CN116715669B - 一种牛血中血红素的固相提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛血中血红素的固相提取方法，其包括以下步骤：S1：从牛血中分离红细胞，S2：涨破红细胞得备用液，S3：将备用液上样ACD‑100氨基羧酸树脂柱，待血红素吸附后加入洗脱剂，得洗脱液，S4：用盐酸调节洗脱液的pH值，析出血红素后将洗脱溶液离心、洗涤、喷雾干燥，得血红素成品；其中，S4的洗脱剂是0.1M氢氧化钠溶液、0.1M碳酸氢三钠溶液、3‑乙基‑2‑甲基‑3‑戊醇、二乙二醇的复配。本申请所制备的血红素成品的纯度高达95%‑98%，且操作简单、污染小，是一种极具开发潜力的血红素提取方法。
Description
技术领域
本发明涉及血红素制备技术领域，尤其是涉及一种牛血中血红素的固相提取方法。
背景技术
血红素是一类天然叶琳化合物，以与有机分子结合的状态广泛存在于动物的血液、肌肉和某些植物组织中。血红素具备重要的生理功能，广泛应用于医疗领域，重点应用于贫血、血液病和肝脏疾病等的诊断和治疗上。
血红素在牛血中主要以血红蛋白的形式存在。目前牛血中血红素的提取方法有冰醋酸法、酶解法、酸性丙酮法，这三种提取方法不是操作繁琐就是对环境污染大，另有大量研究表明，这三种提取方法所制备的血红素成品中血红素的纯度并不算高。
针对上述中的相关技术，发明人认为牛血中血红素的提取方法还具备改进空间。
发明内容
为了进一步改善牛血中血红素的提取方法，本申请提供一种牛血中血红素的固相提取方法。因为螯合树脂具备良好的金属离子结合力，因此螯合树脂在无机、冶金、分析、放射化学、制药、催化和海洋化学领域发展迅速，本申请将螯合树脂应用于牛血中血红素的提取上，发现螯合树脂相较于冰醋酸法、酶解法、酸性丙酮法，所提取的血红素纯度并不具备优势。本申请在继续的深入研究中发现，选用特定的ACD-100氨基羧酸树脂柱对血红素进行固相提取，并配以特殊组成的洗脱剂，所制备的血红素成品的纯度高达95％-98％，且操作简单、污染小，是一种极具开发潜力的血红素提取方法。
本申请提供的一种牛血中血红素的固相提取方法采用如下的技术方案：
一种牛血中血红素的固相提取方法，包括以下步骤：
S1：在新鲜牛血中添加抗凝剂，离心分离、洗涤后得到红细胞；
S2：在红细胞中添加相对于红细胞体积三倍的纯净水将红细胞溶胀破壁、过滤后用3～6M盐酸将过滤溶液的pH值调节至2～3，得备用液；
S3：将备用液上样ACD-100氨基羧酸树脂柱，待血红素完全吸附在ACD-100氨基羧酸树脂上后，用纯水冲洗柱子至无蛋白液流出，再往柱中继续加入洗脱剂，洗脱柱中吸附的血红素，得洗脱液；
S4：用3～6M盐酸将洗脱液的pH值调节至4～4.5，析出血红素后将洗脱溶液离心、洗涤、喷雾干燥，得血红素成品；
其中，S4的洗脱剂是0.1M氢氧化钠溶液、0.1M碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇的复配。
上述技术方案中所制备的血红素成品呈钢蓝色粉末状固体，本申请通过ACD-100氨基羧酸树脂柱对于血红素的特定强吸附作用，具备良好的分离血红素和珠蛋白的能力，能够从备用液中分离出更多的血红素，通过0.1M氢氧化钠溶液、0.1M碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇复配而成的洗脱剂，能够精确地减弱ACD-100氨基羧酸树脂和血红素的结合力，精准洗脱血红素，减少ACD-100氨基羧酸树脂上杂质的洗脱，使得洗脱液中含有更多的血红素且含有更少的杂质，使得最终制备的血红素具备良好的纯度。
优选的，所述ACD-100氨基羧酸树脂柱的预处理包括如下步骤：
步骤1：将ACD-100氨基羧酸树脂装柱；
步骤2：用4wt％盐酸溶液以1～2BV/h的流速正向过柱处理2～3BV，再用去离子水正向过柱清洗树脂，至流出液体pH值在6～7，清洗完成后，在ACD-100氨基羧酸树脂床层上保留1～2cm的液面高度；
步骤3：用4％～6％的氢氧化钠溶液以1～2BV/h的流速正向过柱处理2～3BV，再用去离子水正向过柱清洗树脂，至出口pH在7～9即完成ACD-100氨基羧酸树脂柱的预处理。
上述技术方案中，通过上述方案预处理而成的ACD-100氨基羧酸树脂柱能够充分溶胀，具备更大的比表面积，能够更好地吸附血红素。
