CN116732194A - 基于co1基因测序的通用引物及其在多细胞种属鉴别和交叉污染检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种基于CO1基因测序的通用引物及其在多细胞种属鉴别和交叉污染检测中的应用。所述通用引物序列为：CO1正向引物(CO1‑FP)：TGTAAAACGACGGCCAGTGCWGGAACWGGWTGAACAGT，SEQ ID NO：1，CO1反向引物(CO1‑RP)：CAGGAAACAGCTATGACARRTTRCGRTCTGTWARTAG，SEQ ID NO：2。该通用引物可通过CO1基因扩增后产物测序，实现生物制品中5个常用哺乳动物类细胞的种属鉴定，同时具有杂物种细胞检出能力。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种基于CO1基因测序的通用引物及其在多细胞种属鉴别和交叉污染检测中的应用。
背景技术
生产用细胞基质、治疗性细胞产品，在体外培养过程中细胞身份鉴定及交叉污染确认，是细胞质量控制的重要内容之一。如果细胞系发生错误鉴定或交叉污染，会导致实验结论错误、结果不可重复，给研究及生产造成严重困扰。因此，准确鉴定细胞系及排除交叉污染，是保证细胞系应用安全性的关键质控指标。
细胞种属鉴定和细胞交叉污染目前主要采用的是染色体核型检测法、同工酶谱检测法、PCR检测法等。与同工酶分析和核型学等传统方法相比，PCR检测法相对简单、快速、廉价，可用于高通量分析。PCR检测法常用的有种属特异性PCR、短串联重复序列(STR)、单核苷酸多态性(SNP)分析、DNA条形码检测法等。种属特异性PCR需要寻找每个种属中特异的基因片段进行扩增，根据这些基因分别单独设计引物，然后组合成多重PCR，扩增出不同大小的片段，最后根据电泳产物大小判断实验结果。这个方法特异性靶位寻找麻烦，多重扩增引物设计难度大，扩增条件优化复杂，结果只在大小上判断，不能分辨非特异性扩增。虽然STR和SNP分析可以检测种内细胞系和组织的交叉污染，但它们不能检测种间的交叉污染。
DNA条形码是一种通过检测代表整个基因组的标准化基因区域的序列变化来区分物种的工具。DNA条形码被称为通用产品代码，用于识别物种，是一种快速、可靠、经济的物种鉴定和发现工具。动物条形码区域是线粒体基因细胞色素C氧化酶亚基1(CO1)5'端附近的一个648碱基对(bp)片段，种属层面上具有保守性，所以能够通过COI来确定种属。目前CO1基因的检测方法主要有针对单种细胞的CO1进行引物设计然后扩增，产物进行跑胶或测序确认，也有用兼并引物扩增，产物采用酶切跑胶确认结果的。直接跑胶或酶切后跑胶确认结果，都只能从条带长度上进行分辨，并不知道实际序列，当物种COI序列同源性高的时候，容易出现假阳性判断。另外单个细胞的引物只能确认是否含有对应物种细胞，不能检测是否存在种属污染，需要多组引物进行多重扩增或分组扩增后才能实现杂细胞的检测，多重扩增引物设计难度大，扩增条件优化复杂，而多引物分组扩增试剂消耗大。兼并引物扩增产物起始序列不一致，产物存在测序困难问题，所以只能跑胶确认，而要同时实现专属性和交叉污染检测，在引物设计上需要控制各个种属细胞的扩增效率，否则很难实现交叉污染的检测。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中多重扩增引物设计难度大，扩增条件优化复杂，产物跑胶分析准确度低，兼并引物测序具有偏向性，杂细胞检测能力弱的缺陷，提供一种基于CO1基因测序的通用引物，该通用引物可通过CO1基因扩增后产物测序，实现生物制品中5个常用哺乳动物类细胞的种属鉴定，同时具有杂物种细胞检出能力。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种基于CO1基因测序的通用引物，所述通用引物序列为：CO1正向引物(CO1-FP)：
TGTAAAACGACGGCCAGTGCWGGAACWGGWTGAACAGT，SEQ ID NO：1，CO1反向引物(CO1-RP)：
CAGGAAACAGCTATGACARRTTRCGRTCTGTWARTAG，SEQ ID NO：2。
一种细胞种属鉴别和交叉污染检测的方法，该方法包括以下步骤：
S1、提取待测细胞样品的基因组DNA；
S2、以待测细胞样品的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的通用引物进行PCR扩增；
S3、对扩增产物直接进行一代测序；
S4、数据分析
