CN116724119A - 除草剂抗性植物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物基因工程领域。具体而言，本发明涉及能够在植物中赋予除草剂抗性的对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)突变体，以及产生包含所述对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)突变体的植物的方法。
Description
本发明涉及植物基因工程领域。具体而言，本发明涉及能够在植物中赋予除草剂抗性的对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)突变体，以及产生包含所述对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)突变体的除草剂抗性植物的方法。
发明背景
作物例如水稻生产的一个主要威胁是杂草竞争，这会导致谷物产量降低和质量低劣。虽然可以用耕作来消除杂草，但是经耕种的土地的土壤易受到风和水的侵蚀。由于便于应用和有效性，除草剂处理是控制杂草的首选方法。在减少耕地或设计在土壤表面留下高水平残留物以防止侵蚀的直播种植系统中，除草剂也可以进行杂草控制。
植物中除草剂抗性的开发提供了重要的生产和经济优势；因此，使用除草剂来控制作物中的杂草或不期望的植物几乎成为普遍惯例。然而，此类除草剂的使用也会造成所需作物植物的死亡或生长的降低，这使得除草剂应用的时间和方法相当关键或者在某些情况下根本是不可行的。为了解决这一问题，其中的一个方法是开发抗除草剂的品种。在这个方法中，向作物施用除草剂以控制杂草，而不对抗除草剂的作物造成伤害。
对于农民而言，特别感兴趣的是使用具有更大效力、广杂草谱有效性和快速土壤降解的除草剂。通过允许使用除草剂来控制杂草生长并且没有损害作物的风险，对这些化合物具有抗性的植物、植物组织和种子提供了具有吸引力的解决方案。广谱除草剂的其中一类是那些能抑制植物中对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)活性的化合物。然而，许多作物例如水稻对于许多靶向单子叶植物的HPPD抑制性除草剂是易感的，这使得几乎不可能使用这些除草剂来控制禾本科杂草。
因此，本领域仍然需要开发对HPPD抑制性除草剂具有抗性的作物植物，例如水稻。
发明简述
本申请至少包含以下实施方案：
实施方案1.一种HPPD突变体或其功能性片段，其相对于野生型HPPD在选自第365、378、414、415、417或419位的一或多个位置处具有氨基酸突变例如氨基酸取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
实施方案2.根据实施方案1的HPPD突变体或其功能性片段，其相对于野生型HPPD在选自以下的位置处具有氨基酸突变例如氨基酸取代，所述氨基酸位置参考 SEQ ID NO:1：
i)第378和415位；
ii)第378和417位；
iii)第414和417位；或
iv)第378、415和417位。
实施方案3.根据实施方案1或2的HPPD突变体或其功能性片段，所述野生型HPPD包含SEQ ID NO:1-13之一的氨基酸序列。
实施方案4.根据实施方案1-3中任一项的HPPD突变体或其功能性片段，所述HPPD突变体或其功能性片段在植物中表达时，能够赋予所述植物对除草剂的抗性。
实施方案5.根据实施方案4的HPPD突变体或其功能性片段，所述除草剂选自吡唑类化合物，例如苯吡唑草酮、磺酰草吡唑、酸苯偶氮吡胺；三酮类化合物，例如磺草酮、硝磺草酮、特波三酮、特糠酯酮、双环吡喃酮、苯并双环酮；异噁唑类化合物，例如异噁唑草酮；二酮腈类化合物，例如2-氰基-3-环丙基-1-(2-甲基磺酰基-4-三氟甲基苯基)-丙烷-1,3-二酮和2-氰基-1-[4-(甲基磺酰基)-2-三氟甲基苯基]-3-(1-甲基环丙基)丙烷-1,3-二酮；和二苯酮类化合物，或它们的任意组合。
实施方案6.根据实施方案1-5中任一项的HPPD突变体或其功能性片段，其中相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段包含选自L365K、F378A、G414A、G414V、G415A、G415V、G417S、G417A、G417K、G419W、G417V、G417R、G417N、G417D、G417C、G417Q、G417E、G417H、G417I、G417M、G417F、G417P、G417T的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
实施方案7.根据实施方案6的HPPD突变体或其功能性片段，其中相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段包含选自以下的氨基酸取代
i)F378A和G415A；
ii)F378A和G415V；
iii)F378A和G417K；
iv)F378A和G417R；
v)F378A和G417V；
vi)F378A和G417A；
vii)G414V和G417K；
viii)F378A、G415A和G417A；或
ix)F378A、G415V和G417K；
其中所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
实施方案8.根据实施方案1-7中任一项的HPPD突变体或其功能性片段，所述HPPD突变体包含SEQ ID NO:14-55中任一所示的氨基酸序列。
实施方案9.一种核酸，其包含编码实施方案1-8中任一项的HPPD突变体或其功能性片段的核苷酸序列。
实施方案10.一种表达盒，其包含与调控序列可操纵地连接的编码实施方案1-8中任一项的HPPD突变体或其功能性片段的核苷酸序列。
实施方案11.一种表达构建体，其包含实施方案10的表达盒。
实施方案12.一种通过转基因产生除草剂抗性植物的方法，包括将实施方案9的核酸、实施方案10的表达盒和/或实施方案11的表达构建体导入所述植物中。
实施方案13.一种产生除草剂抗性植物的方法，所述方法包括靶向修饰植物的内源HPPD编码序列，由此导致所述内源HPPD在选自第365、378、414、415、417或419位的一或多个位置处的氨基酸突变，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
实施方案14.根据实施方案13的方法，其中所述靶向修饰导致所述内源HPPD包含选自L365K、F378A、G414A、G414V、G415A、G415V、G417S、G417A、G417K、G419W、F378A/G417A、G417V、G417R、G417N、G417D、G417C、G417Q、G417E、G417H、G417I、G417M、G417F、G417P、G417T的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:11。
实施方案15.根据实施方案13或14的方法，其中所述靶向修饰导致实施方案1-8中任一项所述的HPPD突变体。
实施方案16.根据实施方案13-15中任一项的方法，其中通过基因编辑或同源重组来进靶向修饰所述内源HPPD的编码序列。
实施方案17.根据实施方案16的方法，其中所述基因编辑是碱基编辑(base editing)或引导编辑(prime editing)。
实施方案18.一种产生除草剂抗性植物的方法，包括对所述植物的群体进行物理诱变或化学诱变，并且筛选内源HPPD至少在选自第365、378、414、415、417或419位的一或多个位置，例如1、2、3、4、5或6个位置处包含氨基酸突变的植物，其中所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
实施方案19.根据实施方案18的方法，其中筛选内源HPPD包含至少选自L365K、F378A、G414A、G414V、G415A、G415V、G417S、G417A、G417K、G419W、F378A/G417A、G417V、G417R、G417N、G417D、G417C、G417Q、G417E、G417H、G417I、G417M、G417F、G417P、G417T的一个或多个氨基酸取代的植物，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
实施方案20.根据实施方案18或19的方法，其中筛选包含或表达实施方案1-8中任一项所述的HPPD突变体的植物。
实施方案21.根据实施方案18-20中任一项的方法，其中所述物理诱变包括通过放射性照射所述植物群体，所述化学诱变包括通过用甲基磺酸乙酯(EMS)处理所述植物群体。
实施方案22.根据实施方案12-21中任一项的方法，其中所述植物包括单子叶植物或双子叶植物，优选地，所述植物是作物植物，例如单子叶作物植物。
实施方案23.根据实施方案22的方法，其中所述植物选自水稻、小麦、大麦、高 粱、玉米、燕麦、拟南芥、硬直黑麦草、旱雀麦、野生大豆、大豆和烟草。
实施方案24.一种除草剂抗性植物或其后代，其包含或表达实施方案1-8中任一项所述的HPPD突变体或其功能性片段，或其通过实施方案12-21中任一项的方法产生。
实施方案25.根据实施方案24的除草剂抗性植物或其后代，其中所述植物包括单子叶植物或双子叶植物，优选地，所述植物是作物植物，例如单子叶作物植物。
实施方案26.根据实施方案25的除草剂抗性植物或其后代，其中所述植物选自水稻、小麦、大麦、高粱、玉米、燕麦、拟南芥、硬直黑麦草、旱雀麦、野生大豆、大豆和烟草。
图1-图6示出在体外生化实验中测试的具有硝磺草酮除草剂抗性的突变体。与野生型相比，图中具有除草剂抗性突变体依次为L365K、F378A、G419W、G417A、G417A/F378A、G417S、G417K、G415A、G415V、G414A、G414V、G417V、G417R、G417N、G417D、G417C、G417Q、G417E、G417H、G417I、G417M、G417F、G417P、G417T。第一张图1表示这些突变体都是具有酶活的，代表它们都可以催化底物(HPPA)生成产物，有最基本的植物生长的酶活性。图2至图6分别表示了各个突变体比野生型都具有抗除草剂活性，使用的除草剂为硝磺草酮，横坐标为硝磺草酮的浓度梯度，纵坐标为测的吸光值计算出的生成产物的速度(V)。
图1各个突变体的酶反应动力学参数。
图2突变体L365K和F378A比野生型抗除草剂。
图3突变体G419W和G417A比野生型抗除草剂。
图4突变体G417A/F378A和G417S比野生型抗除草剂。
图5突变体G417K、G415A、G415V、G414A、G414V比野生型抗除草剂。
图6突变体G417V、G417R、G417N、G417D、G417C、G417Q、G417E、G417H、G417I、G417M、G417F、G417P、G417T比野生型抗除草剂。
图7示出水稻HPPD高抗性位点的双突和三突抗性。左边的Y轴表示酶活，右边的Y轴表示抑制常数，抑制常数Ki越高，抗性越强。
图8示出玉米和大豆来源的HPPD突变体的酶反应动力学常数和抑制常数(抗性)。依次对应的水稻来源的HPPD位点是：F378A/G417A、G414A、G417K、G417Q、G417R。