优选的，所述0.1M氢氧化钠溶液、0.1M碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇的质量比是(90～95)：(2～5)：(1～5)：(2～5)。
上述技术方案中，通过按照上述质量比配比0.1M氢氧化钠溶液、0.1M碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇，具备更好的减弱ACD-100氨基羧酸树脂和血红素的结合力的技术效果，更容易将血红素从ACD-100氨基羧酸树脂上洗脱下来。
优选的，所述0.1M氢氧化钠溶液、0.1M碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇的质量比是(90～95)：(2～3)：(1～2)：(2～5)。
上述技术方案中，(90～95)：(2～3)：(1～2)：(2～5)的质量比是0.1M氢氧化钠溶液、0.1M碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇的最佳质量配比，在此范围内配制而成的洗脱剂对血红素的洗脱效果最好。
优选的，所述步骤S3中至少用纯水以1～2BV/h的流速正向过柱处理4～5BV。
上述技术方案中，通过限制纯水用量为4～5BV，能够最大程度地洗脱ACD-100氨基羧酸树脂柱上的蛋白质并避免血红素的流失，进一步提高血红素的提取纯度。
优选的，所述步骤S4中用6M盐酸、6M乙酸的复配溶液将洗脱液的pH值调节至4～4.5，所述6M盐酸、6M乙酸的质量比为(90～95)：(5～10)。
上述技术方案中，通过特定选择质量比为(90～95)：(5～10)的6M盐酸、6M乙酸作为血红素析出剂，能够维持洗脱液稳定的pH值，更好更多的析出血红素，并减少析出血红素中的杂质。
优选的，所述步骤S4中pH值调节至4.2。
上述技术方案中，利用质量比为(90～95)：(5～10)的6M盐酸、6M乙酸将洗脱液pH值调节成特定的4.2，能够最大化地析出洗脱液中的血红素，最大化的减少析出血红素中的杂质，使得提取出的血红素纯度更高。
优选的，所述步骤1之后、步骤2之前还包括如下步骤：用95％(V/V)乙醇溶液以1～2BV/h的流速正向过柱处理2～3BV，在ACD-100氨基羧酸树脂床层上保留1～2cm的液面高度。
上述技术方案中，通过预先用乙醇溶液浸润ACD-100氨基羧酸树脂柱，能够更好的溶胀ACD-100氨基羧酸树脂，并保证ACD-100氨基羧酸树脂具备良好的分散性，后续能够更好的从ACD-100氨基羧酸树脂柱中冲洗出蛋白质。
综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：
1.本申请所制备的血红素成品呈钢蓝色粉末状固体，本申请通过ACD-100氨基羧酸树脂柱对于血红素的特定强吸附作用，具备良好的分离血红素和珠蛋白的能力，能够从备用液中分离出更多的血红素，通过0.1M氢氧化钠溶液、0.1M碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇复配而成的洗脱剂，能够精确地减弱ACD-100氨基羧酸树脂和血红素的结合力，精准洗脱血红素，减少ACD-100氨基羧酸树脂上杂质的洗脱，使得洗脱液中含有更多的血红素且含有更少的杂质，使得最终制备的血红素具备良好的纯度。
2.本申请通过(90～95)：(2～3)：(1～2)：(2～5)的质量比配比0.1M氢氧化钠溶液、0.1M碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇，使得所制备的洗脱液具备更好的减弱ACD-100氨基羧酸树脂和血红素的结合力的技术效果，更容易将血红素从ACD-100氨基羧酸树脂上洗脱下来。
3.本申请通过质量比为(90～95)：(5～10)的6M盐酸、6M乙酸将洗脱液pH值调节成特定的4.2，能够最大化的析出洗脱液中的血红素，最大化的减少析出血红素中的杂质，使得提取出的血红素纯度更高。
附图说明
图1：血红素标准品绘制的标准曲线。
图2：实验例6提取得到的血红素成品图片。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
