CN116751119A - 一种从真海鞘被囊中分离的具有抗肿瘤活性的萜类化合物 - Google Patents

一种从真海鞘被囊中分离的具有抗肿瘤活性的萜类化合物 Download PDF

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Abstract

本发明从真海鞘被囊中分离纯化到一种新颖的抗肿瘤萜类化合物。该化合物能够抑制多种肿瘤细胞增殖，尤其是肝细胞癌细胞系，同时该化合物对正常细胞毒性较小。在添加该萜类化合物的培养基中，肝细胞癌细胞系及其他类型的肿瘤细胞系的增殖受到抑制。并且对于肝细胞癌细胞系来说，随着时间的延长，抑制其增殖的效果一直持续。表明该化合物不仅为结构新颖的萜类化合物，同时具有良好的体外抗肿瘤效果，有成为抗肿瘤药物先导化合物的可能。

Description

一种从真海鞘被囊中分离的具有抗肿瘤活性的萜类化合物
技术领域
本发明属于天然活性物质制备及应用领域，具体涉及一种从真海鞘中分离的具有抗肿瘤活性的萜类化合物。
背景技术
随着现代生物技术的不断发展，人们对海洋资源认识的不断提高和深入，对于海洋资源的利用也更为广泛，海洋中大量天然结构的活性物质逐渐被发现，这些天然化合物往往具有抗肿瘤、抗微生物、抗病毒和免疫调节等重要功效。大量的海洋生物产物有望成为冶疗人类疾病有效的和特异的良药，许多天然产物可作为临床药物的先导化合物进行研究。恶性肿瘤严重威胁着人类的生命健康。
肿瘤治疗方法之一的化学药物疗法的成效已初步显现，但对于一些死亡率较高的癌症，一些化学药物仍具有毒副作用大，治疗效率低，肿瘤细胞易耐药等问题。因此，寻求高效、毒性小、特异性强的抗肿瘤化学药物意义重大，对解决癌症疾病问题具有深远的影响。
真海鞘(Halocynthia roretzi)属于于脊索动物门(Chordates)，尾索动物亚门(Urochordata)，海鞘纲(Ascidiacea)。真海鞘的构造可以分为三部分。外部包围着一层坚硬的壳，呈橙红色。壳顶部有生殖根。壳内部为其身体组织，呈橙色。以往的研究表明，真海鞘不仅含有丰富的矿物质元素和多种稀有氨基酸，还含有大量多不饱和脂肪酸，近年来也有关于真海鞘内囊能够预防糖尿病的报道。真海鞘由于生存环境的特殊性导致其含有大量共生微生物，能够产生丰富的次级代谢产物，但目前对于真海鞘为原料制备具有抗肿瘤活性的天然产物的报道还很少。
发明内容
本发明提供了一种从真海鞘中分离的具有抗肿瘤活性的萜类化合物，本发明中提供的萜类化合物在较低剂量下能够抑制多种肿瘤细胞系的增殖，同时对正常细胞毒性较小，具有作为未抗肿瘤药物的先导化合物的应用潜力。
本发明首先提供一种从真海鞘中分离的抗肿瘤萜类化合物，其化学结构式如下：
其中R代表一个甲基(CH3)；
所述的萜类化合物是将真海鞘的被囊(Tunic)使用乙醇溶液或乙酸乙酯进行提取，提取液先通过硅胶柱层析分离，然后甲醇洗脱的组分再用硅胶制备板分离，半制备液相分离后制备的；
其中使用乙醇溶液或乙酸乙酯进行提取，是将真海鞘被囊打碎后采用95％乙醇浸泡或乙酸乙酯浸泡得到真海鞘被囊提取物；
其中硅胶柱层析使用填充了300-400目的正相硅胶粉的正相硅胶柱，
所述的硅胶制备板分离流动相条件为二氯甲烷和甲醇的混合液，其中二氯甲烷:甲醇＝30:1。
其中半制备液相分离，其中流动相体系为乙腈与纯水，梯度洗脱的条件如下：0-10min,乙腈20％-50％；10-20min,乙腈50％-70％；20-30min,乙腈70％-100％；30-45min,100％乙腈；45-50min,乙腈100％-20％。
本发明再一个方面还提供所述的萜类化合物在制备抗肿瘤细胞的制品中的应用：
本发明再一个方面还提供所述的萜类化合物在抑制肿瘤细胞增殖中的应用；
本发明再一个方面提供一种抗肿瘤的制品，其中包含有所述的萜类化合物；
所述的肿瘤细胞，作为一个实施例的具体记载，为肝癌细胞。
本发明从真海鞘被囊中分离纯化到一种新颖的抗肿瘤萜类化合物，该化合物能够抑制多种肿瘤细胞增殖，尤其是肝细胞癌细胞系，同时该化合物对正常细胞毒性较小。在添加该萜类化合物的培养基中，肝细胞癌细胞系的增殖受到抑制，并且随着时间的延长，抑制增殖的效果一直持续。表明该化合物不仅为结构新颖的萜类化合物，同时具有良好的体外抗肿瘤效果，有成为抗肿瘤药物先导化合物的可能。
附图说明
