CN116731875B - 一种蛹虫草-贝母发酵菌质及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种蛹虫草‑贝母发酵菌质及其制备方法，属于微生物发酵技术领域。本发明制备方法包括如下步骤：(1)将贝母制成湿度范围为52％～61％的贝母发酵基质；(2)将蛹虫草菌种接种至所述贝母发酵基质中进行双向发酵，接种量为12‑33mL/100g，在15℃‑28℃下发酵6‑25d，获得蛹虫草‑贝母发酵菌质；所述蛹虫草菌种由如下方法制备获得：先活化，再在含0.1～1％贝母的培养基中培养。本发明将贝母用于蛹虫草菌种活化、和与蛹虫草进行双向发酵，获得具有高抗氧化能力且富含黄酮、多酚的蛹虫草‑贝母菌质，可作为保健食品、药品新原料。

Description

一种蛹虫草-贝母发酵菌质及其制备方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种蛹虫草-贝母发酵菌质，还涉及蛹虫草-贝母发酵菌质的制备方法。
背景技术
珍稀药用真菌蛹虫草是一种兼具食用和药用价值的优质大型真菌，除含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素等营养因子外,还含有虫草素、腺苷、多糖、黄酮等生物活性物质，具有增强动物机体免疫力、抗肿瘤、抗辐射、延缓衰老等多种生理功效，被广泛地应用于食品、医药、保健品中。贝母为百合科贝母属植物贝母的干燥鳞茎；现代研究表明，贝母具有优良的药用价值及营养价值，不仅是中药材的重要成分，同时也被批准作为保健食品的原料，用于功能性食品加工，是一种药食同源中药材。
贝母富含多糖、生物碱、核苷、氨基酸、甾醇、木脂素等活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌等功效。在功能食品及中药方剂中的应用中，贝母的炮制方法采用干燥处理，然后碾成粉体或者打成碎块后再进行添加使用，但是不同产地、不同品种的贝母中活性成分的含量及功效效果有所不同，同时贝母炮制方法简单，然而在煎药室的日常煎药过程中，会造成贝母的有效成分没有完全煎出，影响贝母的营养保健价值；此外，蛹虫草加工工艺过程中虫草素等活性成分的也存在尚未充分利用的现象。
中药双向发酵技术是以将药用真菌接种在中药基质上，发酵生产药用真菌的同时，产生的酶可催化中药的化学成分发生转化，提高或降低中药化学成分的的含量或产生新化合物，使发酵得到菌质的生物活性、毒性发生改变，或具备新的活性。例如，李慧星等人在《山药-蛹虫草双向发酵的抗氧化活性增效性》一文中研究发现山药-蛹虫草发酵体系在抗氧化活性方面具有增效性。尚愈在论文《蛹虫草SN-18固态发酵鹰嘴豆对其理化特性和功能活性的影响》中研究以蛹虫草为菌种，对鹰嘴豆进行固态发酵处理，发现蛹虫草SN-18发酵鹰嘴豆能产生丰富的微生物酶系，提高鹰嘴豆的自由基清除能力，增强抗氧化能力。但上述现有技术中未提及中药基质对于蛹虫草菌丝生长速度等方面的影响。
现有技术中也还未有公开以蛹虫草为发酵菌种、以贝母为发酵基质的进行双向发酵获得抗氧化活性的特色菌质的相关报道。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种蛹虫草-贝母发酵菌质及其制备方法。通过利用贝母活化培养蛹虫草，进一步促进蛹虫草生长、代谢；并不断优化蛹虫草-贝母双向发酵参数，提高对贝母、蛹虫草活性成分利用率，获得具有高抗氧化能力且富含黄酮、多酚的蛹虫草-贝母菌质，可作为保健食品、药品新原料。
本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种蛹虫草-贝母菌质的制备方法，包括如下步骤：
