CN116710145A - 防止真菌毒素中毒症的偶联的t-2毒素 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及偶联的T‑2毒素(T2)在保护动物免受T2诱发的真菌毒素中毒症的方法中的用途，特别是防止平均日增重的减少、肠损伤、皮肤损伤和口鼻部损伤，从而防止由于摄取T2引起的由T2诱发的真菌毒素中毒症的一种或多种体征。

Description

防止真菌毒素中毒症的偶联的T-2毒素
发明背景
本发明总体上涉及抗由真菌毒素(mycotoxin)诱发的真菌毒素中毒症(mycotoxicosis)的保护作用。特别是，本发明涉及抗由T-2毒素(A型单端孢霉烯族(trichothecenes)-2毒素或T2)诱发的真菌毒素中毒症的保护作用。
真菌毒素通常是由多种真菌在自然界中产生的高度多样的次级代谢物，其引起食物污染，导致动物和人的真菌毒素中毒症。特别是，由镰刀菌属产生的单端孢霉烯族毒素，由于其造成潜在的健康危害而在世界范围内在农业上更重要。它主要在摄入后被代谢和消除，产生超过20种代谢物，其中羟基单端孢霉烯族-2毒素是主要代谢物。单端孢霉烯由于其被局部吸收的额外潜力而具有危险的毒性，并且其代谢物影响胃肠道、皮肤、肾、肝以及免疫和造血祖细胞系统。从奶牛到猪对这种类型毒素的敏感性各不相同，最敏感的终点是神经、生殖、免疫和血液效应。作用机制主要包括蛋白质合成的抑制和对细胞的氧化损伤，然后是核酸合成的破坏和随之而来的细胞凋亡。与单端孢霉烯真菌毒素中毒症有关的可能的危害、历史意义、毒代动力学、基因毒性和细胞毒性作用以及监管指南和建议是公知的。
T-2毒素主要存在于谷物中，例如小麦、玉米、大麦、水稻、大豆，特别是燕麦及其产品中。在全世界的发展中国家中，由于诸如高温和湿度水平、季风、收获期间的非季节性降雨和突发性洪水的热带条件，真菌繁殖和T-2的产生得到增强。T-2的产生通过诸如底物的湿度、相对湿度、温度和氧气的可获得性的因素而增强。
T-2易于通过各种方式吸收，包括外用、口服和吸入途径。作为皮肤刺激物和起泡剂，据称其毒性是芥子气(sulfur mustard)的400倍。毒素的呼吸摄入表明其活性与芥子气或路易斯气相当。T-2真菌毒素的独特之处在于全身性毒性可由任何暴露途径(即皮肤、口腔或呼吸道)引起。
T-2的毒性和有害作用基于多种因素而变化，例如给药途径；暴露的时间和量；给药剂量；以及动物的年龄、性别和总体健康状况以及任何其他真菌毒素的存在。中毒通常发生在投喂由谷物、干草和稻草制成的在露天中越冬并被拟枝镰刀菌(F.sporotrichiella)和梨孢镰刀菌(F.poae)污染的饲料后。T-2诱发的真菌毒素中毒的典型体征是呕吐(emesis，vomiting)、皮肤起水疱、食欲不振和体重减轻。
与单胃动物相比，已知反刍动物对T-2毒素具有相对抗性。在家禽中，T-2毒素已经成为除了免疫应答受损、造血系统破坏、产蛋量下降、蛋壳变薄、拒食、体重减轻和羽毛样式改变、翅膀定位异常、歇斯底里的发作(hysteroid seizures)或翻正反射受损之外的口腔和肠道病变的致病因素[49，50]。据报道，与猪相比，家禽对单端孢霉烯族相对较不敏感。在猪中，伴随着消化道的浆液性出血性坏死性溃疡性炎症，在口鼻部、嘴唇和舌头上形成一些坏死，胃粘膜的水肿和粘膜包被、头部区域的肿胀(尤其是眼睑和喉周围)、有时甚至轻瘫或麻痹(paresis或paralysis)能被看到。T-2毒素的毒性作用通常表现为食物中毒性白细胞缺乏症(ATA)的形式。体征包括呕吐、腹泻、白细胞减少、出血、休克和死亡。急性毒理学效应的特征还在于肝脏浆膜以及沿肠道、胃和食道的多处出血。
事实上，单端孢霉烯族作为潜在危险试剂的前景、去污策略和未来的前景在本领域中得到全面描述。关于针对T-2诱发的真菌毒素中毒症的治疗，这主要限于与饲料和食物储备中的最大允许限度有关的检测策略。它的存在仍然可以证明是有毒的。目前，T-2毒素诱发损伤的治疗主要强调天然物质、益生菌和氨基酸的使用，并且对针对该毒素的精确解毒剂的探求持续至今。因此，制定了严格的规定，并开展了检疫活动，以防止大规模的非计划性接触。尽管已经提及(参见例如Manohar V.等,“Final Report:Development OfVaccines To The Mycotoxin T-2”,Borriston Laboratories,Maryland,USA，1985年3月15日，AD-A158544/7/XAB 16p,NTIS数据库)，受试动物可以接种抵抗T-2的疫苗，这一直使用抗独特型疫苗接种策略进行，其中针对T-2特异性抗体引发抗体应答。然而，还没有发现该策略在T2诱发的真菌毒性(mycotoxicis)的预防性治疗中是成功的。因此，T2诱发的真菌毒素中毒症的预防性治疗目前主要限于良好的农业实践以减少作物上的真菌毒素产生与食品和饲料商品的控制程序以确保真菌毒素水平保持低于某些限度。