图9示出水稻HPPD蛋白的过表达载体示意图。
图10示出已知HPPD-mRNA的相对表达量情况下，表达不同抗性突变的水稻经过筛选后的表型。
图11示出在mRNA相对表达量相近时，表达G417K突变的烟草具有更强的耐药性。
发明内容
一、定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。例如，本发明中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，1989(下文称为“Sambrook”)。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文所用，术语“和/或”涵盖由该术语连接的项目的所有组合，应视作各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”涵盖了“A”、“A和B”以及“B”。例如，“A、B和/或C”涵盖“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
“包含”一词在本文中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。此外，本领域技术人员清楚多肽N端由起始密码子编码的甲硫氨酸在某些实际情况下(例如在特定表达系统表达时)会被保留，但不实质影响多肽的功能。因此，本申请说明书和权利要求书中在描述具体的多肽氨基酸序列时，尽管其可能不包含N端由起始密码子编码的甲硫氨酸，然而此时也涵盖包含该甲硫氨酸的序列，相应地，其编码核苷酸序列也可以包含起始密码子；反之亦然。
针对序列而言的“外源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。
“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸”可互换使用并且是单链或双链RNA或DNA聚合物，任选地可含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸通过如下它们的单个字母名称来指代：“A”为腺苷或脱氧腺苷(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷或脱氧胞苷，“G”表示鸟苷或脱氧鸟苷，“U”表示尿苷，“T”表示脱氧胸苷，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“D”表示A、T或G，“I”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。
密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁地或者最频繁地使用的密码子代替天然序列的至少一个密码子(例如约或多于约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个密码子同时维持该天然氨基酸序列而修饰核酸序列以便增强在感兴趣宿主细胞中的表达的方法。不同的物种对于特定氨基酸的某些密码子展示出特定的偏好。密码子偏好性(在生物之间的密码子使用的差异)经常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而该翻译效率则被认为依赖于被翻译的密码子的性质和特定的转运RNA(tRNA)分 子的可用性。细胞内选定的tRNA的优势一般反映了最频繁用于肽合成的密码子。因此，可以将基因定制为基于密码子优化在给定生物中的最佳基因表达。密码子利用率表可以容易地获得，例如在www.kazusa.orjp/codon/上可获得的密码子使用数据库(“Codon Usage Database”)中，并且这些表可以通过不同的方式调整适用。参见，Nakamura Y.等，“Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases:status for the year2000.Nucl.Acids Res.，28:292(2000)。
“多肽”、“肽”、和“蛋白”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
序列“相同性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列相同性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列相同性。(参见，例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；and Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991)。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的相同性的方法，但是术语“相同性”是技术人员公知的(Carrillo,H.&Lipman,D.,SIAM J Applied Math 48:1073(1988))。
在肽或蛋白中，合适的保守型氨基酸取代是本领域技术人员已知的，并且一般可以进行而不改变所得分子的生物活性。通常，本领域技术人员认识到多肽的非必需区中的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见，例如，Watson et al.,Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.co.,p.224)。
如本发明所用，“表达构建体”是指适于感兴趣的核苷酸序列在生物体中表达的载体如重组载体。“表达”指功能产物的产生。例如，核苷酸序列的表达可指核苷酸序列的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
本发明的“表达构建体”可以是线性的核酸片段、环状质粒、病毒载体，或者，在一些实施方式中，可以是能够翻译的RNA(如mRNA)，例如是体外转录生成的RNA。
本发明的“表达构建体”可包含不同来源的调控序列和感兴趣的核苷酸序列，或相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和感兴趣的核苷酸序列。
“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。在本发明的一些实施方案中，启动子是能够控制细胞中基因转录的启动子，无论其是否来源于所述细胞。启动子可以是组成型启动子或组织特异性启动子或发育调控启动子或诱导型启动子。
“组成型启动子”指一般将引起基因在多数细胞类型中在多数情况下表达的启动子。“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而且也可在一种特定细胞或细胞型中表达的启动子。“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。“诱导型启动子”响应内源性或外源性刺激(环境、激素、化学信号等)而选择性表达可操纵连接的DNA序列。
启动子的实例包括但不限于聚合酶(pol)I、pol II或pol III启动子。当用于植物时，启动子可以是花椰菜花叶病毒35S启动子、玉米Ubi-1启动子、小麦U6启动子、水稻U3启动子、玉米U3启动子、水稻肌动蛋白启动子。
如本文中所用，术语“可操作地连接”指调控元件(例如但不限于，启动子序列、转录终止序列等)与核酸序列(例如，编码序列或开放读码框)连接，使得核苷酸序列的转录被所述转录调控元件控制和调节。用于将调控元件区域可操作地连接于核酸分子的技术为本领域已知的。
将核酸分子(例如质粒、线性核酸片段、RNA等)或蛋白质“导入”生物体是指用所述核酸或蛋白质转化生物体细胞，使得所述核酸或蛋白质在细胞中能够发挥功能。本发明所用的“转化”包括稳定转化和瞬时转化。“稳定转化”指将外源核苷酸序列导入基因组中，导致外源基因稳定遗传。一旦稳定转化，外源核酸序列稳定地整合进所述生物体和其任何连续世代的基因组中。“瞬时转化”指将核酸分子或蛋白质导入细胞中，执行功能而没有外源基因稳定遗传。瞬时转化中，外源核酸序列不整合进基因组中。
如本文所使用的，术语“植物”包括整个植物和任何后代、植物的细胞、组织、或部分。术语“植物部分”包括植物的任何部分，包括，例如但不限于：种子(包括成熟种子、没有种皮的未成熟胚、和不成熟的种子)；植物插条(plant cutting)；植物细胞；植物细胞培养物；植物器官(例如，花粉、胚、花、果实、芽、叶、根、茎，和相关外植体)。植物组织或植物器官可以是种子、愈伤组织、或者任何其他被组织成结构或功能单元的植物细胞群体。植物细胞或组织培养物能够再生出具有该细胞或组织所来源的植物的生理学和形态学特征的植物，并能够再生出与该植物具有基本上相同基因型的植物。与此相反，一些植物细胞不能够再生产生植物。植物细胞或组织培养物中的可再生细胞可以是胚、原生质体、分生细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、丝、花、果仁、穗、穗轴、壳、或茎。
植物“后代”包括植物的任何后续世代。
二、赋予除草剂抗性的对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)突变体
对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)同时参与酪氨酸分解代谢和质体醌和生育酚的生 物合成两条代谢途径。对羟基苯基丙酮酸在HPPD酶催化下转化得到尿黑酸。尿黑酸进一步脱羧、烷基化，生成质体醌和生育酚。质体醌在类胡萝卜素生物合成中作为最终的电子受体以及光合链中的电子传递体，类囊体中质体醌的缺乏将导致类胡萝卜素生物合成减少。对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)抑制剂具有广谱的除草活性，能防除阔叶作物中的阔叶杂草，可以在芽前使用，也可以在苗后使用，具有活性高、残留低、环境相容性好、使用安全的特点。
HPPD抑制性除草剂包括但不限于吡唑类、三酮类、异噁唑类、二酮腈类和二苯酮类化合物，或它们的任意组合。合适的吡唑类化合物包括但不限于苯吡唑草酮(苞卫)、磺酰草吡唑、酸苯偶氮吡胺等。合适的三酮类化合物包括但不限于磺草酮、硝磺草酮、特波三酮、特糠酯酮、双环吡喃酮、苯并双环酮等。合适的异噁唑类化合物包括但不限于异噁唑草酮。合适的二酮腈类化合物包括但不限于2-氰基-3-环丙基-1-(2-甲基磺酰基-4-三氟甲基苯基)-丙烷-1,3-二酮和2-氰基-1-[4-(甲基磺酰基)-2-三氟甲基苯基]-3-(1-甲基环丙基)丙烷-1,3-二酮。
在本发明中，发明人通过原核表达和酶活性分析技术，创建并鉴定出对HPPD抑制性除草剂具有抗性的新的HPPD突变体。
