CN116731134A - 一种糖转运蛋白tp6568及其在改造高产链霉菌中的应用 - Google Patents

一种糖转运蛋白tp6568及其在改造高产链霉菌中的应用 Download PDF

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Abstract

一种糖转运蛋白TP6568及其在改造高产链霉菌中的应用，属于基因工程技术领域。为了挖掘出更多提高菌株产素的有效元件，本发明利用Tn‑5的转座子诱变获得了来自阿维链霉菌的新型ABC型碳水化合物糖转运蛋白TP6568；通过广泛的糖底物结合吸收，证明了TP6568是可以转运多种糖的转运蛋白；在多种链霉菌中过表达TP6568，证明该糖转运蛋白可以在不同链霉菌中起到显著促进菌株糖吸收和显著提高产素的作用。此外，本发明在阿维链霉菌S0中对TP6568进行了适配表达，并串联了下游的GM006564——LacI家族转录调控因子，再次适配，最终构建了一株高产阿维菌素的工程菌株。

Description

一种糖转运蛋白TP6568及其在改造高产链霉菌中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种糖转运蛋白TP6568及其在改造高产链霉菌中的应用。
背景技术
链霉菌是生产天然产品药物的重要生产者。一般来说，转运蛋白占链霉菌蛋白质的10％以上，其中碳水化合物的转运蛋白最丰富，约占26.8％。并且糖转运蛋白对菌株的生长和生产都有重要贡献，是高产微生物细胞工厂工程的一般潜在目标。尽管目前已经对一小部分糖转运蛋白进行表征，但转运体的表征仍然面临着实验和计算方法的挑战。因此，对链霉菌有用的碳水化合物转运体的探索和表征对于构建天然产物的高产工程菌株是必要的。
发明内容
为了在链霉菌中挖掘有用的碳水化合物转运体，并利用其构建高产天然产物的工程菌株，本发明提供了一种新型的糖转运蛋白TP6568及其在改造高产链霉菌中的应用，具体技术方案如下：首先，利用阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)S0作为出发菌株进行转座突变，发现一株阿维菌素B1a产量稳定提高的转座突变菌株SP152，相比于原始菌株S0，该菌株阿维菌素B1a产量提高了35.22％，总糖残糖量下降了18.44％。随后，通过反向扩增的方法进一步确定了SP152突变菌株的转座片段插入位点，分析发现，该突变菌株的转座片段插入在编码底物结合蛋白的基因GM006568上游12bp处。而在GM006568蛋白的下游，发现了一个透性酶(GM006567)、一个假定蛋白(GM006566)和一个ATP结合蛋白(GM006565)。并且通过分析发现，底物结合蛋白GM006568包含一个1型周质结合蛋白(PBP1)超家族结构域，该超家族被注释参与多种糖的转运。因此，推测从GM006565到GM006568的四个蛋白可能形成了一个ABC型糖转运蛋白，并将其命名为TP6568。此外，在TP6568的下游发现了一个由GM006564基因编码的转录调控因子。该调控因子属于LacI家族，一般调控碳源运输与代谢相关基因的转录水平。操纵子分析表明，GM006564可能与TP6568共同转录，表明该调控因子与TP6568之间存在密切的关系。并且，根据之前的转录组数据显示，TP6568与GM006564蛋白的编码基因转录水平似乎与阿维菌素B1a产量呈正相关趋势。随后，为了验证上述结果，在阿维链霉菌S0中使用强启动子kasOp*过表达TP6568，构建成工程菌株S0-TPK，随后进行发酵，检测其阿维菌素B1a产量与总糖残余量。然后，为了表征该糖转运系统，将TP6568在模式生物——天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)中异源表达，构建工程菌株M145-TPK，随后将M145-TPK与M145分别放在八种不同糖的固体和液体培养基中进行培养，观测菌株在固体平皿中的生长表型，检测菌株次级代谢物的产量和残糖量，随后也对GM006568进行了与八种被试糖的分子对接模拟，对TP6568的吸收底物进行总结。然后将TP6568分别在冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)BC-101-4、生暗灰链霉菌NEAU6(Streptomycescaniferus)和玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)NRRL11379中使用kasOp*强启动子进行过表达，分别构成工程菌株BC-TPK、N6-TPK和NR-TPK，随后分别对上述菌株进行发酵，检测菌株的次级代谢物产量和总糖残糖量。最后，以阿维链霉菌为例，在S0中对TP6568进行了适配表达，并串联了下游的GM006564——LacI家族转录调控因子，再次适配，最终构建了一株高产阿维菌素的工程菌株，再次验证了TP6568在链霉菌高产工程改造上的可行性。
基于上述发明内容，本发明的第一个目的是提供一种糖转运蛋白TP6568，所述糖转运蛋白TP6568由底物结合蛋白GM006568、透性酶GM006567、假定蛋白GM006566和ATP结合蛋白GM006565组成；编码所述底物结合蛋白GM006568的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，编码所述透性酶GM006567的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述假定蛋白GM006566的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述ATP结合蛋白GM006565的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
本发明的第二个目的是提供上述糖转运蛋白TP6568在构建高产阿维菌素的重组阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)中的应用。
本发明的第三个目的是提供上述糖转运蛋白TP6568在构建高产米尔贝霉素的重组冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是在冰城链霉菌中过表达糖转运蛋白TP6568。
本发明的第四个目的是提供上述糖转运蛋白TP6568在构建高产谷维菌素的重组生暗灰链霉菌(Streptomyces caniferus)中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是在生暗灰链霉菌中过表达糖转运蛋白TP6568。