将测序得到的结果在Boldsystems(http://www.boldsystems.org/index.php)网站中进行分析，得出序列与对应物种的匹配率，从而实现序列层面的细胞种属鉴定和种属交叉污染情况的确认；
如果测序结果是单一的峰，且跟数据库中对应物种的CO1基因匹配率≥98％，则样品判定为对应物种细胞，且无其它4种物种细胞的污染；
如果测序结果是重叠峰，则判定该细胞存在种属交叉污染；
所述方法能用于HEK293，Vero，BHK-21，CHO-K1，sp2/0细胞的种属鉴别和交叉污染检测，上述细胞依次对应的种属分别为Homo sapiens、Chlorocebus aethiops、Mesocricetus auratus、Cricetulus griseus、Mus musculus。
作为优选，所述S2中PCR扩增的反应体系为：
TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)12.5μL，CO1-FP(10μM)1μL，CO1-RP(10μM)1μL，50×ROX 0.5μL，无核酶水5μL，20ng/μL的样本5μL。
作为优选，所述S2中PCR扩增的反应程序为
阶段1：95℃，5min，1个循环；
阶段2：95℃，10s，60℃，40s，35个循环；
阶段3：60℃，1min，1个循环。
作为优选，S4中根据测序结果峰型是否单一，来判定是否含杂细胞；根据单一峰测序结果在数据库中比对到对应种属。
作为优选，S3中一代测序采用的测序引物是：
FP：TGTAAAACGACGGCCAGT，SEQ ID NO：3；
RP：CAGGAAACAGCTATGAC，SEQ ID NO：4。
一种用于细胞种属鉴别和交叉污染检测的试剂盒，该试剂盒包括本发明所述的通用引物。作为优选，该试剂盒还包括PCR反应缓冲液和DNA提取试剂中的至少一种。
本发明通过对HEK293，Vero，BHK-21，CHO-K1，sp2/0细胞色素酶I(COI)的保守区域设计一组能同时扩增上述5种代表五个种属(Homo sapiens、Chlorocebus aethiops、Mesocricetus auratus、Cricetulus griseus、Mus musculus)细胞的兼并引物，并在兼并引物的5’端加上不含兼并碱基的测序序列，保证测序引物没有偏向性，能够覆盖到所有产物。这样扩增产物能直接进行一代测序，将测序得到的结果在Boldsystems(http://www.boldsystems.org/index.php)网站中进行分析，得出序列与对应物种的匹配率，从而实现序列层面的细胞种属鉴定和种属交叉污染情况的确认。如果测序结果是单一的峰，且跟数据库中对应物种的CO1基因匹配率≥98％，则样品判定为对应物种细胞，且无其它4种物种细胞的污染。如果测序结果是重叠峰，则判定该细胞存在种属交叉污染。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明提供的这种方法覆盖度广，能够通过1组通用引物对生物制品中常用的哺乳类细胞进行种属鉴别及相互的种属间交叉污染检测；
2、本发明提供的这种方法对各细胞COI基因扩增后进行双向测序检测，能从序列层面对细胞物种进行确认，双向测序提供了准确度，本方法得到的结论精确度高；
3、本发明提供的这种方法会将测序得到的单一产物进入专业的COI数据库(Boldsystems)进行比对，得到具体的匹配率，数据具有量化标准；
4、本发明提供的这种方法样本使用量少，在测序之前对各物种标志性COI基因进行扩增，只需要100ng DNA就能在序列层面实现种属鉴别和交叉污染检测；
5、本发明提供的这种方法对扩增产物进行测序，比跑胶或酶切跑胶更简便，省去了复杂的酶切和跑胶过程，操作简单，效率高，能实现高通量检测。
附图说明
图1是使用本发明的通用引物对CHO-K1细胞扩增后的正反向测序结果；
图2是使用本发明的通用引物对Vero细胞扩增后的正反向测序结果；
图3是使用本发明的通用引物对SP2/0细胞扩增后的正反向测序结果；
图4是使用本发明的通用引物对BHK-21细胞扩增后的正反向测序结果；
图5是使用本发明的通用引物对HEK293细胞扩增后的正反向测序结果；
图6是使用本发明的通用引物对90％CHO-K1+10％Vero细胞扩增后的正反向测序结果；
图7是使用本发明的通用引物对90％CHO-K1+10％SP2/0细胞扩增后的正反向测序结果；
图8是使用本发明的通用引物对90％CHO-K1+10％BHK-21细胞扩增后的正反向测序结果；
