CN116710073A - 一种自缓释免疫佐剂混悬液及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自缓释免疫佐剂混悬液，由脂溶性免疫佐剂和表面活性剂组成微米颗粒，余量为分散剂，所述表面活性剂包覆所述脂溶性免疫佐剂形成微米级颗粒，并分散在所述分散剂中形成混悬液，该自缓释免疫佐剂混悬液可在肿瘤内的长时间滞留和保持缓释性能，还可以通过免疫反应抑制远端转移肿瘤的生长和降低肿瘤复发的概率。本发明还提供一种自缓释免疫佐剂混悬液的制备方法，以及自缓释免疫佐剂混悬液在放疗、化疗或热疗等肿瘤治疗所用的增敏制剂中的应用。
Description
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种自缓释免疫佐剂混悬液及其制备方法和应用。
化疗、放疗、微波热消融疗法是有效的恶性肿瘤治疗的方法，在临床肿瘤治疗中已经发挥了巨大的作用，已经广泛用于肝癌、肺癌、肾癌等常见肿瘤。放射治疗(简称放疗)是基于射线的外照射放疗在临床被广泛使用，但这是一种局部治疗方案，只能对局部的肿瘤进行照射，远端转移肿瘤不能得到有效照射(如远端隐匿的肿瘤)。临床中广泛使用的外照射放疗是利用射线(如X射线)对肿瘤部位进行局部定点照射，从而实现杀伤肿瘤细胞的目标，对于未发生远端转移的肿瘤甚至有机会实现治愈。然而，当肿瘤发生远端转移时，利用局部治疗很难覆盖人体内所有的肿瘤细胞，特别是转移肿瘤细胞，这些“漏网之鱼”有可能在远端生长出新的肿瘤转移灶。
在放射治疗临床应用中发现，对于少部分患者有可能产生“远端效应”，即对肿瘤的局部治疗有时也会抑制远端未被照射的肿瘤的生长。这种放疗诱导的“远端效应”近年来引起了研究者们的极大兴趣。研究表明，“远端效应”的机制在于诱导肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡，暴露肿瘤相关抗原，从而激活针对肿瘤的免疫反应，并进一步通过肿瘤特异性CD8+T细胞对远端肿瘤的浸润来实现对远端肿瘤的免疫抑制。尽管诱导的“远端效应”具有重要的临床价值，但是这一效应的个体化差异非常大，对于临床中的大部分患者放疗诱导的“远端效应”并不十分显著。其中的重要原因，是诱导肿瘤细胞免疫原性细胞死亡后产生的肿瘤细胞“尸体”中的肿瘤相关抗原本身的免疫原性并不是很强，不能作为有效的“肿瘤疫苗”，多数时候难以激活足够有效的抗肿瘤免疫反应。
现代医学技术中，有效的免疫反应需要充分的肿瘤抗原暴露以及免疫佐剂的抗原呈递，其中免疫佐剂的作用是通过刺激免疫细胞，数量级地放大肿瘤抗原产生的免疫反应。因此，如能在肿瘤的治疗时在瘤内局部注射免疫佐剂，再对肿瘤进行治疗，将有望通过佐剂的免疫刺激效应从而显著性放大放疗后产生的肿瘤相关抗原的免疫原性，如招募抗原呈递细胞到肿瘤残留物部位来识别、吞噬和呈递肿瘤抗原，从而在体产生内源性的“肿瘤疫苗”，获得强有力的抗肿瘤免疫反应，实现对远端肿瘤的更有效抑制。
由于临床放疗大都是多次分剂量照射，因此需要注射的免疫刺激剂能够在肿瘤内实现长 时间滞留和缓释，这对于增敏放疗至关重要。目前大部分水溶性免疫佐剂本身存在的问题是很容易通过血液循环而被清除，不能够长期滞留在作用部位以实现长效刺激；而脂溶性免疫佐剂的分散性差，很难直接使用。怎样恰当的设计免疫刺激剂，并设计可操作的生产制造方法，以及药物产品的灭菌和储存长期稳定性，都是难题，例如在球磨法工艺制备微纳颗粒时，会产生陶瓷颗粒残留在产物中，这种杂质在普通的微纳材料制备加工中问题不大，但是用于人体注射则存在较大风险，这些成药阶段的问题无法被解决导致很多实验药物无法真正的走向临床的应用。