本发明的第五个目的是提供上述糖转运蛋白TP6568在促进链霉菌糖吸收能力中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述糖为葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、甘露醇、核糖或麦芽糖。
本发明的第六个目的是提供一种提高阿维菌素产量的方法，所述方法是在阿维链霉菌中表达权利要求1所述的糖转运蛋白TP6568，或共表达LacI家族转录调节因子GM006564与权利要求1所述的糖转运蛋白TP6568；所述LacI家族转录调节因子GM006564的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述阿维链霉菌为阿维链霉菌S0。
本发明的第七个目的是提供一种高产阿维菌素的重组链霉菌，所述重组链霉菌以阿维链霉菌为出发菌株，表达权利要求1所述的糖转运蛋白TP6568，或共表达LacI家族转录调节因子GM006564与权利要求1所述的糖转运蛋白TP6568；所述LacI家族转录调节因子GM006564的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述阿维链霉菌为阿维链霉菌S0。
本发明的有益效果：
本发明为了挖掘出更多的提高菌株产素的有效元件，利用Tn-5的转座子诱变获得了来自阿维链霉菌的新型ABC型碳水化合物转运蛋白TP6568。进而，通过广泛的糖底物结合吸收，证明了TP6568是可以转运多种糖的转运蛋白。然后，在多种链霉菌中过表达TP6568，证明该糖转运蛋白可以在不同链霉菌中起到显著促进菌株糖吸收，并且显著提高产素的作用。最后，本发明以阿维链霉菌S0为例，在S0中对TP6568进行了适配表达，并串联了下游的GM006564——LacI家族转录调控因子，再次适配，最终构建了一株高产阿维菌素的工程菌株，再次验证了糖转运蛋白TP6568在链霉菌高产工程改造上的可行性。
附图说明
图1为转座子突变体SP152与亲本株S0产阿维菌素B1a及发酵液中残留总糖的比较结果图；其中，图1中的a为转座子突变体SP152与亲本株S0产阿维菌素B1a的比较结果图，图1中的b为转座子突变体SP152与亲本株S0发酵液中残留总糖的比较结果图；
图2为转座子突变体SP152转座子插入位点的鉴定结果图；
图3为糖转运蛋白TP6568对阿维菌素生物合成的影响结果图；其中，图3中的a为发酵第八天SP152与S0菌株GM006564、GM006565、GM006567和GM006568基因相对转录水平的比值，图3中的b为糖转运蛋白TP6568基因转录水平与阿维菌素B1a产量的相关性分析图，该图为S0、SP66、SP104和SP152菌株第八天与第四天GM006564、GM006565、GM006567和GM006568基因的相对转录水平的比值，图3中的c为糖转运蛋白TP6568过表达株S0-TPK与亲本株S0阿维菌素B1a产量比较结果图，图3中的d为S0-TPK和S0发酵液中残留总糖的比较结果图；
图4为在模式生物天蓝链霉菌中对糖转运蛋白TP6568进行表征的结果图；其中，图4中的a为TP6568过表达菌株M145-TPK与亲本菌株M145在以不同测试糖为唯一碳源的SMM琼脂平板上的表型，图4中的b为TP6568过表达菌株M145-TPK与亲本菌株M145在以不同测试糖为唯一碳源的SMM液体培养基中的产量(Act或Red)和残糖的比较结果图(M145-TPK为橙色曲线，M145为蓝色曲线)，图4中的c为GM006568与八种被测试糖的分子对接模型，对于图4中的a和图4中的b，每一种培养基中的碳源中的碳摩尔数相同；
图5为将在不同链霉菌中过表达TP6568获得的各重组链霉菌进行发酵获得的发酵结果图；其中，图5中的a为TP6568过表达菌株与其亲本菌株残糖比较结果图，图5中的b为TP6568过表达菌株及其单个亲本菌株中不同产物产量比较结果图，图5中的c为TP6568过表达菌株与其亲本菌株的干重比较结果图，图5中的d为TP6568过表达菌株及其亲本菌株的液相色谱图；
图6为GM006564的表达对阿维链霉菌S0的阿维菌素产量及发酵残留总糖的影响结果图；
图7为GM006564对TP6568糖转运蛋白中各蛋白编码基因转录水平的影响结果图；
图8为在S0中适配表达TP6568的发酵结果图；其中图8中的a为阿维链霉菌S0在不同发酵阶段的总糖吸收速率，P1为发酵0-96h，P2为发酵96-192h，P3为发酵192-240h；图8中的b为三个候选时序启动子第四天和第八天的FPKM值，p3为GM000355基因的自身启动子，p5为GM005847基因的自身启动子，p8为GM008731基因的自身启动子；图8中的c为在S0中以不同强度的时序启动子过表达TP6568获得的菌株的总糖残余量；图8中的d为在S0中以不同强度的时序启动子过表达TP6568获得的菌株B1a产量比较结果图；
图9为利用不同启动子在阿维链霉菌S0中共表达GM006564与TP6568获得的重组菌株发酵生产阿维菌素B1a产量的比较结果图；
图10为GM006568底物结合蛋白与8种被试糖的分子对接分数。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述清楚说明本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
以下实施例中涉及的实验方法如无特别说明均为常规方法，所使用的材料、试剂、酶、感受态细胞、质粒等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明涉及的培养基如下：
冰城链霉菌产孢培养基SKYM：蔗糖0.40％，脱脂奶粉0.10％，酵母浸粉0.20％，麦芽浸粉0.50％，琼脂粉2.00％，pH 7.20。
天蓝链霉菌产孢培养基MS：黄豆粉2.00％，甘露醇2.00％，琼脂粉2.00％。
天蓝链霉菌产素培养基SMM：PEG60005.00％，MgSO4·7H2O 0.123％，葡萄糖1.00％，酪蛋白水解物0.20％，氯化钠0.00001％，FeSO4·7H2O 0.00001％，ZnSO4·7H2O0.00001％，MnCl2·7H2O 0.00001％，CaCl2·6H2O 0.00001％，琼脂粉2.00％，将上述组分定容至97mL灭菌，随后加入2mL 5×TES buffer(1.25M，pH＝7.2)作为发酵培养基的缓冲液，加入1mL的磷酸盐溶液(NaH2PO4和K2HPO4各50mM)。
阿维链霉菌产孢培养基YMS：可溶性淀粉0.40％，酵母浸粉0.40％，麦芽浸粉1％，CoCl2·6H2O 5.00×10-6％，琼脂粉2.00％，pH 7.40。