真菌通常在动物中引起广泛的疾病，涉及器官和组织的寄生以及过敏性表现。然而，除了通过摄入不可食用的蘑菇而中毒之外，真菌还可产生真菌毒素和有机化学物质，导致被称为真菌毒素中毒症的各种毒性作用。这种疾病是暴露于由丝状真菌污染食物或动物饲料产生的药理活性化合物真菌毒素引起的。真菌毒素是对真菌生理机能不重要的次级代谢物，其在摄入、吸入或皮肤接触时在最小浓度下对脊椎动物具有极大的毒性。目前约400种真菌毒素被识别，细分为具有相似生物学和结构特性的化学相关分子家族。其中，因为对动物健康的威胁，大约12个小组经常受到关注。具有最大公共利益和农业经济意义的真菌毒素的实例包括黄曲霉毒素(AF)、赭曲毒素(OT)、单端孢霉烯(T；包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇，缩写为DON)、玉米赤霉烯酮(ZEA)、伏马毒素(F)、震颤毒素和麦角生物碱。真菌毒素与急性和慢性疾病相关，其生物效应主要根据其化学结构的多样性而变化，但也与生物、营养和环境因素有关。真菌毒素中毒症的病理生理学是真菌毒素与动物细胞中的功能性分子和细胞器相互作用的结果，其可引起致癌性、基因毒性、蛋白质合成的抑制、免疫抑制、皮肤刺激和其它代谢紊乱。在敏感的动物物种中，真菌毒素可引起复杂和重叠的毒性作用。真菌毒素中毒症不是传染性的，也不存在免疫系统的显著刺激。用药物或抗生素治疗对疾病过程几乎没有或没有影响。迄今为止，没有人或动物疫苗可用于对抗真菌毒素中毒症。
因此，越来越多的工作集中在开发具有针对广泛真菌种类的功效的疫苗和/或免疫疗法，作为对抗真菌病的有力工具，即在预防特定真菌疾病中用真菌本身代替毒素感染。与真菌病相反，真菌毒素中毒症不需要涉及产生毒素的真菌，并且尽管具有生物起源，但被认为是非生物危害。在这个意义上，真菌毒素中毒症已经被认为是通过自然手段中毒的实例，并且保护策略基本上集中在预防暴露上。人和动物暴露主要发生在摄取基于植物的食物中的真菌毒素。摄入的真菌毒素的代谢可能导致在不同器官或组织中积累；因此，真菌毒素可以通过动物肉、奶或蛋(携带)进入人类食物链。由于产生毒素的真菌污染了多种用于人类和动物消费的作物，因此真菌毒素可能存在于所有种类的农业原材料、商品和饮料中。粮食和农业组织(FAO)估计，世界粮食作物的25％被真菌毒素显著污染。目前，预防真菌毒素中毒症的最佳策略包括良好的农业实践，以减少作物上的真菌菌毒素产生，以及食品和饲料商品的控制程序，以确保真菌毒素水平低于预定的阈值限度。这些策略可限制商品被一些组的真菌毒素污染的问题，但成本高且效果不一。尽管在暴露于AF的个体中，用一些诸如叶绿酸、绿茶多酚和二硫醇硫酮类(dithiolethione)(奥替普拉，oltipraz)的保护剂获得了一些令人鼓舞的结果，但除了支持性治疗(例如饮食、补水)之外，几乎不存在对真菌毒素暴露的治疗，并且通常没有真菌毒素的解毒剂。
在本领域中，已经提出了针对一些真菌毒素的特定疫苗接种策略，主要是为了用基于产生抗体的策略防止由动物来源的重要食物的污染而引起的真菌毒素中毒症，该抗体可以通过免疫拦截特异性地阻断真菌毒素的初始吸收或生物活化、它们在动物产品(如牛奶)中的毒性和/或分泌，主要针对预防人的真菌毒素中毒症。
然而，生产用于防止真菌毒素中毒症的疫苗是非常具有挑战性的，主要与以下事实相关：真菌毒素本身是小的非免疫原性分子，并且与真菌毒素相关的毒性使得在健康受试者中用作抗原并非没有风险。真菌毒素是低分子量的，通常是非蛋白质分子，其通常具有免疫原性的(半抗原)，但当与诸如蛋白质的大载体分子连接时可能引发免疫应答。真菌毒素与蛋白质或多肽载体偶联的方法和动物免疫条件的优化已经被广泛研究，目的是产生具有不同特异性的单克隆或多克隆抗体，用于免疫分析以筛选供动物和人消费的产品中的真菌毒素。这些研究中使用的偶联蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白(TG)和聚赖氨酸等。在过去的几十年中，已经进行了许多努力来开发可以与蛋白质结合同时保留足够的原始结构的真菌毒素衍生物，使得产生的抗体将识别原生毒素。