图9是使用本发明的通用引物对90％CHO-K1+10％HEK293细胞扩增后的正反向测序结果；
图10是使用本发明的通用引物对100％CHO-K1细胞扩增后的正反向测序结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本发明，但不构成对本发明的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容(如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到)。
以下实施例中的试剂来源：
裂解液GHL，磁珠法通用型基因组DNA提取试剂盒，天根生物，DP705。
磁珠悬浮液GH，磁珠法通用型基因组DNA提取试剂盒，天根生物，DP705。
缓冲液GDZ，磁珠法通用型基因组DNA提取试剂盒，天根生物，DP705。
漂洗液PWD，磁珠法通用型基因组DNA提取试剂盒，天根生物，DP705。
洗脱缓冲液TB，磁珠法通用型基因组DNA提取试剂盒，天根生物，DP705。
TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)，TAKARA，RR820A。
实施例1设计能够同时扩增出多种哺乳类COI基因通用引物
利用美国国立生物技术信息中心(NCBI)的核酸数据库比对上述5种哺乳动物HEK293，Vero，BHK-21，CHO-K1，sp2/0的COI基因,依次代表Homo sapiens、Chlorocebusaethiops、Mesocricetus auratus、Cricetulus griseus、Mus musculus5个种属。COI基因具有物种保守性，筛选高度保守且具有特异性的区域，用引物设计软件Primer进行分析设计，筛选得到能同时扩增5个种属的细胞，且能检测10％上述杂细胞的引物。在设计得到的引物5’端加上测序序列，且不能影响目标靶位的扩增，加上测序序列的扩增引物为通用引物。
所述通用引物序列为：
CO1正向引物(CO1-FP)：
TGTAAAACGACGGCCAGTGCWGGAACWGGWTGAACAGT，SEQ ID NO：1，CO1反向引物(CO1-RP)：
CAGGAAACAGCTATGACARRTTRCGRTCTGTWARTAG，SEQ ID NO：2。
测序引物序列：
FP：TGTAAAACGACGGCCAGT，SEQ ID NO：3；
RP：CAGGAAACAGCTATGAC，SEQ ID NO：4
实施例2细胞种属鉴别和交叉污染检测的方法
实验主要流程：DNA提取、PCR扩增、一代测序，数据分析。
S1、DNA提取
1取1E6个细胞的细胞悬液样品加入至EP管，不到200μL的用水补齐至200μL。2加入20μL Proteinase K和350μL裂解液GHL。恒温振荡金属浴温度设置75℃，转数设置1,500rpm/min，裂解15-30min，直至样品中无团块存在。
3加入350μL异丙醇，振荡混匀10sec，加入15μL磁珠悬浮液GH，振荡混匀1min，共静置9min，每3min振荡混匀1min。
4将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。
5加入900μL缓冲液GDZ，振荡混匀2min；
6将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体；
7加入500μL缓冲液GDZ，振荡混匀2min；
8将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体；
9将离心管从磁力架上取下，加入900μL漂洗液PWD，振荡混匀2min。
10将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。
11将离心管从磁力架上取下，加入300μL漂洗液PWD，振汤混匀2min。
12将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。
13将离心管于磁力架上，室温晾干10-15min。
注意：乙醇残留会抑制后续的酶反应，所以晾干时要确保乙醇挥发干净。但也不要干燥太长时间，以免难以洗脱DNA。
14将离心管从磁力架上取下，加入100μL洗脱缓冲液TB，振荡混匀，置于56℃孵育10min，期间颠倒混匀3回，每回3-5次。
