CN116716336A - OsSKIPa基因及其编码蛋白在调控植物种子发育中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了OsSKIPa基因及其编码蛋白在调控植物种子发育中的应用。本发明基于CRISPR/Cas9技术，构建了OsSKIPa基因的CRISPR/Cas9基因编辑敲除载体并转化水稻植株，获得敲除表达OsSKIPa的转基因植株。结果显示，敲除表达OsSKIPa会影响水稻种子发育，表现为胚变小、和/或胚退化，胚乳凹陷、和/或凸起，表明OsSKIPa基因为调控植物种子发育的基因，可为培育高品质植物新品种提供基因资源，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，涉及水稻OsSKIPa基因及其编码蛋白在调控植物种子发育中的应用。
背景技术
水稻是主要的粮食作物，世界上由超过三分之一的人口以稻米为主食。种子发育是高等植物生长周期的重要环节，也是作物产量和品质决定的最关键因素。种子胚胎发育是植物发育的最初阶段，也是植物生命周期中尤为关键的环节。种胚是稻株新个体的原始体，在颖果成熟时已有胚芽、胚轴、胚根和子叶等器官的分化，胚的发育对稻株的个体发生和形态建成至关重要。胚乳由两个组织组成：淀粉质胚乳和糊粉层。胚乳是水稻种子的主要食用部分，胚乳的发育情况直接影响稻米的产量和品质。
关于水稻胚和胚乳的发育调控，脂质转移蛋白基因OsLTPL36在发育中的种皮和胚乳糊粉层细胞表达。OsLTPL36-RNAi转基因植物造成种子白垩化严重，并且胚的发育延迟(Wang et al.,2015)。OsGrxC2.2过量表达参与调控水稻胚胎发育过程，使种胚产生畸形甚至退化(Liu et al.,2019)。MISSEN是一个来源于亲本的lncRNA，在胚乳中表达，负调控胚乳的发育，导致种子出现明显的凹陷和凸起(Zhou et al.,2021)。
SKIP通过与不同蛋白互作，参与转录调控和RNA剪接过程，从而调控多个细胞信号途径。SKIP在不同的物种中又有不同的功能，在酿酒酵母中，SKIP同源基因PRP45的功能减弱或缺失会影响细胞活力甚至存活状态(Albers et al.,2003)。Hou等报道了在水稻中SKIP同源蛋白OsSKIPa的功能，OsSKIPa可以互补酿酒酵母同源基因PRP45的缺失突变，挽救其致死的表型；OsSKIPa抑制表达转基因植株发芽率降低，生育期生长受抑制，可能抑制分生组织细胞活力；OsSKIPa超量表达植株对干旱胁迫表现出显著的抗性增强(Hou X,Xie K,Yao J,et al.A homolog of human ski-interacting protein in rice positivelyregulates cell viability and stress tolerance.[J].Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America,2009,106(15):6410-6415.)。但是关于OsSKIPa蛋白或其编码基因在调控水稻种子发育，尤其是水稻胚及胚乳发育中的功能和应用还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供OsSKIPa基因及其编码蛋白在调控植物种子发育中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
本发明提供了水稻OsSKIPa基因的新应用，所述水稻OsSKIPa基因的cDNA全长1824bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码606个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，OsSKIPa基因在基因组中的序列如SEQ ID No.3所示。
