CN116715713A - 一种c20酮基孕甾烷型生物碱衍生物及其合成方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物及其合成方法和应用。本发明基于苗药三两银中活性孕甾烷型生物碱骨架结构，以表雄酮为原料，通过Wittig反应、还原反应、Corey氧化、还原胺化，N的烷基化等反应得到系列C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物的方法。该方法原料廉价易得，反应条件温和，操作简便，反应的产率较好。合成所得C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物具有优异的抗肿瘤活性及抗炎活性，可用于抗肝癌、抗结直肠癌及抗炎药物中。为新型抗肿瘤和抗炎孕甾烷型生物碱的新药开发及应用提供了科学依据。

Description

一种C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物及其合成方法和应用

技术领域

本发明属于药物合成技术领域，涉及一种C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物及其合成方法和应用。

背景技术

苗药三两银(Sarcococca ruscifolia，苗药名bub jid ngongx)，为黄杨科野扇花属(Sarcococca L.)植物，研究显示其中的化学成分主要为孕甾烷型甾体生物碱类化合物，其在胆碱脂酶抑制、抗癌、抗溃疡、抗炎、解痉等多方面具有广泛的生物活性。课题组前期从中分离鉴定系列新的孕甾烷型甾体生物碱，对该类生物碱进行体外抗肿瘤及抗炎活性测试，显示较好的抗肿瘤活性及抗炎活性。但前期研究发现该类生物碱天然产生的衍生物结构多样性较低，限制了从中寻找高效低毒衍生物及其构效关系的深入研究。为寻找高效低毒孕甾烷型甾体生物碱衍生物，该发明基于苗药三两银孕甾烷型生物碱骨架结构，以表雄酮为原料，通过Wittig反应、还原反应、Corey氧化、还原胺化，N的烷基化等一系列反应得到系列C20-酮基孕甾烷型生物碱衍生物，进一步通过抗肿瘤、抗炎活性评价，发现所得衍生物显示显著抗肿瘤及抗炎活性。该发明为寻找高选择性和安全性的新型抗肿瘤和抗炎先导化合物，开发新型抗肿瘤和抗炎药物提供了科学依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物。

本发明的目的在于提供一种C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物的合成方法。

本发明的另一目的在于提供C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物在抗肝癌、结直肠癌、抗炎中的应用。

为了实现本发明目的，本发明采用如下技术方案和步骤实现：

本发明所述的C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物，结构通式为(Ⅰ)所示：

其中，R₁选自苯胺，对甲基苯胺，邻甲基苯胺，间甲基苯胺，对氯苯胺，对甲氧基苯胺，邻甲氧基苯胺，间甲氧基苯胺；

R₂选自氢，甲基，乙基。

本发明所述的所述衍生物化合物为25种，依次记为4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4a'、4c'、4d'、4f'、4g'、5a、5b、5c、5d、5e、5f、5g、5h、6a、6b、6c、6f，R₁，R₂的对应关系如下：

本发明所述的C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物的合成方法，包括如下步骤：

(1)化合物1的合成：将叔丁醇钾和乙基三苯基溴化磷加入烧瓶中，抽真空，加入适量无水四氢呋喃，室温搅拌1h，加入预先配置好的表雄酮四氢呋喃溶液，室温搅拌3h，TLC监测反应完成，然后向反应液中加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，将有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得粗产物，用硅胶色谱法纯化，流动相为石油醚：乙酸乙酯＝5∶1，得化合物1；

(2)化合物2的合成：将BH₃-Me₂S加入到化合物1的四氢呋喃溶液中，25℃搅拌2h后，滴加乙醇、NaOH和H₂O₂，在60℃搅拌1h后，用Na₂S₂O₃淬灭混合物，并用乙酸乙酯萃取，将合成的有机溶液用饱和食盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤浓缩，得化合物2；

(3)化合物3的合成：将化合物2和PCC，适量硅胶加入DCM中，混合物在室温搅拌3h，将混合物过滤，过滤后的滤饼用DCM洗涤，减压回收溶剂，硅胶柱层析，流动相为石油醚：乙酸乙酯，得化合物3；

(4)化合物4a的合成：将化合物3置于烧瓶中，加入乙酸，注射加入苯胺，搅拌过夜，缓慢分批加入硼氢化钠，室温搅拌2h，减压除去乙酸，固体加水，稀盐酸调节pH值在2-3，用乙酸乙酯萃取，有机层用稀氢氧化钠溶液调节值中性或弱碱性，有机层萃取，减压浓缩，得粗产物，用硅胶色谱法纯化，流动相为石油醚∶乙酸乙酯，进行梯度洗脱，得化合物4a；

化合物4b-4h/4a'/4c'/4d'/4f'/4g'的合成：按照上述化合物4a的合成步骤操作，化合物3与苯胺反应得到化合物4a'；与对甲基苯胺反应得到化合物4b；与对甲氧基苯胺反应得到化合物4c和4c'；与对氯苯胺反应得到化合物4d和4d'；与邻甲基苯胺反应得到化合物4e；与间甲基苯胺反应得到化合物4f和4f'；与间甲氧基苯胺反应得到化合物4g和4g'；与邻甲氧基苯胺反应得到化合物4h。

(5)化合物5a的合成：将化合物4a置于烧瓶中，加入碘甲烷，无水DMF，加入氢化钠，加热体系控制温度60℃-70℃，反应3h，TLC监测反应完成，降至室温，DMF减压蒸发除去，三氯甲烷萃取，合并有机相，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得粗产物，用硅胶色谱法纯化，流动相为石油醚∶乙酸乙酯，进行梯度洗脱，得化合物5a；

化合物5b-5h的合成：按照上述化合物5a合成步骤操作，与化合物4b反应得到化合物5b；与化合物4c反应得到化合物5c；与化合物4d反应得到化合物5d；与化合物4e反应得到化合物5e；与化合物4f反应得到化合物5f；与化合物4g反应得到化合物5g；与化合物4h反应得到化合物5h。

(6)化合物6a的合成：将化合物4a置于烧瓶中，加入溴乙烷，无水碳酸钾，氮气置换3次保护，无水DMF，加热体系控制温度60℃-70℃，TLC监测反应完成，降至室温DMF减压旋转蒸发除去，加水，三氯甲烷(3×20mL)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得粗产物，用硅胶色谱法纯化，流动相为石油醚：乙酸乙酯，进行梯度洗脱，得化合物6a。

化合物6b、6c、6f的合成：按照上述合成步骤操作，与化合物4b反应得到化合物6b；与化合物4c反应得到化合物6c；与化合物4f反应得到化合物6f。

本发明所述的C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物的合成方法，所述合成方法具体包括如下步骤：

(1)化合物1的合成：分别称取叔丁醇钾2.34g、乙基三苯基溴化磷7.67g，加入烧瓶中，抽真空，加入适量无水四氢呋喃，室温搅拌1h，加入预先配置好的表雄酮(1g，3.5mmol)四氢呋喃溶液，室温搅拌3h，TLC监测反应完成，然后向反应液中加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次，每次100ml，合并萃取液，用饱和食盐水洗(2×100mL)，将有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得粗产物，用硅胶色谱法纯化，流动相为石油醚：乙酸乙酯＝5∶1，得化合物1；

(2)化合物2的合成：加入BH₃-Me₂S(7.5mL，10M，75.0mmol)到化合物1(5g，15.0mmol)的THF(100mL)溶液中，25℃搅拌2h后，滴加乙醇10mL、NaOH(30mL，5M)和H₂O₂(15mL，10M)，在60℃搅拌1h后，用10％Na₂S₂O₃溶液400mL淬灭混合物，并用乙酸乙酯萃取2次，每次300ml，将合成的有机溶液用饱和食盐水300mL洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤浓缩，得化合物2；