因此，在一方面，本发明提供了一种对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)突变体或其功能性片段，其相对于野生型HPPD至少在选自第365、378、414、415、417或419位的一或多个位置处具有氨基酸突变，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，所述HPPD突变体或其功能性片段，其相对于野生型HPPD至少在选自第365、378、414、415、417或419位的1个、2个、3个、5个或6位置处具有氨基酸突变，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，所述HPPD突变体或其功能性片段，其相对于野生型HPPD至少在第378和415位处具有氨基酸突变，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述HPPD突变体或其功能性片段，其相对于野生型HPPD至少在第378和417位处具有氨基酸突变，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述HPPD突变体或其功能性片段，其相对于野生型HPPD至少在第414和417位处具有氨基酸突变，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述HPPD突变体或其功能性片段，其相对于野生型HPPD至少在第378、415和417位处具有氨基酸突变，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
如本文所用，“氨基酸位置参考SEQ ID NO:x”(SEQ ID NO:x为本文所列的某一具体序列)指的是所描述的具体氨基酸的位置编号是该氨基酸在SEQ ID NO:x上对应的氨基酸的位置编号。不同序列中的氨基酸的对应性可以根据本领域公知的序列比对方法确定。例如氨基酸对应性可以通过EMBL-EBI的在线比对工具来确定(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/)，其中两个序列可以使用Needleman-Wunsch算法，使用默认参数来对齐。例如，一多肽从其N末端起第360位的丙氨酸与SEQ ID NO:x的第365位的氨基酸在序列比对中对齐，则该多肽中的该丙氨酸在本文中也可以被描述 为“在该多肽的第365位的丙氨酸，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:x”。再例如，本发明中的氨基酸序列SEQ ID NO:9中的真实位置第412位的甘氨酸与SEQ ID NO:1的第417位的甘氨酸在序列比对中对齐，则SEQ ID NO:9中的该甘氨酸在本文中也可以被描述为“在SEQ ID NO:9的第417位的甘氨酸，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1”。
在一些实施方案中，所述HPPD突变体或其功能性片段在植物中表达时，能够赋予所述植物对除草剂例如HPPD抑制性除草剂的抗性。“赋予所述植物对除草剂例如HPPD抑制性除草剂的抗性”指的是包含或表达所述HPPD突变体或其功能性片段的植物对除草剂例如HPPD抑制性除草剂的抗性相对于不包含或不表达所述HPPD突变体或其功能性片段或仅包含或表达(相当的量的)野生型HPPD的植物增强，例如增强10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或更高。对HPPD抑制性除草剂的抗性的测定方法是本领域已知的。抗性可以由本领域技术人员根据具体的植物和具体的除草剂容易地确定。在一些实施方案中，本发明的除草剂抗性植物能够在至少1μmol/L、至少1.5μmol/L、至少1.8μmol/L、至少2μmol/L、至少3μmol/L、至少5μmol/L、至少10mol/L或更高浓度的除草剂(例如HPPD抑制性除草剂，如硝磺草酮)存在下展现出正常生长。
本发明的HPPD突变体或其功能性片段对HPPD抑制性除草剂的抗性可以在体外通过本申请所描述的酶反应动力学方法测定，例如参见实施例4所描述的方法。本发明的HPPD突变体或其功能性片段对HPPD抑制性除草剂的抗性可以在体内通过检测HPPD抑制性除草剂存在下包含所述突变体或其功能性片段的植物的生长状况来测定，例如参见实施例5所描述的方法。
在一些实施方案中，所述野生型HPPD包含SEQ ID NO:1-13之一的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述野生型HPPD的氨基酸序列例如为SEQ ID NO:1-13之一。在一些实施方案中，所述野生型HPPD例如是与SEQ ID NO:1-13之一的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％的序列相同性的SEQ ID NO:1-13之一的天然存在的变体。在一些实施方案中，所述HPPD突变体衍生自水稻野生型HPPD。示例性的水稻野生型HPPD包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPPD突变体衍生自小麦(Triticum aestivum)野生型HPPD。示例性的小麦野生型HPPD包含SEQ ID NO:2、3或4所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPPD突变体衍生自燕麦(Avena sativa)野生型HPPD。示例性的燕麦野生型HPPD包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPPD突变体衍生自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)野生型HPPD。示例性的荧光假单胞菌野生型HPPD包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPPD突变体衍生自硬直黑麦草(Lolium rigidum)野生型HPPD。示例性的硬直黑麦草野生型HPPD包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPPD突变体衍生自旱雀麦(Bromus tectorum)野生型HPPD。示例性的旱雀麦野生型HPPD包含SEQ ID NO:8所示 的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPPD突变体衍生自玉米(Zea mays)野生型HPPD。示例性的玉米野生型HPPD包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPPD突变体衍生自大麦(Hordeum vulgare)野生型HPPD。示例性的大麦野生型HPPD包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPPD突变体衍生自野生大豆(Glycine soja)野生型HPPD。示例性的野生大豆野生型HPPD包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPPD突变体衍生自拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型HPPD。示例性的拟南芥野生型HPPD包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPPD突变体衍生自大豆(Glycine max)野生型HPPD。示例性的大豆野生型HPPD包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述氨基酸突变是氨基酸取代。
在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第365位的亮氨酸(L)被取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第378位的苯丙氨酸(F)被取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第414位的甘氨酸(G)被取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第415位的甘氨酸(G)被取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第417位的甘氨酸(G)被取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第419的甘氨酸(G)被取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第378的苯丙氨酸(F)和在第417位的甘氨酸(G)被取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第378的苯丙氨酸(F)和在第415位的甘氨酸(G)被取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第414位的甘氨酸(G)和在第417位的甘氨酸(G)被取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第378的苯丙氨酸(F)、在第415位的甘氨酸(G)和在第417位的甘氨酸(G)被取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第365位的亮氨酸(L)被赖氨酸(K)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第378位的苯丙氨酸(F)被丙氨酸(A)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第414位的甘氨酸(G)被丙氨酸(A)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第414位的甘氨酸(G)被缬氨酸(V)取代， 所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第415位的甘氨酸(G)被丙氨酸(A)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第415位的甘氨酸(G)被缬氨酸(V)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第417位的甘氨酸(G)被丝氨酸(S)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第417位的甘氨酸(G)被丙氨酸(A)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第417位的甘氨酸(G)被赖氨酸(K)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第419的甘氨酸(G)被色氨酸(W)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第378的苯丙氨酸(F)和在第417位的甘氨酸(G)分别被丙氨酸(A)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:13。