通过这些方法，可以获得抗许多真菌毒素的抗体，表明与蛋白质的偶联可能是产生抗体的有效工具。由于可能在体内释放的分子的毒性，因此将该策略应用于人和动物疫苗接种以实现保护，同时对接受者安全，迄今为止尚未成功。例如，诸如T-2的毒素与蛋白质载体的偶联已经显示出产生了不稳定的复合物，并可能释放活性形式的游离毒素(Chanh等,Monoclonalanti-idiotype induces protection against the cytotoxicity of thetrichothecene mycotoxin T-2,J Immunol.1990,144:4721-4728)。与可赋予针对细菌毒素的病理作用的保护状态的类毒素疫苗类似，开发针对真菌毒素的疫苗的合理方法可基于偶联的“类真菌毒素(mycotoxoid)”，其被定义为真菌毒素的修饰形式，尽管保持抗原性但没有毒性(Giovati L等,Anaflatoxin B1 as the paradigm of a new class ofvaccines based on“Mycotoxoids”,Ann Vaccines Immunization 2(1):1010,2015)。鉴于真菌毒素的非蛋白质性质，转化为类真菌毒素的方法应依赖于化学衍生化。在相关母体真菌毒素的战略性位置引入特定基团可导致形成具有不同物理化学特性的分子，但仍能够诱导对原生毒素具有足够交叉反应的抗体。因此，真菌毒素疫苗接种的共同原理是基于产生抗类真菌毒素的抗体，与细胞靶标相比，其具有增强的结合天然真菌毒素的能力，中和毒素并在暴露的情况下预防疾病发展。这种策略的潜在应用已经在属于AF组的真菌毒素的情况下得到证实(Giovati等,2015)，但对任何其他真菌毒素都没有。此外，还没有证明这种保护作用针对接种动物本身的真菌毒素中毒症，而只是防止奶牛携带到其奶中，以保护消费奶或由其制成的产品的人免于真菌毒素中毒症。
发明目的
本发明的目的是提供一种保护动物免受动物饲料中重要真菌毒素T-2毒素诱发的真菌毒素中毒症的方法。
发明内容
为了满足本发明的目的，已经发现偶联的T-2毒素(T2)适用于保护动物免受T2诱发的真菌毒素中毒症的方法。发现不需要将T2转化为类毒素，偶联的毒素似乎对接受治疗的宿主动物是安全的。而且，令人惊讶地发现，在治疗后，针对诸如真菌毒素的小分子诱导的免疫应答强到足以保护动物自身免受摄入真菌毒素后的真菌毒素中毒症。对于任何真菌毒素，通过在动物中诱导针对真菌毒素本身的免疫应答的动物的这种实际保护在本领域中还没有展示。
定义
真菌毒素中毒症是由于暴露于真菌毒素而引起的疾病。临床体征，靶器官和结果取决于真菌毒素的内在毒性特征和暴露的量和长度，以及暴露动物的健康状况。
防止真菌毒素中毒症是指防止或减少动物中真菌毒素的一种或多种负面生理作用，例如平均日增重减少、肠损伤、皮肤损伤和口鼻部损伤。
T-2毒素(也表示为T-2真菌毒素、T-2镰刀菌毒素(fusariotoxin)、Insariotoxin或单端孢霉烯)是真菌毒素，共同点是具有四环的倍半萜12，13-环氧单端孢霉-9-烯环，该环氧环负责毒理学活性。它们的化学结构的特征在于在C-3位的羟基、在C-4和C-15位的乙酰氧基、在C-7位的氢和在C-8位的酯连接的异戊酰基(而不是其它类型的单端孢霉烯族的羰基，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇)，如下式1所示：
式1：T-2毒素
偶联分子是免疫原性化合物通过共价键与之结合的分子。通常，免疫原性化合物是大蛋白如KLH、BSA或OVA。
佐剂是非特异性免疫刺激剂。原则上，能够支持或放大免疫事件级联中的特定过程，最终导致更好的免疫应答(即，对抗原的综合身体应答，特别是由淋巴细胞介导的并且通常涉及特异性抗体或先前致敏的淋巴细胞对抗原的识别的应答)的每种物质可被定义为佐剂。佐剂对于所述特定过程的发生通常是不被需要的，而只是有利于或放大所述过程。佐剂通常可以根据它们诱导的免疫学事件进行分类。第一类，包含i.a.ISCOM(免疫刺激复合物)、皂苷(或其馏分和衍生物如Quil A)、氢氧化铝、脂质体、耳蜗酸盐(cochleate)、聚乳酸/乙醇酸、促进APC(抗原呈递细胞)的抗原摄取、转运和呈递。第二类，包含i.a.油乳液(W/O、O/W、W/O/W或O/W/O)、凝胶、聚合物微球(Carbopol)、非离子嵌段共聚物和最可能还有氢氧化铝，提供储存效应(depot effect)。第三类，包含i.a.富含CpG的基序、单磷酰脂质A、分枝杆菌(胞壁酰二肽)、酵母提取物、霍乱毒素，是基于保守微生物结构的识别，因此被称为病原体相关的微生物模式(PAMP)，定义为信号0。第四类，包含i.a.油乳液表面活性剂、氢氧化铝、缺氧，是基于刺激免疫系统在危险和无害(其不必与自身和非自身相同)之间的区分能力。第五类，包含i.a.细胞因子，是基于共刺激分子信号2在APC上的上调。
