CN116731144A - 一种重组大米抗氧化肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组大米抗氧化肽及其制备方法和应用。该重组大米抗氧化肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明将重组大米肽的抗氧化肽的基因序列插入pPICZα‑A载体，转入毕赤酵母GS115宿主细胞中，获得高效表达重组抗氧化肽酵母菌株，并将验证成功的阳性克隆菌株采用甲醇进行诱导表达，对最终的上清产物进行鉴定，并进行活性、稳定性及应用的研究。本发明得到的重组大米抗氧化肽具有很强的抗氧化作用，能够高效清除自由基，并且受温度、pH及酶的影响较小，稳定性较好，可以延缓食物腐烂变质，在食品保鲜、医药等方面有较好的应用前景。

Description

一种重组大米抗氧化肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组大米抗氧化肽及其制备方法和应用。

背景技术

研究表明，自由基的含量与机体的各种疾病密切相关，比如肿瘤、糖尿病、心脑血管疾病等。抗氧化剂可以有效地清除体内的自由基，从而减少体内自由基的含量，保护体内的生物大分子，同时可以促进身体免疫反应，提高机体抵抗外界病毒和细菌的能力，增加免疫细胞的活性，增强免疫力，抑制病菌的增殖，减少感染性疾病的发生。因此，抗氧化剂已经成为治疗慢性疾病的重要药物之一。目前常用的抗氧化剂包括BHT、BHA等，主要作用是抑制食物中蛋白质的降解，防止蛋白质被氧化；以及抑制脂肪的降解及氧化。但是这些抗氧化剂都有一定的毒副作用，它们可能会导致胃肠道不适、消化不良、头痛、过敏反应等。因此，它们在食品和药品中的应用受到限制。而天然抗氧化剂则由于其来源广泛、具有较高的抗氧化活性和安全性等特点，正逐渐成为食品工业领域中一种重要的抗氧化剂。通过蛋白质水解制得的多肽具有很好的抗氧化作用，可以有效地清除体内多余的自由基，从而达到抗氧化的目的。天然的植物多肽是目前的研究热门之一，如大米肽。

对大米肽已有的研究表明：大米肽具有良好的溶解性，能够改善大米蛋白质的不良性质，并且表现出许多优良的特性，例如具有高浓度、低粘度等特性。利用此性质可以将其应用于普通营养食品，如高蛋白流体食品，并可以提供良好的营养和口感。此外，大米肽还具有多种生理活性，如易消化吸收、降血压、抗氧化活性等，这些特性都可用于食品的添加剂、婴幼儿食品基料、保健食品的开发、食品保鲜等。同时，大米肽还可以用来开发新型饮品，比如强化营养，调节血压，增强免疫力等。大米肽不仅具有高生物活性，而且易于消化吸收，有助于提高人们的健康水平，因此在新型饮品中具有很大的应用前景。随着科技的发展和人们对健康的重视，大米肽作为一种食品和药物的天然来源将会展现出更广泛的应用前景。

开发大米蛋白主要产品形式有：改善大米蛋白的功能性并用作食品添加剂；制取高蛋白营养粉(蛋白含量80%以上)和具有特殊功能生物活性肽等。但是，水稻中的大米肽合成工艺存在产量低、成本高、不能满足要求等缺点，这是因为大米肽合成工艺的产物产量极低，而且成本也较高，这使得它无法满足实际的需求。此外，大米肽的大规模表达主要依赖于基因工程技术，这不仅可以节省时间，而且还可以节省大量资金，同时也能够获得更多需求量大的大米蛋白。

