照。
实验实施例11：抗体-接头-普朗尼克-光敏剂缀合物的细胞光毒性的证实
根据先前的实验结果，证实了实施例3中制备的西妥昔单抗-马来酰亚胺-普朗尼克-二氢卟吩e6缀合物的表皮生长因子受体(HER2)特异性分布模式。此外，用不具有细胞毒性效应的浓度的缀合物处理细胞并用激光辐照，然后在正常细胞或癌细胞中分析细胞活力的变化。
在培养NIH-3T3(其为正常细胞)和表达表皮生长因子受体的癌细胞A2780和SKOV3后，用基于抗体的光敏剂组合物和作为对比组的马来酰亚胺-聚乙二醇2k-二氢卟吩e6(Mal-PEG 2k-Ce6)处理细胞4小时，用强度为2J/cm2的激光辐照，然后再次在培养箱中培养1天。
用MTT试剂处理培养的细胞并培养3小时，然后除去培养液、MTT试剂等，并加入二甲基亚砜以溶解细胞中形成的甲瓒。此后，在570nm处测量吸光度，并比较形成的甲瓒的量，以分析每种类型的细胞的活力和基于抗体的光敏剂组合物的细胞毒性。
结果，证实了在NIH-3T3(其为正常细胞)中，在引入西妥昔单抗之前或之后没有出现光毒性(图30的A)，而在癌细胞中，根据HER2表达水平、西妥昔单抗处理和激光辐照，光毒性增加(图30的B和C)。
Claims (13)
1.一种缀合物，其包含：
(a)用于治疗癌症的抗体；
(b)通过共价键与抗体连接的接头；和
(c)嵌段共聚物，所述嵌段共聚物包含通过共价键与接头连接的聚(环氧乙烷)(PEO)和聚(环氧丙烷)(PPO)。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中(a)中用于治疗癌症的抗体选自由动物来源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体组成的组。
3.根据权利要求1所述的缀合物，其中(b)中的接头选自由马来酰亚胺、琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺酯组成的组。
4.根据权利要求1所述的缀合物，其中(c)中包含PEO和PPO的嵌段共聚物选自由泊洛沙姆68、泊洛沙姆124、泊洛沙姆127、泊洛沙姆184、泊洛沙姆185、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407组成的组。
5.根据权利要求4所述的缀合物，其中包含PEO和PPO的嵌段共聚物是泊洛沙姆188或泊洛沙姆407。
6.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述共价键选自由酰胺键、羰基键、酯键、硫酯键、磺酰胺键和氨基甲酸酯键组成的组。
7.根据权利要求1所述的缀合物，其中低分子量化合物进一步结合到所述缀合物的一端。
8.根据权利要求7所述的缀合物，其中所述低分子量化合物是抗癌剂或光敏剂。
9.根据权利要求8所述的缀合物，其中所述光敏剂选自由二氢卟吩、菌绿素、卟啉、卟啉烯和酞菁组成的组。
10.根据权利要求9所述的缀合物，其中二氢卟吩光敏剂是二氢卟吩e6。
11.一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含权利要求1所述的缀合物作为活性成分。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述癌症在癌细胞表面上表达选自由表皮生长因子受体、人表皮生长因子受体2、程序性死亡配体1和血管内皮生长因子受体2组成的组的基因。
13.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向需要治疗的个体施用权利要求11所述的药物组合物。
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