暗灰链霉菌产孢培养基：酵母浸粉0.40％，麦芽浸粉1％，葡萄糖0.4％，琼脂粉2.00％。
玫瑰孢链霉菌产孢培养基DA1：酵母浸粉0.40％，麦芽浸粉1％，葡萄糖0.4％，CaCO30.2％，琼脂粉2.00％，pH 7.0。
冰城链霉菌种子培养基SSPY：蔗糖1.00％，脱脂奶粉0.10％，酵母膏0.50％，细菌蛋白胨0.35％，K2HPO40.05％，pH 7.20。
冰城链霉菌发酵用培养基：黄豆饼粉2.00％，蔗糖8.00％，脱脂奶粉0.10％，FeSO40.01％，K2HPO40.01％，CaCO30.03％，pH 7.00-7.20。
阿维链霉菌种子培养基：玉米淀粉3.00％，黄豆饼粉0.80％，花生饼粉1％，酵母浸粉0.40％，CoCl2·6H2O 0.003％，α-淀粉酶0.004％，pH 7.40。
阿维链霉菌发酵用培养基：玉米淀粉10.00％，黄豆饼粉2.00％，酵母浸粉1.00％，CoCl2·6H2O 0.002％，α-淀粉酶0.01％，(NH4)2SO40.05％，Na2MoO4·2H2O 0.0022％，MnSO4·H2O 0.00023％，CaCO30.08％。
天蓝链霉菌发酵培养基：PEG60005.00％，MgSO4·7H2O 0.123％，葡萄糖1.00％，酪蛋白水解物0.20％，氯化钠0.00001％，FeSO4·7H2O 0.00001％，ZnSO4·7H2O 0.00001％，MnCl2·7H2O 0.00001％，CaCl2·6H2O 0.00001％，将上述组分定容至97mL灭菌，随后加入2mL 5×TES buffer(1.25M，pH＝7.2)作为发酵培养基的缓冲液，加入1mL的磷酸盐溶液(NaH2PO4和K2HPO4各50mM)。
生暗灰链霉菌种子培养基：麦芽糊精2.00％，黄豆饼粉4.00％，蔗糖1.00％，碳酸钙0.30％，pH 7.20-7.40。
生暗灰链霉菌发酵培养基：麦芽糊精6.00％，黄豆饼粉4.00％，MgSO4·7H2O0.10％，氯化钠0.30％，碳酸钙0.40％，pH 7.40。
玫瑰孢链霉菌种子培养基：葡萄糖0.50％，糊精1.50％，细菌蛋白胨0.50％，酵母浸粉0.50％，花生饼粉0.50％，K2HPO4·7H2O 0.50％，MgSO4·7H2O 0.50％，CaCO30.02％，pH7.50。
玫瑰孢链霉菌发酵培养基：可溶性淀粉5.00％，葡萄糖1.00％，糊精1.00％，胰蛋白胨1.00％，K2HPO4·7H2O 0.30％，MgSO4·7H2O 0.30％，CaCO30.02％，pH 7.50。
YEME液体培养基：蔗糖10.30％，葡萄糖1.00％，蛋白胨0.50％，麦芽糖0.30％，酵母浸粉0.30％，灭菌后，加入MgSO4·7H2O，直至终浓度达到5mM。
本发明涉及的培养方式如下：
(1)阿维链霉菌：在产孢培养基上以28℃培养7天。在种子培养基中以28℃、250rpm培养40小时。在发酵培养基中以28℃、250rpm发酵10天。
(2)冰城链霉菌：在产孢培养基上以28℃培养9天。在种子培养基中以28℃、250rpm培养46小时。在发酵培养基中以28℃、250rpm发酵9天。
(3)生暗灰链霉菌：在产孢培养基上以28℃培养8天。在种子培养基中以28℃、250rpm培养12小时。在发酵培养基中以28℃、250rpm发酵8天。
(4)玫瑰孢链霉菌：在产孢培养基上以28℃培养7天。在种子培养基中以30℃、250rpm培养48小时。在发酵培养基中以30℃、250rpm发酵10天。
(5)天蓝色链霉菌：在产孢培养基上以28℃培养3天。在SMM固体培养基中以28℃培养5天。在发酵培养基中以28℃、250rpm发酵5天。
本发明涉及的检测方法如下：
阿维菌素的检测方法：取阿维链霉菌的发酵液或发酵液上清0.25mL与1.20mL甲醇充分混合，将样品超声处理40min，用于提取发酵液中的总阿维菌素和胞外的阿维菌素。随后将初步处理后的样品以12000rpm高速离心15min，吸取上层阿维菌素提取液过0.22μM有机滤膜后进行液相检测，检测仪器为岛津HPLC(Shimadzu LC)，色谱柱为C18柱(Zorbax，4.6mm×250mm，5μm)，检测波长为246nm，进样体积20μL，流动相为90％甲醇，流速为1.0mL/min，柱温为35℃。
米尔贝霉素的检测方法：取冰城链霉菌的发酵液0.5mL与1.5mL乙醇充分混合，将处理样品翻转振荡30min用于萃取发酵液中的米尔贝霉素，随后初步处理的样品用12000rpm高速离心15min，吸取上层米尔贝霉素提取液过0.22μM有机滤膜后进行液相检测，检测仪器为Agilent 1260高效液相色谱(HPLC)，色谱柱为C18柱(Zorbax，4.6mm×250mm，5μm)，检测波长为242nm，进样体积为20μL，流动相流速为1.0mL/min，具体色谱条件为0-15min内流动相A(甲醇)从0％洗脱到100％，流动相B(乙腈：甲醇：水＝7：2：1)从100％梯度洗脱到0％；15-17min，流动相A维持100％；17-25min，流动相A(甲醇)从100％洗脱到0％，流动相B从0％梯度洗脱到100％；25-27min，流动相B维持100％，柱温为28℃。
达托霉素的检测方法：取玫瑰孢链霉菌的发酵液1mL，以12000rpm高速离心15min，吸取上清液过0.22μM无机滤膜后进行液相检测，检测仪器为Agilent 1260高效液相色谱(HPLC)，色谱柱为C18柱(Zorbax，4.6mm×250mm，5μm)，检测波长为218nm，进样体积10μL，流动相为44％乙腈、56％组分的超纯水和0.1％组分的三氟乙酸，流速为1.0mL/min，柱温为28℃。
放线菌紫红素的检测方法：在天蓝链霉菌发酵液中加入同等体积的2M NaOH，在涡旋振荡器上振荡1min，上清离心，取上清200μL点在平底透明的96孔板中，在608nm处用酶标仪检测ACT产率。
十一烷基灵菌红素的检测方法：用1M HCl酸化天蓝链霉菌发酵液中的菌丝，用等量甲醇萃取，离心，取上清200μL点在平底透明的96孔板中，在530nm处测量吸光度值，按A＝δcl(δ＝100500)计算样品的红色浓度。
谷维菌素的检测方法：收取0.4mL生暗灰链霉菌发酵液，加入1.60mL的乙醇，超声处理60min，以提取发酵液中的谷维菌素，12000rpm离心10min。取上清过0.22μM有机滤膜后进行液相检测，检测仪器为Agilent 1260高效液相色谱(HPLC)，色谱柱为C18-aq柱(ZorbaxSB-Aq，4.6mm×250mm，5μm)，以11％乙腈和89％的超纯水为流动相，流速为0.8mL/min，检测波长为260nm，柱温为28℃。