在本发明的意义上，疫苗是适于施用于动物的组合物，其包含免疫学有效量的一种或多种抗原(即，能够充分刺激靶标动物的免疫系统以至少减少用疾病诱发剂激发的负效应，通常与药学上可接受的载体(即，生物相容性介质，即在给药后不在受试动物中诱导显著不良反应的介质，能够在施用疫苗后将抗原呈递至宿主动物的免疫系统)组合，例如含有水和/或任何其它生物相容性溶剂的液体或固体载体，例如通常用于获得冻干疫苗(基于糖和/或蛋白质)。任选地包含免疫刺激剂(佐剂)，其在施用给动物后诱导用于治疗疾病或病症的免疫应答，即辅助预防、改善或治愈疾病或病症。
本发明的进一步实施方式
在本发明的进一步实施方式中，将偶联的T2全身地施用于动物。尽管局部给药(例如通过胃肠道(口腔或肛门腔)或眼中(例如当免疫鸡时)的粘膜组织)，已知是在各种动物中诱导免疫应答的有效途径，但发现全身给药会引发足够的免疫应答，以保护动物免受T2诱发的真菌毒素中毒症。特别发现，通过肌内、口服和/或皮内给药可以获得有效的免疫。
尽管优选在动物能够摄取被大量T2污染的饲料之前进行给药，但给药年龄不是关键的。因此，给药时的优选年龄为6周或更年幼。进一步优选4周龄或更年幼，例如1-3周龄。
在本发明的另一个实施方式中，将偶联的T2施用于动物至少两次。尽管许多动物(特别是猪、小鸡、反刍动物)通常仅通过一次注射免疫原性组合物就易于免疫，但被认为，为了经济可行的抗T2的保护，优选两次注射。这是因为实际上动物的免疫系统不会通过自然暴露于T2而被触发产生抗T2抗体，这仅仅是因为自然发生的T2不是免疫原性的。因此，动物的免疫系统完全依赖于偶联的T2的施用。偶联的T2的两次注射之间的时间可以是1周和1-2年之间的任何时间。对于幼年动物，被认为初次免疫方案(例如在1-3周龄时)，1-4周后，通常1-3周后，如2周后，接着加强给药就足够了。年长的动物可能需要每几个月加强给药(如最后一次给药后4、5、6个月)，或在每年或每半年一次的基础上加强给药，如从其它商业应用的动物免疫方案知晓的那样。
在另一个实施方式中，偶联的T2用于除了偶联的T2之外还包含佐剂的组合物中。如果偶联物自身不能诱导免疫应答以获得预定水平的保护，则可以使用佐剂。尽管已知偶联物分子能够在没有另外的诸如KLH或BSA的佐剂情况下充分刺激免疫系统，但使用另外的佐剂可能是有利的。这可以消除对加强给药的需要或延长其给药间隔。所有这些取决于在特定情况下需要的保护水平。当使用偶联的T2作为免疫原时显示出能够并诱导针对T2的良好免疫应答的一类佐剂是水和油的乳液，例如油包水乳液或水包油乳液。前者通常用于家禽，而后者通常用于更容易发生佐剂诱导的部位反应的动物，例如猪和反刍动物。
在另一个实施方式中，偶联的T2包含与分子量高于10,000Da的蛋白质偶联的T2。已经发现这些蛋白质，特别是匙孔血蓝蛋白(KLH)和卵清蛋白(OVA)，能够在动物中，特别是在猪和鸡中诱导足够的免疫应答。蛋白质的实际上限可以是100MDa。
关于抗真菌毒素中毒症的保护作用，特别发现，被认为使用本发明动物得到了保护免受平均日增重的减少、肝损伤和肠损伤，特别是胃损伤，从而免受由T2诱发的一种或多种这些真菌毒素中毒症体征。
现在将使用以下实施例进一步解释本发明。
本发明的实施例
在第一个系列的实验中(参见实施例1-4)，评估了使用偶联的真菌毒素是否可以引起针对真菌毒素的主动免疫应答，如果是可以引起，则能够保护接种的动物在摄取该真菌毒素后免受由该真菌毒素诱发的病症。对于后者，使用了DON激发的猪模型。此后(实施例5)，评估了在疫苗中使用偶联的T2是否可以在接种的动物中诱导抗T-2毒素的抗体。
实施例1：使用偶联的DON的免疫激发实验
目的
本研究的目的是评价偶联的脱氧雪腐镰刀菌烯醇保护动物免受由DON摄取引起的真菌毒素中毒症的功效。为了检测这一点，在用毒性DON激发之前用DON-KLH免疫猪两次。使用了不同的免疫途径来研究给药途径的影响。
研究设计