预处理例1
一种ACD-100氨基羧酸树脂柱的预处理，包括如下步骤：
步骤1：将ACD-100氨基羧酸树脂装柱；
步骤2：用4wt％盐酸溶液以1BV/h的流速正向过柱处理3BV，再用去离子水正向过柱清洗树脂，至流出液体pH值在7，清洗完成后，在ACD-100氨基羧酸树脂床层上保留2cm的液面高度；
步骤3：用4％的氢氧化钠溶液以2BV/h的流速正向过柱处理2BV，再用去离子水正向过柱清洗树脂，至出口pH在7即完成ACD-100氨基羧酸树脂柱的预处理。
其中，ACD-100氨基羧酸树脂购买于陕西领盛新材料科技有限公司。
预处理例2
一种ACD-100氨基羧酸树脂柱的预处理，与预处理例1的区别在于，包括如下步骤：
步骤1：将ACD-100氨基羧酸树脂装柱；
步骤2：用4wt％盐酸溶液以2BV/h的流速正向过柱处理2BV，再用去离子水正向过柱清洗树脂，至流出液体pH值在6，清洗完成后，在ACD-100氨基羧酸树脂床层上保留1cm的液面高度；
步骤3：用6％的氢氧化钠溶液以1BV/h的流速正向过柱处理3BV，再用去离子水正向过柱清洗树脂，至出口pH在9即完成ACD-100氨基羧酸树脂柱的预处理。
预处理例3
一种ACD-100氨基羧酸树脂柱的预处理，预处理例1的区别在于，步骤1之后、步骤2之前还包括如下步骤：用95％(V/V)乙醇溶液以2BV/h的流速正向过柱处理2BV，在ACD-100氨基羧酸树脂床层上保留2cm的液面高度。
实验例1
一种牛血中血红素的固相提取方法，包括以下步骤：
S1：在新鲜牛血中添加抗凝剂，离心分离、洗涤后得到红细胞；
S2：在红细胞中添加相对于红细胞体积三倍的纯净水将红细胞溶胀破壁、过滤后用6M盐酸将过滤溶液的pH值调节至3，得备用液；
S3：将备用液上样ACD-100氨基羧酸树脂柱，待血红素完全吸附在ACD-100氨基羧酸树脂上后，用纯水冲洗柱子至无蛋白液流出，再往柱中继续加入洗脱剂，洗脱柱中吸附的血红素，得洗脱液；
S4：用6M盐酸将洗脱液的pH值调节至4，析出血红素后将洗脱溶液离心、洗涤、喷雾干燥，得血红素成品。
其中，S4的洗脱剂是0.1M氢氧化钠溶液、0.1M碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇按照95：2：1：2的质量比复配而成。
其中，使用的ACD-100氨基羧酸树脂柱来自于预处理例1。
实验例2
一种牛血中血红素的固相提取方法，与实验例1的区别在于，包括以下步骤：
S1：在新鲜牛血中添加抗凝剂，离心分离、洗涤后得到红细胞；
S2：在红细胞中添加相对于红细胞体积三倍的纯净水将红细胞溶胀破壁、过滤后用3M盐酸将过滤溶液的pH值调节至2，得备用液；
S3：将备用液上样ACD-100氨基羧酸树脂柱，待血红素完全吸附在ACD-100氨基羧酸树脂上后，用纯水冲洗柱子至无蛋白液流出，再往柱中继续加入洗脱剂，洗脱柱中吸附的血红素，得洗脱液；
S4：用3M盐酸将洗脱液的pH值调节至4.5，析出血红素后将洗脱溶液离心、洗涤、喷雾干燥，得血红素成品。
其中，S4的洗脱剂是0.1M氢氧化钠溶液、0.1M碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇按照90：5：5：5的质量比复配而成。
其中，使用的ACD-100氨基羧酸树脂柱来自于预处理例2。
实验例3
一种牛血中血红素的固相提取方法，与实验例1的区别在于，步骤S4如下：用6M盐酸、6M乙酸的复配溶液将洗脱液的pH值调节至4，析出血红素后将洗脱溶液离心、洗涤、喷雾干燥，得血红素成品。
其中，S4的洗脱剂是0.1M氢氧化钠溶液、0.1M碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇按照90：2：1：2的质量比复配而成。
其中，6M盐酸、6M乙酸的质量比为90：10。
实验例4
一种牛血中血红素的固相提取方法，与实验例1的区别在于，步骤S4如下：用6M盐酸、6M乙酸的复配溶液将洗脱液的pH值调节至4.5，析出血红素后将洗脱溶液离心、洗涤、喷雾干燥，得血红素成品。
其中，S4的洗脱剂是0.1M氢氧化钠溶液、0.1M碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇按照95：3：2：5的质量比复配而成。