然而利用生物自身合成大米肽的方法合成率低，传统的天然提取抗氧化肽的方法效率低下，存在产量低、成本高等缺点，会消耗大量财力，这使得它无法满足实际的需求。大米肽的大规模表达主要依赖于基因工程技术，通过原核或真核系统进行大量表达，这不仅可以节省时间，而且还可以节省大量资金，同时也能够获得更多需求量大的大米肽。但是采用毕赤酵母高效表达大米抗氧化肽的相关技术在国内外未见公开报道和使用。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种重组大米抗氧化肽及其制备方法和应用。本发明将重组大米抗氧化肽基因序列插入pPICZα-A载体中，然后转入毕赤酵母GS115宿主细胞中，获得高效表达重组抗氧化肽酵母菌株，并将验证成功的阳性克隆菌株采用甲醇进行诱导表达，对最终的上清产物进行鉴定，并进行活性、稳定性及应用的研究。得到的重组大米抗氧化肽具有很强的抗氧化作用，能够高效清除自由基，延缓食物腐烂变质。

本发明的技术方案是：

本发明提供一种重组大米抗氧化肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供一种编码上述重组大米抗氧化肽的基因的核苷酸序列，如SEQ IDNO:2所示。

相应的，本发明提供包含上述重组大米抗氧化肽的基因的重组载体、重组菌株以及表达上述重组大米抗氧化肽的方法。

本发明提供了包含上述的重组大米抗氧化肽基因的重组载体，所述载体优选为pPICZα-A；本发明中所采用的pPICZα-A为分泌型的表达载体，含有可受甲醇调控的醇氧化酶启动子，载体上含有α分泌信号，可进行外源重组大米抗氧化肽的表达。

本发明还提供了包含上述重组载体的高效表达重组大米抗氧化肽的酵母菌株，优选菌株为毕赤酵母GS115。

进一步地，所述的高效表达重组大米抗氧化肽的酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：

S1、将如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列连接于pPICZα-A载体上构成重组载体pPICZα-抗氧化肽-A；

S2、用Sac I内切酶将步骤S1所得的重组载体pPICZα-抗氧化肽-A进行线性化，然后用热击法转入到毕赤酵母GS115中，再用含有博来霉素的YPD平板培养基筛选转化成功的阳性克隆菌株即重组酵母菌株，并且提取菌体DNA，通过PCR鉴定，确定重组大米抗氧化肽基因已成功构建到pPICZα-A载体上，即本发明的重组大米抗氧化肽的酵母菌株构建成功。

更进一步地，所述步骤S1中的SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的合成方法为：

将如SEQ ID NO:3所示的大米抗氧化肽原始序列根据酵母表达系统偏好性进行密码子优化，在N端依次加入EcoR I酶切位点，起始密码子ATG，6个组氨酸标签，C端依次加入终止密码子TAA及Xba I酶切位点获得。

本发明还提供了一种高效表达上述重组大米抗氧化肽的方法，所述重组大米抗氧化肽的制备方法如下：

将上述所得的重组大米抗氧化肽的酵母菌株进行诱导表达，先在BMGY培养基中进行发酵培养，当OD值扩增到6~10时，转换为BMMY培养基，每隔24小时补充100%甲醇进行诱导表达，使甲醇在培养基中的最终浓度为1.5%（体积百分比）直至120 h培养结束，然后收集发酵液的上清液，即得重组大米抗氧化肽，该抗氧化肽为分子量为10 kDa。

对采用本发明提供的重组大米抗氧化肽的制备方法制得的重组大米抗氧化肽进行鉴定，并进行活性、稳定性及应用的研究，可以发现，得到的重组抗氧化肽具有很强的抗氧化作用，能够高效清除自由基，延缓食物腐烂变质。

进一步地，本发明获得的重组大米抗氧化肽特征如下：

抗氧化性：本发明制得的重组大米抗氧化肽对DPPH自由基具有较好的清除作用，在37℃下反应30 min时，其清除率为92.0%，反应1 h时其清除率为98.0%。

温度稳定性：将本发明制得的重组发明抗氧化肽分别在4℃，25℃，37℃，60℃和90℃条件下处理1 h，其抗氧化能力在90℃条件下效果较弱，DPPH自由基的清除率为92.12%，仍具有较强的抗氧化能力。

pH稳定性：将本发明制得的重组发明抗氧化肽分别在pH为2、4、7、10、14的PBS缓冲液中于37℃条件下处理4 h，在pH为2和14时效果较弱，但仍有较强的抗氧化性能。