(3)化合物3的合成：称取1g化合物2和2.76g PCC，适量硅胶加入DCM(100mL)中，混合物在室温搅拌3h，将混合物过滤，过滤后的滤饼用DCM洗涤(2×100mL)，减压回收溶剂，硅胶柱层析，流动相为石油醚∶乙酸乙酯，得化合物3；

(4)化合物4a的合成：称取100mg化合物3置于25mL烧瓶中，加入乙酸1mL，注射加入苯胺23.70μL，搅拌12h，缓慢分批加入硼氢化钠22.70mg，室温搅拌2h，减压除去乙酸，固体加水，稀盐酸调节pH值在2-3，乙酸乙酯萃取，有机层用稀氢氧化钠溶液调节值中性或弱碱性，有机层萃取，减压浓缩，得粗产物，用硅胶色谱法纯化，流动相为石油醚∶乙酸乙酯，进行梯度洗脱，得化合物4a；

化合物4b-4h/4a'/4c'/4d'/4f'/4g'的合成：按照上述化合物4a的合成步骤操作，化合物3与苯胺反应得到化合物4a'；与对甲基苯胺反应得到化合物4b；与对甲氧基苯胺反应得到化合物4c和4c'；与对氯苯胺反应得到化合物4d和4d'；与邻甲基苯胺反应得到化合物4e；与间甲基苯胺反应得到化合物4f和4f'；与间甲氧基苯胺反应得到化合物4g和4g'；与邻甲氧基苯胺反应得到化合物4h。

(5)化合物5a的合成：称取50mg化合物4a置于25mL烧瓶中，加入碘甲烷22.98μL，无水DMF 2mL，加入氢化钠3.12mg，加热体系控制温度60℃-70℃，反应3h，TLC监测反应完成，降至室温，DMF减压蒸发除去，用三氯甲烷萃取3次，每次20mL，合并有机相，用饱和食盐水洗(2×20mL)，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得粗产物，用硅胶色谱法纯化，流动相为石油醚∶乙酸乙酯，进行梯度洗脱，得化合物5a；

化合物5b-5h的合成：按照上述化合物5a合成步骤操作，与化合物4b反应得到化合物5b；与化合物4c反应得到化合物5c；与化合物4d反应得到化合物5d；与化合物4e反应得到化合物5e；与化合物4f反应得到化合物5f；与化合物4g反应得到化合物5g；与化合物4h反应得到化合物5h。

(6)化合物6a-6c/6的合成：称取50mg 4a置于25mL烧瓶中，加入溴乙烷29.09μL，无水碳酸钾17.97mg，氮气置换3次保护，无水DMF 2mL，加热体系控制温度60℃-70℃，TLC监测反应完成，降至室温，DMF减压旋转蒸发除去，加水，三氯甲烷萃取3次，每次20mL，合并有机相，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得粗产物，用硅胶色谱法纯化，流动相为石油醚∶乙酸乙酯，得化合物6a；

化合物6b、6c、6f的合成：按照上述合成步骤操作，与化合物4b反应得到化合物6b；与化合物4c反应得到化合物6c；与化合物4f反应得到化合物6f。

本发明所述步骤(1)中叔丁醇钾、乙基三苯基溴化磷与表雄酮的摩尔比为6∶6∶1。

本发明所述步骤(2)中BH₃-Me₂S与化合物1的摩尔比为5∶1。

本发明所述步骤(3)中化合物2与PCC的摩尔比为1∶4。

本发明所述步骤(4)中化合物3、苯胺与硼氢化钠的摩尔比为1.6∶1.3∶3。

本发明所述步骤(5)中化合物4a、碘甲烷与氢化钠的摩尔比为1∶3∶1；所述步骤(6)中化合物4a、溴乙烷与无水碳酸钾的摩尔比为1∶3∶1。

本发明所述的C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物在制备抗肝癌、抗结直肠癌及抗炎药物中的应用。

本发明有益效果：

1.本发明合成方法，所用原料廉价易得，反应条件温和，绿色安全，操作简便。

2.本发明得到的C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物是新化合物，通过CCK8法对所得化合物进行体外抗肿瘤、抗炎活性筛选，显示该类化合物具有抗肿瘤、抗炎作用。为寻找高选择性和安全性的新型抗肿瘤和抗炎先导化合物，开发新型抗肿瘤和抗炎药物提供了科学依据。

附图说明

图1a化合物4a的¹H-NMR谱

图1b化合物4a的¹³C-NMR谱

图2a化合物4b的¹H-NMR谱

图2b化合物4b的¹³C-NMR谱

图3a化合物4c的¹H-NMR谱

图3b化合物4c的¹³C-NMR谱

图4a化合物4d的¹H-NMR谱

图4b化合物4d的¹³C-NMR谱

图5a化合物4e的¹H-NMR谱

图5b化合物4e的¹³C-NMR谱

图6a化合物4f的¹H-NMR谱

图6b化合物4f的¹³C-NMR谱

图7a化合物4g的¹H-NMR谱

图7b化合物4g的¹³C-NMR谱

图8a化合物4h的¹H-NMR谱

图8b化合物4h的¹³C-NMR谱

图9a化合物4a'的¹H-NMR谱

图9b化合物4a'的¹³C-NMR谱

图10a化合物4c'的¹H-NMR谱

图10b化合物4c'的¹³C-NMR谱

图11a化合物4d'的¹H-NMR谱

图11b化合物4d'的¹³C-NMR谱

图12a化合物4f'的¹H-NMR谱

图12b化合物4f'的¹³C-NMR谱

图13a化合物4g'的¹H-NMR谱

图13b化合物4g'的¹³C-NMR谱

图14a化合物5a的¹H-NMR谱

图14b化合物5a的¹³C-NMR谱

图15a化合物5b的¹H-NMR谱

图15b化合物5b的¹³C-NMR谱

图16a化合物5c的¹H-NMR谱

图16b化合物5c的¹³C-NMR谱

图17a化合物5d的¹H-NMR谱

图17b化合物5d的¹³C-NMR谱

图18a化合物5e的¹H-NMR谱

图18b化合物5e的¹³C-NMR谱

图19a化合物5f的¹H-NMR谱

图19b化合物5f的¹³C-NMR谱

图20a化合物5g的¹H-NMR谱

图20b化合物5g的¹³C-NMR谱

图21a化合物5h的¹H-NMR谱

图21b化合物5h的¹³C-NMR谱

图22a化合物6a的¹H-NMR谱

图22b化合物6a的¹³C-NMR谱

图23a化合物6b的¹H-NMR谱

图23b化合物6b的¹³C-NMR谱

图24a化合物6c的¹H-NMR谱

图24b化合物6c的¹³C-NMR谱

图25a化合物6f的¹H-NMR谱

图25b化合物6f的¹³C-NMR谱

图26化合物4a-4h的细胞毒性

图27化合物5a-5h的细胞毒性

图28化合物4a'、4c'、4d'、4f'、4g'、6a-6c和6f的细胞毒性

图29化合物4a-4h对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO的影响

图30化合物5a-5h对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO的影响

图31化合物4a'、4c'、4d'、4f'、4g'、6a-6c和6f对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO的影响

具体实施方式

实施例1：C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物的合成方法

1.化合物1的合成

将叔丁醇钾(2.34g，21mmol)乙基三苯基溴化磷(7.67g，21mmol)加入烧瓶中，抽真空，加入适量无水四氢呋喃，室温搅拌1h，加入预先配置好的表雄酮(1g，3.5mmol)四氢呋喃溶液，室温搅拌3h，TLC监测反应完成。将饱和氯化铵(NH₄Cl)溶液加入淬灭反应，乙酸乙酯(3×100ml)萃取，饱和食盐水NaCl(aq)洗，将有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得粗产物，通过硅胶色谱法纯化，流动相为石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1，得化合物1。

