CN116735305A - 一种用于检测血清中叶酸含量的叶酸释放剂、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测血清中叶酸含量的叶酸释放剂、制备方法及应用。一种用于检测血清中叶酸含量的叶酸释放剂，按重量体积比，叶酸释放剂包括：二硫苏糖醇0.6‑1.5％，柠檬提取物1.9‑2.5％，海带提取物1％‑2％，氢氧化钠1.0‑3.2％，磷酸氢二钾1.05‑1.5％，氯化钾1.0‑2.3％，氯化钠0.1‑0.5％，Proclin3000.1‑0.5％。本发明解决了血清样本中叶酸含量准确测定的难题,提供了一种相对安全、温和的叶酸释放剂，能够充分解离血清样本中结合状态的叶酸分子，且释放彻底，实现了自动、精准、快速的检测目标。

Description

一种用于检测血清中叶酸含量的叶酸释放剂、制备方法及 应用

技术领域

本发明属于体外诊断技术领域，特别涉及一种用于检测血清中叶酸含量的叶酸释放剂、制备方法及应用。

背景技术

叶酸在人体中参与许多化合物的生成和代谢，在蛋白质合成以及细胞分裂与生长过程中具有重要作用。叶酸由小肠吸收并储存在肝脏中。叶酸缺乏会导致巨幼细胞性贫血并最终引发严重的神经性问题。叶酸的过度消耗在怀孕期间非常普遍。酒精中毒、肝炎或其它损害肝脏的疾病也能引起叶酸的过度消耗。血清和红血球中的叶酸水平会用来评估叶酸状况。血清中的叶酸水平反映了最近叶酸的摄入量。而红血球(RBC)中的叶酸最能反映长期以来的叶酸储存状况。如果RBC中的叶酸值低，则意味着叶酸长期缺乏。叶酸(FA)的测定对贫血病因鉴别诊断有较好的临床价值。

叶酸缺乏会引起新生儿神经管缺陷，脊柱关键部位发育受损，导致脊柱裂、无脑儿和脑脊柱裂的畸形儿。1991年，英国医学研究委员会首次证实了妊娠前后补充叶酸可预防神经管缺陷(NTDs)的发生，降低50-70％的发病率。叶酸缺乏使红细胞DNA的合成受到抑制，核蛋白形成不足，骨髓中新形成的红细胞不能成熟，细胞分裂增殖速度下降，细胞体积增大而出现了巨红细胞，引发孕妇及婴幼儿的核巨红细胞性贫血。给母体和胎儿带来很大伤害，例如习惯性流产、早产、婴儿出生体重过低、胎儿消化不良及生长迟缓等。老年期痴呆症、抑郁症及新生儿的神经系统发生异常等有关脑疾病变疾病，都与叶酸缺乏有着一定的关联。另外，缺乏叶酸还可能引起肿瘤(子宫癌、支气管癌、食道癌、大肠癌等)、慢性萎缩性胃炎、结肠炎、冠心病和脑血管疾病等多种疾病，还会出现舌炎、生长不良、智力退化等症状。叶酸水平增高常见于恶性贫血、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症、肾性贫血和各种肝病。

人体内的叶酸以叶酸结合蛋白复合物的形式存在，要检测血清中的叶酸含量，首先需要将结合态的叶酸从结合蛋白中释放出来，以游离的形式存在于样本中，才能与试剂盒中的相应组分进行结合，实现准确的检测目的。