菌株残糖量的检测：HPLC检测法：将收取的发酵液离心，吸取上清液，加入两倍体积的甲醇萃取，翻转震荡30min。采用岛津LC-20AT高效液相色谱法(HPLC)检测残糖，配备示差折光检测器和碳水化合物柱(Zorbax，4.6mm×250mm，5mm)。以80％乙腈为流动相，流速为1mL/min，柱温为35℃。
试剂盒检测法：收取发酵液后离心取上清，采用3,5-二硝基水杨酸法和苯酚硫酸法用总糖和还原糖含量测定试剂盒(Cominbio，中国)测定残糖。
本发明涉及的所有菌株与质粒见表1。冰城链霉菌BC-101-4公开于Wang X,WangX,Xiang W(2009)Improvement of milbemycin-producing Streptomycesbingchenggensis by rational screening ofultraviolet-and chemically inducedmutants.World J Microbiol Biotechnol25:1051-1056；天蓝色链霉菌M145公开于KieserT,Bibb MJ,Buttner MJ,Chater KF,HopwoodDA(2000)Practical Streptomycesgenetics.John Innes Foundation,Norwich；生暗灰链霉菌NEAU6公开于Liu C,Wang Z,Chen Y,Yan Y,Li L,Wang YJ,Bai L,Li S,Zhang Y,Wang X,Huang SX,Xiang W(2023)Guvermectin biosynthesis revealing the key role of aphosphoribohydrolase andstructural insight into the active glutamate ofa noncanonical adeninephosphoribosyltransferase.ACS Chem Biol 18:102-111doi:10.1021/acschembio.2c00739；玫瑰孢链霉菌NRRL公开于Yan H,Lu X,Sun D,Zhuang S,Chen Q,Chen Z,Li J,WenY(2020)BldD,a master developmental repressor,activatesantibiotic production in two Streptomyces species.Mol Microbiol 113:123-142.doi:10.1111/mmi.14405。质粒pTNM公开于Petzke L,Luzhetskyy A(2009)In vivoTn5-based transposon mutagenesis of streptomycetes.Appl Microbiol Biotechnol83:979-86.doi:10.1007/s00253-009-2047-z；质粒pSETddCpf1公开于Li L,Wei K,ZhengG,Liu X,Chen S,Jiang W,Lu Y(2018)CRISPR-Cpf1 assisted multiplex genomeediting and transcriptional repression in Streptomyces.Appl EnvironMicrobiol84:e00827-18.doi:10.1128/AEM.00827-18；pDR4-K*公开于Wang W,Li X,WangJ,Xiang S,Feng X,Yang K(2013)An engineered strong promoter forstreptomycetes.Appl Environ Microbiol 79:4484-92doi:10.1128/AEM.00985-13。阿维链霉菌S0于2023年3月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC 4.8011，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
表1本发明涉及的所有菌株与质粒信息
本发明涉及的所有引物信息见表2。
表2本发明涉及的所有引物信息
注：表中黑体字表示限制性内切酶位点，斜体字表示同源片段，下划线字符表示RBS序列
实施例1：一种新型ABC型糖转运蛋白TP6568的获得
利用阿维链霉菌S0作为出发菌株进行转座突变。首先，将pTNM转座质粒通过属间接合转移的方法转入阿维链霉菌S0中，使用8μg/mL安普霉素和25μg/mL萘啶酮酸筛选出含有转座质粒pTNM的接合子。在含有8μg/mL安普霉素的MS培养基中，对上述接合子进行挑取和传代。然后，将上述接合子接入含有8μg/mL安普霉素的YEME液体培养基中，28℃、250rpm培养1天。向摇瓶中加入5μg/mL硫链丝菌素，诱导转座酶转录，培养1h，使转座子在S0基因组中进行转座。随后将摇瓶培养温度提高至37℃，丢失菌株中游离的pTNM质粒。然后将摇瓶中的培养物等分涂在无抗的MS培养基平皿上，37℃培养7天。收取MS平皿上的孢子并稀释至10-7，再次涂布到无抗MS培养基平皿上，37℃培养7天。最后，将长出的单菌落挑取至分别含有安普霉素(8μg/mL)和潮霉素(80μg/mL)的MS培养基平皿上，能在含有安普霉素的平皿上正常生长，但在含有潮霉素的平皿上无法生长的菌落即为转座成功的转座突变体。突变后发现一株阿维菌素B1a产量稳定提高的转座突变菌株，将其命名为SP152，该菌株阿维菌素B1a产量为2.75g/L，相比于出发菌株S0，产量提高了35.22％(见图1中的a)，总糖残糖量下降了18.44％(见图1中的b)。同时，上述转座突变还获得了一株阿维菌素B1a产量提高32.51％的转座突变菌株SP104和一株阿维菌素B1a产量下降76.61％的转座突变菌株SP66，菌株SP104的阿维菌素B1a产量为2.69g/L，菌株SP66阿维菌素B1a产量为0.47g/L。