图1：真海鞘解剖照片图，其中bar为1cm；
图2：本发明的萜类化合物的制备级硅胶板分离图；
图3：本发明的萜类化合物的半制备液相分离图；
图4：本发明的萜类化合物的核磁氢谱图；
图5：本发明的萜类化合物的核磁碳谱图；
图6：本发明的萜类化合物的1H-1H COSY谱图；
图7：本发明的萜类化合物的HSQC谱图；
图8：本发明的萜类化合物的HMBC谱图；
图9：本发明的萜类化合物的NOESY谱图；
图10：本发明的萜类化合物的高分辨率质谱图。
图11：上述萜类化合物对不同肿瘤细胞系增殖抑制效果图；
图12：上述萜类化合物抑制肝细胞癌细胞系增殖与时间的关系。
具体实施方式
申请人研究发现真海鞘被囊提取物具有显著抑制肿瘤细胞增殖的活性，通过硅胶柱层析分离，制备级硅胶板分离及半制备液相分离后得到一种新型的抗肿瘤萜类化合物。该化合物能够抑制多种肿瘤细胞增殖，尤其是肝细胞癌细胞系，且随着时间延长抑制肝细胞癌细胞系增殖的效果一直持续。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：制备抗肿瘤萜类化合物
所提供的抗肿瘤萜类化合物，其制备方法包括如下步骤：
1、真海鞘待提取材料准备：
取真海鞘被囊(图1，Tunic)打碎至约150目大小。
2、醇提法或乙酸乙酯提取法制备真海鞘被囊提取液：
真海鞘被囊打碎后浸泡于95％乙醇中或乙酸乙酯中，在浸泡过程中时而摇晃，浸泡时间为一周。
3、硅胶柱层析分离真海鞘被囊提取液：
取真海鞘被囊提取液，如果提取液浓度较低则使用旋转蒸发仪(东京理化)对其进行浓缩。被囊提取液拌于200-300目硅胶中，将提取液在200-300目硅胶中拌干后进行干法装柱。将300-400目硅胶装于玻璃硅胶层析柱(欣维尔牌)最下层，高度约为40cm，300-400目硅胶上方为拌好的提取液样品，样品上方为60-80目硅胶用于缓冲，高度约为15cm。硅胶层析柱装好之后首先用极性最小的洗脱溶剂(乙酸乙酯:石油醚＝1:4)对层析柱进行浸润，
待浸润溶液将整个柱子润湿之后进行梯度洗脱。洗脱时按照极性由小到大的顺序，用乙酸乙酯-石油醚体系进行洗脱，乙酸乙酯:石油醚＝1:4(800mL)，1:3(400mL)，1:2(200mL)，100％甲醇(500mL)，待洗脱完成后，洗脱液使用旋转蒸发仪蒸干后称重，称重后再次使用甲醇溶解，对每种极性洗脱出的样品进行肿瘤细胞毒性检测，其中甲醇洗脱的组分具有肿瘤细胞毒性，制备得到该样品并保存于4℃备用。
4、制备级硅胶板分离硅胶柱层析分离所得洗脱液
将硅胶柱层析分离所得具有细胞毒性的样品蘸于毛细管中之后点于制备型硅胶层析板上，边点边用热烘枪(德力西电器)吹干。点样完成后，进行薄层层析，流动相条件为二氯甲烷-甲醇，流动相比例为二氯甲烷:甲醇＝30:1。层析时待溶液前端到达硅胶层析板顶部约2cm时取出层析板使用热烘枪吹干，根据板上所显示的条带的颜色，我们将每一部分样品割下后溶解于甲醇中，随后进行细胞毒性检测，具有肿瘤细胞毒性的样品如图2的标出部分所示()，制备并于-20℃保存备用。
5、半制备液相分离上述过程中具有肿瘤细胞毒性的样品
制备硅胶板制备得到目的样品后，将目的样品过滤膜后进行半制备液相分离条件。以色谱级乙腈(国药)，纯水为流动相，其后乙腈比例由20％线性增加到100％。制备时每次进样量为200μL，按照各样品出峰时间手动接样。随后对每组化合物峰进行肿瘤细胞毒性检测，具有肿瘤细胞毒性的化合物峰即为上述抗肿瘤萜类化合物。在上述洗脱液条件下，该化合物于27.4分钟时被洗脱出来(图3圈出部分)。制备液相所用色谱柱为Kromasil C18反向色谱柱，液相型号为日立L-2000型液相。
实施例2：萜类化合物的结构鉴定