本发明进一步利用CRISPR/Cas9技术，通过OsSKIPa基因的基因组核苷酸序列(SEQID No.3)上设计sgRNA靶点，构建pYLCRISPR/Cas9-OsSKIPa基因编辑载体，并转化水稻粳稻品种中花11，获得OsSKIPa的基因敲除突变体。结果显示，敲除表达OsSKIPa(OsSKIPa基因发生改变，改变了OsSKIPa基因的阅读框，使其失去功能)会影响水稻种子发育，主要体现为影响水稻胚和/或胚乳发育，具体为：胚变小、和/或胚退化，胚乳凹陷、和/或凸起。表明OsSKIPa同时也是调控植物种子发育的功能基因，可为培育高品质植物新品种提供基因资源。
因此，本发明提供水稻OsSKIPa基因的以下新用途：
OsSKIPa基因在调控植物种子发育中的应用。
OsSKIPa蛋白在调控植物种子发育中的应用。
OsSKIPa基因的敲除或表达抑制在调控植物种子发育中的应用。
具体地，所述调控植物种子发育为调控植物种胚和/或胚乳发育。
优选地，所述OsSKIPa基因的序列如下(A)、(B)、(C)或(D)所示：
(A)如SEQ ID No.1所述序列；
(B)如SEQ ID No.3所述序列；
(C)在严格条件下与(A)或(B)所限定的序列杂交且编码如SEQ ID No.2所示OsSKIPa蛋白的序列；
(D)与(A)-(C)任一限定的序列具有90％以上同源性且编码如SEQ ID No.2所示OsSKIPa蛋白的序列。
具体地，所述调控植物种子发育为胚变小、和/或胚退化，和或胚乳凹陷、和/或凸起。
进一步地，所述应用为构建OsSKIPa基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体并转化水稻植株，获得OsSKIPa基因敲除突变体。
进一步地，所述CRISPR/Cas9基因编辑载体为pYLCRISPR/Cas9-OsSKIPa。
进一步地，所述pYLCRISPR/Cas9-OsSKIPa载体构建方法为设计sgRNA靶点，所述sgRNA按照SEQ ID No.3所示核苷酸序列进行设计，所述靶点的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；通过边切边连、重叠延伸PCR构建sgRNA表达盒并插入线性化pYLCRISPR/Cas9载体，农杆菌转化、筛选，即得。
进一步地，所述植物包括但不限于水稻、小麦、玉米、高粱、拟南芥等及其它禾谷类作物，也包括其它一些重要的经济作物，例如棉花、油菜或番茄等。
优选地，所述植物为水稻。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了水稻OsSKIPa基因在调控种子发育中的新应用，本发明基于CRISPR/Cas9技术，构建了OsSKIPa基因的CRISPR/Cas9基因编辑敲除载体并转化水稻植株，获得敲除表达OsSKIPa的转基因植株。结果显示，敲除表达OsSKIPa调控水稻种子发育，主要体现为胚变小、和/或胚退化，胚乳凹陷、和/或凸起。表明OsSKIPa基因为调控植物种子发育的基因，可为培育高品质植物新品种提供基因资源。
(2)本发明的OsSKIPa基因与水稻胚胎发育有关，主要体现为胚变小、和/或胚退化，可为解决种子穗萌等问题以及培育无胚水稻新品种提供基因资源。本发明对于解决水稻成熟过程中种子穗萌等问题意义重大，在植物育种中具有广阔的应用前景。
(3)本发明的OsSKIPa基因与水稻种子发育有关，为研究控制胚及胚乳相关基因的表达调控提供了材料，也有助于植物种子发育机制的研究。
附图说明
图1为T0代OsSKIPa基因的基于CRISPR/Cas9技术创制的敲除突变体基因型。其中，A为OsSKIPa靶点位置；B为OsSKIPa基因的CRISPR/Cas9转基因株系T0纯合体编辑类型。
图2为OsSKIPa敲除突变体的种子发育表型。其中，A为野生型和OsSKIPa敲除突变体胚乳发育表型(突变体胚乳凹陷或凸起)；B为野生型和OsSKIPa敲除突变体种胚发育表型(突变体种胚变小或种胚退化)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 OsSKIPa的生物信息学分析
OsSKIPa位于水稻第2号染色体上，仅有1个外显子，编码一个由607氨基酸组成的蛋白产物，产物包含SKIP/SNW结构域。登录号分别是Os02g0759800和LOC_Os02g52250。OsSKIPa的cDNA序列如SEQ ID No.1所示，在基因组中的序列如SEQ ID No.3所示，两者编码的OsSKIPa蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