来自8只母猪的40只1周龄猪被用于本研究，被分成5组。第1-3组的24只仔猪在1和3周龄时免疫两次。第1组在两个年龄时都进行了肌内(IM)免疫。第2组在1周龄时接受了IM注射，在3周龄时接受了口服加强。第3组皮内(ID)免疫两次。从51/2周龄起，用在液体中口服施用的DON在4周期间激发第1-3组。第4组未免疫，但如第1-3组所述仅用DON激发。第5组作为对照，仅从5.5周龄开始接受对照液体，持续4周。
液体制剂中的DON浓度对应于5.4mg/kg饲料的量。这对应于每天平均2.5mg DON的量。激发四周后，对所有动物进行尸检研究，特别注意肝脏、肾脏和胃。此外，在研究的第0天、第34天、第41天、第49天、第55天、第64天(安乐死后)进行血液采样，除了第5组仅在第0天、第34天、第49天以及安乐死后直接进行血液采样。
试验品
配制三种不同的免疫原性组合物，即试验品1，其包含在用于IM免疫的注射用水包油乳液(X-solve50，MSD AH，Boxmeer)中50μg/ml的DON-KLH；试验品2，其包含在用于口服免疫的油包水乳液(GNE，MSD AH，Boxmeer)中50μg/ml的DON-KLH以及试验品3，包含在用于ID免疫的注射用水包油乳液(X-solve50)中500μg/ml的DON-KLH。
将激发脱氧雪腐镰刀菌烯醇(获取自Fermentek，Israel)以100mg/ml的终浓度稀释在100％甲醇中并在<-15℃下储存。在使用之前，将DON被进一步稀释并提供在用于给药的治疗剂中。
入选标准
仅使用健康动物。为了排除不健康的动物，在研究开始之前检查所有动物的一般身体外观和没有临床异常或疾病。每组使用来自不同母猪的仔猪。在日常实践中，所有动物都将被免疫，即使是当通过摄入DON污染的饲料预先暴露于DON时。因为DON本身不引起免疫应答，所以认为在预先暴露于DON的动物和未接触过DON的动物之间没有原则性的区别。
结果
没有动物具有与用DON-KLH免疫相关的负面影响。因此，该组合物似乎是安全的。
在实验开始时，所有猪的抗DON滴度均为血清阴性。在激发期间，肌内免疫组(第1组)和皮内免疫组(第3组)产生了抗DON的抗体应答，这是通过用原生DON-BSA作为包被抗原的ELISA所测定的。表1描述了研究期间4个时间点上的平均IgG值及其SD值。肌内免疫和皮内免疫均诱导了显著的抗DON滴度。
表1 IgG滴度
第1组 第2组 第3组 第4组 第5组
T＝0 <4.3 <4.3 <4.3 <4.3 <4.3
T＝35 11.2 4.86 9.99 4.3 4.19
T＝49 9.56 4.64 8.81 4.71 3.97
T＝64 8.48 4.3 7.56 4.3 3.31
如表2所示，所有免疫动物，包括第2组中显示无显著抗DON IgG滴度增加的动物在内，在第一个15天期间与激发动物相比显示出显著更高的增重。对于被激发的动物，所有动物在研究过程中都增加了更多的重量。
表2重量分析
1激发的第一个15天的平均日增重
2激发的最后13天的平均日增重
还监测了小肠的状况(由空肠中的绒毛/隐窝比率确定)。在表3中描述了绒毛/隐窝比率。可以看出，第3组中的动物具有与健康对照(第5组)相当的平均绒毛隐窝/隐窝比率，而未免疫的激发组(第4组)具有低得多的(统计学显著的)绒毛隐窝比率。此外，与未免疫的激发对照组相比，第1组和第2组具有显著更好(即更高)的绒毛/隐窝比率。这表明免疫防止了由DON引发的肠损伤。
表3绒毛/隐窝比率
第1组 第2组 第3组 第4组 第51组0
平均 1.57 1.41 1.78 1.09 1.71
STD 0.24 0.22 0.12 0.10 0.23
还监测了其他器官的一般状况，更具体地是肝、肾和胃。观察到所有三个试验组(第1-3组)比未免疫的激发对照组(第4组)的健康状况更好。在表4中描述了一般健康数据的总结。胃溃疡的程度报告为-(没有溃疡形成的证据)至++(多发溃疡)。胃炎的程度报告为-(没有炎症的证据)至++/-(胃炎的开始)。
表4一般健康数据
肝脏颜色 胃溃疡 胃炎 肾
第1组 正常黄色 - - 苍白(Pail)
第2组 正常 +/-- - 正常
第3组 正常 +/- +/-- 正常
第4组 苍白(Pail) ++ ++/- 苍白(Pail)
第5组 正常 + ++/- 正常
实施例2：免疫对DON水平的影响
目的
本研究的目的是评价用DON偶联物免疫对DON摄取的毒代动力学的影响。为了检测这一点，在饲喂毒性DON之前用DON-KLH免疫猪两次。
研究设计