随后，我们提取了SP152的基因组，并且使用ApaI限制性内切酶将基因组酶切成一段段的DNA序列，并使用T4连接酶将线性DNA序列自环化连接起来，然后将自环化的DNA序列转入大肠杆菌TransforMaxTMEC100DTMpir-116中，将上述大肠杆菌孵育后涂到含有安普抗生素的LB平皿中，将长出的单克隆质粒转接至LB小试管中扩培后，提取质粒。对提取后的质粒使用ME-F/ME-R为引物，将上述提取的质粒作为模板，扩增转座子插入片段相邻的DNA序列，测序后匹配到基因组上，确定了SP152突变菌株的转座片段插入位点。结果分析发现，该突变菌株的转座片段插入在编码底物结合蛋白的基因GM006568上游12bp处。而在GM006568蛋白的下游，发现了一个透性酶(GM006567)、一个假定蛋白(GM006566)和一个ATP结合蛋白(GM006565)(见图2)。并且通过分析发现，底物结合蛋白GM006568包含一个1型周质结合蛋白(PBP1)超家族结构域，该超家族被注释参与多种糖的转运。因此，推测从GM006565到GM006568的四个蛋白可能形成了一个ABC型糖转运蛋白，并将其命名为TP6568。其中，编码底物结合蛋白GM006568的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码透性酶GM006567的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码假定蛋白GM006566的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码ATP结合蛋白GM006565的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.1：
atgtctcgcaccactcgcctgtcctcctcgctcctcagagccgccgcggtcacgggcgtcgcggccctcactctgacggcctgcggctccggctccggctccggttcgggctccaagagctccggctcgggcagcgtcaaggtcggtctgatcaccaagaccgacaccaacccgttcttcgtgaagatgaaggagggcgcggagaaggccgccaaggagaacggtgtccaactgtccaccgcggcgggcaagttcgacggggacaacgccgggcaggtcaccgccatcgagaacatggtcgccgccggggtgaagggcatcctgatcaccccgagcgactccaaggcgatcgtgcccgccattcagaaggcccgcgccaagggtgtcctggtcatcgccctggacaccccgaccgagccggaaagcgcggtcgacgcactcttcgccaccgacaacctcaaggccggccagctgatcggcgagtacgccaaggccgtcatgaagggcaagaaggcgaagatagccgccctcgacctggcgccgggcgtctccgtcggcgtccagcggcacaacggtttcctgaagggcttcggcgccaccgacaaggacgtcgtgtgcgcccaggacaccggcggcgaccaggccaagggccagaccgcgatggagaactgcctgcagaaggcgcccggcatcaacgtcgtctacaccatcaacgaaccggccgccctgggcgcgtacaccgcgctgaaggccaagggccgggagaaggacgtgctgatcgtctccgtcgacggcggctgcaccggcacccaggccgtcaaggacggcaagatcgccgcgacgtcgcagcagtacccgctgaagatggccgccgagggcgtcaaggccgtcgtgacgtacgccaaggacggcaagaaggcgtccggttacaccgacaccggcgtcaccctgatcaccgacaaggcgcaggacggcgtcacggcgaaggacaccggctacggcctggagaactgctggggctga
SEQ ID NO.2：
atgacagccacgacctcgccgtacgccgagctcaaagcaccgaccacggcccgcagactgctcacggcgccgaccaccggcccgctggccgcccttctcctggcctgcgccttcttctccctctcgaccgaccagttcctcaccggcggcaacttctcgctgatcgtgcagcaggtcatggtcgtcggcaccctcgccatcggacagaccctgatcatcctcaccgcgggcatcgacctgtcgtgcggggcggtgatggccttcggcagcatcgtgatcgccaagatggcggccgagggctccgtcccaccgcttgtcgcgatcgctctgggcctggtcgtctgcggcggcttcggcctgctcaacgggctgctggtgcagaagatcccgctgccgccgttcatcgtcaccctcggcatgctcaacgtggcgttcgcactgacccacatctactccgaggagcagacggtcaccaacctgcccggcccgctgacggctctcgggcagaccttcccgctcggccacaccgacatcacctacggctccctggtcaccatcgccctgttcctcctcctcgcctacgcgctgagcagcaccggctgggccggcacgtctacgccctgggcaacagcgccgaggccgcccggctga
SEQ ID NO.3：
gtggccggcctgctgtacggcatcgccgccctgctgctcatctcccgcaccggagtcggcgacccgcaggccggacagaccgacaacctcgacagcatcaccgccgtggtcctcggcggcaccagcctcttcggcggacgcggatcggtcctgggcaccttcatcggcgtcctcatcgtcggcgtgttccgcaacggcctccagctgatgggcgtcgcctccatctaccagaccctgatcaccggagtcctggtgatcctcgcggtgaccgtcgaccagctctcccggaagaaggcccgatga
SEQ ID NO.4：
gtgctgcaggcccgcggcctggtcaagcggtacggccaggtcaccgccatcgacggcgccgacttcgatctgctgcccggcgaggtcctcgccgtcatcggcgacaacggtgccggcaagaccagcctgatcaaggcgctcaccggcgcggtggtccccgacgcgggcgagatacggctgggcggcgagcccatcaccttctccggtccgcagagcgcccgcgcccacggcatcgagacggtctatcaggacctcgccgtggccgcctccatggacatcgcctcgaacatgttcctcgggcgcgagctgcgccgacccggcgttctcggcagtgtcttccgcatgctggacaagaagcgcatgcgccaggaggccgccgagcacatggccgacctgaagatcggcctgcgctcgctgacgcagtcggtcgagacgctctccggcggacagcggcaggccgtcgcggtcgcccgttccgtcgcctgggcccgcagcgtcgtcgtcatggacgaacccaccgccgctctcggcgtcaaggagtcgggccaggtcctggacctcatccgccgagtccgcgacaagggcatgccggtcgttctgatcagccacaacatgccccacgtcttcgagatcgccgaccggatccacgtccaccggctgggccggcgtgccgccctgatcaagccctccgattactccatggccgaggtcgtcgccatcatgaccggcgcgctcagcatcgacgaggccggagatactgtcgtagcggattcggaggccgccaaggccgccggagtacaggccacctga