2.化合物2的合成

加入BH₃-Me₂S(7.5mL，10M，75.0mmol)到化合物1(5g，15.0mmol)的THF(100mL)溶液中。25℃搅拌2h后，滴加乙醇(10mL)、NaOH(30mL，5M)和H₂O₂(15mL，10M)。在60℃搅拌1h后，用Na₂S₂O₃(400mL，10％)淬灭混合物，并用乙酸乙酯(2×300mL)萃取。将合成的有机溶液用饱和食盐水(300mL)洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤浓缩，得化合物2。

3.化合物3的合成

将化合物2(1g，2mmol)和PCC(2.76g，8mmol)，适量硅胶加入DCM(100mL)中，混合物在室温搅拌3h。将混合物过滤，过滤后的滤饼用DCM洗涤，减压回收溶剂，硅胶柱层析，得化合物3。

4.化合物4a的合成

将化合物3(100mg，0.32mmol)置于25mL烧瓶中，加入乙酸1mL，注射加入苯胺(23.70μL，0.26mmol)。搅拌过夜，缓慢分批加入硼氢化钠(22.70mg，0.6mmol)。室温搅拌2h，减压除去乙酸，固体加水，稀盐酸调节pH值在2-3，乙酸乙酯萃取，有机层用稀氢氧化钠溶液调节值中性或弱碱性。有机层萃取，减压浓缩，得粗产物，硅胶色谱法纯化，流动相为石油醚∶乙酸乙酯，得化合物4。

化合物4b-4h/4a'/4c'/4d'/4f'/4g'的合成：按照上述化合物4a的合成步骤操作，化合物3与苯胺反应得到化合物4a'；与对甲基苯胺反应得到化合物4b；与对甲氧基苯胺反应得到化合物4c和4c'；与对氯苯胺反应得到化合物4d和4d'；与邻甲基苯胺反应得到化合物4e；与间甲基苯胺反应得到化合物4f和4f'；与间甲氧基苯胺反应得到化合物4g和4g'；与邻甲氧基苯胺反应得到化合物4h。

5.化合物5a-5h的合成

将化合物4a(50mg，0.13mmol)置于25mL烧瓶中，碘甲烷(22.98μL，0.39mmol)，无水处理的DMF(2mL)，加入氢化钠(3.12mg，0.13mmol)，加热体系控制温度60℃-70℃，反应3h，TLC监测反应完成，降至室温DMF减压蒸发除去，三氯甲烷(3×20mL)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得粗产物，硅胶色谱法纯化，流动相为石油醚∶乙酸乙酯，得化合物5a。

化合物5b-5h的合成：按照上述化合物5a合成步骤操作，与化合物4b反应得到化合物5b；与化合物4c反应得到化合物5c；与化合物4d反应得到化合物5d；与化合物4e反应得到化合物5e；与化合物4f反应得到化合物5f；与化合物4g反应得到化合物5g；与化合物4h反应得到化合物5h。

6.化合物6a-6c/6f的合成

将4a(50mg，0.13mmol)置于25mL烧瓶中，溴乙烷(29.09μL，0.39mmol)，无水碳酸钾(17.97mg，0.13mmol)，氮气置换3次保护，无水处理的DMF 2mL，加热体系控制温度60℃-70℃，TLC监测反应完成，降至室温DMF减压旋转蒸发除去，加水，三氯甲烷(3×20mL)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得粗产物，硅胶色谱法纯化，流动相为石油醚∶乙酸乙酯，得化合物6a。

化合物6b、6c、6f的合成：按照上述合成步骤操作，与化合物4b反应得到化合物6b；与化合物4c反应得到化合物6c；与化合物4f反应得到化合物6f。

化合物1：白色粉末，产率95％。¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ5.13–5.08(1H，m)，3.62–3.56(1H，m)，2.35(1H，ddt，J＝16.7，9.1，1.9Hz)，2.24(1H，dt，J＝12.7，3.5Hz)，2.19–2.12(1H，m)，1.80(1H，dt，J＝14.0，3.3Hz)，1.71(2H，dq，J＝12.0，3.8Hz)，1.64(3H，d，J＝7.4，1.9Hz)，1.61–1.47(5H，m)，1.39(3H，dddd，J＝19.7，12.7，8.1，4.0Hz)，1.28(3H，t，J＝11.6Hz)，1.20–1.08(3H，m)，0.95(2H，dtd，J＝30.4，12.8，12.0，5.0Hz)，0.86(3H，s)，0.81(3H，s)，0.67(1H，ddd，J＝12.8，10.5，4.1Hz)；¹³C-NMR(150MHz，CDCl₃)δ150.6，113.4，71.5，56.4，54.5，45.0，44.5，38.3，37.4，37.1，35.7，35.2，32.1，31.7，31.6，28.8，24.5，21.6，17.0，13.2，12.4。

化合物1的结构式如下：

化合物2：白色粉末，产率95％。¹H-NMR(400MHz，CD₃OD)δ3.69–3.59(1H，m)，3.56–3.47(1H，m)，2.13(1H，dt，J＝12.8，3.4Hz)，1.82–1.57(6H，m)，1.56–1.49(2H，m)，1.46–1.34(3H，m)，1.33–1.26(4H，m)，1.22–1.12(4H，m)，1.10(3H，d，J＝6.1Hz)，1.04–0.90(3H，m)，0.84(3H，s)，0.82(1H，s)，0.75(3H，s)，0.71–0.63(1H，m)；¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD)δ71.9，70.9，59.5，57.5，56.0，46.3，43.8，41.0，38.9，38.3，36.8，36.7，33.4，32.2，30.0，26.8，25.7，23.8，22.2，12.8。

化合物2的结构式如下：

化合物3：白色粉末，产率71％。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ2.52(1H，t，J＝8.9Hz)，2.43–2.22(4H，m)，2.11(4H，s)，2.07–1.97(3H，m)，1.80–1.60(6H，m)，1.44–1.31(6H，m)，1.28–1.11(4H，m)，1.00(3H，s)，0.98(1H，s)，0.92(1H，s)，0.78(1H，td，J＝11.5，10.8，4.3Hz)，0.63(3H，s)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ212.1，209.7，63.9，56.6，53.8，46.8，44.8，44.3，39.1，38.7，38.3，35.8，35.5，31.8，31.6，28.9，24.5，23.0，21.6，13.6，11.6。

化合物3的结构式如下：

化合物4a：无色透明针晶，产率67％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₂₇H₄₀NO([M+H]⁺)394.3104，found 394.3101；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.16(2H，ddd，J＝9.0，7.3，2.0Hz)，6.72–6.56(3H，m)，3.67(1H，p，J＝3.3Hz)，2.57–2.47(1H，m)，2.11(3H，s)，1.84–1.04(24H，m)，0.83(3H，d，J＝6.3Hz)，0.61(3H，s)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ210.0，147.4，129.4，116.8，113.8，113.0，63.9，56.9，54.4，45.7，44.4，40.4，39.2，36.2，35.9，33.0，32.6，32.0，31.7，28.7，25.9，22.8，21.3，20.9，13.6，12.5，11.6。见图1a-1b。

化合物4a的结构式如下：

化合物4a'：白色粉末，产率19％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₂₇H₄₀NO([M+H]⁺)394.3104，found 394.3101；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.20–7.13(2H，m)，6.70–6.55(3H，m)，3.66(1H，p，J＝3.2Hz)，2.53(1H，t，J＝8.9Hz)，2.20–2.13(1H，m)，2.11(3H，s)，2.05–1.97(1H，m)，1.74(2H，dt，J＝10.0，3.6Hz)，1.64(5H，ddt，J＝21.1，11.9，3.8Hz)，1.53(3H，dt，J＝13.5，3.9Hz)，1.36(3H，ddd，J＝17.9，10.4，3.7Hz)，1.30–1.11(7H，m)，0.96–0.89(1H，m)，0.83(3H，s)，0.81–0.76(1H，m)，0.60(3H，s)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ209.9，129.4，113.1，64.0，56.9，54.5，44.4，40.4，39.2，36.3，35.6，33.1，32.7，32.1，31.7，28.6，25.9，24.5，22.9，20.9，13.6，11.6。见图9a-9b。