目前临床上叶酸的检测方法主要有磁微粒化学发光免疫法、酶联免疫法、放射性免疫法等。酶联免疫法灵敏度低，检测范围窄；放射性免疫法存在放射性污染、标记物半衰期短、对操作者具有放射性损伤，且操作繁琐，时间长等缺点。磁微粒化学发光免疫法具有较高的检测灵敏度和准确性，但是存在以下主要问题：一是现有的部分叶酸释放剂配方含氰化物，配制过程比较严苛，配制人员面临的风险较大；二是部分叶酸释放剂的释放效果不理想，释放不完全，因此，如何更有效的将血清样品中的叶酸从结合蛋白中完全释放成游离态以获得准确的检测结果且无毒环保仍然是一项技术难题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的上述缺陷，提供一种用于检测血清中叶酸含量的叶酸释放剂、制备方法及应用。本发明提供了一种缓冲液的制备方法，该缓冲液能够将叶酸完全的从结合状态转换成游离状态，因此又将该缓冲液叫做叶酸释放剂。该释放剂与血清样本中的叶酸结合蛋白相作用，保证游离叶酸分子的结构完整性，保证了检测结果的准确性。

本发明所采用的检测方法是磁微粒化学发光免疫法，其操作方法方便、简单，反应条件温和，发光值稳定且受外界条件影响较小。相比于荧光免疫层析法、酶联免疫法，本发明具有特异性强、灵敏度高等特点。化学发光免疫法具有检测速度快，测试结果准确、重复性好的特点。本发明提供了一种将血清中的结合状态的叶酸转变成游离状态的方法，该方法具有安全、可靠与准确性。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于检测血清中叶酸含量的叶酸释放剂，按重量体积比，叶酸释放剂包括：

作为优化，柠檬提取物的制备方法为：

1)首先取若干整颗新鲜柠檬，投放到软化罐喷淋舱进行初喷淋作业，喷水量控制在0.6kg/min，然后将初喷淋作业后的新鲜柠檬投放到软化罐加温软化舱中，在80℃的恒温软化舱中软化6分钟，再将新鲜柠檬从软化罐加温软化舱中取出，投放到软化罐软化喷淋舱，喷水量控制在0.3kg/min，水温为55℃，软化时间为3分钟；取出软化后的新鲜柠檬，称取重量为100g的整颗新鲜柠檬，切成带皮、带籽的柠檬小块放入破壁机中，加入100g的纯化水，在破壁机的作用下将柠檬小块搅拌打碎成液体状态，得到柠檬液；

2)用滤网过滤掉步骤1)中柠檬液残渣后，转移至减压蒸馏器中，加热到50℃时，开启真空器进行减压蒸馏，减压蒸馏器内压力控制在10-86kPa，逐步升温到80℃，恒温减压蒸馏1小时，得到蒸馏提取液；

3)取步骤2)中蒸馏提取液转移至真空冷冻干燥机中进行冻干操作，收集冻干后的粉末状柠檬提取物备用。

作为优化，海带提取物的制备方法为：

1)取若干重量的干海带，加入自来水中浸泡至完全舒展，将其表面的盐分都溶于水中；然后洗去表面的泥沙，用纯化水冲洗2遍，将清洗后的海带放在破壁机中，加入100g的纯化水，打碎至黏状胶态物，初步得到海带液；

2)在步骤1)中的海带液中加入1000mL的体积比为75％的乙醇溶液，然后放置于磁力搅拌器上搅拌1小时，使海带液均匀分散在整个容器中；

3)利用超声波提取仪器对步骤2)中的溶液进行超声提取30分钟，然后对混合提取液进行过滤，实现固液分离；收集过滤后的溶液转移至真空冷冻干燥机中进行冻干操作，收集冻干后的固体物质即为海带提取物。

上述用于检测血清中叶酸含量的叶酸释放剂的制备方法，包括以下步骤：

1)取500mL的干燥洁净的烧杯，放入磁子，将烧杯放置在电子天平上称量瓶重并记录；

2)在电子天平上准确称取50.00±1.00g的纯化水加入上述烧杯中；

3)在电子天平上依次准确称取二硫苏糖醇1.02g，柠檬提取物2.05g，海带提取物8.52g，氢氧化钠2.20g，磷酸氢二钾1.45g，氯化钾1.85g，氯化钠0.25g并全部加入上述烧杯中；