目前已被临床批准使用的咪喹莫特是一种典型的脂溶性免疫佐剂，这种咪唑奎琳胺小分子免疫调节剂不是一种细胞毒性药物，无显著的直接杀灭病毒或肿瘤细胞功效。咪喹莫特是Toll样受体7(TLR7)的配体，能够刺激巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞，诱导干扰素α(IFN-α)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的产生，同时刺激白介素-2(IL-2)、IL-6、IL-8等细胞因子的产生，从而进一步刺激细胞免疫的激活，识别病毒或其他肿瘤抗原，激发相关免疫应答，清除致病因子。
咪喹莫特现阶段的成熟剂型为乳膏制剂，常通过涂抹的方式作用于表皮病变部位，临床治疗尖锐湿疣等局部病毒感染导致的疾病，也有在临床试验中在被用于皮肤浅表肿瘤治疗的尝试。目前，咪喹莫特已被批准应用于治疗头颈部光化性角化病和浅表性基底细胞癌。另外，多项临床试验证实，咪喹莫特在鳞状细胞癌、转移性黑色素瘤、外阴上皮内瘤变等浅表肿瘤治疗中，发挥免疫佐剂效果，具有一定的应用潜力。
然而，咪喹莫特本身为脂溶性小分子，难溶于水，同时，咪喹莫特具有较强的皮肤刺激性，通过给小鼠裸露皮肤涂抹5％的咪喹莫特乳膏，可以建立小鼠银屑样皮损模型，足以说明咪喹莫特对正常组织的刺激性。外部施用的方式有利有弊，虽然其对个别浅表病变的免疫治疗具有较好的免疫增强效果，但是也限制了咪喹莫特在其他肿瘤中的免疫治疗应用。
目前制备含有咪喹莫特的注射液主要有两种办法，一种是直接将咪喹莫特用酸溶解，例如将咪喹莫特溶于盐酸形成盐酸盐的形式，分散在水相中。但是，这种方法得到的溶液其pH值偏低，一般在3.0-4.0左右，该pH值下的溶液用于生物体，具有一定的刺激性。此外，咪喹莫特盐酸盐作为小分子在注射进入肿瘤内后，会快速从瘤内渗出并进入血液，使得其注射后在血液中有较高的急性暴露量(带来安全性风险)，同时咪喹莫特盐酸盐在肿瘤内的半衰期很短，会被快速清除，因而其瘤内给药后的免疫激活作用无法维持足够长的时间。
另一种制备咪喹莫特注射液的方式，是使用两亲高分子或其他可装载疏水药物的纳米结构装载R837。但这些纳米颗粒的制备过程往往比较复杂，不利于工艺放大和标准化批量生产。 此外，这些纳米颗粒制剂在终端高温高压灭菌的条件下往往难以稳定存在(根据《化学药品注射剂灭菌和灭菌工艺研究及验证指导原则》，终端高温高压灭菌为注射剂首选灭菌策略)。
类似的脂溶性免疫佐剂的进一步应用面临着类似的问题，因此，开发可注射的脂溶性免疫佐剂的注射制剂，作为免疫佐剂应用于非浅表肿瘤的免疫治疗具有重要意义。该制剂应实现佐剂在肿瘤内长时间的滞留和缓释，降低其在血液和正常组织中的暴露以保障其临床使用的安全性；此外，为了满足产业转化的需求，该制剂的制备方法需要可以实现规模化放大，并且该制剂的稳定性需要满足终端高温高压灭菌的要求。
发明内容
本申请提供了一种自缓释免疫佐剂混悬液，其由脂溶性免疫佐剂和表面活性剂组成，余量为分散介质，所述表面活性剂包覆所述脂溶性免疫佐剂形成微米级颗粒，并分散在所述分散介质中形成混悬液。
在某些实施方式中，所述脂溶性免疫佐剂包括咪喹莫特(R837)、雷西莫特(R848)或吡喃葡糖苷脂质A(MPLA)中的至少一种。
在某些实施方式中，所述脂溶性免疫佐剂颗粒为粒径为0.5-5微米的核壳复合颗粒。
在某些实施方式中，所述脂溶性免疫佐剂核壳复合微米颗粒的粒径为1-2微米。
在某些实施方式中，所述脂溶性免疫佐剂为咪喹莫特微米颗粒。
在某些实施方式中，所述咪喹莫特微米颗粒的平均粒径为0.5～5微米。
在某些实施方式中，所述表面活性剂为含有高级脂肪酸链的表面活性剂。
在某些实施方式中，所述含有高级脂肪酸链的表面活性剂包括阴离子型表面活性剂。
在某些实施方式中，所述阴离子型表面活性剂包括油酸钠、十二烷基硫酸钠、硬脂酸钠、N-月桂酰肌胺酸钠、椰油酰基甲基牛磺酸钠、N-月桂酰基谷胺酸钠、月桂醇聚氧乙烯醚羧酸钠、十二烷基磷酸酯的至少一种。
在某些实施方式中，所述含有高级脂肪酸链的表面活性剂包括两亲性离子型表面活性剂。
在某些实施方式中，所述含有高级脂肪酸链的表面活性剂包括磷脂类离子型表面活性剂。