化合物4a'的结构式如下：

化合物4b：无色透明块晶，产率51％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₂₈H₄₂NO([M+H]⁺)408.3261，found 408.3256；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ6.98(2H，d，J＝8.1Hz)，6.55(2H，d，J＝8.1Hz)，3.64(1H，q，J＝3.1Hz)，2.52(1H，t，J＝9.0Hz)，2.23(3H，s)，2.20–2.13(1H，m)，2.11(3H，s)，2.00(1H，dt，J＝11.8，3.3Hz，)，1.78–1.45(10H，m)，1.45–1.24(5H，m)，1.24–1.11(5H，m)，0.98–0.86(1H，m)，0.83(3H，s)，0.61(3H，s)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ209.9，145.2，129.9，113.3，64.0，56.9，54.5，47.8，44.4，40.4，39.2，36.2，35.6，33.0，32.7，32.1，31.7，28.6，25.9，24.5，22.9，20.9，20.5，13.6，11.6。见图2a-2b。

化合物4b的结构式如下：

化合物4c：无色透明块晶，产率51％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₂₈H₄₂NO₂([M+H]⁺)424.3210，found 424.3207；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ6.78(2H，d，J＝8.1Hz)，6.61(2H，s)，3.74(3H，s)，3.58(1H，q，J＝3.9，3.5Hz)，2.52(1H，t，J＝8.9Hz)，2.11(3H，s)，2.00(1H，dt，J＝11.8，3.3Hz，)，1.80–1.45(10H，m)，1.45–1.11(10H，m)，0.98–0.86(1H，m)，0.82(3H，s)，0.60(3H，s)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ209.9，115.1，64.0，56.9，56.0，54.4，44.4，39.2，36.2，35.6，33.0，32.1，31.7，28.6，24.5，22.9，20.9，13.6，11.6。见图3a-3b。

化合物4c的结构式如下：

化合物4c'：白色粉末，产率13％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₂₈H₄₂NO₂([M+H]⁺)424.3210，found 424.3206；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ6.79(4H，d，J＝8.3Hz)，3.76(3H，s)，3.55(1H，s)，2.53(1H，t，J＝8.7Hz)，2.11(4H，s)，2.02–1.95(2H，m)，1.75–1.50(11H，m)，1.34–1.23(16H，m)，0.99–0.83(7H，m)，0.80(3H，s)，0.60(3H，s)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ209.6，114.7，63.7，56.4，55.6，44.1，38.8，35.9，35.3，31.4，31.3，30.0，29.5，28.2，24.2，22.6，20.6，13.3，11.3。见图10a-10b。

化合物4c'的结构式如下：

化合物4d：无色透明块晶，产率67％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₂₇H₃₉NOCl([M+H]⁺)428.2715，found 428.2714；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.13–7.06(2H，m)，6.57–6.47(2H，m)，3.61(1H，t，J＝3.2Hz)，2.52(1H，t，J＝9.0Hz)，2.11(3H，s)，1.79–1.57(7H，m)，1.56–1.00(15H，m)，0.82(3H，s)，0.60(3H，s)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ209.8，129.2，114.2，64.0，60.5，56.9，54.5，44.4，40.4，39.2，36.2，35.6，33.0，32.5，32.0，31.7，28.6，25.7，24.5，22.9，20.9，13.6，11.6。见图4a-4b。

化合物4d的结构式如下：

化合物4d'：白色结晶性粉末，产率17％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₂₇H₃₉NOCl([M+H]⁺)428.2715，found 428.2710；¹H-NMR(400MHz CDCl₃)δ7.09(2H，dd，J＝8.7，1.8Hz)，6.51(2H，dd，J＝10.2，7.8Hz)，3.19(1H，td，J＝11.0，4.4Hz)，2.79(1H，dt，J＝8.5，2.9Hz)，2.12(3H，d，J＝3.5Hz)，1.89(2H，tq，J＝9.6，2.5Hz)，1.81–1.64(6H，m)，1.63–1.51(3H，m)，1.37–1.20(9H，m)，1.18–1.06(4H，m)，0.90(3H，s)，0.80(3H，d，J＝6.7Hz)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ213.1，129.2，114.7，114.2，61.5，53.8，50.4，45.9，45.6，40.3，37.7，35.9，35.8，35.5，33.0，32.3，29.8，29.2，28.7，26.0，25.7，24.4，21.2，21.1，20.9，12.4，11.6。见图11a-11b。

化合物4d'的结构式如下：

化合物4e：无色透明块晶，产率41％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₂₈H₄₂NO([M+H]⁺)408.3261，found 408.3258；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.13–7.02(2H，m)，6.60(2H，d，J＝10.3Hz)，3.30(1H，s)，2.56–2.49(1H，m)，2.16(2H，d，J＝9.5Hz)，2.12(4H，s)，2.0(2H，dt，J＝11.5，3.3Hz)，1.81–1.49(9H，m)，1.45–1.14(13H，m)，0.84(3H，d，J＝2.5Hz)，0.61(3H，s)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ209.9，130.3，127.2，64.0，56.9，54.5，45.8，44.4，39.2，36.1，35.6，35.6，32.1，32.1，31.7，29.8，28.7，24.6，24.5，22.9，21.3，17.8，13.6，12.6。见图5a-5b。

化合物4e的结构式如下：

化合物4f：无色透明块晶，产率47％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₂₇H₄₂NO([M+H]⁺)408.3261，found 408.3261；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.06(1H，t，J＝8.5，7.4Hz)，6.57–6.38(3H，m)，3.30–3.20(1H，m)，2.53(1H，t)，2.27(3H，s)，2.12(4H，s)，2.05–1.92(2H，m)，1.80–1.46(8H，m)，1.46–1.00(12H，m)，0.99–0.85(2H，m)，0.82(3H，d，J＝6.5Hz)，0.77–0.68(1H，m)，0.60(3H，s)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ210.0，139.2，129.3，129.3，64.0，56.8，54.4，45.7，44.4，39.2，37.7，36.2，35.9，35.6，32.1，31.7，28.6，24.5，22.9，21.8，21.3，13.6，12.5，11.6。见图12a-12b。

化合物4f的结构式如下：

化合物4f'：无色透明块晶，产率17％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₂₇H₄₂NO([M+H]⁺)408.3260，found 408.3255；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.14–7.03(2H，m)，6.61(2H，q，J＝5.8，4.1Hz)，3.76–3.72(1H，m)，2.52(1H，t，J＝8.9Hz)，2.18(3H，s)，2.12(4H，s)，2.01(1H，dt，J＝11.8，3.3Hz)，1.77(2H，dt，J＝10.9，3.6Hz)，1.71–1.60(4H，m)，1.59–1.51(4H，m)，1.46–1.14(13H，m)，0.85(3H，s)，0.61(3H，s)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ209.9，130.4，127.3，64.0，56.9，54.7，44.4，40.7，39.2，36.3，35.6，33.4，32.6，32.0，31.7，28.6，26.1，24.5，22.9，21.0，17.7，13.6，11.7。见图12a-12b。

化合物4f'的结构式如下：

化合物4g：无色透明块晶，产率39％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₂₈H₄₂NO₂([M+H]⁺)424.3210，found 424.3206；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.08(1H，t，J＝8.0Hz)，6.28(3H，s)，3.77(3H，s)，2.52(1H，t，J＝8.9Hz)，2.11(3H，s)，2.00(1H，dt，J＝12.0，3.3Hz)，1.80–1.48(11H，m)，1.45–1.30(4H，m)，1.29–1.12(6H，m)，0.91(1H，p，J＝5.7，4.9Hz)，0.82(3H，s)，0.60(3H，s)；¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)δ209.9，161.0，130.2，64.0，56.9，55.3，44.4，39.2，36.2，35.6，32.0，31.7，28.5，24.5，22.9，20.9，13.6，11.6。见图7a-7b。