(1)将贝母制成湿度范围为52％～61％的贝母发酵基质；
(2)将蛹虫草菌种接种至所述贝母发酵基质中进行双向发酵，接种量为12-33mL/100g，在15℃-35℃下发酵6-25d，获得蛹虫草-贝母发酵菌质。
优选的，所述贝母为川贝母、平贝母、浙贝母、伊贝母、湖北贝母、土贝母中的任一种。
优选的，所述贝母为所述的浙贝母。
优选的，所述贝母的含水量为8％-12％。
优选的，步骤(1)中，所述控制湿度为为52％～61％的步骤具体包括：向贝母中加入氮源，获得混合粉，按料液比1：0.8-1.4加水。
在该步骤中，本发明人在实验过程发现中药材浙贝母粉可以当做一种优选中药材作为培养基配方组分之一。在浙贝母、山药、桑叶、茯苓、黄芪等备选中药材中，发现，在不同中药培养基上，以浙贝母培养基上的菌丝生长速度最快，也最为最为浓密、旺盛。
优选的，所述氮源为有机氮源或无机氮源，更有选的，为黑豆、花生、鱼粉、玉米浆、咖啡渣、鸡蛋壳、尿素中的任一种，最优选的，为黑豆。
优选的，所述料液比为1：1.0-1.4。
优选的，所述料液比为1：1.2。
优选的，所述贝母与氮源重量比为8-12：0.5-1.5。
优选的，所述贝母与氮源重量比为10：1-1.5。
优选的，所述贝母与氮源重量比为10：1。
优选的，步骤(2)中，所述蛹虫草菌种由如下方法制备获得：
先活化，再在含质量百分比为0.1～1％贝母的培养基中培养。
优选的，再在含质量百分比为0.2～8％贝母的培养基中培养。
优选的，再在含质量百分比为0.5％贝母的培养基中培养。
优选的，上述培养基还包括如下重量份组分：马铃薯150-250、葡萄糖15-25、蛋白胨4-6、酸二氢钾1-3、硫酸镁0.5-2、维生素B10.008-0.012、玉米粉0.5-1.5。
优选的，步骤(2)中，所述接种量为10-35mL/100g。
优选的，步骤(2)中，所述接种量为12-33mL/100g。
优选的，步骤(2)中，所述接种量为17.5-22.5mL/100g。
优选的，步骤(2)中，所述发酵温度为15-30℃。
优选的，步骤(2)中，所述发酵温度为19-30℃。
优选的，步骤(2)中，所述发酵温度为22℃。
优选的，步骤(2)中，所述发酵时间为10-25d。
优选的，步骤(2)中，所述发酵时间为10-20d。
优选的，步骤(2)中，所述发酵时间为20d。
另一方面，本发明还提供了一种根据上述蛹虫草-贝母菌质的制备方法制备的蛹虫草-贝母菌质。
另一方面，本发明还提供了蛹虫草-贝母菌质在制备高抗氧化产品中的应用；所述的产品包括食品、药品、化妆品、保健品。
优选的，所述食品包括饮品、调味品、乳制品、肉制品；所述化妆品包括护肤水、护肤乳、护肤霜、防晒霜；所述药品/保健品包括丸剂、颗粒剂、口服液。
另一方面，本发明还提供了一种含有上述蛹虫草-贝母菌质的保健品，所述保健品包括但不限于口服液、胶囊、粉。
另一方面，本发明还提供了一种提高菌质中活性物质含量的方法，所述方法包括将贝母用于蛹虫草菌种活化、菌种制备的步骤，将贝母和蛹虫草进行双向发酵的步骤。
另一方面，本发明还提供了一种贝母在蛹虫草发酵中的应用，具体是将所述贝母用于蛹虫草菌种活化，和/或，和蛹虫草进行双向发酵。
本发明提供的技术方案至少具有如下有益效果：
(1)贝母对蛹虫草菌株不仅具有显著的促生长作用，而且能显著提升蛹虫草菌丝合成虫草素等特征活性成分的能力。
本发明将蛹虫草菌种接种到含有中药材贝母的发酵培养基中培养，能够进一步增强蛹虫草菌丝的生长速度；根据实验结果可知，在浙贝母培养基上的菌丝日平均生长速度(0.498cm/d)明显高于五味子培养基(0.279cm/d)、三七培养基(0.287cm/d)、桑叶培养基(0.450cm/d)、西洋参培养基(0.327cm/d)等其它中药材培养基的菌丝日平均生长速度；