其中，6M盐酸、6M乙酸的质量比为95：5。
实验例5
一种牛血中血红素的固相提取方法，与实验例4的区别在于，步骤S4如下：用6M盐酸、6M乙酸的复配溶液将洗脱液的pH值调节至4.2，析出血红素后将洗脱溶液离心、洗涤、喷雾干燥，得血红素成品。
实验例6
一种牛血中血红素的固相提取方法，与实验例5的区别在于，使用的ACD-100氨基羧酸树脂柱来自于预处理例3。
对比实验例1
一种牛血中血红素的固相提取方法，与实验例1的区别在于，S4的洗脱剂是0.1M氢氧化钠溶液。
对比实验例2
一种牛血中血红素的固相提取方法，与实验例1的区别在于，S4的洗脱剂中0.1M碳酸氢三钠溶液等量替换成0.1M碳酸氢钠溶液。
对比实验例3
一种牛血中血红素的固相提取方法，与实验例1的区别在于，S4的洗脱剂中3-乙基-2-甲基-3-戊醇等量替换成95％(V/V)乙醇溶液。
对比实验例4
一种牛血中血红素的固相提取方法，与实验例1的区别在于，S4的洗脱剂中二乙二醇等量替换成95％(V/V)乙醇溶液。
实验试剂：血红素标准品实验仪器：紫外可见光分光光度计(ZJ-01-41)、JF分析天平(ZJ-01-033)、ZXRD-B5055鼓风干燥箱(ZJ-01-027)。
实验1
配制5mg/L血红素溶液，称量5mg/L血红素溶液20mL共三份，分别倒入预处理例1-3的ACD-100氨基羧酸树脂柱中，静置1h后，打开ACD-100氨基羧酸树脂柱，收集完流出的废液，测定血红素浓度，从而计算ACD-100氨基羧酸树脂柱的吸附率(％)，实验结果见表1。
吸附率(％)＝(C0*V0-C1*V1)/C0*V0*100％，其中，C0表示血红素溶液初始浓度，V0表示20mL，C1表示废液中血红素浓度，V1表示废液体积(mL)。
实验2
首先通过血红素标准品绘制标准曲线(385nm处测定吸光度值)，称取血红素标准品20mg于100mL容量瓶中，加0.1mol/LNaOH溶液溶解并定容到100ml，摇匀。分别精密吸取上述溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5.0mL于100mL于100mL容量瓶中，用0.1mol/LNaOH溶液定容到100ml，摇匀。以0.1mol/LNaOH溶液作为空白对照，于波长385nm处测定光吸收值,并作线性回归，得回归方程，并制作血红素标准曲线，如图1所示。
然后称取上述各实验例、对比实验例所制备的血红素成品以及市售酶解法提取的血红素成品各20mg于100mL容量瓶中，加0.1mol/LNaOH溶液适量使完全溶解并定容到100ml，摇匀。吸取上述溶液10mL于100mL容量瓶中用0.1mol/LNaOH溶液定容到100ml，摇匀。测定溶液在385nm处的吸光度值，并代入回归方程计算血红素含量(％)，实验结果见表2。
表1：
表2：
上述实验结果表明，预处理例1-3具备良好的血红素吸附性，实验例1-6所提取的血红素纯度高，在95％～98％。
预处理例3和预处理例1-2的区别在于，预处理例3预先用乙醇溶液浸润过ACD-100氨基羧酸树脂柱，预处理例3的吸附效果在一定程度上更优，由此可见，通过预先用乙醇溶液浸润ACD-100氨基羧酸树脂柱，能够进一步提高ACD-100氨基羧酸树脂柱对于血红素的吸附性。
实验例6和实验例5的区别在于，实验例6使用了预处理例3的ACD-100氨基羧酸树脂柱，实验例6的血红素成品的血红素含量在一定程度上相较于实验例5更优，由此分析可得，提高ACD-100氨基羧酸树脂柱对于血红素的吸附性，能够进一步促使提取的血红素纯度更高。
实验例1和对比实验例1-4的区别在于，实验例1的洗脱剂是0.1M氢氧化钠溶液、0.1M碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇复配而成，实验例1的血红素成品的血红素含量明显高于对比实验例1-4，由此分析可得，0.1M氢氧化钠溶液、0.1M碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇复配而成的洗脱剂具备特殊性，能够精准洗脱血红素并减少ACD-100氨基羧酸树脂上杂质的洗脱，使得最终制备的血红素具备良好的纯度。