化合物4g的结构式如下：

化合物4g'：白色粉末，产率13％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₂₈H₄₂NO₂([M+H]⁺)424.3210，found 424.3206；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.01–6.52(4H，m)，3.87(3H，d，J＝7.9Hz)，3.28(1H，s)，2.52(1H，t，J＝8.8Hz)，2.11(3H，s)，1.99(2H，dd，J＝14.2，10.4Hz)，1.79–1.47(12H，m)，1.44–1.12(13H，m)，0.83(3H，d，J＝3.1Hz)，0.61(3H，s)；¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)δ209.9，157.9，132.4，121.5，68.2，66.2，65.6，64.0，58.5，57.5，56.9，55.7，44.4，39.2，36.3，35.6，31.7，25.3，24.5，22.9，21.5，21.4，13.6，12.5。见图13a-13b。

化合物4g'的结构式如下：

化合物4h：无色透明块晶，产率56％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₂₈H₄₂NO₂([M+H]⁺)424.3002，found 424.3002；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.09(2H，dq，J＝15.1，7.4，6.6Hz)，6.81(2H，dd，J＝27.8，7.3Hz)，3.28(1H，s)，2.52(1H，t，J＝8.8Hz)，2.11(4H，d，J＝11.0Hz)，2.00(2H，d，J＝11.6Hz)，1.80–1.48(10H，m)，1.45–1.12(14H，m)，0.89(1H，d，J＝10.8Hz)，0.84(3H，d，J＝4.5Hz)，0.61(3H，s)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ209.9，153.7，127.6，126.1，64.0，56.9，54.4，45.7，44.4，39.2，36.0，35.6，32.1，31.7，29.8，28.6，24.5，22.9，21.3，13.6，12.5，11.7。见图8a-8b。

化合物4h的结构式如下：

化合物5a：白色粉末，产率42％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₂₈H₄₂NO([M+H]⁺)408.3261，found 408.3257；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.25–7.19(2H，m)，6.97–6.83(1H，m)，6.77(1H，d，J＝8.1Hz)，6.68(1H，t，J＝7.3Hz)，2.82(3H，d，J＝25.3Hz)，2.56–2.49(1H，m)，2.17(1H，tdd，J＝10.1，4.3，2.5Hz)，2.12(3H，s)，2.01(1H，dt，J＝11.7，3.4Hz)，1.80(1H，dt，J＝12.9，3.5Hz)，1.74–1.57(7H，m)，1.50(2H，d，J＝10.1Hz)，1.46–1.32(4H，m)，1.31–1.13(6H，m)，1.01–0.89(1H，m)，0.83(3H，d，J＝6.3Hz)，0.61(3H，d，J＝3.1Hz)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ209.9，129.2，129.0，119.8，119.1，116.4，113.3，64.0，58.5，56.9，54.4，46.4，44.4，39.2，38.1，35.9，35.7，32.1，31.7，28.9，28.7，25.1，24.6，22.9，21.3，21.0，13.6，12.6。见图14a-14b。

化合物5a的结构式如下：

化合物5b：黄色粉末，产率53％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₂₉H₄₄NO([M+H]⁺)422.3417，found 422.3414；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.07(2H，d，J＝8.2Hz)，6.92(2H，d)，2.75(3H，s)，2.53(1H，t，J＝8.9Hz)，2.29(3H，s)，2.11(3H，s)，2.00(1H，dt，J＝11.9，3.4Hz)，1.76(1H，d，J＝14.6Hz)，1.69–1.52(10H，m)，1.44–1.34(5H，m)，1.27(5H，d，J＝11.1Hz)，1.19–1.11(4H，m)，0.81(3H，s)，0.60(3H，s)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ207.4，147.8，128.1，127.0，118.8，61.4，54.4，52.6，52.1，41.9，38.1，37.5，36.7，33.4，33.1，31.5，29.6，29.3，29.1，27.2，26.1，22.4，21.9，20.3，18.4，18.2，11.0，9.7。见图15a-15b。

化合物5b的结构式如下：

化合物5c：黄色粉末，产率41％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₂₉H₄₄NO₂([M+H]⁺)438.3367，found 438.3366；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.08–7.02(2H，m)6.86–6.80(2H，m)，3.78(3H，s)，2.65(3H，s)，2.53(1H，t，J＝8.8Hz)，2.11(3H，s)，1.99(1H，dt，J＝12.0，3.4Hz)，1.72–1.56(8H，m)，1.46–1.23(9H，m)，1.22–1.07(5H，m)，0.80(3H，s)，0.60(3H，s)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ210.0，155.8，147.0，125.1，114.2，64.0，57.4，57.0，55.6，54.6，44.5，42.5，39.6，39.3，36.2，35.7，33.4，32.2，31.9，31.7，28.6，25.1，24.5，22.9，21.0，13.6，12.3。见图16a-16b。

化合物5c的结构式如下：

化合物5d：黄色针状结晶，产率59％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₂₈H₄₁NOCl([M+H]⁺)442.2871，found 442.2860；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.14(2H，d，J＝8.9Hz)，6.67(2H，d，J＝8.7Hz)，3.61–3.51(1H，m)，2.75(3H，s)，2.53(1H，t，J＝8.8Hz)，2.11(3H，s)，2.01(1H，dt，J＝11.6，3.2Hz)，1.80(1H，dt，J＝13.1，3.5Hz)，1.72–1.51(9H，m)，1.43–1.14(14H，m)，0.99–0.86(2H，m)，0.83(3H，s)，0.73(1H，td，J＝11.4，4.1Hz)，0.61(3H，s)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ208.9，129.0，114.4，100.9，64.0，58.8，56.8，54.4，46.4，44.4，39.2，38.6，35.9，35.6，32.1，31.7，29.8，28.8，24.6，22.9，22.8，21.3，13.6，12.6。见图17a-17b。

化合物5d的结构式如下：

化合物5e：黄色粉末，产率60％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₂₉H₄₄NO([M+H]⁺)422.3417，found 422.3415；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.20–7.10(2H，m)，7.05(1H，dd，J＝8.0，1.4Hz)，6.94(1H，td，J＝7.3，1.4Hz)，2.66(3H，s)，2.55–2.47(2H，m)，2.28(3H，s)，2.16(1H，d，J＝3.9Hz)，2.11(4H，d，J＝2.2Hz)，1.99(1H，dt，J＝11.3，3.0Hz)，1.76–1.56(10H，m)，1.40–1.16(11H，m)，0.80(3H，d，J＝3.6Hz)，0.59(3H，s)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ209.9，152.3，133.8，131.2，126.1，122.6，121.8，64.0，62.0，56.9，54.5，46.2，44.4，39.3，38.1，36.0，35.6，35.1，32.2，31.7，31.1，28.9，24.9，24.5，22.9，21.3，18.5，13.6，12.6。见图18a-18b。

化合物5e的结构式如下：

化合物5f：黄色粉末，产率48％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₂₉H₄₄NO([M+H]⁺)422.3417，found 422.3413；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.10(1H，t，J＝8.2Hz)，6.58(2H，s)，6.51(1H，d，J＝7.4Hz)，2.77(3H，s)，2.53(1H，t，J＝8.8Hz)，2.31(3H，s)，2.11(3H，s)，2.01(1H，dt，J＝11.5，3.1Hz)，1.80(1H，d，J＝13.0Hz)，1.72–1.53(8H，m)，1.44–1.31(4H，m)，1.31–1.20(5H，m)，1.17(2H，p，J＝5.8Hz)，0.92(1H，d，J＝11.7Hz)，0.84(3H，s)，0.74(1H，t，J＝10.8Hz)，0.61(3H，s)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ209.9，150.8，138.9，129.1，117.4，114.1，110.6，77.4，64.0，58.5，56.9，54.5，46.4，44.4，39.2，38.1，37.8，35.9，35.7，32.2，31.7，28.9，25.1，24.6，22.9，22.1，21.3，13.6，12.6。见图19a-19b。