同时，本发明中浙贝母的添加，还进一步提高了蛹虫草菌丝中虫草素、黄酮等活性成分含量，能够将蛹虫草菌丝虫草素、黄酮、多糖含量分别从未添加浙贝母粉时的1.173μg/mL、0.007mg/mL、15.070mg/mL提升至1.7μg/mL、0.04mg/mL、16mg/mL左右。
(2)本发明利用贝母中富含蛋白质、淀粉、纤维素、矿物质元素、维生素等营养因子的特点，将药食同源的贝母作为珍稀食药用菌蛹虫草固态发酵的底物，能促进蛹虫草菌的生长、代谢，促进活性产物的产生；同时，蛹虫草的酶系可以降解贝母基质的细胞结构，促进贝母基质胞内活性成分的释放及转化，改变贝母基质中成分组成和空间结构，最终使得发酵后的贝母基质较发酵前基质有更强的抗氧化活性，发酵具有“双向性”。
(3)本发明将具有抗氧化、抑制肿瘤等功效的药食同源中药材及珍稀食药用菌有机结合，利用微生物发酵技术获得的发酵终产物，不仅包含了珍稀食药菌菌体蛋白，而且实现了黄酮、虫草素等功效成分的补充及含量的提高，提升了贝母中药材的利用价值，为贝母中药材的炮制提供了新方法、新途径。
(4)本发明采用的技术工艺具有工艺简单、易于工业化生产，所获菌质富含珍稀食药用菌菌体蛋白及抗氧化、抑制肿瘤等功效成分，有益于人们的身体健康。
附图说明
图1为不同中药材培养基上蛹虫草菌丝长势；
图2为料液比对基质上蛹虫草菌种长势的影响；
图中从左往右依次是料液比为1：1.4、1：1.2、1：1.0、1：0.8；时的菌种长势；
图3为料液比对菌质中成分的影响；
图4为温度对贝母发酵基质上蛹虫草菌种长势的影响；
图中从左往右依次是温度为19℃、22℃、25℃、28℃、30℃时的菌种长势；
图5为温度对菌质中主要活性成分的影响；
图6为接种量对蛹虫草菌种长势的影响；
图中从左往右依次是接种量为2.5、7.5、12.5、17.5、22.5、27.5、32.5mL/100g菌种长势；
图7为接种量对菌质中主要活性成分的影响；
图8为蛹虫草-贝母菌质中总糖及活性物质含量；
图9为实施例7蛹虫草-贝母菌质表观情况；
图10为实施例7蛹虫草-贝母菌质。
具体实施方式
为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
如未特殊说明，在以下实施方式中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1不同中药材对蛹虫草菌丝生长的影响
1.蛹虫草菌种活化及菌种培养
(1)活化培养基制备：使用PDA综合斜面培养基对蛹虫草菌种进行活化处理。所述PDA综合斜面培养基配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨3g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g、维生素B110mg、琼脂20g、水1000mL；按上述配比制作培养基后，分装于试管中，在121℃、25min条件下灭菌后摆成斜面、备用；
(2)菌种活化：然后将蛹虫草菌株接种到斜面培养基上，放置在18-25℃条件下培养5d，选择菌丝洁白、浓密、生长速度快的菌株作为蛹虫草菌种；
(3)平板培养基配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨3g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g、维生素B110mg、琼脂20g、水1000mL；按上述配比制作培养基后，在121℃、25min条件下灭菌，无菌倾倒至培养皿中制备呈平板培养基、备用；