本研究使用了10只3周龄的猪，其被分成2组，每组5只。第1组的猪在3周和6周龄时用DON-KLH(试验品1；实施例1)进行了两次IM免疫。第2组作为对照，仅接受对照液。在11周龄时，通过大丸剂以0.05mg/kg的剂量向每只动物施用DON(Fermentek，Israel)，其(基于每日饲料摄取)类似于1mg/kg饲料的污染水平。在DON施用前与DON施用后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8和12小时取猪的血样。
入选标准
仅使用健康动物。
血浆DON分析
在与TQ-SMS仪器(Waters，Zellik，Belgium)连接的/>UPLC系统上使用经过验证的LC-MS/MS方法进行未结合DON的血浆分析。使用该方法的猪血浆中DON的定量下限为0.1ng/ml。
毒代动力学分析
通过非房室分析(Phoenix,Pharsight Corporation,USA)对DON的血浆浓度-时间曲线进行毒代动力学建模。计算以下参数：从时间零点至无穷大的曲线下面积(AUC0→∞)、最大血浆浓度(Cmax)和最大血浆浓度下的时间(tmax)。
结果
毒代动力学结果如下表5所示。可以看出，用DON-KLH免疫降低了所有毒代动力学参数。由于未结合的DON负责发挥毒性作用，因此可以得出结论，用DON-KLH免疫将通过减少动物血液中未结合的DON的量来减少由DON引起的毒性作用。
表5未结合DON的毒代动力学参数
毒代动力学参数 DON-KLH 对照
AUC0→∞ 77.3±23.6 187±33
Cmax 12.5±2.7 30.8±2.5
tmax 1.69±1.03 2.19±1.07
实施例3：针对各种DON偶联物的血清学应答
目的
本研究的目的是评价不同的偶联的脱氧雪腐镰刀菌烯醇产物的功效。
研究设计
本研究使用了18只3周龄的猪，其被分成3组，每组6只。第1组的猪在3周和5周龄时用DON-KLH肌内免疫两次(使用实施例1的试验品1)。第2组相应地用DON-OVA免疫。第3组作为阴性对照。在3周龄、5周龄和8周龄时检查所有动物的抗DON IgG应答。
结果
血清学结果在下表中以log2抗体滴度表示。
表6抗DON IgG应答
试验品 3周 5周 8周
DON-KLH 3.5 6.6 8.3
DON-OVA 3.3 3.9 11.8
对照 4.8 3.3 3.3
似乎两种偶联物都适于引起抗DON IgG应答。而且，似乎仅通过一次注射就能诱导应答。
实施例4：鸡的血清学应答
目的
本研究的目的是评价DON-KLH在鸡中的血清学应答。
研究设计
本研究使用了30只4周龄的鸡，其被分成三组，每组10只鸡。用DON-KLH肌内免疫鸡。第1组用作对照，仅接受PBS。第2组接受没有任何佐剂的DON-KLH，第3组接受GNE佐剂配制的DON-KLH(购自MSD Animal Health,Boxmeer)。在第0天用0.5ml疫苗注入右腿进行初次免疫。在第14天，小鸡在左腿接受了类似的加强免疫。
在第0天和第14天以及第35天、第56天、第70天和第84天进行血液取样。分离血清用于测定抗DON的IgY。在第0天和第14天，血样在免疫前被分离。
结果
血清学结果以log2抗体滴度表示在表7中。PBS背景已从数据中减去。
表7抗DON IgY应答
可以看出，偶联的DON还在鸡中诱导抗DON滴度。GNE佐剂显著增加应答，但似乎对于获得这样的净应答不是必需的。
实施例5：针对T2偶联物的血清学应答
目的
本实验的目的是评价在疫苗中使用偶联的T2是否可以在接种的动物中诱导抗T-2毒素的抗体。
研究设计
为此，使用了包含与匙孔血蓝蛋白偶联的T-2毒素(T2-KLH)的疫苗。将偶联物与水包油乳液佐剂(XSolve 50,MSD Animal Health,The Netherlands)混合，其终浓度为115μg/ml(用于肌内(IM)施用)或1150μg/ml(用于皮内(ID)施用)。
在实验中，也将如上所述的DON疫苗用作阳性对照。除此之外，配制和使用了具有其它偶联的真菌毒素的疫苗。特别是，将与匙孔血蓝蛋白偶联的玉米赤霉烯酮(ZEA)(ZEA-KLH)和与KLH偶联的伏马毒素(FUM)(T2-KLH)配制成疫苗。将偶联物与如上所述的水包油乳液佐剂(XSolve)混合，其终浓度分别为50μg/ml(用于肌内(IM)施用)或500μg/ml(用于皮内(ID)施用)。