4)用移液器量取Proclin3000.25mL并加入上述烧杯中；

5)将上述烧杯定重至1000.00±1.00g；

6)将上述烧杯置于磁力搅拌器上室温混匀2小时，至所有组分完全溶解；

7)将配制好的释放剂用0.22μm的滤膜进行过滤，过滤后的缓冲液转入新的干燥的试剂瓶，置于2～8℃条件下保存。

上述用于检测血清中叶酸含量的叶酸释放剂的应用，包括以下步骤：

1)试验前将所有试剂平衡至室温，全自动化学发光免疫分析仪开机预热30分钟,对全自动化学发光免疫分析仪进行基础维护，进行反应管的装载，配套试剂(底物液、清洗液)的添加，废液、废管的清理和液路灌注操作；

2)在全自动化学发光免疫分析仪操作界面装载叶酸试剂盒，并添加校准曲线与质控测试；

3)进行叶酸试剂盒的定标与质控测试，定标成功，高低值质控品测试合格后进行样本测试；

4)实验过程中全自动化学发光免疫分析仪先吸取30μL待测样本加入反应管中，然后吸取60μL叶酸释放剂加入反应管中，充分混匀后，转移至温育盘37℃条件下温育5min；

5)吸取叶酸检测试剂盒中的抗试剂A组分30μL加入到步骤4)温育好的反应管中，同时吸取抗试剂B组分30μL加入到步骤4)温育好的反应管中；充分混匀后，转移至温育盘37℃条件下继续温育15min；

6)全自动化学发光免疫分析仪对步骤5)温育后的反应物进行磁分离，将反应管转移至全自动化学发光免疫分析仪清洗区，吸取并加入300μL清洗液，充分混匀，清洗，重复3次，清洗后对反应物进行磁分离；

7)进行磁分离后的反应物，用加样针吸取并加入200μL全自动免疫检验系统用底物液，充分混匀后，放置在全自动化学发光免疫分析仪光感测试区，120秒后进行光信号检测；

8)血清样本中叶酸的含量与全自动化学发光免疫分析仪检测到的光信号成反比，全自动化学发光免疫分析仪通过试剂盒的定标信息以及样本测试的发光值自动拟合计算血清样本中的叶酸含量。

本发明的有益效果是：

本发明解决了血清样本中叶酸含量准确测定的难题。提供了一种相对安全、温和的叶酸释放剂，能够有效的将血清样本中结合态的叶酸释放出来。结合叶酸测定试剂盒(磁微粒化学发光)，实现了自动、精准、快速的检测目标。

本发明采用的柠檬提取物与海带提取物性质温和、天然有机，对操作人无害，对环境无害，解决了传统释放剂的毒性与环境污染性的问题；另外，本发明的叶酸释放剂能够充分解离血清样本中结合状态的叶酸分子，且柠檬提取物与海带提取物在该释放剂中起到了将叶酸释放彻底的作用，能达到准确的测试效果。

本发明柠檬提取物的制备方法，采用新型加工工艺，通过初喷淋-恒温软化-软化喷淋，分步进行，软化效果非常好，使有效成分进一步释放，进而便于充分解离血清样本中结合状态的叶酸分子，更有效的将血清样品中的叶酸从结合蛋白中完全释放成游离态，且效果较好；其次，由于采用软化作业，使柠檬得到充分软化，便于下一步破壁机中将柠檬小块搅拌打碎成液体状态，另外，投料速度与喷水量相匹配，能够满足软化需水要求，并且不会造成溶有原料内含营养成分的多余的水分流失，保持了原料营养及功效不衰减，此外，温度及时间指标能满足原料软化需求，且效果较好。

本发明海带提取物制备方法，采用新型加工工艺，通过采用超声波的空化作用使有效成分进一步释放，进而便于充分解离血清样本中结合状态的叶酸分子，更有效的将血清样品中的叶酸从结合蛋白中完全释放成游离态，且效果较好。

具体实施方式

下面结合实施例，对本申请作进一步的详细描述。特别指出的是，以下实施例仅用于说明本申请，但不对本申请的范围进行限定。同样的，以下实施方式仅为本申请的部分实施方式而非全部实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施方式，都属于本申请保护的范围。