化合物5f的结构式如下：

化合物5g：黄色粉末，产率42％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₂₉H₄₄NO₂([M+H]⁺)438.3367，found 438.3363；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.18–7.10(1H，m)，6.55–6.23(3H，m)，3.79(3H，d，J＝1.3Hz)，2.89–2.75(3H，m)，2.53(1H，td，J＝8.9，4.3Hz)，2.11(3H，d，J＝1.2Hz)，2.04–1.97(1H，m)，1.84–1.76(1H，m)，1.76–1.56(6H，m)，1.55–1.44(3H，m)，1.39–1.33(2H，m)，1.31–1.22(5H，m)，1.22–1.09(4H，m)，0.91(1H，d，J＝2.7Hz)，0.85–0.79(3H，m)，0.61(2H，d，J＝2.3Hz)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ209.9，160.5，129.8，129.5，110.9，104.4，103.9，63.9，64.0，56.9，55.2，44.4，40.8，39.2，38.1，35.8，35.8，35.6，32.1，31.9，31.6，28.7，24.9，24.5，22.9，21.0，13.6，12.4。见图20a-20b。

化合物5g的结构式如下：

化合物5h：黄色粉末，产率42％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₂₉H₄₄NO₂([M+H]⁺)438.3367，found 438.3368；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ6.96(2H，td，J＝9.4，2.0Hz)，6.91–6.82(2H，m)，3.85(3H，s)，2.73(3H，s)，2.51(1H，t，J＝8.9Hz)，2.10(4H，s)，1.99(1H，dt，J＝11.4，3.1Hz)，1.78–1.56(9H，m)，1.42–1.20(9H，m)，1.17–1.04(3H，m)，0.99–0.86(2H，m)，0.80(3H，s)，0.60(3H，s)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ209.9，153.2，142.0，122.5，121.2，120.6，111.4，64.0，61.3，56.9，55.6，54.5，46.2，44.4，39.3，38.2，35.9，35.6，33.9，32.2，31.7，30.8，28.9，24.7，24.5，22.9，21.3，13.6，12.5。见图21a-21b。

化合物5h的结构式如下：

化合物6a：白色粉末，产率23％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₂₉H₄₄NO([M+H]⁺)422.3417，found 422.3413；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.25–7.21(2H，m)，7.01–6.95(2H，m)，6.90(1H，ddd，J＝7.3，6.2，1.1Hz)，3.25(2H，q，J＝7.0Hz)，2.52(1H，t，J＝8.9Hz)，2.11(3H，s)，1.99(1H，dt，J＝11.9，3.3Hz)，1.81–1.74(1H，m)，1.68–1.58(4H，m)，1.57(2H，d，J＝3.0Hz)，1.46(1H，d，J＝3.7Hz)，1.43–1.39(1H，m)，1.34(4H，tt，J＝8.1，4.2Hz)，1.29(1H，t，J＝3.2Hz，)，1.26(3H，s)，1.17(2H，td，J＝6.6，6.1，2.6Hz)，1.14–1.09(2H，m)，0.97–0.89(4H，m)，0.81(3H，s)，0.60(3H，s)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ210.0，150.2，128.7，122.5，120.8，64.1，57.0，54.7，51.5，45.1，44.5，40.0，39.3，36.0，35.7，33.9，32.2，31.7，31.7，28.7，24.8，24.5，22.9，21.0，13.6，12.5，11.7。见图22a-22b。

化合物6a的结构式如下：

化合物6b：白色粉末，产率19％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₃₀H₄₆NO([M+H]⁺)436.3574，found 436.3573；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.02(2H，d，J＝8.2Hz)，6.66(2H，d，J＝8.5Hz)，3.23(2H，q，J＝7.0Hz)，2.53(1H，t，J＝8.9Hz)，2.24(3H，s)，2.12(3H，s)，2.01(2H，dt，J＝11.8，3.2Hz)，1.78(1H，dd，J＝13.1，3.5Hz)，1.63(10H，dddd，J＝29.6，12.5，9.4，3.3Hz)，1.42(2H，s)，1.29(4H，d，J＝3.5Hz)，1.26(10H，d，J＝3.8Hz)，1.13(4H，t，J＝7.0Hz)，0.83(4H，s)，0.61(3H，s)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ209.9，146.5，129.8，125.3，113.7，64.0，58.2，56.9，54.5，46.5，44.4，39.6，39.2，38.2，36.0，35.7，32.5，31.7，29.8，29.4，28.9，25.8，24.6，22.9，21.3，20.3，15.4，14.3，13.6，12.7。见图23a-23b。

化合物6b的结构式如下：

化合物6c：白色粉末，产率22％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₃₀H₄₆NO₂([M+H]⁺)452.3528，found 452.3520；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.05–7.00(2H，m)，6.84–6.79(2H，m)，3.78(3H，s)，3.01(2H，q，J＝7.0Hz)，2.52(1H，t，J＝8.8Hz)，2.11(3H，s)，1.99(1H，dt，J＝12.0，3.4Hz)，1.62(8H，dtd，J＝23.5，9.9，8.8，3.6Hz)，1.53–1.46(1H，m)，1.44–1.13(17H，m)，1.06(2H，tt，J＝9.5，3.8Hz)，0.79(3H，s)，0.59(3H，s)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ210.0，155.7，144.0，127.3，113.9，64.1，57.0，55.5，54.6，53.7，46.9，44.5，39.3，39.3，36.2，35.7，33.1，32.3，31.8，31.7，28.6，25.0，24.5，22.9，21.0，13.6，12.3，11.5。见图24a-24b。

化合物6c的结构式如下：

化合物6f：白色粉末，产率17％。HR-ESI-MS m/z calcd for C₃₀H₄₆NO([M+H]⁺)436.3574，found 436.3576；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.13–7.05(1H，m)，6.54(2H，d，J＝6.6Hz)，6.48(1H，d，J＝7.4Hz)，3.26(2H，q，J＝7.0Hz)，2.54(1H，t，J＝8.7Hz)，2.30(3H，s)，2.12(3H，s)，2.04–1.99(1H，m)，1.83–1.77(1H，m)，1.73–1.56(8H，m)，1.46–1.41(4H，m)，1.31–1.24(13H，m)，1.16(5H，t，J＝7.0Hz)，0.84(3H，s)，0.61(3H，s)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ209.9，148.7，139.0，129.2，116.8，113.5，110.0，64.0，57.6，56.9，54.5，46.5，44.4，39.3，38.2，36.0，35.7，32.6，32.2，31.7，29.8，28.9，25.8，24.6，22.9，22.2，21.3，15.5，13.6，12.7。见图25a-25b。

化合物6f的结构式如下：

试验例1：本发明对合成的新的C20-酮基孕甾烷型生物碱进行了人肝癌细胞(HepG2、SK-Hep1)、人结直肠癌细胞(HCT116、SW480、DLD-1)的细胞毒活性筛选，并通过以下实施来进一步阐明本发明。

一、本发明化合物的细胞毒活性研究：

1.实验原理：CCK-8的英文全称为Cell Counting Kit-8。其中起主要作用的化学药品是WST-8，化学名为2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐。它的核心基团和MTT是一样的，是MTT的升级版本。在电子耦合试剂(也就是细胞是活的，有呼吸，有能量代谢)存在的情况下，可被NAD+氧化还原成为水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan)。活细胞越多，产生的Formazan就越多，颜色也会越深。