结合实施例1中制备的具有肿瘤细胞毒性的化合物的氢谱及HSQC谱(图4、图7)可见，在该化合物中含有五个甲基，并且位于2.28ppm处的甲基可能与不饱和碳相连；在高场区还存在两组亚甲基信号，其化学不等价特征表明两个亚甲基可能位于环状结构中；此外，在3.93ppm附近有一个次甲基氢信号，在低场区6.00-8.00ppm范围内存在三个芳香氢或烯氢信号。核磁共振碳谱(图5)显示该化合物共有18个碳，除了上述与氢相连的11个碳之外，还有七个季碳，其中199.9ppm处的信号提示化合物存在一个醛基或羰基基团。在COSY谱(图6)中，H-2/3/4之间的相关提示化合物含有-CH2-CH(OH)-CH2-结构片段，结合CH3-15/CH3-16与C-1/2/6之间的HMBC谱(图8)的相关信号以及CH3-17与C-4/6之间的HMBC谱的相关信号，推测出结构中含有的环己烷部分片段。另外，在COSY谱中，H-10/11/12之间的相关表明含有相邻的两个双键结构，结合HMBC谱中H-12与C-10/13之间的相关以及H-14与C-12/13的相关表明甲基C-14与不饱和羰基相连，连接于C-12末端。HMBC谱中H-10与C-18的相关，以及H-18与C-8/9之间的HMBC相关进一步完善了侧链结构。除C-8的季碳之外，还存在一个季碳信号，最终推测C-8/9形成炔基将环己烷部分与侧链部分相连。在NOESY谱(图9)中，CH3-18与H-10存在NOE相关，与H-11没有相关，因此C-9/10之间的双键为Z构型，根据H-10和H-12之间存在的NOE相关以及H-11与H-12间的大偶合常数(15.6Hz)推测出C-11/12双键为E构型。制备的萜类化合物并通过高分辨率质谱(图10)对以上结论进行了验证，其平面结构得以确定。
实施例3：萜类化合物的抗肿瘤细胞的效果
1、CCK-8法检测萜类化合物对不同肿瘤细胞系的细胞毒性
采用CCK-8法检测萜类化合物对HepG-2、BHT-101、Hela、Mcf-7、Sk-Hep-1、Bel-7402、Huh-7等肿瘤细胞系和正常细胞系(L929)的增殖抑制率(图11)。细胞传代时，一部分细胞悬液用于细胞铺板，随后按照实验要求铺板，37℃培养24h，待细胞的密度长到60％左右时吸去旧培养液，加入不同待测样品。继续37℃培养48h后吸去旧培养液，加入配置好的CCK-8染液。37℃孵育2h，孵育完成后使用酶标仪测吸光度(450nm)，计算相细胞相对活性。
结果表明，随着萜类化合物作用浓度的增加，其对肿瘤细胞的抑制作用也逐渐增强，在25μM的浓度下处理48小时后上述萜类化合物对HepG2、BHT-101、Hela、Mcf-7、Sk-Hep-1、Bel-7402、Huh-7等细胞的增殖抑制率分别为74.60％±0.8723％、30.17％±1.856％、49.14％±2.523％、26.41％±2.649％、51.43±2.664％、56.98±0.5692％、37.71±1.638％。在25μM的浓度下处理48小时后上述萜类化合物对正常细胞系(L929)的增殖抑制率小于20％。
2、CCK-8法检测萜类化合物随时间变化对肝细胞癌细胞系增殖抑制效果
采用CCK-8法检测萜类化合物对HepG-2、Sk-Hep-1、Bel-7402、Huh-7等肝细胞癌细胞系的增殖抑制率(图12)。细胞传代时，一部分细胞悬液用于细胞铺板，随后按照实验要求铺板，37℃培养24h，待细胞的密度长到60％左右时吸去旧培养液，加入不同待测样品。继续37℃培养24h、48h、72h后吸去旧培养液，加入配置好的CCK-8染液。37℃孵育2h，孵育完成后使用酶标仪测吸光度(450nm)，计算相细胞相对活性。
结果表明，随着作用时间的延长，其对肝细胞癌细胞系的增殖抑制作用也持续增强。在20μM的浓度下处理24小时后上述萜类化合物对HepG2、Sk-Hep-1、Bel-7402、Huh-7等细胞的增殖抑制率分别为46.53％±1.503％、9.620％±3.606％、26.89％±1.026％、19.27％±1.415％；在20μM的浓度下处理48小时后上述萜类化合物对HepG2、Sk-Hep-1、Bel-7402、Huh-7等细胞的增殖抑制率分别为72.22％±0.7576％、56.10％±1.446％、46.01％±2.335％、24.85％±3.206％；在20μM的浓度下处理72小时后上述萜类化合物对HepG2、Sk-Hep-1、Bel-7402、Huh-7等细胞的增殖抑制率分别为79.43％±0.5153％、62.11％±2.076％、63.60％±2.330％、58.13％±0.4278％。
上述结果表明抗肿瘤萜类化合物对正常细胞毒性较小，该化合物能够抑制多种肿瘤细胞增殖，尤其是肝细胞癌细胞系。同时随着时间的延长，该化合物能够持续抑制肝细胞癌细胞系的增殖。表明该化合物不仅为结构新颖的萜类化合物，同时具有良好的体外抗肿瘤效果，可作为抗肿瘤药物的先导化合物。