(4)菌种扩繁：将活化好的蛹虫草新鲜斜面培养物接种至平板培养基中央，在22℃条件下倒置、避光培养，当蛹虫草菌丝布满平板培养基表面时终止培养，保存、备用。
2.不同中药培养基制备
(1)中药材前处理：将含水量为10％的不同的中药材用粉碎机粉碎，过100目筛，备用；
(2)中药培养基配置
培养基配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨3g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1.0g、维生素B110mg、中药材粉末0.5％、琼脂20g、水1000mL；按上述配比制作培养基后，分别在培养基中在121℃、25min条件下灭菌，无菌倾倒至培养皿中制备呈平板培养基、备用。
3、菌种培养
用无菌的打孔器，将步骤1中扩繁的蛹虫草菌株分割成约0.3cm2的小块，无菌接种于含有不同中药的固体平板培养基中央，在22℃条件下倒置、避光培养，观察菌丝长势、测量菌丝生长速度。
本实施例中蛹虫草菌种在不同中药材培养基上的长势如图1所示，生长速度见表1，其中，CK为蛹虫草菌种在未添加任何中药材的培养基中的长势。
表1 不同中药材对蛹虫草菌丝生长的影响
从表1、图1可知，蛹虫草在11种具有抗氧化、抗肿瘤药食同源中药材培养基上均可生长，但不同中药培养基上蛹虫草菌丝日生长速度、菌丝长势存在明显差异。其中，在菌丝生长速度方面，菌丝生长速度从快到慢的顺序为：浙贝母>山药>桑叶>CK>茯苓>黄芪>黑豆>甘草>绞股蓝>西洋参>三七>五味子；在菌丝长势方面，在浙贝母、黑豆、黄芪、西洋参、三七培养基上蛹虫草菌丝对照培养基浓密，以浙贝母培养基上的菌丝最为浓密、旺盛。可见，浙贝母对蛹虫草菌株具有显著促生长作用。
实施例2贝母不同添加量对蛹虫草菌丝生长及活性成分合成能力的影响
1.蛹虫草菌种的活化同实施例1。
2.不同贝母含量的蛹虫草菌种培养基制备
(1)按照实施例1中的中药材前处理方法，将含水量为8％-12％浙贝母用粉碎机粉碎，过100目筛，备用；
(2)不同贝母添加量的培养基配置
培养基配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨3g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1.0g、维生素B110mg、玉米粉1.0g、分别设置浙贝母粉添加量为质量百分比0.2％、0.5％、0.8％，水1000mL；按上述配比制作培养基后，分别在培养基中在121℃、25min条件下灭菌，无菌倾倒至培养皿中制备呈平板培养基、备用。
3、蛹虫草培养
将活化好的蛹虫草菌株接种到培养基中，在22℃、140r/min条件下恒温震荡培养5d；然后用纱布过滤、收集菌丝体，于55℃烘干、备用。
本实施例中蛹虫草菌丝体干重、活性成分含量如表2所示。
表2 浙贝母添加量对蛹虫草菌丝生长及特征活性成分含量的影响
名称 菌丝体干重/(g/100mL) 虫草素/（μg/mL） 黄酮/（mg/mL） 多糖/（mg/mL）
CK 0.355 1.173 0.007 15.070
浙贝母粉0.2% 0.329 1.705 0.041 16.117
浙贝母粉0.5% 0.646 1.703 0.045 16.628
浙贝母粉0.8% 1.001 1.649 0.026 15.038
由表2可知，蛹虫草液体菌种培养基中不同浓度的浙贝母对菌丝生长及特征活性成分的含量具有显著影响。其中，在菌丝生长方面，随着浙贝母含量增加，蛹虫草菌丝收率逐渐增加，当添加量达到0.5％以上时，菌丝体收率明显高于对照培养基；在特征活性成分方面，含有浙贝母液体培养基中蛹虫草菌丝体中虫草素、黄酮、多糖的含量显著高于对照培养基，且随着浙贝母添加量的增加，菌丝体中虫草素、黄酮、多糖的含量逐渐增加，当浙贝母添加量达到0.5％时，均达到较高水平。可见，浙贝母对蛹虫草菌株不仅具有显著的促生长作用，而且能显著提升蛹虫草菌丝合成虫草素等特征活性成分的能力，其液体菌种培养基中浙贝母最适添加量为0.5％。