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第417位的甘氨酸(G)被缬氨酸(V)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第417位的甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第417位的甘氨酸(G)被天冬酰胺(N)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第417位的甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第417位的甘氨酸(G)被半胱氨酸(C)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第417位的甘氨酸(G)被谷氨酰胺(Q)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第417位的甘氨酸(G)被谷氨酸(E)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第417位的甘氨酸(G)被组氨酸(H)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第417位的甘氨酸(G)被异亮氨酸(I)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第417位的甘氨酸(G)被甲硫氨酸(M)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第417位的甘氨酸(G)被苯丙氨酸(F)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第417位的甘氨酸(G)被脯氨酸(P)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案 中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第417位的甘氨酸(G)被苏氨酸(T)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段至少包含选自L365K、F378A、G414A、G414V、G415A、G415V、G417S、G417A、G417K、G419W、F378A/G417A、G417V、G417R、G417N、G417D、G417C、G417Q、G417E、G417H、G417I、G417M、G417F、G417P、G417T的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段至少包含选自L365K、F378A、G414A、G414V、G415A、G415V、G417S、G417A、G417K、G419W、F378A/G417A、G417V、G417R、G417N、G417D、G417C、G417Q、G417E、G417H、G417I、G417M、G417F、G417P、G417T的一个氨基酸取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段至少包含氨基酸取代F378A和G415A，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段至少包含氨基酸取代F378A和G415V，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段至少包含氨基酸取代F378A和G417K，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段至少包含氨基酸取代F378A和G417R，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段至少包含氨基酸取代F378A和G417V，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段至少包含氨基酸取代F378A和G417A，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段至少包含氨基酸取代G414V和G417K，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段至少包含氨基酸取代F378A、G415A和G417A，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段至少包含氨基酸取代F378A、G415V和G417K，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
如本文所用，“功能性片段”指的是至少部分地或全部保留其衍生自的全长HPPD突变体的功能的片段。
在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段还包含一个或多个额外的氨基酸突变，例如保守氨基酸取代。此外，本领域技术人员还能理解的是，在蛋白的末端(C末端和/或N末端)进行少量的氨基酸插入、缺失或添加通常并不显著改变蛋白的功能。例如，可以在蛋白的末端添加标签以利于蛋白纯化和/或检测，如组氨酸标签。
在一些实施方案中，所述HPPD突变体包含与SEQ ID NO:14-55中任一具有至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPPD突变体包含SEQ ID NO:14-55中任一所示的氨基酸序列。
在另一方面，本发明还提供一种核酸，其包含编码本发明的HPPD突变体或其功能性片段的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核酸是分离的核酸或是重组核酸。
在一些实施方案，所述编码本发明的HPPD突变体或其功能性片段的核苷酸序列可以针对感兴趣的植物进行密码子优化。
在另一方面，本发明还提供一种表达盒，其包含与调控序列可操纵地连接的编码HPPD突变体或其功能性片段的核苷酸序列。
在另一方面，本发明还提供一种表达构建体，其包含本发明的表达盒。
在另一方面，本发明还提供本发明的HPPD突变体或其功能性片段、本发明的分离的核酸、本发明的表达盒或本发明的表达构建体在产生除草剂抗性植物中的用途。
在另一方面，本发明还提供一种除草剂抗性植物，其包含或表达本发明的HPPD突变体或其功能性片段。
本发明各个方面中所述植物可以是对HPPD抑制剂敏感的植物，包括单子叶植物或双子叶植物。优选地，所述植物是作物植物，例如单子叶作物植物。合适的植物的实例包括但不限于水稻、小麦、大麦、高粱、玉米、燕麦、拟南芥、硬直黑麦草、旱雀麦、野生大豆、大豆或烟草等。在一些优选实施方案中，所述植物是水稻。在另一些优选实施方案中，所述植物是玉米。在另一些优选实施方案中，所述植物是大豆。在另一些优选实施方案中，所述植物是烟草。
三、通过转基因产生除草剂抗性植物的方法
在另一方面，本发明还提供一种通过转基因产生除草剂抗性植物的方法，包括将本发明的核酸、本发明的表达盒和/或本发明的表达构建体导入植物中。在一些实施方案中，本发明的核酸、本发明的表达盒和/或本发明的表达构建体的导入导致所述植物包含或表达本发明的HPPD突变体或其功能性片段。
可以使用本领域已知的各种方法将本发明的核酸、本发明的表达盒和/或本发明的表达构建体导入所述植物中。合适的导入方法包括但不限于基因枪法、PEG介导的原生质体转化、土壤农杆菌介导的转化、植物病毒介导的转化、花粉管通道法和子房注射法。
在一些实施方案中，本发明的核酸、本发明的表达盒和/或本发明的表达构建体整合至所述植物的基因组中。本发明的分离的核酸、本发明的表达盒和/或本发明的表达构建体将赋予所述植物对能够抑制HPPD活性的除草剂的抗性。
在另一方面，本发明还提供一种除草剂抗性植物，所述植物包含本发明的表达盒、本发明的核酸或表达构建体，或由本发明的核酸、本发明的表达盒和/或本发明的表达 构建体转化。本发明还涵盖所述除草剂抗性植物的后代。
本发明各个方面中所述植物可以是对HPPD抑制剂敏感的植物，包括单子叶植物或双子叶植物。优选地，所述植物是作物植物，例如单子叶作物植物。合适的植物的实例包括但不限于水稻、小麦、大麦、高粱、玉米、燕麦、拟南芥、硬直黑麦草、旱雀麦、野生大豆、大豆和烟草等。在一些优选实施方案中，所述植物是水稻。在另一些优选实施方案中，所述植物是玉米。在另一些优选实施方案中，所述植物是大豆。在另一些优选实施方案中，所述植物是烟草。
四、通过靶向修饰植物内源HPPD产生除草剂抗性植物的方法
基于本发明所鉴别的赋予除草剂抗性的HPPD突变体及相应的突变位点，可以通过靶向突变的方式，工程化改造植物内源的HPPD，从而产生除草剂抗性植物。
因此，在一方面，本发明还提供一种产生除草剂抗性植物的方法，所述方法包括修饰例如靶向修饰植物的内源HPPD编码序列，由此导致所述内源HPPD(例如表达的内源HPPD)在选自第365、378、414、415、417或419位的一或多个位置处，例如1、2、3、4、5或6个位置处的氨基酸突变，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
所述植物的内源HPPD例如包含SEQ ID NO:1-13之一的氨基酸序列或其是与SEQ ID NO:1-13之一的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％的序列相同性的天然存在的变体。
在一些实施方案中，所述修饰导致所述内源HPPD(例如表达的内源HPPD)在第365位的亮氨酸(L)被取代，和/或在第378位的苯丙氨酸(F)被取代，和/或在第414位的甘氨酸(G)被取代，和/或在第415位的甘氨酸(G)被取代，和/或在第417位的甘氨酸(G)被取代，和/或在第419的甘氨酸(G)被取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，所述修饰导致所述内源HPPD(例如表达的内源HPPD)在第365位的亮氨酸(L)被赖氨酸(K)取代，和/或在第378位的苯丙氨酸(F)被丙氨酸(A)取代，和/或在第414位的甘氨酸(G)被丙氨酸(A)或缬氨酸(V)取代，和/或在第415位的甘氨酸(G)被丙氨酸(A)或缬氨酸(V)取代，和/或在第417位的甘氨酸(G)被丝氨酸(S)或丙氨酸(A)或赖氨酸(K)或缬氨酸(V)或精氨酸(R)或天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)或半胱氨酸(C)或谷氨酰胺(Q)或谷氨酸(E)或组氨酸(H)或异亮氨酸(I)或甲硫氨酸(M)或苯丙氨酸(F)或脯氨酸(P)或苏氨酸(T)取代，和/或在第419的甘氨酸(G)被色氨酸(W)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，所述修饰导致所述内源HPPD(例如表达的内源HPPD)包含选自L365K、F378A、G414A、G414V、G415A、G415V、G417S、G417A、G417K、G419W、F378A/G417A、G417V、G417R、G417N、G417D、G417C、G417Q、G417E、G417H、G417I、G417M、G417F、G417P、G417T的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，所述修饰导致本发明上文所述HPPD突变体，例如导致所述植物表达本发明上文所述HPPD突变体。