酶稳定性：重组抗氧化肽分别在胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶条件下，于37℃处理2 h，各组抗氧化性无明显差异。

综上所述，本发明提供的重组大米抗氧化肽的温度稳定性、pH稳定性及酶稳定性效果较高。

因此，本发明还提供了一种所述的重组大米抗氧化肽在制备具有抗氧化作用的食品、药品、保健品及食品添加剂中的应用。

更进一步地，在食品中添加本发明制得的重组大米抗氧化肽，可以显著提高该食品的保质期，有效提高食物的抗腐败能力，从而改善运输和储存条件。因此，本发明制得的重组大米抗氧化肽可以用于作为制备食品保鲜剂的原料。

进一步地，本发明利用巴斯德毕赤酵母（Bacillus pseudomonas putida）得到的重组大米抗氧化肽，这种表达体系有如下优势：(1)在毕赤酵母表达载体pPICZα-A上存在醇氧化酶启动子，可受甲醇调控。(2)毕赤酵母对营养的需求量很低，价格便宜，并且它的产量很高，它所产的大米肽可以分泌到胞外，不像原核载体那样需要破壁，这给操作者带来了很大的方便，它分泌的蛋白也大多是目的蛋白，容易纯化。(3)毕赤酵母的遗传性状比较稳定，不容易丢失基因，还可以对翻译后的基因进行糖基化、蛋白磷酸化等修饰，使修饰后的肽具有活性。

本发明对大米抗氧化肽原始序列进行了改造，在原氨基酸的基础上添加了6个组氨酸标签，便于对表达出的抗氧化肽进行检测和纯化。重组后，将构建的目的基因通过热击法导入毕赤酵母细胞中。通过博来霉素进行了初步的抗性筛选后，首次获得所需的高效表达重组抗氧化肽阳性酵母菌株。本发明以毕赤酵母作为表达载体，采用甲醇作为毕赤酵母唯一碳源，对其进行诱导表达并亲和纯化，获得高效表达的重组大米抗氧化肽，并对其稳定性以及抗氧化性能进行了研究，结果表明，该酵母菌株表达出来的蛋白稳定性较好，并且可以有效清除自由基，可以应用于制备具有抗氧化作用的食品、药品、保健品及食品添加剂中，以及制备用于延缓海产品的腐败变质的产品中。

与现有技术相比，本发明提供的重组大米抗氧化肽及其制备方法和应用具有以下优势：

（1）本发明成功构建出一种高效表达重组抗氧化肽酵母菌株。通过毕赤酵母诱导表达获得重组大米抗氧化肽的含量为14 μg/mL，比通过大肠杆菌诱导表达获得的重组大米抗氧化肽含量（1.5 μg/mL）显著增加。

（2）本发明通过诱导表达获得重组大米抗氧化肽，具有优异的抗氧化作用，可以高效清除自由基，清除率高达98%。

（3）本发明中毕赤酵母表达体系可高效表达外源蛋白，在发酵液上清中抗氧化肽的含量高达14 μg/mL，有利于抗氧化肽未来的工业化生产。

（4）本发明首次将抗氧化肽的基因克隆到毕赤酵母内，在毕赤酵母中表达抗氧化肽，该方法与人工提取方法和化学合成方法相比，操作简单、成本低。通过毕赤酵母表达获得的抗氧化肽纯度高，不需要再进行二次纯化，并且表达量远高于工业提取。