在某些实施方式中，所述磷脂类离子型表面活性剂包括卵磷脂、大豆磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇中的至少一种。
在某些实施方式中，所述表面活性剂的疏水结构部分含不少于20个的氧丙烯基单元。
在某些实施方式中，所述表面活性剂包括泊洛沙姆188，泊洛沙姆237，泊洛沙姆338，泊洛沙姆407中的至少一种。
在某些实施方式中，所述表面活性剂的疏水结构部分含总数不少于15个碳原子的一条或 多条碳氢链。
在某些实施方式中，所述表面活性剂包括倍半油酸山梨坦，大豆磷脂，单硬脂酸甘油酯，聚山梨酯40，聚山梨酯60，聚山梨酯65，聚山梨酯80，聚山梨酯85，硬脂山梨坦(司盘60)，硬脂酸盐，维生素E聚琥珀酸乙二醇酯，聚氧乙烯烷基醚，硬脂酸聚氧乙烯酯，硬脂酸聚烃氧(40)酯，蔗糖硬脂酸酯，聚氧乙烯蓖麻油衍生物，聚西托醇1000，卵磷脂中的至少一种。
在某些实施方式中，所述表面活性剂为两种亲水亲油平衡值不同的表面活性剂的混合物。
在某些实施方式中，自缓释免疫佐剂混悬液包括咪喹莫特混悬液制剂，所述咪喹莫特混悬液制剂包括：咪喹莫特微米颗粒、含有高级脂肪酸链的表面活性剂和分散介质。
在某些实施方式中，在所述咪喹莫特混悬液中，所述咪喹莫特微米颗粒的浓度为1～18mg/mL，所述含有高级脂肪酸链的表面活性剂与咪喹莫特微米颗粒的质量比为0.025～3：1。
在某些实施方式中，在所述咪喹莫特混悬液中，所述含有高级脂肪酸链的表面活性剂与咪喹莫特微米颗粒的质量比为0.1～1：1。
另一方面，本申请提供了一种自缓释免疫佐剂混悬液的制备方法，其包括如下步骤：S1：将表面活性剂和脂溶性免疫佐剂分散在同一分散体系中，搅拌得到混悬液；S2：对上述制得的混悬液进行均质处理/进行高剪切工艺处理；S3：对均质后/高剪切工艺处理后的混悬液进行灭菌处理。
在某些实施方式中，所述制备方法包括：S1：将脂溶性免疫佐剂通过气流粉碎工艺形成初级微米级粉体；S2：向S1步骤获得的脂溶性免疫佐剂初级微米级粉体中按照脂溶性免疫佐剂：表面活性剂质量比(1：0.025～5)加入表面活性剂的水溶液，进行高压均质工艺处理，处理结束后取出匀浆；或S2’：向S1步骤获得的脂溶性免疫佐剂微米粉体中按脂溶性免疫佐剂：表面活性剂质量比(1：0.025～5)加入表面活性剂的水溶液，进行高剪切工艺处理，处理结束后取出匀浆；S3：高压灭菌处理。
在某些实施方式中，所述制备方法的步骤S2中所述的表面活性剂包括两种溶解度不同表面活性剂。
在某些实施方式中，所述制备方法的所述高压灭菌处理的条件为105℃～150℃下处理10-20分钟。
另一方面，本申请还提供了一种咪喹莫特混悬液制剂的制备方法，其包括如下步骤：S1：将含有高级脂肪酸链的表面活性剂和咪喹莫特微米颗粒分散在同一分散体系中，搅拌得到混悬液；S2：将上述制得的混悬液进行均质处理；S3：对均质后的混悬液进行灌装，封闭后进行高温高压灭菌。在某些实施方式中，所述高温高压灭菌的条件为：110～145℃，5～30min。
另一方面，本申请还提供了本申请所述制备方法获得的自缓释免疫佐剂混悬液在制备肿瘤辅助治疗药物中的应用。
另一方面，本申请还提供了一种自缓释免疫佐剂组合物，其包括第一组合物和第二组合物；所述第一组合物由脂溶性免疫佐剂和表面活性剂组成，余量为分散剂，所述表面活性剂包覆所述脂溶性免疫佐剂形成微米级颗粒，并分散在所述分散剂中形成混悬液；所述第二组合物包括易溶性海藻酸盐和保护填充剂，形成的冻干粉。
在某些实施方式中，在所述自缓释免疫佐剂组合物中，所述脂溶性免疫佐剂包括咪喹莫特(R837)、雷西莫特(R848)或吡喃葡糖苷脂质A(MPLA)中的至少一种。
在某些实施方式中，在所述自缓释免疫佐剂组合物中，所述表面活性剂的疏水结构部分含不少于20个的氧丙烯基单元。