实验例3-4和实验例1-2的区别在于，实验例3-4的洗脱剂是0.1M氢氧化钠溶液、0.1M碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇按照(90～95)：(2～3)：(1～2)：(2～5)的质量比配比而成，且同时配合使用了6M盐酸、6M乙酸析出血红素，实验例3-4的血红素成品的血红素含量在一定程度上相较于实验例1-2更优，由此分析可得，0.1M氢氧化钠溶液、0.1M碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇在(90～95)：(2～3)：(1～2)：(2～5)的特定范围内配制洗脱剂，具备更好的血红素洗脱效果，再配合6M盐酸、6M乙酸的维持洗脱液稳定的pH值效果，能够稳定析出洗脱液中的血红素并减少析出血红素中的杂质，使得提取出的血红素纯度更高。
实验例5和实验例4的区别在于，实验例5的析出pH值为4.2，实验例5的血红素成品的血红素含量在一定程度上相较于实验例4更优，由此分析可得，利用质量比为(90～95)：(5～10)的6M盐酸、6M乙酸将洗脱液pH值调节成特定的4.2，能够最大化的析出洗脱液中的血红素，最大化的减少析出血红素中的杂质，使得提取出的血红素纯度更高。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (6)
1.一种牛血中血红素的固相提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：在新鲜牛血中添加抗凝剂，离心分离、洗涤后得到红细胞；
S2：在红细胞中添加相对于红细胞体积三倍的纯净水将红细胞溶胀破壁、过滤后用3~6M盐酸将过滤溶液的pH值调节至2~3，得备用液；
S3：将备用液上样ACD-100氨基羧酸树脂柱，待血红素完全吸附在ACD-100氨基羧酸树脂上后，用纯水冲洗柱子至无蛋白液流出，再往柱中继续加入洗脱剂，洗脱柱中吸附的血红素，得洗脱液；
S4：用3~6M盐酸或质量比为（90~95）：（5~10）的6M盐酸、6M乙酸的复配溶液将洗脱液的pH值调节至4~4.5，析出血红素后将洗脱溶液离心、洗涤、喷雾干燥，得血红素成品；
其中，S3的洗脱剂是0.1M氢氧化钠溶液、0.1M碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇的复配；
所述0.1M氢氧化钠溶液、0.1M碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇的质量比是（90~95）：（2~5）：（1~5）：（2~5）。
2.根据权利要求1所述的一种牛血中血红素的固相提取方法，其特征在于，所述ACD-100氨基羧酸树脂柱的预处理包括如下步骤：
步骤1：将ACD-100氨基羧酸树脂装柱；
步骤2：用4wt%盐酸溶液以1~2BV/h的流速正向过柱处理2~3BV，再用去离子水正向过柱清洗树脂，至流出液体pH值在6~7，清洗完成后，在ACD-100氨基羧酸树脂床层上保留 1~2cm的液面高度；
步骤3：用4%~6%的氢氧化钠溶液以 1~2BV/h 的流速正向过柱处理2~3BV，再用去离子水正向过柱清洗树脂，至出口 pH 在7~9即完成ACD-100氨基羧酸树脂柱的预处理。
3.根据权利要求1所述的一种牛血中血红素的固相提取方法，其特征在于，所述0.1M氢氧化钠溶液、0.1M碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇的质量比是（90~95）：（2~3）：（1~2）：（2~5）。
4.根据权利要求1所述的一种牛血中血红素的固相提取方法，其特征在于，所述步骤S3中至少用纯水以1~2BV/h的流速正向过柱处理4~5BV。
5.根据权利要求1所述的一种牛血中血红素的固相提取方法，其特征在于，所述步骤S4中pH值调节至4.2。
6.根据权利要求2所述的一种牛血中血红素的固相提取方法，其特征在于，所述步骤1之后、步骤2之前还包括如下步骤：用95%（V/V）乙醇溶液以1~2BV/h的流速正向过柱处理2~3BV，在ACD-100氨基羧酸树脂床层上保留 1~2cm 的液面高度。
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