（5）本发明提供的重组大米抗氧化肽稳定性较好，保鲜效果优良，在农业、畜牧业、医药、食品中均有应用前景。

附图说明

图1为重组大米抗氧化肽基因的PCR跑胶示意图；其中，M为DNA Marker，1为pGAPZα-A空载体；2为阳性对照；3为成功构建的含有本发明实施例1制得的重组大米抗氧化肽基因的重组载体pPICZα-抗氧化肽-A；

图2为重组大米抗氧化肽Western blot示意图；其中M为蛋白质Marker；1为本发明实施例2制得的重组大米抗氧化肽；

图3为重组大米抗氧化肽温度稳定性实验示意图；

图4为重组大米抗氧化肽pH稳定性实验示意图；

图5为重组大米抗氧化肽酶稳定性实验示意图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的保护范围之内。

以下实施例中，未作特别说明的试剂为常规试剂，均可在常规试剂生产销售公司购买，所用方法，如无特殊说明，均为现有技术，部分原料生产厂家等信息如下：

毕赤酵母GS115，产品编号：D0412；内切酶EcoR I，产品编号：D6329；内切酶Sac I，产品编号：D6593，均购自上海碧云天生物技术有限公司；

大肠杆菌XL10-Gold化学感受态细胞，货号：YB140431-10；酶切缓冲液，货号：YB180701，均购自上海钰博生物科技有限公司；

pPICZα-A载体，购自Invitrogen公司（美国）；

YPD培养基，货号：VWRC1B1493-1L；LB培养基，货号：PM20174，均购自上海怡淼化学科技有限公司；

YPG培养基，货号：T2605，购自上海嘉楚生物工程有限公司；

BMMY培养基，货号：LM84080；高保真酶，货号：LM0036，均购自上海联迈生物工程有限公司；

胃蛋白酶，CAS号：9001-75-6；木瓜蛋白酶，CAS号：9001-73-4；蛋白酶K，CAS号，39450-01-6、胰蛋白酶，CAS号：9002-07-7，均购自上海源叶生物科技有限公司。

实施例1、重组大米抗氧化肽基因的合成与高效表达重组大米抗氧化肽的酵母菌株的构建

1.重组大米抗氧化肽基因的合成和基因表达载体的构建：

（1）重组大米抗氧化肽基因序列合成：

选择原始抗氧化肽序列，如SEQ ID NO:3所示，根据酵母表达系统偏好性进行密码子优化，在N端依次加入EcoR I酶切位点，起始密码子ATG，6个组氨酸标签，C端依次加入终止密码子TAA及Xba I酶切位点，获得重组大米肽抗氧化基因，如SEQ ID NO:2所示。该序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成。将合成的基因序列和pPICZα-A载体分别经EcoR Ⅰ/Xba I双酶切，将合成的目的基因连接到pPICZα-A载体得到重组载体pPICZα-抗氧化肽-A。

SEQ ID NO:2：

ATGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTGTTCCATCTGCTGTTTCTAGAAACATGACTAGATCTAGATTGGCTTCTCAACATTTGGTTGCTATTTTGGATCCACCAAGAGGTGTTCCATCTGCTGTTTCTAGAAACATGACTAGATCTAGATAA。

SEQ ID NO:2对应的的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MGSHHHHHHGVPSAVSRNMTRSRLASQHLVAILDPPRGVPSAVSRNMTRSR。

所述的原始抗氧化肽序列如SEQ ID NO:3所示：

GVPSAVSRNMTRSRLASQHLVAILDPPRGVPSAVSRNMTRSR。

（2）重组大米抗氧化肽基因扩增及验证：

将上述所得的重组载体pPICZα-抗氧化肽-A转入大肠杆菌XL10-Gold化学感受态细胞中，挑取多个单菌落，并转移至30 mL LB培养基中进行扩增培养，37℃培养12 h。然后用质粒中提试剂盒（购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司）提取质粒。将提取出的质粒经1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