以下具体实施例中用到的叶酸检测试剂盒(磁微粒化学发光法)(鲁械注准20192400901号)，清洗液(鲁济械备20170035号)，全自动免疫检验系统用底物液(鲁济械备20180055号)均来自山东博科诊断科技有限公司。本发明以下实验中所用的105例血清样本均来自济南军区总医院，浓度已经由罗氏叶酸检测试剂盒(电化学发光法)(国械注进20152402647)测试完毕。

如未特殊说明，下述实施例中各原料组分均可通过商业途径购得，所使用的实验仪器均为实验室常规实验仪器，性能测试方法为本领域已知测试方法。

优选的实施方式如下：

一种用于检测血清中叶酸含量的叶酸释放剂，按重量体积比，叶酸释放剂包括：

柠檬提取物的制备方法为：

1)首先取若干整颗新鲜柠檬，投放到软化罐喷淋舱进行初喷淋作业，喷水量控制在0.6kg/min，然后将初喷淋作业后的新鲜柠檬投放到软化罐加温软化舱中，在80℃的恒温软化舱中软化6分钟，再将新鲜柠檬从软化罐加温软化舱中取出，投放到软化罐软化喷淋舱，喷水量控制在0.3kg/min，水温为55℃，软化时间为3分钟；取出软化后的新鲜柠檬，称取重量为100g的整颗新鲜柠檬，切成带皮、带籽的柠檬小块放入破壁机中，加入100g的纯化水，在破壁机的作用下将柠檬小块搅拌打碎成液体状态，得到柠檬液；

2)用滤网过滤掉步骤1)中柠檬液残渣后，转移至减压蒸馏器中，加热到50℃时，开启真空器进行减压蒸馏，减压蒸馏器内压力控制在10-86kPa，逐步升温到80℃，恒温减压蒸馏1小时，得到蒸馏提取液；

3)取步骤2)中蒸馏提取液转移至真空冷冻干燥机中进行冻干操作，收集冻干后的粉末状柠檬提取物备用。

海带提取物的制备方法为：

1)取若干重量的干海带，加入自来水中浸泡至完全舒展，将其表面的盐分都溶于水中；然后洗去表面的泥沙，用纯化水冲洗2遍，将清洗后的海带放在破壁机中，加入100g的纯化水，打碎至黏状胶态物，初步得到海带液；

2)在步骤1)中的海带液中加入1000mL的体积比为75％的乙醇溶液，然后放置于磁力搅拌器上搅拌1小时，使海带液均匀分散在整个容器中；

3)利用超声波提取仪器对步骤2)中的溶液进行超声提取30分钟，然后对混合提取液进行过滤，实现固液分离；收集过滤后的溶液转移至真空冷冻干燥机中进行冻干操作，收集冻干后的固体物质即为海带提取物。

上述用于检测血清中叶酸含量的叶酸释放剂的制备方法，包括以下步骤：

1)取1000mL的干燥洁净的烧杯，放入磁子，将烧杯放置在电子天平上称量瓶重并记录；

2)在电子天平上准确称取500.00±1.00g的纯化水加入上述烧杯中；

3)在电子天平上依次准确称取二硫苏糖醇1.02g，柠檬提取物2.05g，海带提取物1.52g，氢氧化钠2.20g，磷酸氢二钾1.45g，氯化钾1.85g，氯化钠0.25g并全部加入上述烧杯中；

4)用移液器量取Proclin3000.25mL并加入上述烧杯中；

5)将上述烧杯定重至1000.00±1.00g；

6)将上述烧杯置于磁力搅拌器上室温混匀2小时，至所有组分完全溶解；

7)将配制好的释放剂用0.22μm的滤膜进行过滤，过滤后的缓冲液转入新的干燥的试剂瓶，置于2～8℃条件下保存。

上述用于检测血清中叶酸含量的叶酸释放剂的应用，包括以下步骤：

1)试验前将所有试剂平衡至室温，全自动化学发光免疫分析仪开机预热30分钟,对全自动化学发光免疫分析仪进行基础维护，进行反应管的装载，配套试剂(底物液、清洗液)的添加，废液、废管的清理和液路灌注操作；