实施例2 OsSKIPa靶位点的设计及相关敲除载体的构建
OsSKIPa-CRP敲除株系是根据(曾栋昌，马兴亮，谢先荣，等.植物CRISPR/Cas9多基因编辑载体构建和突变体分析的操作方法[J].中国科学:生命科学,2018,048(007):783-794.)中记载的CRISPR/Cas9技术构建的，具体步骤如下：
1、靶序列选择
在水稻基因组中第一个外显子区设计sgRNA靶点序列(图1)，如下：
5'-CACATTCTTGGGCTGTGCGGCGG-3'(SEQ ID No.4)；
其中下划线序列为PAM序列，将其命名为sgRNA-OsSKIPa。
2、将制备的靶点接头sgRNA-OsSKIPa与pYLCRISPR/Cas9载体连接。具体操作如下：
(1)经退火合成双链DNA靶点sgRNA-OsSKIPa，然后分别与U6a启动子连接形成sgRNA-OsSKIPa-U6a表达盒。
(2)将sgRNA-OsSKIPa-U6a表达盒与PYLCRISPR/Cas9载体经BsaI酶切及PCR方法连成重组载体pYLCRISPR/Cas9-OsSKIPa-U6a之后转化大肠杆菌DH5α，37℃过夜培养。阳性克隆测序验证后用于后续试验。
将测序正确的重组载体命名为pYLCRISPR/Cas9-OsSKIPa。重组载体pYLCRISPR/Cas9-OsSKIPa的结构描述为：在载体pYLCRISPR/Cas9的BsaI处插入含“CACATTCTTGGGCTGTGCGGCGG”DNA片段的表达盒U6a后得到的重组质粒。
3、重组质粒pYLCRISPR/Cas9-OsSKIPa转化农杆菌菌株EHA105
将重组质粒pYLCRISPR/Cas9-OsSKIPa热激转化农杆菌菌株EHA105，获得含有重组质粒pYLCRISPR/Cas9-OsSKIPa的重组农杆菌，命名EHA105/pYLCRISPR/Cas9-OsSKIPa；同时将空载体pYLCRISPR/Cas9热激转化农杆菌菌株EHA105，获得含有重组载体pYLCRISPR/Cas9的重组农杆菌，命名为EHA105/pYLCRISPR/Cas9。
实施例3定点敲除水稻基因组中的OsSKIPa基因
1、农杆菌介导法转基因水稻的获得
用实施例2中获得的重组农杆菌EHA105/pYLCRISPR/Cas9-OsSKIPa和EHA105/pYLCRISPR/Cas9分别浸染水稻品种中花11(Oryza sativa L.ssp.japonica cv.ZH11)成熟胚诱导的愈伤组织，将获得抗性愈伤组织分别命名为抗性愈伤OsSKIPa-CRP和抗性愈伤CK。
其中，重组农杆菌浸染愈伤组织的具体方法如下：
(1)挑选饱满的成熟种子去壳，用75％的酒精消毒90s，用2.5％ NaCLO溶液摇45min，180rpm。无菌水漂洗3～5次，风干，铺在NB0培养基上，26℃暗培养4周，15天继代一次。
(2)将农杆菌在LB培养基上划线涂板，28℃暗培养3天。
(3)挑取单菌落接种到5ml含抗生素的LB液体培养基中，28℃震荡培养过夜。
(4)将新鲜的农杆菌菌液离心，收集(浓度适中)放入AAM液体培养基中，26℃避光培养2～5h。
(5)选择致密的愈伤组织颗粒(直径3～5mm)用于转化。将待转化的愈伤组织颗粒在准备好的AAM菌液中浸染5min，放在无菌滤纸上除去过多的菌液后，转移到共培养培养基中28℃暗培养3天。
(6)共培养后，用无菌水洗3次，用AAM培养液润洗一次，，吹干愈伤组织，然后将愈伤组织转移到筛选培养基含抗生素上筛选1个月。
(7)筛选后的抗性愈伤组织转移到分化培养基含抗生素上在光照条件下26℃继续培养至分化出绿苗。把小苗转移到生根培养基含抗生素中培养，将其从生根培养基中移除，洗净残留培养基，在清水中炼苗。当白色的新根长出时，将其移栽到温室或大田。
2、CRISPR/Cas9诱导的转基因T0代植株突变体筛选
(1)步骤一共获得28株T0代转基因植株，然后T0代每个植株都进行DNA提取，用特异性引物通过PCR扩增包含靶标片段sgRNA-OsSKIPa的OsSKIPa基因，然后将含有靶标片段的PCR产物克隆到PMD18-T载体上。转化大肠杆菌后37℃培养过夜，在蓝白斑筛选培养基上挑取白色单克隆测序，确定各株系基因型。选取其中移码突变株系进行后续试验。