2.实验步骤：取对数生长期细胞，用含0.25％EDTA(1×)胰蛋白酶消化至细胞处于悬浮状态后，加入含血清的培养基稀释胰酶浓度，终止消化。用完全培养基制备密度为2×10⁴cells/mL单细胞混悬液，以100uL/孔接种于96孔板中，外圈细胞培养孔中加入100uLPBS缓冲液，减小边缘效应对实验结果的影响。于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养24h，观察细胞贴壁后。加入100uL含待测试生物碱衍生物的培养液。生物碱衍生物试液浓度范围设为：20，10，5，2.5，1.25，0.625μM，每个浓度设3个复孔。留三孔只加细胞的培养液作为空白对照，以不加药只加DMSO的培养液孔作为阴性对照。培养72h后弃去上清液，加入100μL10％CCK-8的CCK-8工作液，继续放入培养箱培养2h后，用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定吸光度值，所有的吸光度值首先减去空白对照值后，通过与对照组值的比较得到实验组药物的相对细胞抑制率，药物细胞抑制率＝[OD对照-OD实验]/[OD对照-OD阴性]×100％。以同一药物的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率可以求出该药物对细胞生长抑制率为50％的浓度即半数抑制浓度IC₅₀。由于每个生物碱衍生物同一浓度在96孔板中占3孔，即同一浓度平均作用细胞三次取平均值，而每个实验重复三次。所得数据以“均数+标准误差”(mean+SEM)表示，Student's t-test进行显著性分析，以P<0.05认为有显著性差异。

3.实验结果：

表1化合物对HepG2、SK-HEP-1、HCT-116、SW480、DLD-1的IC₅₀(单位：μmol/mL)

注：*为化合物的IC₅₀优于阳性对照

目标衍生物抗肝癌细胞(HepG2、SK-Hep1)测试结果表明(表1)：化合物5b、6c对HepG2细胞的IC₅₀值分别为0.36μmol/mL和0.43μmol/mL，优于阳性对照索拉非尼；化合物4a、4d、4f、4g、4h、4f'、4g'、5a-5c、5g、5h、6c对SK-Hep1细胞的IC₅₀优于阳性对照索拉非尼；目标衍生物抗结直肠癌细胞(HCT116、SW480、DLD-1)测试结果表明(表1)：化合物4c'对HCT116、SW480两种细胞均有较好的抑制活性，IC₅₀值分别为0.04μmol/mL和0.22μmol/mL，均优于阳性对照；化合物4e、4f、4c'、5c、5d、6b对结直肠癌细胞SW480具有显著抑制作用。

试验例2：本发明对合成的新的C20-酮基孕甾烷型生物碱进行体外抗炎活性筛选，测试合成衍生物对RAW264.7细胞的活性影响，再从炎症理论角度出发，以脂多糖诱导小鼠单核巨噬细胞系(RAW264.7)造成炎症细胞模型，随后通过对细胞的一氧化氮释放量的检测判断合成该类化合物是否具有抑炎作用。并通过以下实施来进一步阐明本发明。

1.实验原理：CCK-8法基本原理同上。NO在体内或水溶液等环境中极易氧化为NO2-，而在酸性条件下，NO可发生一系列反应生成粉红色特殊物质，这种特殊物质在540nm处有最大吸收峰，可通过OD值推算NO浓度。

2.实验步骤：

(1)孕甾烷生物碱衍生物对RAW264.7细胞毒性实验步骤同上。

(2)Griess法测定RAW264.7细胞中的NO分泌量

取对数生长期细胞，制备密度为1×10⁵cells/mL单细胞混悬液，以100μL/孔接种于96孔板中，外圈细胞培养孔中加入100μLPBS缓冲液，减小边缘效应对实验结果的影响。于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养20h，观察细胞贴壁后。加入100μL含待测试生物碱衍生物的培养液。生物碱衍生物试液浓度范围设为：200，100，50，25，12.5，6.25μM，每个浓度设3个复孔。留三孔只加细胞的培养液作为正常组，以不加药只加DMSO的培养液孔作为空白组，于37℃，5％ CO₂培养箱中静置培养1h后，加入浓度为1μg/mL的LPS刺激其产生炎症，最后放入37℃，5％CO₂培养箱中培养20h。

取出Griess Reagent I和II，使恢复室温，按照试剂说明书制作标准曲线，将培养好的细胞上清液按50μL/孔，在新的96孔板中加入标准品及样品，按50μl/孔，在各孔中先加入Griess Reagent I，再Griess Reagent II，最后使用酶标仪于540nm处测定其吸光度，并根据标准品曲线计算出样品中一氧化氮的浓度。

3.实验结果

通过CCK8实验测定6个不同浓度下C20-酮基孕甾烷型生物碱对RAW264.7细胞的存活率。如图26-28所示：对于化合物4a-4h，除化合物4b外，其余化合物在100μM-6.25μM的剂量下不会对巨噬细胞RAW264.7产生影响；对于化合物5a-5h，化合物5a给药浓度为200以下，与正常组对比无显著性差异，无细胞毒性，化合物5e、5f、5h在25μM以下的剂量下不会对巨噬细胞RAW264.7产生影响；化合物4a'、4c'、4d'、4g'、4f'只有在最小浓度6.25μM左右，无细胞毒性；化合物6b具有较强的细胞毒性；所有目标化合物的安全浓度范围差异较大。

一氧化氮(NO)是一种在炎症发病机制中起关键作用的信号分子，它是一种促炎症介质，在异常情况下过度分泌进而引起炎症。当用LPS刺激RAW264.7细胞后，大量NO从细胞释放到培养基中以亚硝酸盐的形式存在，可用Griess试剂测定亚硝酸盐的含量。由于不同化合物的存活率不同，我们在其安全浓度范围内设置不同的浓度梯度，探究化合物作用于LPS(1μg/mL)刺激的RAW264.7细胞炎症模型24h后NO表达水平的影响。实验结果显示，所有化合物均能在一定程度上降低NO的分泌。如图29-31所示：其中化合物4a、4e除12.5μM，其他给药浓度均与模型组对比无显著性差异，可以抑制NO的生成；而化合物4h除6.25μM，其他给药浓度均与模型组对比无显著性差异，可以抑制NO的生成；化合物4g'除200μM，其他给药浓度均与模型组对比无显著性差异，可以抑制NO的生成。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域或技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物，其特征在于，结构通式为(Ⅰ)所示：

其中，R₁选自苯胺，对甲基苯胺，邻甲基苯胺，间甲基苯胺，对氯苯胺，对甲氧基苯胺，邻甲氧基苯胺，间甲氧基苯胺；R₂选自氢，甲基，乙基。

2.根据权利要求1所述的C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物，其特征在于，所述衍生物化合物为25种，依次记为4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4a'、4c'、4d'、4f'、4g'、5a、5b、5c、5d、5e、5f、5g、5h、6a、6b、6c、6f，R₁，R₂的对应关系如下：

3.一种如权利要求1所述的C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)化合物1的合成：将叔丁醇钾和乙基三苯基溴化磷加入烧瓶中，抽真空，加入适量无水四氢呋喃，室温搅拌1h，加入预先配置好的表雄酮四氢呋喃溶液，室温搅拌3h，TLC监测反应完成，然后向反应液中加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，将有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得粗产物，用硅胶色谱法纯化，流动相为石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1，得化合物1；

(2)化合物2的合成：将BH₃-Me₂S加入到化合物1的四氢呋喃溶液中，25℃搅拌2h后，滴加乙醇、NaOH和H₂O₂，在60℃搅拌1h后，用Na₂S₂O₃淬灭混合物，并用乙酸乙酯萃取，将合成的有机溶液用饱和食盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤浓缩，得化合物2；

(3)化合物3的合成：将化合物2和PCC，适量硅胶加入DCM中，混合物在室温搅拌3h，将混合物过滤，过滤后的滤饼用DCM洗涤，减压回收溶剂，硅胶柱层析，流动相为石油醚∶乙酸乙酯，得化合物3；