2)在全自动化学发光免疫分析仪操作界面装载叶酸试剂盒，并添加校准曲线与质控测试；

3)进行叶酸试剂盒的定标与质控测试，定标成功，高低值质控品测试合格后进行样本测试；

4)实验过程中全自动化学发光免疫分析仪先吸取30μL待测样本加入反应管中，然后吸取60μL叶酸释放剂加入反应管中，充分混匀后，转移至温育盘37℃条件下温育5min；

5)吸取叶酸检测试剂盒中的抗试剂A组分30μL加入到步骤4)温育好的反应管中，同时吸取抗试剂B组分30μL加入到步骤4)温育好的反应管中；充分混匀后，转移至温育盘37℃条件下继续温育15min；

6)全自动化学发光免疫分析仪对步骤5)温育后的反应物进行磁分离，将反应管转移至全自动化学发光免疫分析仪清洗区，吸取并加入300μL清洗液，充分混匀，清洗，重复3次，清洗后对反应物进行磁分离；

7)进行磁分离后的反应物，用加样针吸取并加入200μL全自动免疫检验系统用底物液，充分混匀后，放置在全自动化学发光免疫分析仪光感测试区，120秒后进行光信号检测；

8)血清样本中叶酸的含量与全自动化学发光免疫分析仪检测到的光信号成反比，全自动化学发光免疫分析仪通过试剂盒的定标信息以及样本测试的发光值自动拟合计算血清样本中的叶酸含量。

实施例1：

一种用于检测血清中叶酸含量的叶酸释放剂，按重量体积比，叶酸释放剂包括：

柠檬提取物的制备方法为：

1)首先取若干整颗新鲜柠檬，投放到软化罐喷淋舱进行初喷淋作业，喷水量控制在0.6kg/min，然后将初喷淋作业后的新鲜柠檬投放到软化罐加温软化舱中，在80℃的恒温软化舱中软化6分钟，再将新鲜柠檬从软化罐加温软化舱中取出，投放到软化罐软化喷淋舱，喷水量控制在0.3kg/min，水温为55℃，软化时间为3分钟；取出软化后的新鲜柠檬，称取重量为100g的整颗新鲜柠檬，切成带皮、带籽的柠檬小块放入破壁机中，加入100g的纯化水，在破壁机的作用下将柠檬小块搅拌打碎成液体状态，得到柠檬液；

2)用滤网过滤掉步骤1)中柠檬液残渣后，转移至减压蒸馏器中，加热到50℃时，开启真空器进行减压蒸馏，减压蒸馏器内压力控制在10-86kPa，逐步升温到80℃，恒温减压蒸馏1小时，得到蒸馏提取液；

3)取步骤2)中蒸馏提取液转移至真空冷冻干燥机中进行冻干操作，收集冻干后的粉末状柠檬提取物备用。

海带提取物的制备方法为：

1)取若干重量的干海带，加入自来水中浸泡至完全舒展，将其表面的盐分都溶于水中；然后洗去表面的泥沙，用纯化水冲洗2遍，将清洗后的海带放在破壁机中，加入100g的纯化水，打碎至黏状胶态物，初步得到海带液；

2)在步骤1)中的海带液中加入1000mL的体积比为75％的乙醇溶液，然后放置于磁力搅拌器上搅拌1小时，使海带液均匀分散在整个容器中；

3)利用超声波提取仪器对步骤2)中的溶液进行超声提取30分钟，然后对混合提取液进行过滤，实现固液分离；收集过滤后的溶液转移至真空冷冻干燥机中进行冻干操作，收集冻干后的固体物质即为海带提取物。