实施例2：糖转运蛋白TP6568在提高阿维菌素产量中的应用
由于转座子的插入破坏了GM006568基因的启动子区域(图2)，所以我们推测转座菌株阿维菌素产量的大幅度变化可能与上述假定糖转运蛋白的转录水平改变相关。
为证实上述猜想，收取S0、SP66、SP104和SP152菌株第4天和第8天的发酵液样品，按照试剂盒《Ultrapure RNAKit》说明书提取上述样品的RNA。并按照Thermo Fisher公司的反转录酶SuperScriptTMIII Reverse的说明书将上述提取的RNA反转录成cDNA后，使用PowerUp SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems,Applied Biosystems)进行qRT-PCR实验。使用Q16s-F/Q16s-R为引物以上述不同菌株不同时间的cDNA样品为模板扩增内参基因16s rRNA。使用Q6564-F/Q6564-R、Q6565-F/Q6565-R、Q6567-F/Q6567-R和Q6568-F/Q6568-R为引物以上述不同菌株不同时间的cDNA样品为模板扩增GM006564、GM006565、GM006567和GM006568。并使用ΔΔCt法分析产量不同的阿维链霉菌中GM006564、GM006565、GM006567和GM006568基因第四天和第八天的相对转录水平。
通过上述实验分析发现，与S0相比，转座突变菌株SP152中GM006565、GM006567和GM006568的基因的转录水平均有所增加(图3中的a)。同时，根据之前的转录组数据，我们比较了不同阿维菌素产量的菌株(S0，SP66，SP104和SP152)中GM006565-GM006568基因的转录水平，通过分析也发现了，这些基因转录水平与阿维菌素产量呈正相关的趋势(图3中的b)。这些结果表明，TP6568可能是提高阿维菌素产量的有效元件。
为了验证糖转运蛋白TP6568对阿维菌素B1a的正相关影响，我们在阿维链霉菌S0中，使用强启动子kasOp*过表达TP6568构建工程菌株S0-TPK，具体方法为以阿维链霉菌S0的基因组为模板，以KTP-F/KTP-R为引物，扩增TP6568基因片段(FTP-1)。以pDR4-K*为模板，以KasO-F/KasO-R为引物，扩增启动子kasOp*片段。使用EcoRI和XbaI酶切pSET152质粒，得到线性载体骨架LpSET152-1。将LpSET152-1、kasOp*片段和TP6568基因片段使用Gibson拼接成质粒pTP-pK。将pTP-pK质粒导入S0中得到工程菌株S0-TPK。
通过对比S0与S0-TPK的阿维菌素产量与残糖量发现S0-TPK的产素相比于S0提高了75.61％(图3中的c)，同时，总糖残糖量下降了36.16％(图3中的d)。这些数据表明，在阿维链霉菌中TP6568是一个有效的糖转运蛋白，并且能够有效提高阿维菌素的产量。
实施例3：糖转运蛋白TP6568在促进多种糖的吸收能力中的应用
尽管GM006568可能是链霉菌工程中一个有用的糖转运体，但详细的实验证实相当有限。为了验证上述猜测，对268种具有完整基因组的链霉菌进行了GM006568的同源比对分析。我们在198种链霉菌中发现了303个具有高度相似性的同源物。其中来自阿维链霉菌MA-4680的蛋白SAVERM_RS29430(BAC73416.1)与GM006568的关系最近，被标记为果糖转运蛋白，而其他的同源蛋白被标记为不同的糖结合蛋白，包括核糖、木糖和阿洛糖。这些数据表明，包含GM006568的糖转运蛋白TP6568可能是一个多功能的转运体，能够促进多种糖的吸收。
为了证实上述猜想，在模式生物天蓝链霉菌中对糖转运蛋白TP6568进行表征，具体方法为将实施例2获得的质粒pTP-pK导入天蓝链霉菌M145中，得到工程菌株M145-TPK。将M145与TP6568过表达菌株M145-TPK分别培养以葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、甘露醇、核糖、麦芽糖或纤维二糖作为唯一碳源的SMM琼脂板和液体培养基中。具体方法为将SMM培养基中的葡萄糖换成相同碳摩尔数的其余七种被试糖，分别记录并检测M145与M145-TPK在分别以八种被试糖为唯一碳源的培养基中的菌株产素和残糖量。上述碳源通常用于工业发酵或有前景的可持续碳源。
当菌株生长至第五天时，在琼脂平板上，我们发现含有TP6568的M145-TPK增强了使用纤维二糖以外的不同糖的菌株的二级代谢物生物合成(Act或Red)(见图4中的a)。在液体发酵中也发现了类似的现象，果糖、葡萄糖和麦芽糖的残留量分别显著降低了47.51％、23.82％和26.86％(图4中的b)。由上述实验结果可知，糖转运蛋白TP6568促进了除纤维素二糖外的其他糖的吸收。进一步的硅分子模型模拟表明，尽管TP6568没有增强M145中纤维二糖的摄取，但GM006568可以结合所有测试糖(图4中的c和图10)。这些数据不仅证明了TP6568是一个多重糖转运体，而且表明了该转运体在链霉菌代谢工程中的巨大潜力。
实施例4：糖转运蛋白TP6568在不同链霉菌中促进菌株糖吸收，提高产素能力中的应用
由实施例3可知糖转运蛋白TP6568能显著促进大多数测试糖的吸收，这些糖是淀粉、蔗糖和糊精等常用的碳源，也是常用的工业碳源的水解产物。因此，糖转运蛋白TP6568在链霉菌的工程改造中具有很高的潜力。利用强启动子kasOp*，在利用不同碳源的三个不同链霉菌(包括冰城链霉菌BC-101-4、生暗灰链霉菌NEAU6和玫瑰孢链霉菌NRRL 11379)中过表达了该糖转运蛋白。具体方法为将实施例2获得的质粒pTP-pK分别导入冰城链霉菌BC-101-4、生暗灰链霉菌NEAU6和玫瑰孢链霉菌NRRL 11379中，得到工程菌株BC-TPK、N6-TPK和NR-TPK。分别检测过表达TP6568的工程菌株与其相应的出发菌株的产素与总糖残糖量。