因此，蛹虫草-贝母菌质最优的蛹虫草液体菌种驯化培养基配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、浙贝母粉0.5％、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1.0g、维生素B110mg、玉米粉1.0g；
进一步的，本发明又将该优化条件下获得的蛹虫草菌种作为发酵菌种，与贝母进行双向发酵，旨在进一步促进蛹虫草菌的生长、代谢，促进活性产物的产生，同时获得一种具有高抗氧化能力的菌质，具体见以下实施例。
实施例3蛹虫草-贝母菌质双向发酵-培养基料液比优化
1.蛹虫草菌种活化、蛹虫草菌种制备同实施例2。
蛹虫草菌种制备中的培养基配方为实施例2中优选出的含有浙贝母粉0.5％的培养基配方。
2.贝母发酵基质制备
(1)贝母前处理：将含水量为10％的贝母用粉碎机打碎成碎渣，过100目筛，备用；
(2)贝母发酵基质制备：从步骤(1)取20g贝母粉分装于50mL三角瓶等培养容器中，按照10：1的比例加入黑豆粉作为氮源补充，然后分别按照料液比(g/mL)为1：0.8、1：1.0、1：1.2、1：1.4的比例加入水，在121℃条件下灭菌40min，得到贝母发酵基质，冷却备用。
3.蛹虫草-贝母发酵菌质的制备
将步骤1制备蛹虫草菌种接种到的步骤2获得的贝母发酵基质中：按照12.5mL/100g接种量将蛹虫草菌种接种于贝母发酵基质表面，在19℃条件下避光发酵15d，获得蛹虫草-贝母发酵菌质。
4.虫草-贝母发酵菌质粉制备
在大于或等于65℃的条件下对菌质进行干燥、粉碎，获得蛹虫草-贝母发酵菌质粉。
图2为料液比对基质上蛹虫草菌种长势的影响；图中从左往右依次是料液比为1：1.4、1：1.2、1：1.0、1：0.8；图3为料液比对菌质中成分(总糖及活性物质含量)的影响。
由图2、图3可知，料液比显著影响蛹虫草菌种长势及菌质中黄酮、多酚、虫草素的含量。其中，在菌种长势方面，料液比为1:0.8的基质上的蛹虫草菌种长速最慢，在1:1.0-1:1.4料液比(g/mL)范围内，蛹虫草菌丝长势良好；在活性成分含量方面，随着料液比的增大，活性成分的含量呈先增加后降低的趋势，当接种量达到1:1.2时，虫草素(2.00mg/g)、黄酮(1.64mg/g)、多酚(3.91mg/g)的含量最高，当料液比大于1：1.2时，蛹虫草菌丝生长缓慢，菌质中黄酮、多酚、虫草素含量显著降低。可见，适宜的湿度有利于蛹虫草菌种生长，湿度过大，基质粘度增加，通气效果不良，抑制了蛹虫草菌丝的生长及次级代谢产物合成。综合考虑，蛹虫草-贝母菌质发酵最适料液比为1:1.2以此为参数，进行下一步实验。
实施例4蛹虫草-贝母菌质双向发酵-培养温度优化
1.蛹虫草菌种的活化及液体菌种制备
按照实施例3进行蛹虫草菌种的活化及液体菌种制备。
2.贝母发酵基质制备
(1)贝母前处理：同实施例3；
(2)贝母基质制备：分别从步骤(1)获得的贝母粉中取20g贝母颗粒分装于50mL三角瓶等培养容器中，按照10:1的比例加入黑豆粉作为氮源补充，然后按照量料液比为1：1.2(g/mL)的比例加入水，在121℃条件下灭菌40min，得到发酵基质，冷却备用。
3.蛹虫草-贝母发酵菌质的制备
将步骤2制备的发酵基质接种蛹虫草液体菌种：按照12.5mL/100g接种量将蛹虫草菌种接种于贝母基质表面，分别在19℃、22℃、25℃、28℃、30℃条件下发酵15d，获得蛹虫草-贝母发酵菌质。