上述用于检测血清中叶酸含量的叶酸释放剂的制备方法，包括以下步骤：

1)取1000mL的干燥洁净的烧杯，放入磁子，将烧杯放置在电子天平上称量瓶重并记录；

2)在电子天平上准确称取500.00±1.00g的纯化水加入上述烧杯中；

3)在电子天平上依次准确称取二硫苏糖醇1.02g，柠檬提取物2.20g，海带提取物1.52g，氢氧化钠2.20g，磷酸氢二钾1.45g，氯化钾1.85g，氯化钠0.25g并全部加入上述烧杯中；

4)用移液器量取Proclin3000.25mL并加入上述烧杯中；

5)将上述烧杯定重至1000.00±1.00g；

6)将上述烧杯置于磁力搅拌器上室温混匀2小时，至所有组分完全溶解；

7)将配制好的释放剂用0.22μm的滤膜进行过滤，过滤后的缓冲液转入新的干燥的试剂瓶，置于2～8℃条件下保存。

上述用于检测血清中叶酸含量的叶酸释放剂的应用，用叶酸(FA)测定试剂盒(磁微粒化学发光法)(来自山东博科诊断科技有限公司)在全自动化学发光免疫分析测定仪(来自山东博科诊断科技有限公司)上进行定标操作；取105例经罗氏叶酸试剂盒测定的血清样本进行检测，具体步骤如下：

1)试验前将所有试剂平衡至室温，全自动化学发光免疫分析仪开机预热30分钟,对全自动化学发光免疫分析仪进行基础维护，进行反应管的装载，配套试剂(底物液、清洗液)的添加，废液、废管的清理和液路灌注操作；

2)在全自动化学发光免疫分析仪操作界面装载叶酸试剂盒，并添加校准曲线与质控测试；

3)进行叶酸试剂盒的定标与质控测试，定标成功，高低值质控品测试合格后进行样本测试；

4)实验过程中全自动化学发光免疫分析仪先吸取30μL待测样本加入反应管中，然后吸取60μL叶酸释放剂加入反应管中，充分混匀后，转移至温育盘37℃条件下温育5min；

5)吸取叶酸检测试剂盒中的抗试剂A组分30μL加入到步骤4)温育好的反应管中，同时吸取抗试剂B组分30μL加入到步骤4)温育好的反应管中；充分混匀后，转移至温育盘37℃条件下继续温育15min；

6)全自动化学发光免疫分析仪对步骤5)温育后的反应物进行磁分离，将反应管转移至全自动化学发光免疫分析仪清洗区，吸取并加入300μL清洗液，充分混匀，清洗，重复3次，清洗后对反应物进行磁分离；

7)进行磁分离后的反应物，用加样针吸取并加入200μL全自动免疫检验系统用底物液，充分混匀后，放置在全自动化学发光免疫分析仪光感测试区，120秒后进行光信号检测；

8)血清样本中叶酸的含量与全自动化学发光免疫分析仪检测到的光信号成反比(试剂盒方法原理为竞争法)，全自动化学发光免疫分析仪通过试剂盒的定标信息以及样本测试的发光值自动拟合计算血清样本中的叶酸含量。

实施例2-5

实施例2与实施例1的区别仅在于，实施例2中柠檬提取物为1.9％；

实施例3与实施例1的区别仅在于，实施例3中柠檬提取物重量体积比为2.5％；

实施例4与实施例1的区别仅在于，实施例4中海带提取物重量体积比为1％；

实施例5与实施例1的区别仅在于，实施例5中海带提取物重量体积比为2％；

对比例1-4

对比例1与实施例1的区别仅在于，对比例1的叶酸释放剂不添加柠檬提取物与海带提取物；

对比例2与实施例1的区别仅在于，对比例2的柠檬提取物的制备方法采用常规方法；

对比例3与实施例1的区别仅在于，对比例3的海带提取物的制备方法采用常规方法；

对比例4与实施例1的区别仅在于，对比例4未添加叶酸释放剂。

各实施例、对比例测试105血清样本，实验测试结果见表1。

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实验结果如表1所示，本申请的叶酸释放剂应用于叶酸测定试剂盒(磁微粒化学发光法)(山东博科诊断科技有限公司)对105例血清样本的测试效果，跟罗氏测试效果相比，直线方程为Y＝0.9683x-0.007，相关系数R2＝0.965，由表1中的数据可知，相较于其他示例的方法，本申请实施例1的方法的效果更好。本申请实施例1的测试结果与罗氏测试结果的相对偏倚表明，超过95％以上的样本偏差在其95％的置信区间内。