因此，本发明还提供一种产生除草剂抗性植物的方法，所述方法包括修饰例如靶向修饰植物的内源HPPD编码序列，由此导致本发明上文所述HPPD突变体，例如导致所述植物表达本发明上文所述HPPD突变体。
“除草剂抗性植物”可以指的是相对于未经所述靶向修饰的植物，本发明的内源HPPD编码序列经靶向修饰的植物对HPPD抑制性除草剂的抗性增强，例如增强10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或更高。对HPPD抑制性除草剂的抗性的测定方法是本领域已知的。抗性可以由本领域技术人员根据具体的植物和具体的除草剂容易地确定。在一些实施方案中，本发明的除草剂抗性植物能够在至少1μmol/L、至少1.5μmol/L、至少1.8μmol/L、至少2μmol/L、至少3μmol/L、至少5μmol/L、至少10mol/L或更高浓度的除草剂(例如HPPD抑制性除草剂，如硝磺草酮)存在下展现出正常生长。
在一些实施方案中，通过同源重组来靶向修饰植物的内源HPPD编码序列。通过同源重组来实现植物内源基因修饰的方法是本领域技术人员所熟知的。
在一些实施方案中，通过基因编辑来靶向修饰植物的内源HPPD编码序列。在一些实施方案中，通过将靶向所述植物基因组中内源HPPD编码区的基因编辑系统导入植物来靶向修饰所述植物的内源HPPD编码序列。
在一些实施方案中，所述基因编辑系统的导入导致所述内源HPPD在选自第365、378、414、415、417或419位的一或多个位置处的氨基酸突变，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，所述基因编辑系统的导入导致所述内源HPPD在第365位的亮氨酸(L)被取代，和/或在第378位的苯丙氨酸(F)被取代，和/或在第414位的甘氨酸(G)被取代，和/或在第415位的甘氨酸(G)被取代，和/或在第417位的甘氨酸(G)被取代，和/或在第419的甘氨酸(G)被取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，所述基因编辑系统的导入导致所述内源HPPD在第365位的亮氨酸(L)被赖氨酸(K)取代，和/或在第378位的苯丙氨酸(F)被丙氨酸(A)取代，和/或在第414位的甘氨酸(G)被丙氨酸(A)或缬氨酸(V)取代，和/或在第415位的甘氨酸(G)被丙氨酸(A)或缬氨酸(V)取代，和/或在第417位的甘氨酸(G)被丝氨酸(S)或丙氨酸(A)或赖氨酸(K)或缬氨酸(V)或精氨酸(R)或天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)或半胱氨酸(C)或谷氨酰胺(Q)或谷氨酸(E)或组氨酸(H)或异亮氨酸(I)或甲硫氨酸(M)或苯丙氨酸(F)或脯氨酸(P)或苏氨酸(T)取代，和/或在第419的甘氨酸(G)被色氨酸(W)取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，所述基因编辑系统的导入导致所述内源HPPD包含选自L365K、F378A、G414A、G414V、G415A、G415V、G417S、G417A、G417K、G419W、F378A/G417A、G417V、G417R、G417N、G417D、G417C、G417Q、 G417E、G417H、G417I、G417M、G417F、G417P、G417T的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，所述基因编辑系统的导入导致本发明上文所述HPPD突变体，例如导致所述植物表达本发明上文所述HPPD突变体。
本发明可用的基因编辑系统可以是本领域已知的各种基因编辑系统，只要其能在植物内进行靶向基因组编辑。所述基因编辑系统可以是基于CRISPR、ZFN或TALEN的基因编辑系统。优选地，所述基因编辑系统是基于CRISPR的基因编辑系统。
在一些优选实施方案中，所述基因编辑系统是碱基编辑系统。本发明可用的碱基编辑系统可以是本领域已知的各种碱基编辑系统，只要其能在植物内进行靶向基因组碱基编辑。例如，所述碱基编辑系统包括但不限于WO 2018/056623、WO 2019/120283、WO 2019/120310中记载的那些。
在一些实施方案中，所述碱基编辑系统包含碱基编辑融合蛋白或包含编码其的核苷酸序列的表达构建体，以及至少一种向导RNA或包含编码其的核苷酸序列的表达构建体，例如所述系统包含以下i)至v)中至少一项：
i)碱基编辑融合蛋白，和至少一种向导RNA；
ii)包含编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和至少一种向导RNA；
iii)碱基编辑融合蛋白，和包含编码至少一种向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
iv)包含编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和包含编码至少一种向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
v)包含编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列和编码至少一种向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
其中所述碱基编辑融合蛋白包含CRISPR效应蛋白和脱氨酶结构域，所述至少一种向导RNA能够将所述碱基编辑融合蛋白靶向植物基因组中的内源HPPD编码序列。
在本文实施方案中，“碱基编辑融合蛋白”和“碱基编辑器”可互换使用，指的是可以以序列特异性方式介导基因组中靶序列的一或多个核苷酸取代的蛋白。
如本文所用，术语“CRISPR效应蛋白”通常指在天然存在的CRISPR系统中存在的核酸酶(CRISPR核酸酶)或其功能性变体。该术语涵盖基于CRISPR系统的能够在细胞内实现序列特异性靶向的任何效应蛋白。
如本文所用，就CRISPR核酸酶而言的“功能性变体”意指其至少保留向导RNA介导的序列特异性靶向能力。优选地，所述功能性变体是核酸酶失活的变体，即其缺失双链核酸切割活性。然而，缺失双链核酸切割活性的CRISPR核酸酶也涵盖切口酶(nickase)，其在双链核酸分子形成切口(nick)，但不完全切断双链核酸。在本发明的一些优选的实施方案中，本发明所述CRISPR效应蛋白具有切口酶活性。在一些实施方案中，所述功能性变体相对于野生型核酸酶识别不同的PAM(前间区序列邻近基序)序列。
“CRISPR效应蛋白”可以衍生自Cas9核酸酶，包括Cas9核酸酶或其功能性变体。所述Cas9核酸酶可以是来自不同物种的Cas9核酸酶，例如来自化脓链球菌(S.pyogenes)的spCas9或衍生自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的SaCas9。“Cas9核酸酶”和“Cas9”在本文中可互换使用，指的是包括Cas9蛋白或其片段(例如包含Cas9的活性DNA切割结构域和/或Cas9的gRNA结合结构域的蛋白)的RNA指导的核酸酶。Cas9是CRISPR/Cas(成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统)基因组编辑系统的组分，能在向导RNA的指导下靶向并切割DNA靶序列形成DNA双链断裂(DSB)。
“CRISPR效应蛋白”还可以衍生自Cpf1核酸酶，包括Cpf1核酸酶或其功能性变体。所述Cpf1核酸酶可以是来自不同物种的Cpf1核酸酶，例如来自Francisella novicida U112、Acidaminococcus sp.BV3L6和Lachnospiraceae bacterium ND2006的Cpf1核酸酶。
可用的“CRISPR效应蛋白”还可以衍生自Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3、GSU0054、Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11、Csx10、Csf1、Csn2、Cas4、C2c1、C2c3或C2c2核酸酶，例如包括这些核酸酶或其功能性变体。
在一些实施方案中，所述CRISPR效应蛋白是核酸酶失活的Cas9。Cas9核酸酶的DNA切割结构域已知包含两个亚结构域：HNH核酸酶亚结构域和RuvC亚结构域。HNH亚结构域切割与gRNA互补的链，而RuvC亚结构域切割非互补的链。在这些亚结构域中的突变可以使Cas9的核酸酶活性失活，形成“核酸酶失活的Cas9”。所述核酸酶失活的Cas9仍然保留gRNA指导的DNA结合能力。
本发明所述核酸酶失活的Cas9可以衍生自不同物种的Cas9，例如，衍生自化脓链球菌(S.pyogenes)Cas9(SpCas9)，或衍生自金黄色葡萄球菌(S.aureus)Cas9(SaCas9)。同时突变Cas9的HNH核酸酶亚结构域和RuvC亚结构域(例如，包含突变D10A和H840A)使Cas9的核酸酶失去活性，成为核酸酶死亡Cas9(dCas9)。突变失活其中一个亚结构域可以使得Cas9具有切口酶活性，即获得Cas9切口酶(nCas9)，例如，仅具有突变D10A的nCas9。
Cas9核酸酶在用于基因编辑时，通常需要靶序列在3’端具有5’-NGG-3’的PAM(前间区序列邻近基序)序列。然而，这一PAM序列在某些物种例如水稻中出现频率很低，极大地限制了在这些物种如水稻中的基因编辑。为此，本发明中优选使用识别不同的PAM序列的CRISPR效应蛋白，例如具有不同的PAM序列的Cas9核酸酶功能性变体。
在一些优选实施方案中，所述CRISPR效应蛋白是识别PAM序列5’-NG-3’的Cas9变体。在一些优选实施方案中，所述CRISPR效应蛋白是核酸酶失活的且识别PAM序列5’-NG-3’的Cas9变体。
本文所述脱氨酶结构域可以是胞嘧啶脱氨结构域或腺嘌呤脱氨结构域。
如本文所用，“胞嘧啶脱氨结构域”指的是能够接受单链DNA作为底物，催化胞苷或脱氧胞苷分别脱氨化为尿嘧啶或脱氧尿嘧啶的结构域。
可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶的实例包括但不限于例如APOBEC1脱氨酶、激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)、APOBEC3G、CDA1、人APOBEC3A脱氨酶，或它们的功能性变体。在一些实施方式中，所述胞嘧啶脱氨酶是人APOBEC3A脱氨酶或其功能性变体。