在某些实施方式中，在所述自缓释免疫佐剂组合物中，所述表面活性剂包括泊洛沙姆188，泊洛沙姆237，泊洛沙姆338和泊洛沙姆407中的至少一种。
在某些实施方式中，在所述自缓释免疫佐剂组合物中，所述表面活性剂的疏水结构部分含总数不少于15个碳原子的一条或多条碳氢链。
在某些实施方式中，在所述自缓释免疫佐剂组合物中，所述表面活性剂包括倍半油酸山梨坦，大豆磷脂，单硬脂酸甘油酯，聚山梨酯40，聚山梨酯60，聚山梨酯65，聚山梨酯80，聚山梨酯85，硬脂山梨坦(司盘60)，硬脂酸盐，维生素E聚琥珀酸乙二醇酯，聚氧乙烯烷基醚，硬脂酸聚氧乙烯酯，硬脂酸聚烃氧(40)酯，蔗糖硬脂酸酯，聚氧乙烯蓖麻油衍生物，聚西托醇1000和卵磷脂中的至少一种。
在某些实施方式中，在所述自缓释免疫佐剂组合物中，所述表面活性剂为两种亲水亲油平衡值不同的表面活性剂的混合物。
在某些实施方式中，在所述自缓释免疫佐剂组合物中，所述分散剂为水或生理盐水。
在某些实施方式中，在所述自缓释免疫佐剂组合物中，所述保护填充剂为甘露醇或乳糖。
在某些实施方式中，所述第二组合物还包括pH调节剂。
另一方面，本申请还提供了所述自缓释免疫佐剂混悬液或所述的自缓释免疫佐剂组合物在制备抗肿瘤联合免疫治疗制剂中的应用。
在某些实施方式中，所述自缓释免疫佐剂包含咪喹莫特混悬液制剂。
在某些实施方式中，所述咪喹莫特混悬液制剂与铂类化药预混，协助铂类化药的缓释。
在某些实施方式中，所述咪喹莫特混悬液制剂与蒽环类化药预混，协助蒽环类化药的缓释。
另一方面，本申请还提供了所述自缓释免疫佐剂混悬液或所述自缓释免疫佐剂组合物在制备放疗增敏剂中的应用。
另一方面，本申请还提供了所述自缓释免疫佐剂混悬液或所述自缓释免疫佐剂组合物在制备化疗增敏剂中的应用。
另一方面，本申请还提供了所述自缓释免疫佐剂混悬液或所述自缓释免疫佐剂组合物在制备热疗增敏剂中的应用。
另一方面，本申请还提供了所述自缓释免疫佐剂混悬液或所述自缓释免疫佐剂组合物在制备酒精消融增敏剂中的应用。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1是自缓释免疫佐剂混悬液制备示意图；
图2是加入不同含有高级脂肪酸链的表面活性剂的微米级咪喹莫特混悬液灭菌后经震摇后的照片；
图3是不同形态的自缓释免疫佐剂混悬液注射到肿瘤内后，其肿瘤滞留量随时间的变化对比图；
图4是不同形态的自缓释免疫佐剂混悬液注射到肿瘤内后，其血液中的药物浓度随时间的变化对比图；
图5是不同形态的咪喹莫特注射到肿瘤内后进行放疗，原位肿瘤的生长曲线对比图；
图6是不同形态的咪喹莫特注射到肿瘤内后进行放疗，远端肿瘤的生长曲线对比图；
图7是不同形态的咪喹莫特注射到肿瘤内后进行放疗的小鼠体重变化对比图；
图8是咪喹莫特微米颗粒注射到肿瘤内后进行微波消融治疗，小鼠原位肿瘤的生长曲线图；
图9是咪喹莫特微米颗粒注射到肿瘤内后进行微波消融治疗，小鼠远端肿瘤的生长曲线 图；
图10是咪喹莫特微米颗粒增效肿瘤化疗的小鼠原位肿瘤生长曲线图；
图11是咪喹莫特微米颗粒增效肿瘤化疗的小鼠远端肿瘤生长曲线图；
图12是微米级咪喹莫特混悬液联合放疗实验中不同组别的小鼠的原位肿瘤生长曲线；
图13是微米级咪喹莫特混悬液联合放疗实验中不同组别的小鼠的远端肿瘤生长曲线；
图14是微米级咪喹莫特混悬液联合酒精消融疗法实验中不同组别的小鼠的肿瘤生长曲线。
图15是奥沙利铂与微米级咪喹莫特混悬液混合前后，瘤内注射后72小时，主要组织器官中铂的相对含量统计图；
图16是奥沙利铂与微米级咪喹莫特混悬液混合前后，瘤内注射后，血液中的药物浓度随时间变化的曲线；
图17是小鼠双边肿瘤模型，原位瘤的肿瘤生长曲线图，组别分别为溶媒对照组、奥沙利铂单药治疗组、咪喹莫特混悬液制剂治疗组、奥沙利铂与咪喹莫特混悬液制剂联合治疗组；
图18是小鼠双边肿瘤模型，远端瘤的肿瘤生长曲线图，组别分别为溶媒对照组、奥沙利铂单药治疗组、咪喹莫特混悬液制剂治疗组、奥沙利铂与咪喹莫特混悬液制剂联合治疗组。