用于扩增含有靶标片段sgRNA-OsSKIPa的引物序列如下：上游引物OsSKIPa-CRP-F：GTGGTTCAAGGAGCGGTATGG；下游引物：OsSKIPa-CRP-R：GCTGGTCCTTCACTGTCACTG。
(2)结果显示：T0代共获得28株转入重组载体pYLCRISPR/Cas9-OsSKIPa的植物，经测序后，共有10株植物OsSKIPa基因的两条链都发生突变，突变效率为35.7％(两条链都突变的植株数目/T0代获得的转基因植物总数)。
对T0代OsSKIPa纯合突变体植株(OsSKIPa-CRP-8、OsSKIPa-CRP-23、OsSKIPa-CRP-28)的测序结果见图1，其中OsSKIPa-CRP-8在设计的靶点处含有1bp的碱基增加；OsSKIPa-CRP-23在设计的靶点处含有5bp的碱基删除；OsSKIPa-CRP-28在设计的靶点处含有1bp的碱基删除。所有株系的突变最终改变OsSKIPa基因的阅读框，使其失去功能，获得OsSKIPa纯合突变体。
实施例4水稻基因OsSKIPa敲除突变体的种子发育表型
将实施例3获得的OsSKIPa-CRP纯合突变体株系与野生型株系进行种子发育表型观察。结果如图2所示，显示：OsSKIPa影响水稻种子发育，与野生型相比，OsSKIPa-CRP敲除株系出现了种胚变小甚至无胚表型，胚乳出现了凸起或凹陷表型。而空载体对照水稻的种子发育情况与野生型水稻基本一致。以上结果表明OsSKIPa影响水稻种子发育，表现为胚变小、和/或胚退化，胚乳凹陷、和/或凸起，表明OsSKIPa基因为调控植物种子发育的基因，可为培育高品质植物新品种提供基因资源；可为解决种子穗萌等问题以及培育无胚水稻新品种提供基因资源，对于解决水稻成熟过程中种子穗萌等问题意义重大；为研究控制胚及胚乳相关基因的表达调控提供了材料，也有助于植物种子发育机制的研究。
Claims (10)
1.OsSKIPa基因在调控植物种子发育中的应用。
2.OsSKIPa蛋白在调控植物种子发育中的应用。
3.OsSKIPa基因的敲除或表达抑制在调控植物种子发育中的应用。
4.根据权利要求1或3所述应用，其特征在于，所述OsSKIPa基因的序列如下(A)、(B)、(C)或(D)所示：
(A)如SEQ ID No.1所述序列；
(B)如SEQ ID No.3所述序列；
(C)在严格条件下与(A)或(B)所限定的序列杂交且编码如SEQ ID No.2所示OsSKIPa蛋白的序列；
(D)与(A)-(C)任一限定的序列具有90％以上同源性且编码如SEQ IDNo.2所示OsSKIPa蛋白的序列。
5.根据权利要求1～3所述应用，其特征在于，所述调控植物种子发育为调控植物种胚和/或胚乳发育。
6.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述OsSKIPa基因的敲除或表达抑制为采用基因编辑技术进行。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，为构建OsSKIPa基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体并转化植株，获得OsSKIPa基因敲除突变体。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因编辑载体为pYLCRISPR/Cas9-OsSKIPa。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述pYLCRISPR/Cas9-OsSKIPa载体构建方法为设计sgRNA靶点，所述sgRNA按照SEQ ID No.3所示核苷酸序列进行设计，所述靶点的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；通过边切边连、重叠延伸PCR构建sgRNA表达盒并插入线性化pYLCRISPR/Cas9载体，农杆菌转化、筛选，即得。
10.根据权利要求1～3任一所述应用，其特征在于，所述植物为禾谷类作物。
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