由表1中的数据显示，对比例1未添加柠檬提取物与海带提取物的叶酸释放剂的试剂盒血清样本测试跟罗氏测值有明显差距，整体偏低，且相关性低于0.80，测值不具备参考性与准确性。

由表1中的数据显示，对比例2采用常规方法制备柠檬提取物的叶酸释放剂的试剂盒血清样本测试跟罗氏测值有明显差距，整体偏低且相关性低于0.90，测值不具备参考性与准确性。

由表1中的数据显示，对比例3采用常规方法制备海带提取物的叶酸释放剂的试剂盒血清样本测试跟罗氏测值有明显差距，整体偏低且相关性低于0.80，测值不具备参考性与准确性。

由表1中的数据显示，对比例4未添加叶酸释放剂的试剂盒测试浓度样本的结果一致，均为0.001，实验结果不具备参考性与准确性。

以上实验结果表明，本申请的样本释放剂能够充分解离血清样本中结合状态的叶酸分子，并且柠檬提取物与海带提取物在该释放剂中起到了将叶酸释放彻底的作用，能达到准确的测试效果，该叶酸释放剂可以应用于血清样本中的叶酸测定，具有较好的应用前景。

本发明解决了血清样本中叶酸含量准确测定的难题。提供了一种相对安全、温和的释放剂，本申请的样本释放剂能够充分解离血清样本中结合状态的叶酸分子，并且柠檬提取物与海带提取物在该释放剂中起到了将叶酸释放彻底的作用，能达到准确的测试效果，该叶酸释放剂可以应用于血清样本中的叶酸测定，实现了自动、精准、快速的检测目标。本发明的创新物料为柠檬提取物与海带提取物，这2种提取物物料性质温和、天然有机，对操作人无害，对环境无害，解决了传统释放剂的毒性与环境污染性的问题。

以上描述显示了本发明的主要特征、基本原理，以及本发明的优点。对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施方式或者实施例的细节，且在不背离本发明的精神或者基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此应将上述实施方式或者实施例看作示范性的，且非限制性的。本发明的范围由所附权利要求而非上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。凡是未脱离本发明技术原理的前提下，依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何简单修改、等同变化与改型，皆应落入本发明的专利保护范围。

Claims (5)

1.一种用于检测血清中叶酸含量的叶酸释放剂，其特征在于，按重量体积比，所述叶酸释放剂包括：

2.如权利要求1所述的一种用于检测血清中叶酸含量的叶酸释放剂，其特征在于：所述柠檬提取物的制备方法为：

1)首先取若干整颗新鲜柠檬，投放到软化罐喷淋舱进行初喷淋作业，喷水量控制在0.6kg/min，然后将初喷淋作业后的新鲜柠檬投放到软化罐加温软化舱中，在80℃的恒温软化舱中软化6分钟，再将新鲜柠檬从软化罐加温软化舱中取出，投放到软化罐软化喷淋舱，喷水量控制在0.3kg/min，水温为55℃，软化时间为3分钟；取出软化后的新鲜柠檬，称取重量为100g的整颗新鲜柠檬，切成带皮、带籽的柠檬小块放入破壁机中，加入100g的纯化水，在破壁机的作用下将柠檬小块搅拌打碎成液体状态，得到柠檬液；

2)用滤网过滤掉步骤1)中柠檬液残渣后，转移至减压蒸馏器中，加热到50℃时，开启真空器进行减压蒸馏，减压蒸馏器内压力控制在10-86kPa，逐步升温到80℃，恒温减压蒸馏1小时，得到蒸馏提取液；