如本文所用，“腺嘌呤脱氨结构域”是指能够接受单链DNA作为底物，催化腺苷或脱氧腺苷(A)形成肌苷(I)的结构域。在一些实施方案中，所述腺嘌呤脱氨酶是大肠杆菌tRNA腺嘌呤脱氨酶TadA(ecTadA)的变体。
如本文所用，“向导RNA”和“gRNA”可互换使用，指的是能够与CRISPR效应蛋白形成复合物并由于与靶序列具有一定相同性而能够将所述复合物靶向靶序列的RNA分子。向导RNA通过与靶序列互补链之间的碱基配对而靶向所述靶序列。例如，Cas9核酸酶或其功能性变体所采用的gRNA通常由部分互补形成复合物的crRNA和tracrRNA分子构成，其中crRNA包含与靶序列具有足够相同性以便与该靶序列的互补链杂交并且指导CRISPR复合物(Cas9+crRNA+tracrRNA)与该靶序列序列特异性地结合的引导序列(也称种子序列)。然而，本领域已知可以设计单向导RNA(sgRNA)，其同时包含crRNA和tracrRNA的特征。而Cpf1核酸酶或其功能性变体所采用的gRNA通常仅由成熟crRNA分子构成，其也可称为sgRNA。基于所使用的CRISPR核酸酶和待编辑的靶序列设计合适的gRNA属于本领域技术人员的能力范围内。
在一些实施方案中，本发明所述至少一种gRNA包含所述内源HPPD编码区中的靶序列，所述靶序列所编码的氨基酸序列包含所述内源HPPD在选自第365、378、414、415、417或419位的一或多个位置处，例如1、2、3、4、5或6个位置处的氨基酸，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，所述基因编辑系统是所谓的引导编辑(prime editing)系统。该系统包括有靶标链切口活性的Cas核酸酶(例如，Cas9-H840A)与逆转录酶(例如M-MLV逆转录酶)的融合物、以及一个3’端带有修复模板(RT template)和游离单链的结合区(PBS)的pegRNA(prime editing gRNA，引导编辑gRNA)。该系统通过PBS结合Cas切口酶(例如Cas9-H840A)所产生的游离单链，并使其依照给定的RT模板转录出单链DNA序列，经过细胞的修复，可以在基因组中实现位于PAM序列-3位下游的DNA序列的任意变化。例如，引导编辑(prime editing)系统可以参照Anzalone,A.et al.Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.Nature https://doi.org/10.1038/s41586-019-1711-4(2019)所描述的。
在本发明的方法中，所述基因编辑系统可以本领域技术人员熟知的各种方法导入植物。可用于将本发明的基因编辑系统导入植物的方法包括但不限于：基因枪法、PEG介导的原生质体转化、土壤农杆菌介导的转化、植物病毒介导的转化、花粉管通道法和子房注射法。
在本发明的方法中，只需在植物细胞中导入或产生所述基因编辑系统即可实现对靶序列的修饰，并且所述修饰可以稳定遗传，无需将所述基因编辑系统稳定转化植物。 这样避免了稳定存在的基因编辑系统的潜在脱靶作用，也避免外源核苷酸序列在植物基因组中的整合，从而具有更高生物安全性。
在一些优选实施方式中，所述导入在不存在选择压力下进行，从而避免外源核苷酸序列在植物基因组中的整合。
在一些实施方式中，所述导入包括将本发明的基因编辑系统转化至分离的植物细胞或组织，然后使所述经转化的植物细胞或组织再生为完整植物。优选地，在不存在选择压力下进行所述再生，也即是，在组织培养过程中不使用任何针对表达载体上携带的选择基因的选择剂。不使用选择剂可以提高植物的再生效率，获得不含外源核苷酸序列的除草剂抗性植物。
在另一些实施方式中，可以将本发明的基因编辑系统转化至完整植物上的特定部位，例如叶片、茎尖、花粉管、幼穗或下胚轴。这特别适合于难以进行组织培养再生的植物的转化。
在本发明的一些实施方式中，直接将体外表达的蛋白质和/或体外转录的RNA分子转化至所述植物。所述蛋白质和/或RNA分子能够在植物细胞中实现基因编辑，随后被细胞降解，避免了外源核苷酸序列在植物基因组中的整合。
在另一方面，本发明还提供一种除草剂抗性植物，所述植物通过本发明的靶向修饰植物内源HPPD的方法产生。本发明还涵盖所述除草剂抗性植物的后代。
在本发明的一些实施方式中，所述除草剂抗性植物是非转基因的。
本发明各个方面中所述植物可以是对HPPD抑制剂敏感的植物，包括单子叶植物或双子叶植物。优选地，所述植物是作物植物，例如单子叶作物植物。合适的植物的实例包括但不限于水稻、小麦、大麦、高粱、玉米、燕麦、拟南芥、硬直黑麦草、旱雀麦、野生大豆、大豆和烟草等。在一些优选实施方案中，所述植物是水稻。在另一些优选实施方案中，所述植物是玉米。在另一些优选实施方案中，所述植物是大豆。在另一些优选实施方案中，所述植物是烟草。
五、通过物理或化学诱变产生除草剂抗性植物的方法
在另一方面，本发明还提供一种产生除草剂抗性植物的方法，包括对所述植物的群体进行物理诱变或化学诱变，并且筛选内源HPPD(例如表达的内源HPPD)至少在选自第365、378、414、415、417或419位的一或多个位置，例如1、2、3、4、5或6个位置处包含氨基酸突变的植物，其中所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，筛选内源HPPD(例如表达的内源HPPD)至少在第365位的亮氨酸(L)被取代，和/或在第378位的苯丙氨酸(F)被取代，和/或在第414位的甘氨酸(G)被取代，和/或在第415位的甘氨酸(G)被取代，和/或在第417位的甘氨酸(G)被取代，和/或在第419的甘氨酸(G)被取代的植物，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，筛选内源HPPD(例如表达的内源HPPD)至少在第365位的亮氨酸(L)被赖氨酸(K)取代，和/或在第378位的苯丙氨酸(F)被丙氨酸(A)取代，和/或在第 414位的甘氨酸(G)被丙氨酸(A)或缬氨酸(V)取代，和/或在第415位的甘氨酸(G)被丙氨酸(A)或缬氨酸(V)取代，和/或在第417位的甘氨酸(G)被丝氨酸(S)或丙氨酸(A)或赖氨酸(K)或缬氨酸(V)或精氨酸(R)或天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)或半胱氨酸(C)或谷氨酰胺(Q)或谷氨酸(E)或组氨酸(H)或异亮氨酸(I)或甲硫氨酸(M)或苯丙氨酸(F)或脯氨酸(P)或苏氨酸(T)取代，和/或在第419的甘氨酸(G)被色氨酸(W)取代的植物，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，筛选内源HPPD(例如表达的内源HPPD)包含至少选自L365K、F378A、G414A、G414V、G415A、G415V、G417S、G417A、G417K、G419W、F378A/G417A、G417V、G417R、G417N、G417D、G417C、G417Q、G417E、G417H、G417I、G417M、G417F、G417P、G417T的一个或多个氨基酸取代的植物，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，筛选内源HPPD(例如表达的内源HPPD)被突变为本发明上文所述的HPPD突变体的植物。
因此，本发明还提供一种产生除草剂抗性植物的方法，包括对所述植物的群体进行物理诱变或化学诱变，并且筛选包含或表达本发明上文所述的HPPD突变体的植物。
“除草剂抗性植物”可以指的是相对于不包含所述内源HPPD的突变的植物，本发明的内源HPPD经诱变的植物对HPPD抑制性除草剂的抗性增强，例如增强10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或更高。对HPPD抑制性除草剂的抗性的测定方法是本领域已知的。抗性可以由本领域技术人员根据具体的植物和具体的除草剂容易地确定。在一些实施方案中，本发明的除草剂抗性植物能够在至少1μmol/L、至少1.5μmol/L、至少1.8μmol/L、至少2μmol/L、至少3μmol/L、至少5μmol/L、至少10mol/L或更高浓度的除草剂(例如HPPD抑制性除草剂，如硝磺草酮)存在下展现出正常生长。
在一些实施方案中，所述物理诱变可以通过放射性照射所述植物群体(例如照射植物种子)实现。在一些实施方法，所述化学诱变可以通过用甲基磺酸乙酯(EMS)处理所述植物群体(例如处理植物种子)实现。
在一些实施方案中，所述筛选可以通过对所述内源HPPD的编码序列进行测序实现。
在另一方面，本发明还提供一种除草剂抗性植物，所述植物通过本发明的物理或化学诱变方法产生。本发明还涵盖所述除草剂抗性植物的后代。
本发明各个方面中所述植物可以是对HPPD抑制剂敏感的植物，包括单子叶植物或双子叶植物。优选地，所述植物是作物植物，例如单子叶作物植物。合适的植物的实例包括但不限于水稻、小麦、大麦、高粱、玉米、燕麦、拟南芥、硬直黑麦草、旱雀麦、野生大豆、大豆和烟草等。在一些优选实施方案中，所述植物是水稻。在另一些优选实施方案中，所述植物是玉米。在另一些优选实施方案中，所述植物是大豆。在另一些优选实施方案中，所述植物是烟草。
六、植物育种方法
在另一方面，本发明提供一种植物育种方法，包括将通过本发明上述的方法获得的具有除草剂抗性的第一植物与不含有所述除草剂抗性的第二植物杂交，从而将所述除草剂抗性导入第二植物。
本发明各个方面中所述植物可以是对HPPD抑制剂敏感的植物，包括单子叶植物或双子叶植物。优选地，所述植物是作物植物，例如单子叶作物植物。合适的植物的实例包括但不限于水稻、小麦、大麦、高粱、玉米、燕麦、拟南芥、硬直黑麦草、旱雀麦、野生大豆、大豆和烟草等。在一些优选实施方案中，所述植物是水稻。在另一些优选实施方案中，所述植物是玉米。在另一些优选实施方案中，所述植物是大豆。在另一些优选实施方案中，所述植物是烟草。
实施例1 构建OsHPPD突变体质粒
野生型的OsHPPD(氨基酸序列示于SEQ ID NO:1)在pET-smt载体中表达纯化。为了得到突变体，利用环化PCR在需要突变的位点处设计正、反向引物，经过PCR、转化、测序等步骤，获得点突变正确的突变体质粒，以便进行下一步的实验。
实施例2 表达OsHPPD突变体蛋白
将测序确认构建正确的突变体质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，从转化的平板上挑取单克隆接种在已经加入K
+抗生素的3ml液体LB培养基中，37℃220rpm过夜培养(12-14h)。观察试管小量培养的菌液浑浊、生长旺盛。取2mL菌液接种到装有120mL新鲜配制的液体LB培养基的小三角瓶中，37℃220rpm扩大培养12小时。将小三角瓶中的菌液接种到新鲜配制的TB培养基中，每500mL TB培养基加入10mL菌液。37℃250rpm培养至菌液的OD值到达0.6左右时，加入终浓度为0.4mM的IPTG、16℃诱导表达目的蛋白，诱导表达结束后，使用高速离心机来收集菌体。
实施例3 纯化OsHPPD突变体蛋白
3.1利用镍亲和层析纯化目的蛋白
表达的HPPD蛋白是带有10个组氨酸标签，因此可以与层析介质上的镍离子结合，达到与其他杂质分离的目的。再利用自由配体溶剂可以将吸附在层析介质上的目的蛋白洗脱下来，从而完成目的蛋白的初步纯化。
3.2凝胶过滤层析纯化目的蛋白