4.蛹虫草-贝母发酵菌质粉的制备，同实施例3。
图4为温度对贝母发酵基质上蛹虫草菌种长势的影响；图中从左往右依次是温度为19℃、22℃、25℃、28℃、30℃时的菌种长势；
图5为温度对菌质中主要活性成分的影响。
从图4、图5可知，温度对贝母基质上蛹虫草菌种生长、主要活性物质的含量有明显影响。在19-25℃温度范围内，蛹虫草在贝母基质上长势均良好，然后随着培养温度的升高，蛹虫草菌丝长势逐渐变弱，生长速度显著下降；在活性成分积累方面，随着培养温度升高，黄酮、多酚、虫草素的含量呈先增加后降低的趋势，在22-25℃时均达到了较高水平，然后随着培养温度的升高，黄酮、多酚、虫草素的含量显著下降。可见，蛹虫草菌株的长势与活性成分的积累呈正相关，蛹虫草菌株在19-25℃温度范围内能很好生长，菌质中的黄酮、多酚、虫草素含量维持在较高水平，其中以22℃获得的菌质中黄酮(1.66mg/g)、多酚(4.15mg/g)、虫草素(1.98mg/g)含量最优。故蛹虫草-贝母菌质最佳培养温度为22℃，并以此为参数进行下一步实验。
实施例5蛹虫草-贝母菌质双向发酵-培养接种量优化
1.按照实施例3进行蛹虫草菌种的活化及液体菌种制备。
2.贝母发酵基质制备
(1)贝母前处理：同实施例3；
(2)贝母基质制备：分别从步骤(1)获得的贝母粉中取20g贝母颗粒分装于50mL，按照10:1的比例加入黑豆粉作为氮源补充，然后分别按照1：1.2的料液比(g/mL)加入水，在121℃条件下灭菌40min，得到发酵基质，冷却备用。
3.蛹虫草-贝母发酵菌质的制备
将步骤2制备的发酵基质接种蛹虫草液体菌种；按照2.5、7.5、12.5、17.5、22.5、27.5、32.5mL/100g的接种量，将蛹虫草菌种接种于贝母基质表面，在22℃条件下避光发酵15d时获得蛹虫草-贝母发酵菌质。
4.蛹虫草-贝母发酵菌质粉的制备，同实施例3。
图6为本实施例接种量对蛹虫草菌种长势的影响；图中从左往右依次是接种量为2.5、7.5、12.5、17.5、22.5、27.5、32.5mL/100g菌种长势；图7为接种量对菌质中主要活性成分的影响。
从图6、图7可知，接种量对菌种在基质上的生长速率及菌质中多酚、黄酮、虫草素的含量具有显著影响。实验范围内，随着接种量的增加，菌丝生长速度逐渐增快，基质中的虫草素、多酚、黄酮的含量也随之增加，当接种量达到在17.5mL/100g时，蛹虫草菌丝生长速率达到了较好的水平，此时菌质中多酚(4.11mg/g)含量达到峰值，黄酮(1.88mg/g)、虫草素(1.83mg/g)含量达到较高水平，然后随着接种量的增加，菌丝生长速率趋于稳定，菌质中多酚含量呈小幅度下降趋势，而虫草素、黄酮的含量呈小幅度的上升趋势，当接种量为22.5mL/100g时，多酚含量3.99mg/g，黄酮、虫草素含量达到峰值，分别为2.00mg/g、2.18mg/g；然后随着接种量的增加多酚、黄酮、虫草素菌呈小幅度下降趋势，这是由于，接种量除影响菌种的繁殖速率外，还直接影响培养基质中的湿度，接种量过大，基质中湿度增加，基质的通气性变差，减弱了蛹虫草菌株分解基质的能力，进而影响了活性物质的合成能力。故选择最适合的接种量为17.5-22.5mL/100g，并以此为参数进行下一步实验。
实施例6蛹虫草-贝母菌质双向发酵-发酵周期优化
1.按照实施例3进行蛹虫草菌种的活化及液体菌种制备。
2.贝母发酵基质制备，同实施例5。
3.蛹虫草-贝母菌质的制备
将步骤2制备的发酵基质接种蛹虫草液体菌种：按照17.5mL/100g接种量将蛹虫草菌种接种于贝母基质表面，在22℃条件下避光发酵；以未接种的发酵基质为对照(0d),分别在6d(蛹虫草菌丝长满半瓶)、10d(菌丝布满发酵基质)及15d、20d、25d时获得蛹虫草-贝母发酵菌质。