图19是与微米级咪喹莫特混悬液制剂混合后的多柔比星体外释放曲线图；
图20是与不同浓度的微米级咪喹莫特混悬液制剂混合后的多柔比星体外释放曲线图；
图21是与微米级咪喹莫特混悬液制剂混合后的表柔比星体外释放曲线图；
图22是与磷脂酰甘油助悬得到的微米级咪喹莫特混悬液混合的表柔比星体外释放曲线图。
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
发明详述
本发明提供一种自缓释免疫佐剂混悬液，提供一种能够在原位分散效果好的，且能够实现自缓释以辅助化疗、放疗或热疗产生免疫记忆，激活人体免疫特性的免疫佐剂新剂型，降低癌症转移及复发概率的抗癌药物组合物，在有效杀灭原位肿瘤的同时还可以通过免疫反应 抑制、降低远端转移肿瘤的生长和肿瘤复发的概率。
为解决相关技术问题，本发明提供了如下方案：
一种自缓释免疫佐剂混悬液，由脂溶性免疫佐剂和表面活性剂组成，余量为分散剂，所述表面活性剂包覆所述脂溶性免疫佐剂形成微米级颗粒，并分散在所述分散剂中形成混悬液。
进一步的，所述分散剂为水或生理盐水。
进一步的，所述脂溶性免疫佐剂包括咪喹莫特(R837)、雷西莫特(R848)或吡喃葡糖苷脂质A(MPLA)中的至少一种。
进一步的，所述表面活性剂的疏水结构部分含不少于20个的氧丙烯基单元；具体包括泊洛沙姆188(P188)，泊洛沙姆237，泊洛沙姆338，泊洛沙姆407。
并列可选地，所述表面活性剂的疏水结构部分含总数不少于15个碳原子的一条或多条碳氢链；具体包括倍半油酸山梨坦，大豆磷脂，单硬脂酸甘油酯，聚山梨酯40，聚山梨酯60，聚山梨酯65，聚山梨酯80，聚山梨酯85，硬脂山梨坦(司盘60)，硬脂酸盐，维生素E聚琥珀酸乙二醇酯，聚氧乙烯烷基醚，硬脂酸聚氧乙烯酯，硬脂酸聚烃氧(40)酯，蔗糖硬脂酸酯，聚氧乙烯蓖麻油衍生物，聚西托醇1000，或卵磷脂中的至少一种。
进一步的，所述自缓释免疫佐剂混悬液为粒径为0.5-5微米的复合颗粒，所述表面活性剂包覆所述脂溶性免疫佐剂。优选的，所述自缓释免疫佐剂混悬液的粒径为1-2微米。
进一步的可选的，所述表面活性剂可以为两种亲水亲油平衡值(HLB值)不同的表面活性剂的混合。两种不同亲水亲油平衡值的表面活性剂可以在复合颗粒进入瘤体后，HLB值较大的表面活性剂首先溶解，从而包覆在脂溶性免疫佐剂微米颗粒的表面形成一些开口或者微小的缺陷区域，从而使内层咪喹莫特微米颗粒的表面积逐步变化，有效成分逐步释放，更可根据不同瘤体及人体的实际需要，通过表面活性剂的配比关系调配更加个性化的药剂方案。
本发明提供了一种自缓释免疫佐剂混悬液的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
S1：将脂溶性免疫佐剂通过气流粉碎工艺形成初级粉体；
S2：向S1步骤获得的初级粉体中加入表面活性剂的水溶液，进行高压均质工艺处理，处理结束后取出匀浆；
或S2’：向S1步骤获得的初级粉体中加入表面活性剂的水溶液，进行高剪切工艺处理，处理结束后取出匀浆；
S3：灭菌处理。
进一步的，所述步骤S1中所述的表面活性剂的水溶液中，包含两种亲水亲油平衡值不同 表面活性剂。
优选的，所述步骤S1中所述的表面活性剂的水溶液浓度为6-30mg/mL。
进一步的，所述步骤S3中所述灭菌处理为条件为105℃～150℃的湿热处理10-15分钟。
本发明还提供一种自缓释免疫佐剂组合物，包括第一组合物和第二组合物；所述第一组合物由脂溶性免疫佐剂和表面活性剂组成，余量为分散剂，所述表面活性剂包覆所述脂溶性免疫佐剂形成微米级颗粒，并分散在所述分散剂中形成混悬液；所述第二组合物包括易溶性海藻酸盐和保护填充剂，形成的冻干粉。
第二组合物可进一步优化所述第一组合物的缓释特性。
进一步的，所述分散剂为水或生理盐水。
进一步的，所述脂溶性免疫佐剂包括咪喹莫特(R837)、雷西莫特(R848)或吡喃葡糖苷脂质A(MPLA)中的至少一种。