在实验中，6组5只动物在三周龄时用于接种，第1组皮内接种0.2ml的FUM-KLH两次，第2组接受0.2ml的ZEA-KLH两次，第3组用2.0ml的DON-KLHIM的X-solve 50溶液接种两次，第4组IM接种2.0ml的FUM-KLH两次，第5组IM接种2.0ml的ZEA-KLH两次，最后第6组IM接种2.0ml的T2-KLH两次。对照组有三只仔猪，对照组未接受疫苗接种。所有的初次免疫均在3周龄时，加强接种均在5周龄时。研究开始后监测动物14周。
结果
在实验开始时，所有猪抗FUM、ZEA、T2和DON的滴度均为血清学阴性，并且所有接种组产生了抗体滴度。所得log2滴度示于下表8中。可以看出，针对每种偶联的真菌毒素，可以产生高水平的抗体。这支持了该疫苗可以被有效地用于对抗相应的真菌毒素中毒症，如关于DON诱发的真菌毒素中毒症的上文所示。
表8 IgG滴度
组别 T＝0 T＝28 T＝42 T＝56 T＝70 T＝84 T＝91
1 <3.3 12.2 11.1 9.9 8.5 7.1 6.7
2 <4.3 10.1 8.8 8.6 6.7 6.0 5.4
3 <4.3 10.5 9.5 8.5 7.6 6.5 6.6
4 <3.3 15.4 14.7 13.1 12.6 10.6 10.1
5 <4.3 12 10.9 11.5 8.8 8.1 8.0
6 <3.3 13.5 12.6 11.4 10.3 9.1 8.9
对照FUM <3.3 <3.3 <3.3 <3.3 <3.3 <3.3 <3.3
对照ZEA <4.3 <4.3 <4.3 <4.3 <4.3 <4.3 <4.3
对照T2 <3.3 <3.3 <3.3 <3.3 <3.3 <3.3 <3.3
对照DON <4.3 <4.3 <4.3 <4.3 <4.3 <4.3 <4.3
实施例6：在鸡中针对T2偶联物的应答
目的
本实验的目的是评价在疫苗中使用偶联的T2是否能在鸡中诱导抗T2的保护性抗体。
研究设计
为此，根据实施例5使用了包含与匙孔血蓝蛋白偶联的T2(T2-KLH)的疫苗。使用与实施例5中使用的相同的矿物油将偶联物与油乳液佐剂混合，并且作为替代方案，使用非矿物油的类似乳液，二者的终浓度均为50μg/ml。
研究中使用一组15只鸡。使用了三组，每组5只动物。第1组用作阴性对照并施用PBS溶液，第2组用混合在含矿物油的佐剂中的T2-KLH接种，第3组用不含矿物油的佐剂接种。在T＝8和T＝22时，用0.5ml疫苗肌内接种鸡(为了适应环境，在T＝0时禽被纳入研究中)。
结果
在实验开始时，所有鸡的抗T2的滴度均为血清学阴性(T＝0，数据未显示)，并且所有接种组产生抗体滴度。所得log2滴度示于下表9中。可以看出，尽管使用非矿物油诱导抗体似乎更好，但在两组中，针对偶联的T2，都可以产生高水平的抗体。这支持了通常的理解，即佐剂的类型对于引起足够的免疫应答本身不是必需的，但是增加免疫应答的实际水平可能是佐剂依赖性的。
表9鸡中抗T2抗体滴度
组别 T＝8 T＝22 T＝36 T＝50 T＝71
1 PBS <3.1 <3.1 4.0 5.0 5.2
2 T2-KLH矿物油 4.5 5.0 10.3 10.9 10.1
3 T2-KLH非矿物油 5.5 11.5 16.9 16.3 14.8
在体外效力测定中另外测试来自该研究的血清样品，将细胞(白种人结肠腺癌细胞)和毒素单独，和与ELISA中来自阳性动物池的血清组合的毒素，以及和与来自注射PBS(阴性动物)的血清组合的毒素进行孵育。通过加入CCK8并读取450nm处的光密度来测量细胞的生存力，表10描述了结果。
可以观察到，当比较第1组和第2组中的阳性血清时，OD450值(细胞的生存力)与相同稀释度(2x或4x)的阴性血清相比增加了。与不加入血清和T2的组合相比，OD也增加了。这表明阳性(接种的动物)的血清能够至少部分中和毒素的作用。由于阴性血清不能，这表明了疫苗诱导的免疫应答的保护作用。
表10鸡IgY对细胞的中和数据
实施例7：猪中针对T2激发的保护
目的
本实验的目的是评估疫苗中使用偶联的T2是否能在猪中诱导抗T2激发的保护。
研究设计
为此，使用了在两种不同佐剂(如实施例6所述，一种基于矿物油，另一种基于非矿物油)中包含与匙孔血蓝蛋白偶联的T2(T2-KLH)的相同疫苗。在本研究中，使用了一组24只猪。第一组8只仔猪用T2-KLH接种，尽管第一亚组4只动物接受基于含矿物油佐剂的疫苗，第二亚组接受备选疫苗。两种疫苗以2ml的量以50μg/ml的浓度肌内施用。在7-12日龄(T＝0)时对动物进行初次免疫接种，在21-26日龄(T＝14)时对动物进行加强免疫接种。第2组未接种疫苗，但用T2激发并作为阳性对照。第3组未接种且未激发，用作阴性对照。16只激发的仔猪(第1组和第2组)在约5.5周龄时每天接受在液体制剂中的1.15mg/kg T2饲料，持续4周(0.56mg/天)：在第一周，猪在16ml液体中接受0.19mgT2/天；在第二周，在32ml液体中接受0.39mg/天；在第三周，在45ml液体中接受0.72mg/天；在第四周，在60ml液体中接受0.93mgT2/天。随时间监测抗体滴度。在研究结束时，评估仔猪的肠、皮肤和口鼻部。