4.蛹虫草-贝母发酵菌质粉的制备，同实施例3。
本实施例所得蛹虫草-贝母菌质中总糖及活性物质含量如图8所示：
由图8可知，与为发酵的基质对照相比，随着培养时间的延长，基质中的总糖含量显著下降，黄酮、多酚、虫草素呈增加趋势，显著高于未发酵的贝母基质，这是由于蛹虫草在发酵过程中分解利用了山药中总多糖等营养成分，代谢合成了多酚、黄酮、虫草素等活性成分。其中在0-15d培养期限内，菌质中的黄酮、多酚、虫草素的含量显著增加，当培养至15d时达到较高水平，黄酮、多酚、虫草素的含量分别为1.98mg/g、4.16mg/g、2.08mg/g，然后随着培养时间的延长菌质中的黄酮、多酚含量呈小幅度增加趋势，而虫草素含量继续呈显著增加趋势，当培养时间达到20d时，黄酮、多酚、虫草素含量分别达到了2.02mg/g、4.21mg/g、2.63mg/g，后随着培养时间的延长除菌质中的黄酮、多酚、虫草素含量趋于稳定，维持在较高的含量水平。综合考虑，蛹虫草-贝母基质最佳培养周期为20d，并作为优化条件进行下一步实验。
实施例7优化条件下菌质制备及双向发酵效果分析
1.按照实施例3进行蛹虫草菌种的活化及液体菌种制备。
2.贝母发酵基质制备
(1)贝母前处理：同实施例3；
(2)贝母基质制备：分别将20g贝母颗粒分装于50mL三角瓶等培养容器中，按照10:1的比例加入黑豆粉作为氮源补充，然后分别按照1：1.2的料液比(g/mL)加入水，在121℃条件下灭菌40min，得到发酵基质，冷却备用。
3蛹虫草-贝母发酵菌质的制备
将步骤1制备的发酵基质接种蛹虫草液体菌种；按照17.5mL/100g接种量将蛹虫草菌种接种于贝母基质表面，在22℃条件下避光发酵，当菌丝吃满基质后给予300勒克斯的散射光照继续培养，发酵20d时终止发酵，获得蛹虫草-贝母发酵菌质。
4.蛹虫草-贝母发酵菌质粉的制备，同实施例3。
本实施例所得蛹虫草-贝母菌质的表观情况见图9，图10为本实施例获得的蛹虫草-贝母菌质；主要活性成分含量及抗氧化活性见表3。
表3实施例7蛹虫草、贝母菌质中主要活性物质含量
从表3看出，优化条件下，利用蛹虫草菌株对贝母进行发酵后，贝母基质中总多糖含量明显下降，说明基质中的总多糖为蛹虫草菌株生长提供了营养条件；在活性成分、抗氧化活性方面，发酵后的基质中不仅富含蛹虫草特色成分虫草素(1.92mg/g)，而且所获菌质中黄酮、多酚的含量、总抗氧化活性及对DHHP自由基清除能力均优于未发酵的贝母基质。其中蛹虫草-贝母菌质粉的黄酮的含量提高了2.36倍，多酚的含量提高了6.17倍，总抗氧化活性提高了2.02倍，DPPH自由基清除能力提升了5.02倍。由此说明，本发明制备的蛹虫草-贝母菌质比未发酵贝母基质具有更好的药用、保健价值及抗氧化活性，可作为保健食品、药品新原料。
综上，本发明结合贝母原料药食同源的特性，经过物理破碎后作为蛹虫草菌丝生长代谢提供营养物质，蛹虫草的酶系能够改变贝母成分组成和空间结构，显著提升了贝母中黄酮、多酚、虫草素等功效成分的含量及抗氧化活性。本发明开发了贝母新的炮制方法及新的应用途径。
需要说明的是，上述实施例仅仅是实现本发明的优选方式的部分实施例，而非全部实施例。显然，基于本发明的上述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例，都应当属于本发明保护的范围。

Claims (22)

1.一种蛹虫草-贝母菌质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将贝母制成湿度范围为52%~61%的贝母发酵基质；
（2）将蛹虫草菌种接种至所述贝母发酵基质中进行双向发酵，接种量为12-33mL/100g，在15℃-28℃下发酵6-25d，获得蛹虫草-贝母发酵菌质；