进一步的，所述表面活性剂的疏水结构部分含不少于20个的氧丙烯单元，包括泊洛沙姆188，泊洛沙姆237，泊洛沙姆338，泊洛沙姆407；或者含总数不少于15个碳原子的一条或多条碳氢链，包括倍半油酸山梨坦，大豆磷脂，单硬脂酸甘油酯，聚山梨酯40，聚山梨酯60，聚山梨酯65，聚山梨酯80，聚山梨酯85，硬脂山梨坦(司盘60)，硬脂酸盐，维生素E聚琥珀酸乙二醇酯，聚氧乙烯烷基醚，硬脂酸聚氧乙烯酯，硬脂酸聚烃氧(40)酯，蔗糖硬脂酸酯，聚氧乙烯蓖麻油衍生物，聚西托醇1000或卵磷脂中的至少一种。
本发明还提供了所述自缓释免疫佐剂混悬液在制备放疗增敏剂中的应用。
本发明还提供了所述自缓释免疫佐剂混悬液在制备化疗增敏剂中的应用。
本发明还提供了所述自缓释免疫佐剂混悬液在制备热疗增敏剂中的应用。
采用本发明的技术方案，会具有如下的有益技术效果：
本发明的自缓释免疫佐剂混悬液是脂溶性免疫佐剂的微米级颗粒构成的混悬液，表面活性剂包覆在所述脂溶性免疫佐剂表面，与免疫佐剂的盐酸盐或者其他的水溶性免疫佐剂分子(如CpG、polyIC等)相比，本制剂局部注射后不需要其他的缓释辅助剂，即可以在瘤内滞留且缓慢释放，形成自缓释效果，免疫刺激效应稳定而持久。由于临床放疗大都是多次分剂量照射(如一周照射5次)，需要使注射的免疫刺激剂在肿瘤内具有比较长时间的滞留和缓释，可以有效增强诱导的免疫原性细胞死亡，诱导抗肿瘤免疫反应，本制剂咪喹莫特微米级颗粒在肿瘤内的长时间滞留和缓释性能，对于增敏放疗、化疗或热疗的应用，诱导抗肿瘤免疫反应而言至关重要。
本发明的自缓释免疫佐剂混悬液克服了脂溶性免疫佐剂本身的水溶性差，而脂溶性免疫佐剂盐酸盐虽然可以水溶好，但是局部注射到肿瘤内作为小分子会迅速扩散到其他器官并较快从体内代谢的技术问题。将脂溶性免疫佐剂做成微米级悬液是一类脂溶性免疫佐剂的新剂型，具有自缓释的效果，增加了脂溶性免疫佐剂微米颗粒在肿瘤内的滞留时间，减缓了免疫佐剂分子的释放速度，这个特点对于增敏外照射放疗来说至关重要。此外，由于该微米级颗粒混悬液在注射到瘤内前需要进行标准的高压灭菌操作以满足无菌的要求，需要确保微米级颗粒在约121摄氏度的条件下不发生显著的团聚，要求表面活性剂与颗粒表面具有足够强的吸附能力，主要依靠疏水相互作用，因此所选表面活性剂的疏水结构对于保护该微米级混悬液高压灭菌下的稳定性有重要作用，本发明选择的所述表面活性剂的疏水结构部分含总数不少于15个碳原子的一条或多条碳氢链或表面活性剂的疏水结构部分含不少于20个的氧丙烯基单元。
本发明的自缓释免疫佐剂混悬液，可以进一步选择两种及以上的亲水亲油平衡值(HLB值)不同的表面活性剂组合作为微米颗粒的包覆层。两种不同溶解性的表面活性剂在微观中并不是完全均质的相互分散，而是局部区域性的聚集式分散，因此形成的复合颗粒包覆层进入瘤体后，HLB值较大的表面活性剂首先溶解，从而在微米颗粒的包覆层表面形成一些微小开口或者微小的缺陷区域，从而使内层脂溶性免疫佐剂微米颗粒的表面积逐步变化，有效成分逐步释放，更可根据不同瘤体及人体的实际需要，通过调配两种或多种表面活性剂的选择或调控配比关系，获得更加个性化(符合不同病人实际情况)的药剂组合方案供医生选择。且两种及以上的亲水亲油平衡值(HLB值)不同的表面活性剂组合可进一步提高微米颗粒在高压灭菌过程中的稳定性。
本发明还提供了一种新的自缓释免疫佐剂混悬液制备方法，因为本研发团队发现在球磨法工艺放大时，球磨过程会产生陶瓷颗粒从而带来注射风险，这种杂质在普通的微纳材料制备中问题不大，但是用于人体注射则存在较大风险；申请人研发团队为了替换现有技术中用球磨法获得咪喹莫特做成微米颗粒的技术方案进行了大量的实验方案的试错和改进，并进一步提出了一种气流粉碎联合高压均质或气流粉碎联合高剪切法的新型技术路线，制备了微米尺度的脂溶性免疫佐剂微米颗粒混悬液。