Claims (10)

1.一种萜类化合物，其特征在于，所述的萜类化合物化学结构式如下：
其中R为甲基。
2.权利要求1所述的萜类化合物，其特征在于，所述的萜类化合物是将真海鞘的被囊使用乙醇溶液或乙酸乙酯进行提取，提取液先通过硅胶柱层析分离，然后洗脱的组分再用硅胶制备板分离，半制备液相分离后制备的。
3.如权利要求2所述的萜类化合物，其特征在于，所述的乙醇溶液是95％的乙醇溶液。
4.如权利要求2所述的萜类化合物，其特征在于，所述的硅胶柱层析使用填充了300-400目的正相硅胶粉的正相硅胶柱进行分离。
5.如权利要求2所述的萜类化合物，其特征在于，所述的硅胶柱层析的洗脱的组分为甲醇洗脱的组分。
6.如权利要求2所述的萜类化合物，其特征在于，所述的硅胶制备板分离流动相条件为二氯甲烷和甲醇的混合液，其中二氯甲烷:甲醇＝30:1。
7.如权利要求2所述的萜类化合物，其特征在于，所述的半制备液相分离，其中流动相体系为乙腈与纯水，梯度洗脱的条件如下：0-10min,乙腈20％-50％；10-20min,乙腈50％-70％；20-30min,乙腈70％-100％；30-45min,100％乙腈；45-50min,乙腈100％-20％。
8.权利要求1所述的萜类化合物在制备抗肿瘤细胞的制品中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤细胞为肝癌细胞。
10.一种抗肿瘤的制品，其特征在于，所述的制品中包含有权利要求1所述的萜类化合物。
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