15将离心管放置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，小心将溶液转移至一个新离心管中，并于适当条件保存。
S2、PCR扩增
1、CO1引物体系准备
CO1正向引物(CO1-FP)：
TGTAAAACGACGGCCAGTGCWGGAACWGGWTGAACAGT，SEQ ID NO：1，CO1反向引物(CO1-RP)：
CAGGAAACAGCTATGACARRTTRCGRTCTGTWARTAG，SEQ ID NO：2，
根据引物探针合成说明书，将CO1正向引物(CO1-FP)、CO1反向引物(CO1-RP)用TEbuffer分别制备成10μM工作液备用。
2、核酸添加量为100ng每反应，将提取的核酸稀释成20ng/μL添加5μL至DNA反应体系中。DNA反应体系预混液的配制方案见表1。
表1：DNA反应体系预混液的配制方案
| 组分 | 1个反应(μL) |
| TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2X) | 12.5 |
| 正向引物CO1-FP(10μM) | 1 |
| 反向引物CO1-RP(10μM) | 1 |
| 50×ROX(Rhodamine X) | 0.5 |
| 无核酶水 | 5 |
| 总计 | 20 |
3、qPCR反应程序设置
qPCR反应程序设置如表2所示。
表2：qPCR反应程序
S3、一代测序与结果分析
将扩增得到的产物进行一代测序(Sanger测序)，测序引物FP：TGTAAAACGACGGCCAGT，SEQ ID NO：3；RP：CAGGAAACAGCTATGAC，SEQ ID NO：4。
一代测序最前和最后的信号不稳定，将结果前后各去掉30个碱基，在Boldsystems(http://www.boldsystems.org/index.php)网站中选择Identification选项，在AnimalIdentification(CO1)中勾选Species Level Barcode Records选项，将序列拷贝进序列框(下游引物的测序结果需要反向互补后再比对)，点击Submit进行分析。
结果判断
如测序结果是单一的峰，且跟数据库中对应物种的CO1基因匹配率≥98％，则供试品判定为对应物种细胞，且无其它4种物种细胞的污染。
如测序结果是重叠峰，则判定细胞中含有杂细胞。检查结果判断表见表3。
表3：检测结果判断表
应用例专属性和交叉污染检测能力验证
1、专属性试验验证
专属性是指检测目的细胞目标靶位的能力。对目的细胞扩增时能发生特异性的扩增，测序确认是单一目的基因序列，且在CO1数据库中能匹配到目的物种。本验证的目的是通过细胞色素酶CO1的基因序列，对供试品(细胞库样本或细胞收获液)进行细胞物种鉴别。
实验方案设计
取供试细胞提取后用扩增引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2进行扩增，然后利用上下游引物(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)进行测序，按照表4的试验设计进行实验。
表4：专属性实验方案设计
实验操作方法
参照实施例2细胞种属鉴别和交叉污染检测的方法。
可接受标准
无模板阴性对照和提取阴性对照未检出，CHO-K1、Vero、BHK-21、HEK293、SP2/0能特异性检出，且测序结果为单一峰，比对后为对应物种细胞。
专属性实验结果
专属性实验结果见表5。
表5.专属性实验结果
根据表5可知，结果显示设计的通用引物的扩增产物经过测序能得到单一峰，测序峰型图见图1、CHO-K1细胞正反向测序峰型结果；图2、Vero细胞正反向测序峰型结果；图3、SP2/0细胞正反向测序峰型结果；图4、BHK-21细胞正反向测序峰型结果；图5、HEK293细胞正反向测序峰型结果。正反向引物测序结果跟目标物种的匹配率都大于98％，所以通用引物扩增的产物通过测序和分析后能确定CHO-K1、Vero、SP2/0、BHK-21、HEK293细胞为对应种属结果Cricetulus griseus、Chlorocebus aethiops、Mus musculus、Mesocricetusauratus、Homo sapiens。测序序列如表6所述：
表6：专属性产物测序结果
2、交叉污染检测能力
本实验目的是考察CHO细胞中杂细胞的检测能力。
实验方案设计
在CHO细胞中分别添加10％的Vero、HEK293、BHK、SP2/0细胞。对混合细胞进行提取和扩增，然后利用上下游引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4进行测序，按照表7的试验设计进行。