该制备方法克服了微米颗粒的制备工艺中的技术偏见和技术改进过程中实际的技术问题，即高压均质工艺或高剪切法工艺是一种液相的加工方法，而脂溶性免疫佐剂是一种半固态药剂，实验发现如果直接对脂溶性免疫佐剂进行高压均质或高剪切工艺，由于脂溶性免疫佐剂的粘滞性远高于溶液或常用固态纳米材料，会造成均 质阀的堵塞从而无法获得微米级颗粒；而直接采用高剪切法虽然可以部分得到微米颗粒，但是得到的微粒均匀性极差，大部分微粒无法达到预期的颗粒化粉碎效果和产率；而本发明中通过预先的气流粉碎工艺后获得初级粉体，加入表面活性剂的水溶液的条件下进行高压均质或高剪切法，可以对高压均质或高剪切的微米颗粒进行快速的表面修饰。表面活性剂的存在，使得脂溶性免疫佐剂可以离散化的分散在液相之中，从而使得脂溶性免疫佐剂的初级粉体得以利用液相微纳工艺进行加工且获得尺寸均一性好的脂溶性免疫佐剂微米级颗粒混悬液。
本发明的自缓释免疫佐剂混悬液，相比于现有各类工艺获得的微纳颗粒，可进一步适应更严苛的灭菌条件，能够经受高压灭菌处理，依然保持混悬液的稳定性和颗粒尺寸的稳定，提高自缓释免疫佐剂混悬液的生产效率和安全性。
将自缓释免疫佐剂混悬液注射进入肿瘤内，可以有效增强放疗、化疗或热疗诱导的免疫原性细胞死亡，诱导抗肿瘤免疫反应，其体现的治疗效果一方面可以提升放疗对原位肿瘤的疗效，另一方面获得更强的远端效应，抑制远端没有被照射肿瘤的生长。
为了解决相关技术问题，本发明还提供一种咪喹莫特混悬液制剂，包括咪喹莫特微米颗粒、含有高级脂肪酸链的表面活性剂和分散介质。其中，所述分散介质为水，生理盐水或葡萄糖溶液。
具体的，咪喹莫特微米颗粒的平均粒径为0.5～5.0μm。
其中，所述含有高级脂肪酸链的表面活性剂为含有高级脂肪链的离子型表面活性剂。
具体的，所述含有高级脂肪酸链的表面活性剂包括阴离子型表面活性剂和两亲性离子型表面活性剂。
具体的，所述含有高级脂肪酸链的表面活性剂包括直链烷基羧酸盐，直链烷基磺酸盐，直链烷基硫酸盐，直链烷醇硫酸酯盐等。
具体的，所述含有高级脂肪酸链的阴离子型表面活性剂为油酸钠、十二烷基硫酸钠、硬脂酸钠、N-月桂酰肌胺酸钠、椰油酰基甲基牛磺酸钠、N-月桂酰基谷胺酸钠、月桂醇聚氧乙烯醚羧酸钠、十二烷基磷酸酯。
可选的，所述含有高级脂肪酸链的表面活性剂为磷脂类离子型表面活性剂。
具体的，所述磷脂类离子型表面活性剂为卵磷脂、大豆磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇。
可选的，所述分散介质为水。
可选的，所述含有高级脂肪酸链的表面活性剂与咪喹莫特的质量比为0.025～3：1。
可选的，所述含有高级脂肪酸链的表面活性剂与咪喹莫特的质量比为0.1～1：1。
本发明提供的咪喹莫特混悬液制剂，能够在肿瘤内长时间的滞留和缓释，进一步联合化疗、放疗、酒精消融等引起肿瘤细胞免疫原性死亡的疗法，显著增强抗肿瘤免疫反应，在有效消灭原位肿瘤的同时，诱发全身性抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤转移及远端肿瘤的生长。同时，该微米级咪喹莫特混悬液制剂具有较好的稳定性，能够实现高温高压灭菌，达到临床应用的制剂安全标准。本发明所述可终端灭菌的微米级咪喹莫特混悬液具有组分简单、制备简便、成品稳定、无菌低热原的特点。
本发明提出了一种咪喹莫特混悬液制剂的制备方法。
包括如下步骤：
S1：将含有高级脂肪酸链的表面活性剂和咪喹莫特微米颗粒分散在同一分散体系中，搅拌得到混悬液；
S2：将上述制得的混悬液进行均质；
S3：对均质后的混悬液进行灌装，封闭后进行高温高压灭菌。
其中高温高压灭菌的条件为110℃～145℃，5～30min。
具体的，所述微米级咪喹莫特混悬液制剂经过高温高压灭菌处理后，其状态为无聚沉或结块，或结块/聚沉后可通过简单晃动重新分散为均匀混悬液。
本发明还提供所述咪喹莫特混悬液制剂在制备抗肿瘤联合免疫治疗制剂中的应用。
具体的，本发明所述咪喹莫特混悬液制剂在和铂类化药混合后，可实现化药的缓释。