结果
在实验开始时，所有仔猪的抗T2滴度均呈血清学阴性。在激发期间，用T2-KLH接种的仔猪产生抗T2的抗体应答，如表11所示，其显示了研究期间6个时间点上的IgG值。
表11猪中抗T2的IgG滴度
组别 T＝0 T＝28 T＝33 T＝40 T＝47 T＝55
1a T2-KLH矿物油 <3.3 14.2 14.0 13.1 12.4 11.5
1b T2-KLH非矿物 <3.3 14.7 14.4 13.2 12.8 12.0
2阳性对照 <3.3 <3.3 <3.3 <3.3 <3.3 <3.3
3阴性对照 <3.3 <3.3 <3.3 <3.3 <3.3 <3.3
对于所有动物，确定与激发时的起始重量相比每只仔猪的生长百分比。接种对生长没有负面影响。相反，当将接种的动物与激发的动物比较时，生长稍微增加。此外，当观察仔猪的肠、皮肤和口鼻部时，接种的动物显示出更好的健康状况。
表12描述了在激发期间，较之激发的起始重量，每组动物的增重百分比(％)，此外还描述了对特定器官有损伤的动物的增重％。这均显示偶联的T2可以成功地用于保护动物免受T2诱发的真菌毒素中毒症的方法中。
表12仔猪的重量和器官评分
组别 增重 空肠损伤 皮肤损伤 口鼻部损伤
1a 304％ 25 50 25
1b 300％ 75 0 25
2 299％ 87.5 50 50
3 306％ 12.5 0 0
如表13所示，接种的动物中与激发的动物相比更高(更健康)的绒毛/隐窝比率证实了改善的肠健康。
表13绒毛/隐窝比率
组别 绒毛/隐窝比率
健康对照 1.67
T2激发 1.48
T2接种加激发 1.79

Claims (15)

1.偶联的T-2毒素(T2)，其用于保护动物免受T2诱发的真菌毒素中毒症的方法中。
2.根据权利要求1所述用于方法中的偶联的T-2毒素(T2)，其用以保护动物免受所述T2诱发的真菌毒素中毒症的一种或多种临床体征，其中所述临床体征选自增重减少、肠损伤、皮肤损伤和口鼻部损伤。
3.根据权利要求1或权利要求2所述用于方法中的偶联的T2，其特征在于，在所述方法中，所述偶联的T2被全身施用于所述动物。
4.根据权利要求3所述用于方法中的偶联的T2，其特征在于，在所述方法中，所述偶联的T2经肌内、口服和/或皮内施用。
5.根据权利要求1-4中任一项所述用于方法中的偶联的T2，其特征在于，在所述方法中，将所述偶联的T2施用于6周龄或更年幼的所述动物。
6.根据权利要求5所述用于方法中的偶联的T2，其特征在于，在所述方法中，将所述偶联的T2施用于4周龄或更年幼的所述动物。
7.根据权利要求6所述用于方法中的偶联的T2，其特征在于，在所述方法中，将所述偶联的T2施用于1-3周龄的所述动物。
8.根据前述权利要求中任一项所述用于方法中的偶联的T2，其特征在于，在所述方法中，将所述偶联的T2施用于所述动物至少两次。
9.根据前述权利要求中任一项所述用于方法中的偶联的T2，其特征在于，在所述方法中，所述偶联的T2用于除了所述偶联的T2之外还包含佐剂的组合物中。
10.根据权利要求9所述用于方法中的偶联的T2，其特征在于，在所述方法中，所述佐剂是水和油的乳液。
11.根据权利要求10所述用于方法中的偶联的T2，其特征在于，在所述方法中，所述佐剂是油包水乳液或水包油乳液。
12.根据前述权利要求中任一项所述用于方法中的偶联的T2，其特征在于，在所述方法中，所述偶联的T2包含与分子量高于10,000Da的蛋白质偶联的T2。
13.根据权利要求12所述用于方法中的偶联的T2，其特征在于，在所述方法中，所述偶联的T2包含与匙孔血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA)偶联的T2。
14.根据前述权利要求中任一项所述用于方法中的偶联的T2，其特征在于，所述动物是猪或鸡。
15.一种疫苗，其包含偶联的T2、佐剂和药学上可接受的载体。
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