3)取步骤2)中蒸馏提取液转移至真空冷冻干燥机中进行冻干操作，收集冻干后的粉末状柠檬提取物备用。

3.如权利要求1所述的一种用于检测血清中叶酸含量的叶酸释放剂，其特征在于：所述海带提取物的制备方法为：

1)取若干重量的干海带，加入自来水中浸泡至完全舒展，将其表面的盐分都溶于水中；然后洗去表面的泥沙，用纯化水冲洗2遍，将清洗后的海带放在破壁机中，加入100g的纯化水，打碎至黏状胶态物，初步得到海带液；

2)在步骤1)中的海带液中加入1000mL的体积比为75％的乙醇溶液，然后放置于磁力搅拌器上搅拌1小时，使海带液均匀分散在整个容器中；

3)利用超声波提取仪器对步骤2)中的溶液进行超声提取30分钟，然后对混合提取液进行过滤，实现固液分离；收集过滤后的溶液转移至真空冷冻干燥机中进行冻干操作，收集冻干后的固体物质即为海带提取物。

4.一种如权利要求1-3任一所述的用于检测血清中叶酸含量的叶酸释放剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取500mL的干燥洁净的烧杯，放入磁子，将烧杯放置在电子天平上称量瓶重并记录；

2)在电子天平上准确称取50.00±1.00g的纯化水加入上述烧杯中；

3)在电子天平上依次准确称取二硫苏糖醇1.02g，柠檬提取物2.05g，海带提取物8.52g，氢氧化钠2.20g，磷酸氢二钾1.45g，氯化钾1.85g，氯化钠0.25g并全部加入上述烧杯中；

4)用移液器量取Proclin3000.25mL并加入上述烧杯中；

5)将上述烧杯定重至1000.00±1.00g；

6)将上述烧杯置于磁力搅拌器上室温混匀2小时，至所有组分完全溶解；

7)将配制好的释放剂用0.22μm的滤膜进行过滤，过滤后的缓冲液转入新的干燥的试剂瓶，置于2～8℃条件下保存。

5.一种如权利要求4所述的用于检测血清中叶酸含量的叶酸释放剂的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)试验前将所有试剂平衡至室温，全自动化学发光免疫分析仪开机预热30分钟,对全自动化学发光免疫分析仪进行基础维护，进行反应管的装载，配套试剂(底物液、清洗液)的添加，废液、废管的清理和液路灌注操作；

2)在全自动化学发光免疫分析仪操作界面装载叶酸试剂盒，并添加校准曲线与质控测试；

3)进行叶酸试剂盒的定标与质控测试，定标成功，高低值质控品测试合格后进行样本测试；

4)实验过程中全自动化学发光免疫分析仪先吸取30μL待测样本加入反应管中，然后吸取60μL叶酸释放剂加入反应管中，充分混匀后，转移至温育盘37℃条件下温育5min；

5)吸取叶酸检测试剂盒中的抗试剂A组分30μL加入到步骤4)温育好的反应管中，同时吸取抗试剂B组分30μL加入到步骤4)温育好的反应管中；充分混匀后，转移至温育盘37℃条件下继续温育15min；

6)全自动化学发光免疫分析仪对步骤5)温育后的反应物进行磁分离，将反应管转移至全自动化学发光免疫分析仪清洗区，吸取并加入300μL清洗液，充分混匀，清洗，重复3次，清洗后对反应物进行磁分离；

7)进行磁分离后的反应物，用加样针吸取并加入200μL全自动免疫检验系统用底物液，充分混匀后，放置在全自动化学发光免疫分析仪光感测试区，120秒后进行光信号检测；

8)血清样本中叶酸的含量与全自动化学发光免疫分析仪检测到的光信号成反比，全自动化学发光免疫分析仪通过试剂盒的定标信息以及样本测试的发光值自动拟合计算血清样本中的叶酸含量。