表7：交叉污染实验方案设计
实验操作方法
参照实施例2细胞种属鉴别和交叉污染检测的方法。
交叉污染实验结果
交叉污染实验结果见表8。
表8交叉污染实验结果
表8结果显示，设计的通用引物在CHO-K1和10％的Vero、HEK293、BHK-21或SP2/0的交叉实验中，结果呈现为重叠峰。重叠峰意味着扩增产物中存在了不止一种细胞序列，如果是单纯的CHO-K1细胞呈现为单一峰，且数据库比对能比到对应物种Cricetulus griseus，测序序列见表9。测序的结果见图6、90％CHO-K1+10％Vero；图7、90％CHO-K1+10％SP2/0、图8、90％CHO-K1+10％BHK-21；图9、90％CHO-K1+10％HEK293；图10、100％CHO-K1。
表9：交叉污染实验中100％CHO-K1测序结果
综上，根据上述实验结果可知，本发明的通用引物能够实现CHO-K1、Vero、HEK293、BHK-21、SP2/0的种属鉴别，及能实现10％杂细胞的交污染检测。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
以上对本发明所提供的基于CO1基因测序的通用引物及其在多细胞种属鉴别和交叉污染检测中的应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (8)
1.一种基于CO1基因测序的通用引物，其特征在于所述通用引物序列为：
CO1正向引物(CO1-FP)：
TGTAAAACGACGGCCAGTGCWGGAACWGGWTGAACAGT，SEQ ID NO：1，CO1反向引物(CO1-RP)：
CAGGAAACAGCTATGACARRTTRCGRTCTGTWARTAG，SEQ ID NO：2。
2.一种细胞种属鉴别和交叉污染检测的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
S1、提取待测细胞样品的基因组DNA；
S2、以待测细胞样品的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的通用引物进行PCR扩增；
S3、对扩增产物直接进行一代测序；
S4、数据分析
对测序得到的结果进行分析，得出序列与对应物种的匹配率，从而实现序列层面的细胞种属鉴定和种属交叉污染情况的确认；
如果测序结果是单一的峰，且跟数据库中对应物种的CO1基因匹配率≥98％，则样品判定为对应物种细胞，且无其它4种物种细胞的污染；
如果测序结果是重叠峰，则判定该细胞存在种属交叉污染；
所述方法能用于HEK293，Vero，BHK-21，CHO-K1，sp2/0细胞的种属鉴别和交叉污染检测。
3.根据权利要求2所述的细胞种属鉴别和交叉污染检测的方法，其特征在于所述S2中PCR扩增的反应体系为：
TBGreenPremixExTaqII(TliRNaseHPlus)(2×)12.5μL，CO1-FP(10μM)1μL，CO1-RP(10μM)1μL，50×ROX0.5μL，无核酶水5μL，20ng/μL的样本5μL。
4.根据权利要求2所述的细胞种属鉴别和交叉污染检测的方法，其特征在于所述S2中PCR扩增的反应程序为阶段1：95℃，5min，1个循环；
阶段2：95℃，10s，60℃，40s，35个循环；
阶段3：60℃，1min，1个循环。
5.根据权利要求2所述的细胞种属鉴别和交叉污染检测的方法，其特征在于：S4中根据测序结果峰型是否单一，来判定是否含杂细胞；根据单一峰测序结果在数据库中比对到对应种属。
6.根据权利要求2所述的细胞种属鉴别和交叉污染检测的方法，其特征在于S3中一代测序采用的测序引物是：
FP：TGTAAAACGACGGCCAGT，SEQ ID NO：3；
RP：CAGGAAACAGCTATGAC，SEQ ID NO：4。
7.一种用于细胞种属鉴别和交叉污染检测的试剂盒，该试剂盒包括权利要求1所述的通用引物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包括PCR反应缓冲液和DNA提取试剂中的至少一种。
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2023
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