(4)化合物4a的合成：将化合物3置于烧瓶中，加入乙酸，注射加入苯胺，搅拌12h，缓慢少量多次分批加入硼氢化钠，室温搅拌2h，减压除去乙酸，固体加水淬灭，稀盐酸调节pH值在2-3，用乙酸乙酯萃取3次(3×30ml)，有机层用稀氢氧化钠溶液调节值中性或弱碱性，用Na₂SO₄干燥，减压浓缩，得粗产物，用硅胶色谱法纯化，流动相为石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱，得化合物4a；

化合物4b-4h/4a'/4c'/4d'/4f'/4g'的合成：按照上述化合物4a的合成步骤操作，化合物3与苯胺反应得到化合物4a'；与对甲基苯胺反应得到化合物4b；与对甲氧基苯胺反应得到化合物4c和4c'；与对氯苯胺反应得到化合物4d和4d'；与邻甲基苯胺反应得到化合物4e；与间甲基苯胺反应得到化合物4f和4f'；与间甲氧基苯胺反应得到化合物4g和4g'；与邻甲氧基苯胺反应得到化合物4h。

(5)化合物5a的合成：将化合物4a置于烧瓶中，加入碘甲烷，无水DMF，加入氢化钠，加热体系控制温度60℃-70℃，反应3h，TLC监测反应完成，降至室温，DMF减压蒸发除去，三氯甲烷萃取，合并有机相，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得粗产物，用硅胶色谱法纯化，得化合物5a；

化合物5b-5h的合成：按照上述化合物5a合成步骤操作，与化合物4b反应得到化合物5b；与化合物4c反应得到化合物5c；与化合物4d反应得到化合物5d；与化合物4e反应得到化合物5e；与化合物4f反应得到化合物5f；与化合物4g反应得到化合物5g；与化合物4h反应得到化合物5h。

(6)化合物6a的合成：将化合物4a置于烧瓶中，加入溴乙烷，无水碳酸钾，氮气置换3次保护，无水DMF，加热体系控制温度60℃-70℃，TLC监测反应完成，降至室温DMF减压旋转蒸发除去，加水2mL淬灭，三氯甲烷(3×20mL)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得粗产物，用硅胶色谱法纯化，流动相为石油醚：乙酸乙酯，进行梯度洗脱，得化合物6a。

化合物6b、6c、6f的合成：按照上述合成步骤操作，与化合物4b反应得到化合物6b；与化合物4c反应得到化合物6c；与化合物4f反应得到化合物6f。

4.根据权利要求3所述的C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物的合成方法，其特征在于，所述合成方法具体包括如下步骤：

(1)化合物1的合成：分别称取叔丁醇钾2.34g、乙基三苯基溴化磷7.67g，加入烧瓶中，抽真空，加入15mL无水四氢呋喃，室温搅拌1h，加入预先配置好的表雄酮(1g，3.5mmol)四氢呋喃溶液，室温搅拌3h，TLC监测反应完成，然后向反应液中加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取(3×100mL)，合并萃取液，用饱和食盐水洗(3×100mL)，将有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得粗产物，用硅胶色谱法纯化，流动相为石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1，得化合物1；

(2)化合物2的合成：加入BH₃-Me₂S(7.5mL，10M，75.0mmol)到化合物1(5g，15.0mmol)的THF(100mL)溶液中，25℃搅拌2h后，滴加乙醇10mL、NaOH(30mL，5M)和H₂O₂(15mL，10M)，在60℃搅拌1h后，用10％Na₂S₂O₃溶液400mL淬灭混合物，并用乙酸乙酯萃取2次，每次300ml，将合成的有机溶液用饱和食盐水300mL洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤浓缩，得化合物2；

(3)化合物3的合成：称取1g化合物2和2.76g PCC，适量硅胶加入DCM(100mL)中，混合物在室温搅拌3h，将混合物过滤，过滤后的滤饼用100mLDCM洗涤2次，减压回收溶剂，硅胶柱层析，流动相为石油醚∶乙酸乙酯，得化合物3；

(4)化合物4a的合成：称取100mg化合物3置于25mL烧瓶中，加入乙酸1mL，注射加入苯胺23.70μL，搅拌过夜，缓慢分批加入硼氢化钠22.70mg，室温搅拌2h，减压除去乙酸，固体加水，稀盐酸调节pH值在2-3，乙酸乙酯萃取萃取(3×30ml)，有机层用稀氢氧化钠溶液调节值中性或弱碱性，用Na₂SO₄干燥，减压浓缩，得粗产物，用硅胶色谱法纯化，流动相为石油醚∶乙酸乙酯，进行梯度洗脱，得化合物4a；

化合物4b-4h/4a'/4c'/4d'/4f'/4g'的合成：按照上述化合物4a的合成步骤操作，化合物3与苯胺反应得到化合物4a'；与对甲基苯胺反应得到化合物4b；与对甲氧基苯胺反应得到化合物4c和4c'；与对氯苯胺反应得到化合物4d和4d'；与邻甲基苯胺反应得到化合物4e；与间甲基苯胺反应得到化合物4f和4f'；与间甲氧基苯胺反应得到化合物4g和4g'；与邻甲氧基苯胺反应得到化合物4h。

(5)化合物5a的合成：称取50mg化合物4a置于25mL烧瓶中，加入碘甲烷22.98μL，无水DMF 2mL，加入氢化钠3.12mg，加热体系控制温度60℃-70℃，反应3h，TLC监测反应完成，降至室温，DMF减压蒸发除去，用三氯甲烷萃取3次，每次20mL，合并有机相，用饱和食盐水洗(2×20ml)，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得粗产物，用硅胶色谱法纯化，流动相为石油醚∶乙酸乙酯，进行梯度洗脱，得化合物5a；

化合物5b-5h的合成：按照上述化合物5a合成步骤操作，与化合物4b反应得到化合物5b；与化合物4c反应得到化合物5c；与化合物4d反应得到化合物5d；与化合物4e反应得到化合物5e；与化合物4f反应得到化合物5f；与化合物4g反应得到化合物5g；与化合物4h反应得到化合物5h。

(6)化合物6a的合成：称取50mg 4a置于25mL烧瓶中，加入溴乙烷29.09μL，无水碳酸钾17.97mg，氮气置换3次保护，无水DMF 2mL，加热体系控制温度60℃-70℃，TLC监测反应完成，降至室温，DMF减压旋转蒸发除去，加水，三氯甲烷萃取3次，每次20mL，合并有机相，饱和食盐水洗(2×20ml)，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得粗产物，用硅胶色谱法纯化，流动相为石油醚∶乙酸乙酯，进行梯度洗脱，得化合物6a；

化合物6b、6c、6f的合成：按照上述合成步骤操作，与化合物4b反应得到化合物6b；与化合物4c反应得到化合物6c；与化合物4f反应得到化合物6f。

5.根据权利要求3或4任一项所述的C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物的合成方法，其特征在于，所述步骤(1)中叔丁醇钾、乙基三苯基溴化磷与表雄酮的摩尔比为6∶6∶1。

6.根据权利要求3或4任一项所述的C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物的合成方法，其特征在于，所述步骤(2)中BH₃-Me₂S与化合物1的摩尔比为5∶1。

7.根据权利要求3或4任一项所述的C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物的合成方法，其特征在于，所述步骤(3)中化合物2与PCC的摩尔比为1∶4。

8.根据权利要求3或4任一项所述的C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物的合成方法，其特征在于，所述步骤(4)中化合物3、苯胺与硼氢化钠的摩尔比为1.6∶1.3∶3。

9.根据权利要求3或4任一项所述的C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物的合成方法，其特征在于，所述步骤(5)中化合物4a、碘甲烷与氢化钠的摩尔比为1∶3∶1；所述步骤(6)中化合物4a、溴乙烷与无水碳酸钾的摩尔比为1∶3∶1。

10.如权利要求1所述的C20酮基孕甾烷型生物碱衍生物在制备抗肝癌、抗结直肠癌及抗炎药物中的应用。