根据发酵数据发现，所有工程菌株(BC-TPK、N6-TPK和NR-TPK)的剩余总糖含量与亲本菌株相比显著降低(图5中的a)，各总糖含量分别降低了33.56％、38.40％和30.21％。在BC-TPK和N6-TPK中，与亲本菌株相比，米尔贝霉素和古维菌素的产量分别显著提高了41.25％和56.65％(图5中的b)。总之，这些结果表明了糖转运蛋白TP6568在工业发酵应用中的巨大潜力。然而，TP6568对NR-TPK中达托霉素(daptomycin)的效价提高影响不大(图5中的b)。随着这些菌株的糖吸收增强，我们推测TP6568的表达模式与生产者的代谢不匹配可能是导致产品效价升高的原因。我们发现，NR-TPK的生物量比亲本株NRRL 11379提高了60.55％(图5中的c)，这表明更多的碳用于细胞生长，而不是生产。这些数据表明，TP6568在工程高效链霉菌细胞工厂方面具有很高的潜力，同时也表明了在菌株工程中对转运蛋白表达进行微调的必要性。
实施例5：GM006564可能与糖转运蛋白TP6568共同转录
在TP6568的下游，有一个LacI家族转录调节因子GM006564，GM006564基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。以往研究表明，大部分LacI转录调控因子参与碳源的运输和代谢。根据图3中的a和图3中的b所示，在产素水平不同的菌株中，GM006564与TP6568的基因的转录水平均与产量呈正相关。并且，操纵子分析表明，GM006564可能与TP6568的基因共同转录，表明该转录调控因子与TP6568之间存在密切的关系。因此，我们推测GM006564可能调控TP6568的表达水平，影响碳的利用、阿维菌素的生产和产量。为了验证我们的想法，我们首先在S0菌株中过表达和抑制GM006564，产生的菌株分别为S0-6564k和S0-d6564，然后测定发酵液中阿维菌素B1a产量和总糖残留量。具体方法为以S0基因组为模板，以K6564-F/K6564-R为引物，扩增基因片段GM006564(F6-1)。将LpSET152载体、F6-1和kasOp*片段使用Gibson拼接得到质粒p6564-pK，并转入S0中得到工程菌株S0-6564K。使用GM006564基因，设计sgRNA-6564，并使用pSETddCpf1质粒为模板，以D6564-F/D6564-R为引物，扩增携带sgRNA-6564片段的基因序列，并使用NdeI和SpeI酶切，得到片段FD6564。用NdeI和SpeI酶切质粒pSETddCpf1，得到线性载体骨架LpSETddCpf1。连接LpSETddCpf1与FD6564，获得质粒pd6564。并将质粒pd6564转入S0中得到工程菌株S0-d6564。收取S0、S0-6564K和S0-d6564菌株第2天、第4天和第8天的发酵液样品，按照试剂盒《Ultrapure RNAKit》说明书提取上述样品的RNA。并按照Thermo Fisher公司的反转录酶SuperScriptTMIII Reverse的说明书将上述提取的RNA反转录成cDNA后，使用PowerUp SYBR Green Master Mix(AppliedBiosystems,AppliedBiosystems)进行qRT-PCR实验。使用Q16s-F/Q16s-R为引物以上述不同菌株不同时间的cDNA样品为模板扩增内参基因16s rRNA。使用Q6565-F/Q6565-R、Q6566-F/Q6566-R、Q6567-F/Q6567-R和Q6568-F/Q6568-R为引物以上述不同菌株不同时间的cDNA样品为模板扩增GM006565、GM006566、GM006567和GM006568。使用ΔΔCt法对第二天、第四天和第八天的S0、S0-6564K和S0-d6564菌株中GM006565、GM006566、GM006567和GM006568基因的相对转录水平进行分析。
SEQ ID NO.5：
atggcagcgaaccgccgccctaccctggccgacgtcgcccgagaagtcggcgtcagcgccaagacggtctcacgcgtcctcaacgaggacggacccgcctccgcgcagaccagggaacaggtactcgccgcagtggccaagctcggcttccagccgaacctcatggcccgcaacatccgcgtcggcggcccggacaccaccatcggcctggtcattcccgacctcgccaaccccttcttcggagctgtggcccgtgccatcgaggacaccgtccgcgaacgcggactgaccctgctcatgggctcctccgcggacgactccgagcgcgaacgtgccctgaccgacaagttcctcgcccgccgcgtcagcatcctgatcgtcgttccgtccgtcggcgccgaccactcccacctcaagtcccatcgcacggcgggactacccgtgatcttcctcgaccgacccggagtcggcctcgccacggacagcatcgtcagctccaaccgtgccggcgcccacgacggcgtcacccacctcatcgcccacggacaccggcgcatcggcttcgtcggcgacctgcccccgaagctgtacacccgtcgcgagcgtcaggccggttaccgctcggcactacaggaagccgacatcccctacgaccgctcgctcgtcaccaacgcccacgaccagcggggcgccgagaccgcgaccgcccaactcctcggcctggccgatccccccaccgccctgttcgccggcaacaacatcatggcgctgggcatagtcgccgaactggcccgcagcaagcgcaaggacgtcgccgtagtcgccttcgacgacgtggcactcgccgaggcactcgagccggccctgaccgtcgtcgcccaggacgcggaagaaatcggcagaacggcagcgaccaccgcgctgacccgcctggacggggaccgctcccgagcccgcaccatcaccgtccccacccacctgatcgtccgaggctcgggcgaactccccgtcccgcgttacaggaagcgtgacttggagtcggcaccgaaccgcacggctgccggcaccaggtga