2.高效表达重组大米抗氧化肽的酵母菌株的构建及PCR验证：

将实施例1中测序验证正确的质粒，经Sal I酶切线性化后，然后用热击法转至毕赤酵母GS115细胞中，并进行PCR验证。

（1）质粒线性化：

用内切酶Sac I将环形质粒线性化，反应体系及条件如下：

酶切体系(50 μL)：质粒：取35 μL；10×酶切缓冲液:取5 μL；ddH₂O: 取7 μL；SacⅠ: 取3 μL。

按照上述顺序依次添加试剂并混合均匀，之后瞬时离心13000 rpm，将反应体系置于37℃培养箱中进行过夜酶切。

（2）酵母转化：

将上述线性化后的质粒采用普因特生物工程有限公司的毕赤酵母酵母感受态制备及转化试剂盒转化至毕赤酵母GS115细胞中：

①取一支无菌ep管，依次加入预冷的上述制得的线性化质粒15 μL，酵母促转化剂5 μL，100 μL GS115感受态细胞，毕赤酵母转化液500 μL，轻轻翻转6-8次，使其混合均匀；

②在30℃水浴30 min，每15 min轻轻翻转6-8次，使其混匀；

③在ep管中加入20 μL的二甲基亚砜，轻轻翻转6-8次，使其混合均匀；

④42℃水浴15 min，每7.5 min轻轻翻转混匀6-8次；

⑤12000 rpm瞬时离心，弃去上清，ep管中加1 mL的YPG培养基在30℃条件下复苏1h；

⑥12000 rpm瞬时离心，弃去上清，取100 μL 0.9% NaCl 重悬，混合均匀，涂板，30℃培养3-7 d；

⑦挑取不同的单菌落在含有30 μg/mL博来霉素的YPD平板培养基上进行活化，筛选转化成功的阳性克隆菌株。

（3）PCR验证：

采用诺唯赞质粒提取试剂盒提取筛选得到的阳性克隆菌株的基因组DNA，并以此为模板，选择毕赤酵母的通用引物进行PCR鉴定，结果如图1所示，其中，1为pGAPZα-A空载体，2为阳性对照，3为本发明成功构建的含有本发明实施例1制得的重组大米抗氧化肽基因的重组载体pPICZα-抗氧化肽-A。图1表明，本发明的重组载体pPICZα-抗氧化肽-A成功载人毕赤酵母GS115的基因组中：

①PCR扩增体系：

总体系50 μL：2×PCR buffer 25 μL，dNTP Mix 1 μL，6-his-up 2 μL，引物 2 μL，模板 2 μL，高保真酶 1 μL，ddH₂O 17 μL；

PCR反应参数为：94℃预变性5 min；94℃变性1min，56℃退火1 min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10 min。

②PCR产物回收：

用1%琼脂糖凝胶进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外照射下切胶，并用胶回收试剂盒(购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司)进行DNA回收，并继续用上述凝胶电泳检测回收状况。

实施例2 重组酵母的诱导表达

挑取实施例2所得的阳性克隆菌株于25 mL的BMGY培养基(2％蛋白胨，1％酵母提取物，10 mM磷酸钾缓冲液(pH=6.0)，1.34％YNB，0.004％生物素，1％甘油)中，在30℃的培养箱中以220 rpm的转速进行培养，直到OD 600达到8.0-10.0，3000 rpm离心5分钟，将菌体收集起来，用无菌水冲洗两次，3000 rpm离心5分钟，用BMMY培养基将其重新悬浮，放入30℃，220 rpm的摇床中进行诱导表达；每隔24小时抽取一次样品，并加入滤膜除菌的100%甲醇溶液，直至最终浓度为1.5%(体积百分比)，持续培养120小时获得目标产物重组大米抗氧化肽。