本实验使用GE公司的型号为Superdex 200 increase分子筛进行凝胶过滤层析纯化，将过完镍柱后的样品用Millipore管对蛋白样品进行浓缩，浓缩至1ml体积，转移到新1.5mL EP管，4℃13000rpm离心10分钟去沉淀。离心后的蛋白通过高效蛋白液相纯 化系统AKTA purifier 10注射到分子筛中，进行目的HPPD蛋白的进一步纯化分离，后续进行SDS-PAGE凝胶电泳来观察HPPD蛋白的大小和纯度。
实施例4 OsHPPD、zmHPPD和gmHPPD蛋白的酶反应动力学的活性测定和依据抑制动力学的抗性突变体的鉴定
4.1酶反应动力学的活性测定：这是一种用于HPPD活性测定和除草剂筛选的耦合方法。该实验将通过HPPD从HPPA转化为HGA的形成，与通过HGA双加氧酶从HGA产生马来酰乙酰乙酸酯相结合。马来酸乙酰乙酸酯的吸收峰约为318nm，用于实时分光光度法监测。通过对先前报道的方法进行改进(参考文献1)，对体外活性和对HPPD抑制的偶联酶测定法进行了测定。在30℃下的96孔板中使用UV/可见板读数器进行监测，以监测在318nm处马来酸乙酰乙酸酯的形成。该反应混合物的总试验体积为200uL，含有适量的HPPA、100uM FeSO4、2mM抗坏血酸钠、20mM HEPES缓冲液(pH＝7.0)、HPPD(125nM)和HGD(750nM)。在进行分析之前，所有的反应组分在30℃预平衡至少30分钟。HGD活性的量预定为大大超过HPPD活性，以确保反应紧密偶联。每个实验在30分钟左右进行并重复至少3次，然后取平均值。
4.2依据抑制动力学的抗性突变体的鉴定：将HPPD除草剂硝磺草酮，溶于二甲基亚砜(DMSO)中作为储备溶液，并在使用前用反应缓冲液稀释至各种浓度(参考文献2)。抑制常数(Ki，inhibition constant)是抑制剂效力的指标，反映的是抑制剂对靶标的抑制强度，这个值越小，说明抑制作用越强，换句话说，Ki值越大，突变体抗性越强。Ki是通过在固定底物浓度下(HPPA的最终浓度分别为40uM和80uM)将1/v相对于抑制剂浓度(总共7种浓度，具体浓度根据抑制剂效力确定)输入软件GraphPad获得的。图1-5中展示的是在7个硝磺草酮浓度梯度下，测到的突变体的吸光值计算出来的速度V0的变化，这些突变体的值都比野生型高，说明它们是具有除草剂——硝磺草酮的抗性。图6中在氨基酸G417位点上有13个突变体比野生型的Ki值大，Ki值越大，说明突变体抗性越强。以野生型HPPD为对照，在不同的硝磺草酮浓度下，共有24个突变体(分别包含氨基酸取代L365K、F378A、G419W、G417A、G417A/F378A、G417S、G417K、G415A、G415V、G414A、G414V、G417V、G417R、G417N、G417D、G417C、G417Q、G417E、G417H、G417I、G417M、G417F、G417P、G417T，编号相对于SEQ ID NO:1；其氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:14-37)的抗性比野生型强。类似的，具有双突变或三突变的水稻HPPD突变体(分别包含氨基酸取代F378A/G415A、F378A/G415V、F378A/G417K、F378A/G417R、F378A/G417V、G414V/G417K、F378A/G417A/G415A、F378A/G417K/G415V，编号相对于SEQ ID NO:1；其氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:48-55)也显示出了针对除草剂的抗性(图7)。图8所显示的玉米来源的HPPD突变体(分别包含氨基酸取代F373A/G412A、G409A、G412K、G412Q、G412R，编号相对于SEQ ID NO:9；或分别包含氨基酸取代F378A/G417A、G414A、G417K、G417Q、G417R，编号相对于SEQ ID NO:1；其氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:38-42)和大豆来源的HPPD突变体(分别包含氨基酸取代F386A/G425A、G422A、G425K、G425Q、G425R，编号相对于SEQ ID NO:13；或分别包含氨基酸取代F378A/G417A、G414A、G417K、G417Q、G417R，编号相对于SEQ ID NO:1；其氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:43-47)与水稻来源HPPD突变体具有相应的突变位点，并同样显示出了针对除草剂的抗性。
实施例5 体内测试水稻除草剂抗性
5.1材料方法：
1).构建过表达HPPD变体蛋白的农杆菌转化载体：首先，以水稻中花11的mRNA反转录的cDNA为扩增模板，得到未突变的OsHPPD-CDS-WT序列。以未突变的OsHPPD-CDS序列为扩增模板，经两轮PCR引入目的突变，得到引入前面实验筛选到的包含如G414V、G417A、G417K或者(F378A+G417K)等氨基酸突变的序列。然后，将未突变的OsHPPD-CDS-WT序列，和引入目的突变后的OsHPPD-CDS-M序列克隆到pHUE411的载体骨架，由RNA聚合酶II的玉米Ubiquitin-1(Ubi-1)启动子启动表达(图9)。
2)水稻转化材料——Kitaake
3)检测过表达系
将转化再生的水稻叶片取样提取总基因组DNA，取少量作为PCR扩增模板，以表达载体上Ubi-1启动子和HPPD的序列分别设前后引物，鉴定基因组是否整合了表达载体。
4).qRT-PCR测定水稻中OsHPPD-mRNA相对表达量
提取整合了表达载体的植物的RNA并逆转录成cDNA，进行实时荧光定量PCR(称为quantitative RT-PCR或qRT-PCR)反应，使用的是ChamQTM Universal
qPCR Master Mix试剂。以OsActin作为内参基因，合成和设计qRT-PCR所需要的目的基因和内参基因的引物，依据制造商说明进行qRT-PCR。
依据所得Ct值，计算目的基因相对于内参基因的相对值X＝2
-ΔCt，ΔCt＝Ct目-Ct内(Ct目为检测的目的基因Ct值，Ct内为内参基因Ct值)。实验组相对于对照组的目的基因表达含量为X实验组/X对照组。
5).构建水稻在HPPD类抑制剂-硝磺草酮培养基上的筛选体系
在水稻的生根培养基中添加适量硝磺草酮母液，配置成含有不同硝磺草酮浓度梯度的M6固体培养基(表1)。然后以过表达野生型HPPD的水稻苗和野生型水稻苗作测试，选择生长状态相似、从生长点起株高约6cm左右的组培苗，转移到不同硝磺草酮浓度梯度的培养基上继代培养，每皿三株苗，过表达和野生型水稻苗每个硝磺草酮浓度各3皿。培养约10天后，观察在硝磺草酮筛选下的幼苗生长表型：在硝磺草酮在培养基中的浓度低于OsW3时，野生型和过表达水稻苗都生长正常；硝磺草酮浓度高于OsW3低于OsW2时，野生型水稻苗新长出的幼叶变白，过表达材料正常生长；当硝磺 草酮浓度高于OsW2时，过表达材料新长出的幼叶变白，而野生型水稻苗叶片变白速度更快。因此选择OsW2作为过表达材料的筛选浓度。
表1：水稻在不同浓度梯度硝磺草酮筛选下的表型鉴定。
5.2结果
培养两周左右，观察在OsW2硝磺草酮筛选浓度下水稻幼苗的生长状态。在相同的筛选浓度下，表达野生型OsHPPD的水稻(OsHPPD-mRNA相对表达量为6.1、7.5或14.3)表现出明显白化的表型，而表达G414V、G417A或G417K突变的水稻(OsHPPD-mRNA相对表达量如图10柱状图)保持正常生长状态，过表达(F378A+G417K)突变的水稻苗长势稍弱，但叶片也没有白化。因此G414、G417或(F378A+G417K)突变相比野生型都提高了水稻的耐药性(图10)。更多突变体过表达植物的抗性表型总结如下表2。
表2水稻过表达HPPD蛋白突变体的培养基筛选表型
实施例6 体内测试烟草除草剂抗性
6.1材料方法：
1).构建野生型和突变型OsHPPD蛋白的表达质粒
将野生型的OsHPPD-CDS-WT序列克隆到pBSE401的载体骨架，由35S启动子启 动表达。利用环化PCR在需要突变的位点处设计正、反向引物，经过PCR、转化、测序等步骤，获得点突变的OsHPPD-CDS-G417K序列，同样克隆到pBSE401的载体骨架，由35S启动子启动表达。
2).转化普通烟草——品种：云37
3).检测过表达系
将烟草叶片取样提取总基因组DNA，取少量作为PCR扩增模板，以表达载体上35S启动子和HPPD的序列分别设前后引物，鉴定基因组是否整合了表达载体。
4).qRT-PCR测定烟草中OsHPPD-mRNA相对表达量
提取整合了表达载体的植物的RNA并逆转录成cDNA，进行实时荧光定量PCR(称为quantitative RT-PCR或qRT-PCR)反应，使用的是ChamQTM Universal
qPCR Master Mix试剂。以NtActin为内参基因，合成和设计qRT-PCR所需要的目的基因和内参基因的引物，依据制造商说明进行qRT-PCR。。
依据所得Ct值，计算目的基因相对于内参基因的相对值X＝2
-ΔCt，ΔCt＝Ct目-Ct内(Ct目为检测的目的基因Ct值，Ct内为内参基因Ct值)。实验组相对于对照组的目的基因表达含量为X实验组/X对照组。
5).构建烟草在HPPD类抑制剂-硝磺草酮培养基上的筛选体系
首先，配置不同硝磺草酮浓度梯度的烟草生根培养基(表3)。然后选择生长状态一致的过表达野生型HPPD的烟草和野生型烟草组培苗，转移到添加了硝磺草酮的培养基上继代培养。经过一段时间筛选培养，抗性较弱的烟草幼叶逐渐白化。因此，选择过表达野生型OsHPPD的烟草不能耐受的最低硝磺草酮浓度作为此次的烟草筛选浓度。
表3：烟草在不同硝磺草酮浓度筛选下的表型鉴定。
6.2结果
培养20天左右，观察在硝磺草酮筛选下烟草幼苗的生长状态：在硝磺草酮浓度等于或低于NbW4时，野生型和过表达烟草苗都生长正常；当筛选浓度为NbW3时，野生型烟草苗新长出的幼叶变白，过表达材料正常生长；当硝磺草酮浓度等于或高于NbW2时，过表达材料新长出的幼叶变白，而野生型烟草苗叶片变白速度更快。因此，选择NbW2的硝磺草酮作为过表达材料的筛选浓度。在相同的筛选浓度下，表达野生型OsHPPD的烟草(OsHPPD-mRNA相对表达量为4.6)表现出明显白化的表型，而表达G417K突变的烟草(OsHPPD-mRNA相对表达量为3.5)保持正常生长状态，因此G417K突变相比野生型提高了烟草的耐药性(图11)。
参考文献
1.Schmidt et al；Murine liver homogentisate 1,2-dioxygenase Purification to homogeneity and novel biochemical properties.Eul:J.Biochem.228,(1995).
2.Y.L.Xu et al；Pyrazolone–quinazolone hybrids:A novel class of human 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase inhibitors.Bioorg.Med.Chem.22(2014).