结果发现与S0相比，S0-6564k使阿维菌素B1a产量提高了58.81％，总糖残留量降低了53.96％，而S0-d6564使阿维菌素B1a产量降低了83.08％，总糖残留浓度提高了23.83％(图6)。之后我们发现，在不同发酵阶段，与S0相比，S0-6564K中TP6568所有基因的转录水平显著增强(超过12.59倍)，而S0-d6564中TP6568基因的转录水平显著降低(低于96.74％)(图7)。这些数据表明，GM006564是TP6568的关键激活剂，对该调控剂进行工程改造可能会进一步促进发酵过程中残糖的利用，并提高阿维菌素的产量。
实施例6：在阿维菌素高产菌株S0中共表达GM006564与TP6568提高阿维菌素产量
以阿维链霉菌S0的基因组为模板，分别以P355-F/P355-R、P5847-F/P5847-R、P8731-F/P8731-R和TP-F/TP-R为引物得到时序启动子片段p3(FP3-1)、p5(FP5-1)、p8和用于连接时序启动子的TP6568基因片段(FTP-2)。将三个时序启动子片段用XbaI和KpnI酶切，FTP-2用KpnI和EcoRI酶切，并且将LpSET152-1与FTP-2分别与上述三个时序启动子连接起来，构建质粒pTP-p3、pTP-p5和pTP-p8。并将上述三个质粒分别导入S0中，得到工程菌株S0-TP3、S0-TP5和S0-TP8。
基于实施例4展示的数据，我们推测使用时序启动子微调表达TP6568的菌株可能比使用组成型启动子过表达TP6568的菌株的碳源吸收能力更强，菌株产素能力更高。我们对S0在三个不同发酵阶段的碳源吸收速率进行分析，结果显示，在发酵第八天以后的碳源吸收速率显著下降(图8中的a)。因此，为了避免在菌株发酵初期TP6568的强表达导致更多碳流流向菌株生长，我们利用转录组数据(GSE227240)选择了三个发酵前期转录水平较低、后期转录水平较高的三个候选时序启动子p3、p5和p8分别对TP6568进行了微调表达(图8中的b)，得到工程菌株S0-TP3、S0-TP5和S0-TP8。结果显示，S0-TP8的碳源吸收能力与菌株产素能力最好，总糖残余量相比于出发菌株S0下降了42.86％，相比于S0-TPK下降了10.49％(图8中的c)，阿维菌素产量相比于出发菌株S0上升了115.76％，相比于S0-TPK上升了22.35％(图8中的d)。这些数据表明，通过对TP6568表达水平的微调，可以使更多的细胞碳通量被重定向到阿维菌素生物合成途径。
基于实施例5展示的数据，我们进一步在不同时间启动子控制下，将GM006564与TP6568共过表达，具体方法为将pTP-p8质粒分别使用PacI与XbaI双酶切和KpnI单酶切，得到线性载体LpTP-p8-1和LpTP-p8-2。以S0基因组为模板，以P355-6564-F/P355-6564-R、P5847-6564-F/P5847-6564-R、6564-P-F/6564-P-R为引物扩增时序启动子片段p3(FP3-2)、p5(FP5-2)和GM006564基因片段(F6-2)。分别将FP3-2与FP5-2两个启动子片段与LpTP-p8-1和F6-2拼接。得到质粒pTP-p8-6564-p3和pTP-p8-6564-p5，将上述两个质粒分别转入S0菌株中，得到工程菌株S0-TP8-6p3与S0-TP8-6p5。同时，使用6564-P8731-F/6564-P8731-R引物扩增基因片段GM006564(F6-3)。将LpTP-p8-2与F6-3拼接得到质粒pTP-p8-6564-p8，将质粒转入S0菌株中得到工程菌株S0-TP8-6p8。结果发现采用p5启动子的菌株S0-TP8-6p5获得了最高的阿维菌素B1a产量(4.76g/L)，分别比S0-TP8高8.68％和比亲本菌株S45高134.48％(图9)。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种糖转运蛋白TP6568，其特征在于，所述糖转运蛋白TP6568由底物结合蛋白GM006568、透性酶GM006567、假定蛋白GM006566和ATP结合蛋白GM006565组成；编码所述底物结合蛋白GM006568的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述透性酶GM006567的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述假定蛋白GM006566的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述ATP结合蛋白GM006565的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述糖转运蛋白TP6568在构建产阿维菌素的重组阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)中的应用。
3.权利要求1所述糖转运蛋白TP6568在构建产米尔贝霉素的重组冰城链霉菌(Streptomycesbingchenggensis)中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用是在冰城链霉菌中过表达糖转运蛋白TP6568。
5.权利要求1所述糖转运蛋白TP6568在构建产谷维菌素的重组生暗灰链霉菌(Streptomycescaniferus)中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用是在生暗灰链霉菌中过表达糖转运蛋白TP6568。
7.权利要求1所述糖转运蛋白TP6568在促进链霉菌糖吸收能力中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述糖为葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、甘露醇、核糖或麦芽糖。
9.一种提高阿维菌素产量的方法，其特征在于，所述方法是在阿维链霉菌中表达权利要求1所述的糖转运蛋白TP6568，或共表达LacI家族转录调节因子GM006564与权利要求1所述的糖转运蛋白TP6568；所述LacI家族转录调节因子GM006564的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
10.一种产阿维菌素的重组链霉菌，其特征在于，所述重组链霉菌以阿维链霉菌为出发菌株，表达权利要求1所述的糖转运蛋白TP6568，或共表达LacI家族转录调节因子GM006564与权利要求1所述的糖转运蛋白TP6568；所述LacI家族转录调节因子GM006564的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
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