收集上述表达上清液8000 rpm离心5 min，取30 mL用冷冻干燥机制成冻干粉。

进一步地，采用ELISA法测定目的蛋白含量—取上述发酵液上清用包被液(15 mMNa₂CO₃，35 mM NaHCO₃，pH=9.6)稀释20倍，取200 μL加入96孔板中，4℃过夜包被，PBST溶液清洗3次。用5％PBST-牛奶溶液37℃孵育1 h封闭特异性结合位点，PBST溶液（将0.1M PBS稀释10倍，取50 mL加25 μL Tween50，可配置200 mL）清洗3次。一抗使用his-tag，稀释2000倍，每孔加入100 μL，37℃孵育1.5 h，用PBST溶液清洗3次。二抗使用HRP-Goat-anti-mouse，稀释5000倍，每孔加入100 μL，37℃孵育1.5 h，用PBST溶液清洗3次。每孔加入150 μL TMB显色液，室温避光显色30 min，加入50 μL终止液(0.5 M H₂SO₄)终止反应，使用酶标仪测定OD 450值，代入标曲公式，计算目的蛋白浓度值，得本发明实施例2制得的重组酵母的诱导表达得到的重组大米抗氧化肽的表达量为14 μg/mL。

实施例3 重组大米抗氧化肽的性能检测

1.Western blot（蛋白免疫印迹）检测：

取实施例2所得的冻干粉，经Tricine胶电泳后，电转至PVDF膜上，顺序为海绵、4层滤纸、PVDF膜、胶、4层滤纸、海绵。放入电泳槽，用冰块降温。350 mA 1 h。转膜完成后，正面朝下，在1×PBST溶液中摇5 min，洗脱1次，封闭1h，封闭液配方(1.25g脱脂牛奶，25 mlPBST)。25ml PBST洗脱3次，每次10 min。一抗孵育过夜，用PBST洗3次，每次10 min 再将膜转移到二抗溶液(HRP辣根过氧化物酶，碧云天生物技术有限公司)中，室温孵育1 h，PBST洗脱3次，每次10min。用ECL显色(A:B=1:1)，并曝光拍照。ECL每次用量大约600 μL。照前用PBST润湿并赶走气泡。得图2，图2为重组大米抗氧化肽Western blot示意图。

由图2可知，图2中泳道1为本发明实施例2制得的重组大米抗氧化肽，其分子量为10 kDa，表明本发明的重组的大米抗氧化肽在毕赤酵母中表达成功。

2.大米肽的抗氧化肽抗氧化性实验：

（1）试验方法：

在DPPH体系中测定待测样品溶液的抗氧化性，配置浓度为20 g/L的重组大米抗氧化肽溶液备用，配置方法为：称2 g实施例2制得的大米抗氧化肽冻干粉溶于100 mL水中。

DPPH有机溶液：称取0.0059g DPPH（纯度98%）于250 mL容量瓶中，用70%甲醇定容，配成DPPH工作液备用。

用紫外-可见分光光度仪器，测定加抗氧剂提取液后在波长517 nm处吸光度值，从而计算抗氧化肽清除自由基的能力，按照表1加反应液。

表1

。

摇匀使其充分混合后，将A₁所表示的样品在室温下静置30 min后，加入比色皿中进行吸光度的测定，测出A₀、A₁、A₂所表示样品的吸光度值，清除率按以下公式进行计算室温避光反应30 min，517 nm测吸光度。DPPH自由基清除率按以下公式计算：

；

（2）本发明制得的大米抗氧化肽的DPPH清除率测定：

对本发明配置好的20 g/L的重组大米抗氧化肽溶液进行DPPH清除率测定，在37℃下反应30 min时，其清除率为92.0%，反应1 h时其清除率为98.0%。

（3）本发明制得的大米抗氧化肽的稳定性检测：

为研究本发明大米抗氧化肽的稳定性，分别测定了其在不同条件下的DPPH清除率，并绘制曲线进行比较。结果发现：本发明制得的重组大米抗氧化肽在不同的反应条件下对DPPH自由基具有很好的清除作用，且具有较强的稳定性。