序列
以下为本发明中涉及的具体序列，其中突变氨基酸以粗体和下划线标出。
>SEQ ID NO:1 Oryza sativa野生型HPPD氨基酸序列(446)
>SEQ ID NO:2 Triticum aestivum-A野生型HPPD氨基酸序列(433)
>SEQ ID NO:3 Triticum aestivum-B野生型HPPD氨基酸序列(436)
>SEQ ID NO:4 Triticum aestivum-D野生型HPPD氨基酸序列(436)
>SEQ ID NO:5 Avena sativa野生型HPPD氨基酸序列(440)
>SEQ ID NO:6 Pseudomonas fluorescens野生型HPPD氨基酸序列(358)
>SEQ ID NO:7 Lolium rigidum野生型HPPD氨基酸序列(443)
>SEQ ID NO:8 Bromus tectorum野生型HPPD氨基酸序列(435)
>SEQ ID NO:9 Zea mays野生型HPPD氨基酸序列(445)
>SEQ ID NO:10 Hordeum vulgare野生型HPPD氨基酸序列(434)
>SEQ ID NO:11 Glycine soja野生型HPPD氨基酸序列(488)
>SEQ ID NO:12 Arabidopsis thaliana野生型HPPD氨基酸序列(473)
>SEQ ID NO:13大豆野生型HPPD氨基酸序列
>SEQ ID NO:14水稻HPPD抗性突变体L365K氨基酸序列
>SEQ ID NO:15水稻HPPD抗性突变体F378A氨基酸序列
>SEQ ID NO:16水稻HPPD抗性突变体G419W氨基酸序列
>SEQ ID NO:17水稻HPPD抗性突变体G417A氨基酸序列
>SEQ ID NO:18水稻HPPD抗性突变体G417A/F378A氨基酸序列
>SEQ ID NO:19水稻HPPD抗性突变体G417S氨基酸序列
>SEQ ID NO:20水稻HPPD抗性突变体G417K氨基酸序列
>SEQ ID NO:21水稻HPPD抗性突变体G415A氨基酸序列
>SEQ ID NO:22水稻HPPD抗性突变体G415V氨基酸序列
>SEQ ID NO:23水稻HPPD抗性突变体G414A氨基酸序列
>SEQ ID NO:24水稻HPPD抗性突变体G414V氨基酸序列
>SEQ ID NO:25水稻HPPD抗性突变体G417V氨基酸序列
>SEQ ID NO:26水稻HPPD抗性突变体G417R氨基酸序列
>SEQ ID NO:27水稻HPPD抗性突变体G417N氨基酸序列
>SEQ ID NO:28水稻HPPD抗性突变体G417D氨基酸序列
>SEQ ID NO:29水稻HPPD抗性突变体G417C氨基酸序列
>SEQ ID NO:30水稻HPPD抗性突变体G417Q氨基酸序列
>SEQ ID NO:31水稻HPPD抗性突变体G417E氨基酸序列
>SEQ ID NO:32水稻HPPD抗性突变体G417H氨基酸序列
>SEQ ID NO:33水稻HPPD抗性突变体G417I氨基酸序列
>SEQ ID NO:34水稻HPPD抗性突变体G417M氨基酸序列
>SEQ ID NO:35水稻HPPD抗性突变体G417F氨基酸序列
>SEQ ID NO:36水稻HPPD抗性突变体G417P氨基酸序列
>SEQ ID NO:37水稻HPPD抗性突变体G417T氨基酸序列
>SEQ ID NO:38玉米HPPD抗性突变体F373A/G412A氨基酸序列(位置参考SEQ ID NO:9)
>SEQ ID NO:39玉米HPPD抗性突变体G409A氨基酸序列(位置参考SEQ ID NO:9)
>SEQ ID NO:40玉米HPPD抗性突变体G412K氨基酸序列(位置参考SEQ ID NO:9)
>SEQ ID NO:41玉米HPPD抗性突变体G412Q氨基酸序列(位置参考SEQ ID NO:9)
>SEQ ID NO:42玉米HPPD抗性突变体G412R氨基酸序列(位置参考SEQ ID NO:9)
>SEQ ID NO:43大豆HPPD抗性突变体F386A/G425A氨基酸序列(位置参考SEQ ID NO:13)
>SEQ ID NO:44大豆HPPD抗性突变体G422A氨基酸序列(位置参考SEQ ID NO:13)
>SEQ ID NO:45大豆HPPD抗性突变体G425K氨基酸序列(位置参考SEQ ID NO:13)
>SEQ ID NO:46大豆HPPD抗性突变体G425Q氨基酸序列(位置参考SEQ ID NO:13)
>SEQ ID NO:47大豆HPPD抗性突变体G425R氨基酸序列(位置参考SEQ ID NO:13)
>SEQ ID NO:48水稻HPPD抗性突变体F378A/G415A氨基酸序列
>SEQ ID NO:49水稻HPPD抗性突变体F378A/G415V氨基酸序列
>SEQ ID NO:50水稻HPPD抗性突变体F378A/G417K氨基酸序列
>SEQ ID NO:51水稻HPPD抗性突变体F378A/G417R氨基酸序列
>SEQ ID NO:52水稻HPPD抗性突变体F378A/G417V氨基酸序列
>SEQ ID NO:53水稻HPPD抗性突变体G414V/G417K氨基酸序列
>SEQ ID NO:54水稻HPPD抗性突变体F378A/G417A/G415A氨基酸序列
>SEQ ID NO:55水稻HPPD抗性突变体F378A/G417K/G415V氨基酸序列
Claims (27)
- 一种HPPD突变体或其功能性片段，其相对于野生型HPPD在选自第417、365、378、414、415、或419位的一或多个位置处具有氨基酸突变例如氨基酸取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
- 权利要求1的HPPD突变体或其功能性片段，其相对于野生型HPPD在选自以下的位置处具有氨基酸突变例如氨基酸取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1：i)第378和415位；ii)第378和417位；iii)第414和417位；或iv)第378、415和417位。
- 权利要求1或2的HPPD突变体或其功能性片段，所述野生型HPPD包含SEQ ID NO:1-13之一的氨基酸序列。
- 权利要求1-3中任一项的HPPD突变体或其功能性片段，所述HPPD突变体或其功能性片段在植物中表达时，能够赋予所述植物对除草剂的抗性。
- 权利要求4的HPPD突变体或其功能性片段，所述除草剂选自吡唑类化合物，例如苯吡唑草酮、磺酰草吡唑、酸苯偶氮吡胺；三酮类化合物，例如磺草酮、硝磺草酮、特波三酮、特糠酯酮、双环吡喃酮、苯并双环酮；异噁唑类化合物，例如异噁唑草酮；二酮腈类化合物，例如2-氰基-3-环丙基-1-(2-甲基磺酰基-4-三氟甲基苯基)-丙烷-1,3-二酮和2-氰基-1-[4-(甲基磺酰基)-2-三氟甲基苯基]-3-(1-甲基环丙基)丙烷-1,3-二酮；和二苯酮类化合物，或它们的任意组合。
- 权利要求1-5中任一项的HPPD突变体或其功能性片段，其中相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段包含选自G417K、G417S、G417A、G419W、G417V、G417R、G417N、G417D、G417C、G417Q、G417E、G417H、G417I、G417M、G417F、G417P、G417T、L365K、F378A、G414A、G414V、G415A、G415V的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
- 权利要求6的HPPD突变体或其功能性片段，其中相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段包含选自以下的氨基酸取代i)F378A和G415A；ii)F378A和G415V；iii)F378A和G417K；iv)F378A和G417R；v)F378A和G417V；vi)F378A和G417A；vii)G414V和G417K；viii)F378A、G415A和G417A；或ix)F378A、G415V和G417K；其中所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
- 权利要求1-7中任一项的HPPD突变体或其功能性片段，所述HPPD突变体包含SEQ ID NO:14-55中任一所示的氨基酸序列。
- 一种核酸，其包含编码权利要求1-8中任一项的HPPD突变体或其功能性片段的核苷酸序列。
- 一种表达盒，其包含与调控序列可操纵地连接的编码权利要求1-8中任一项的HPPD突变体或其功能性片段的核苷酸序列。
- 一种表达构建体，其包含权利要求10的表达盒。
- 一种通过转基因产生除草剂抗性植物的方法，包括将权利要求9的核酸、权利要求10的表达盒和/或权利要求11的表达构建体导入所述植物中。
- 一种产生除草剂抗性植物的方法，所述方法包括靶向修饰植物的内源HPPD编码序列，由此导致所述内源HPPD在选自第417、365、378、414、415或419位的一或多个位置处的氨基酸突变，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
- 权利要求13的方法，其中所述靶向修饰导致所述内源HPPD包含选自G417K、G417S、G417A、G419W、G417V、G417R、G417N、G417D、G417C、G417Q、G417E、G417H、G417I、G417M、G417F、G417P、G417T、F378A/G417A、L365K、F378A、G414A、G414V、G415A、G415V的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:11。
- 权利要求13或14的方法，其中所述靶向修饰导致权利要求1-8中任一项所述的HPPD突变体。
- 权利要求13-15中任一项的方法，其中通过基因编辑或同源重组来进靶向修饰所述内源HPPD的编码序列。
- 权利要求16的方法，其中所述基因编辑是碱基编辑(base editing)或引导编辑(prime editing)。
- 一种产生除草剂抗性植物的方法，包括对所述植物的群体进行物理诱变或化学诱变，并且筛选内源HPPD至少在选自第417、365、378、414、415或419位的一或多个位置，例如1、2、3、4、5或6个位置处包含氨基酸突变的植物，其中所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
- 权利要求18的方法，其中筛选内源HPPD包含至少选自G417K、G417S、G417A、G419W、G417V、G417R、G417N、G417D、G417C、G417Q、G417E、G417H、G417I、G417M、G417F、G417P、G417T、F378A/G417A、L365K、F378A、G414A、G414V、G415A、G415V的一个或多个氨基酸取代的植物，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
- 权利要求18或19的方法，其中筛选包含或表达权利要求1-8中任一项所述的HPPD突变体的植物。
- 权利要求18-20中任一项的方法，其中所述物理诱变包括通过放射性照射所述植物群体，所述化学诱变包括通过用甲基磺酸乙酯(EMS)处理所述植物群体。
- 权利要求12-21中任一项的方法，其中所述植物包括单子叶植物或双子叶植物，优选地，所述植物是作物植物，例如单子叶作物植物。
- 权利要求22的方法，其中所述植物选自水稻、小麦、大麦、高粱、玉米、燕麦、拟南芥、硬直黑麦草、旱雀麦、野生大豆、大豆和烟草。
- 一种除草剂抗性植物或其后代，其包含或表达权利要求1-8中任一项所述的HPPD突变体或其功能性片段，或其通过权利要求12-21中任一项的方法产生。
- 权利要求24的除草剂抗性植物或其后代，其中所述植物包括单子叶植物或双子叶植物，优选地，所述植物是作物植物，例如单子叶作物植物。
- 权利要求25的除草剂抗性植物或其后代，其中所述植物选自水稻、小麦、大麦、高粱、玉米、燕麦、拟南芥、硬直黑麦草、旱雀麦、野生大豆、大豆和烟草。
- 权利要求1-8中任一项所述的HPPD突变体或其功能性片段、权利要求9的核酸、权利要求10的表达盒和/或权利要求11的表达构建体在产生除草剂抗性植物中的用途。
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