所述贝母为浙贝母。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述蛹虫草菌种由如下方法制备获得：
先活化，再在含质量百分比为0.1~1%贝母的培养基中培养。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述培养基还包括如下重量份组分：马铃薯150-250、葡萄糖15-25、蛋白胨4-6、磷酸二氢钾1-3、硫酸镁0.5-2、维生素B1 0.008-0.012、玉米粉0.5-1.5。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，发酵时间为10-25d。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，发酵时间为10-20d。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，控制湿度为52%~61%的步骤具体包括：
向贝母中加入氮源，获得混合粉，按料液比1：0.8-1.4加水。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述贝母的含水量为8-12%。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述氮源为有机氮源或无机氮源。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述氮源为黑豆、花生、鱼粉、玉米浆、咖啡渣、鸡蛋壳、尿素中的任一种。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述氮源为黑豆。
11.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述贝母与氮源重量比为8-12：0.5-1.5。
12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，控制湿度为52%~61%的步骤具体包括：
向贝母中加入氮源，获得混合粉，按料液比1：1.0-1.4加水。
13.如权利要求1-12任一项中所述方法制备的蛹虫草-贝母菌质。
14.如权利要求13所述蛹虫草-贝母菌质在制备抗氧化产品中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述产品包括食品、药品、化妆品、保健品。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述食品包括饮品、调味品、乳制品、肉制品。
17.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述化妆品包括护肤水、护肤乳、护肤霜、防晒霜。
18.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述药品，和/或，所述保健品包括丸剂、颗粒剂、口服液。
19.含有如权利要求13所述蛹虫草-贝母菌质的保健品。
20.根据权利要求19所述的保健品，其特征在于，所述保健品包括口服液、胶囊、粉。
21.一种提高菌质中活性物质含量的方法，其特征在于，所述方法包括将贝母用于蛹虫草菌种活化、菌种制备的步骤，将贝母和蛹虫草进行双向发酵的步骤；
所述贝母为浙贝母。
22.贝母在蛹虫草发酵中的应用，其特征在于，所述贝母用于蛹虫草菌种活化，和/或，和蛹虫草进行双向发酵；
所述贝母为浙贝母。
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