a. 温度稳定性：

将配制好的20 g/L的重组大米抗氧化肽溶液分别于4℃、25℃、37℃、60℃、90℃下处理1 h，分别对其DPPH自由基清除率进行检测，检测结果如图3所示，由图3所示，各温度之间的重组大米抗氧化肽的DPPH清除率无明显差异，表明本发明制得的大米抗氧化肽具有优异的温度稳定性，在90℃的高温下处理1 h，仍具有较强的抗氧化性能，所得结果如图3所示。

b. pH稳定性：

分别用pH为2、4、7、10、14的PBS缓冲液溶解大米抗氧化肽，浓度为20 g/L，于37℃处理4 h，分别对其DPPH自由基清除率进行检测，检测结果如图4所示。由图4可知，不同pH的PBS缓冲液溶解的大米抗氧化肽的DPPH自由基清除率之间差异较小，其中pH为7时，大米抗氧化肽的DPPH自由基清除率最高，为96.91%，当pH为14时，大米抗氧化肽的DPPH自由基清除率最低，为78.42%，表明本发明制得的大米抗氧化肽具有优异的pH稳定性，在强酸或强碱条件下，仍具有较强的抗氧化性能。

c. 酶稳定性：

分别取1 mg胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶，用1 mL缓冲液溶解（胃蛋白酶的缓冲液为pH=2的Glycine - HCL缓冲液，木瓜蛋白酶的缓冲液为pH=6的PBS缓冲液、蛋白酶K的缓冲液为pH=7的Tris缓冲液、胰蛋白酶的缓冲液为pH=8的Tris缓冲液），然后取7μL胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶溶液与7 μL大米抗氧化肽溶液混合，经37℃处理2 h，分别对其DPPH自由基清除率进行检测，检测结果如图5所示。由图5可知，各种酶对大米抗氧化肽的DPPH自由基清除率无明显差异，均在94%以上，表明本发明制得的大米抗氧化肽具有优异的酶稳定性，在强酸或强碱条件下，仍具有较强的抗氧化性能。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种重组大米抗氧化肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码权利要求1所述的重组大米抗氧化肽的基因，其特征在于，所述重组大米抗氧化肽的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的重组大米抗氧化肽的基因。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述载体为pPICZα-A。

5.一种高效表达重组大米抗氧化肽的酵母菌株，其特征在于，包含权利要求3所述的重组载体。

6.根据权利要求5所述的一种高效表达重组大米抗氧化肽的酵母菌株，其特征在于，所述的高效表达重组大米抗氧化肽的酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：

S1、将如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列连接于pPICZα-A载体上构成重组载体pPICZα-抗氧化肽-A；

S2、用Sac I内切酶将步骤S1所得的重组载体pPICZα-抗氧化肽-A进行线性化，然后用热击法转入到毕赤酵母细胞GS115中，再进行阳性克隆菌株筛选，即得。

7.根据权利要求6所述的一种高效表达重组大米抗氧化肽的酵母菌株，其特征在于，所述步骤S1中的SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的合成方法为：将如SEQ ID NO:3所示的大米抗氧化肽原始序列根据酵母表达系统偏好性进行密码子优化，在N端依次加入EcoR I酶切位点，起始密码子ATG，6个组氨酸标签，C端依次加入终止密码子TAA及Xba I酶切位点获得。

8.一种根据权利要求1所述的重组大米抗氧化肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：

将权利要求6筛选出的阳性克隆菌株进行诱导表达，得到发酵液，收集发酵液的上清液，即得重组大米抗氧化肽。

9.根据权利要求8所述的重组大米抗氧化肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法中采用甲醇对阳性克隆菌株进行诱导表达，最佳诱导表达时间为120 h。

10.一种重组大米抗氧化肽在制备具有抗氧化作用的食品、药品、保健品及食品添加剂中的应用，其特征在于，所述重组大米抗氧化肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。