具体的，本发明所述咪喹莫特混悬液制剂在和蒽环类化药混合后，可实现化药的缓释。
具体的，本发明所述咪喹莫特混悬液制剂用于制备增强抗肿瘤免疫治疗的制剂的用途。在具体实施时，可向有需要的患者施用有效剂量的微米级咪喹莫特混悬液制剂，其中该微米级咪喹莫特混悬液制剂的使用方式为瘤内或瘤周注射。
采用本发明的技术方案，具有如下的技术效果：
本发明所述可终端灭菌的微米级咪喹莫特混悬液提供了可注射的咪喹莫特混悬液剂型，能够将咪喹莫特应用于非浅表肿瘤的免疫治疗中。在含有高级脂肪酸链的表面活性剂的帮助下，可通过高温高压灭菌得到无菌、无热原的稳定剂型，具有很好的均一性和稳定性。相比于咪喹莫特盐酸盐小分子注射剂型，该微米级咪喹莫特混悬液在肿瘤内的具有更长的半衰期；相比于咪喹莫特纳米颗粒制剂，该微米级咪喹莫特混悬液的制备工艺放大生产的可行性更强，可在高温高压灭菌后保持剂型的长期稳定，能够满足临床使用的需求。
本发明所述咪喹莫特混悬剂能够通过瘤内或瘤周注射的方式，联合放疗、化学消融等治疗手段应用于增强的抗肿瘤免疫治疗，并且在与铂类化药或蒽环类化药预混后注射，能够引 起化药的缓释，延长药物在病灶部位作用时间，增强联合化药的抗肿瘤免疫反应，有效抑制远端肿瘤的生长，防止肿瘤转移和复发。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的自缓释免疫佐剂混悬液、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例A 制剂的制备
实施例A1：
图1是自缓释免疫佐剂混悬液制备示意图，参考图1制备自缓释咪喹莫特微米颗粒，制备方法如下：
称取一定量的脂溶性免疫佐剂咪喹莫特R837固体进行气流粉碎处理，粉碎气压6-10bar，得到微米级咪喹莫特R837粉体。
按比例1：(0.025～5)称取微米级免疫佐剂咪喹莫特R837和表面活性剂泊洛沙姆188，优选2g R837，加入适量的泊洛沙姆188(0.05g，0.3g，0.6g，1g，2g，4g，6g，8g，10g)，加100mL注射用水，100-500rpm搅拌0.5-2小时，获得悬浊液。
将上述悬浊液于750-1200bar压力下高压均质2-4次获得混悬液，加入注射用水定容至咪喹莫特浓度6.0mg/mL，以蠕动泵吸取混悬液灌装到10mL安瓿瓶中，每瓶6mL，共30瓶。熔封后得到微米悬液，105℃～150℃湿热灭菌15-20分钟。
泊洛沙姆188是一种一类新型的高分子非离子表面活性剂，有多种用途包括：作为乳化剂，稳定剂和增溶剂，可以进一步增强R837的水分散性和稳定性。
所用表面活性剂的疏水结构部分含不少于20个的氧丙烯基单元；具体包括泊洛沙姆188，泊洛沙姆237，泊洛沙姆338，泊洛沙姆407。并列可选地，所述表面活性剂的疏水结构部分含总数不少于15个碳原子的一条或多条碳氢链；具体包括倍半油酸山梨坦，大豆磷脂，单硬脂酸甘油酯，聚山梨酯40，聚山梨酯60，聚山梨酯65，聚山梨酯80，聚山梨酯85，硬脂山梨坦(司盘60)，硬脂酸盐，维生素E聚琥珀酸乙二醇酯，聚氧乙烯烷基醚，硬脂酸聚氧乙烯酯，硬脂酸聚烃氧(40)酯，蔗糖硬脂酸酯，聚氧乙烯蓖麻油衍生物，聚西托醇1000，或卵磷脂中的至少一种。
泊洛沙姆是一系列多用途的药用辅料，由于无毒，无抗原性，无致敏性，无刺激性、不溶血，化学性质稳定。泊洛沙姆188是系列辅料中具有较好安全性的一种。泊洛沙姆188 可以使得咪喹莫特气流粉碎后获得的微米级粉体得以利用液相微纳工艺进行加工获得尺寸均一性好的咪喹莫特微米级颗粒混悬液，泊洛沙姆188还可以帮助咪喹莫特微米级颗粒混悬液(6.0mg/mL及以下)在高压灭菌后保证水分散性和稳定性。
但是泊洛沙姆188包覆的咪喹莫特微米颗粒混悬液虽然在较低浓度(6.0mg/mL)高压灭菌后保持较好的混悬稳定性，如果灭菌时咪喹莫特浓度过高，则会导致灭菌后咪喹莫特团聚结块不能再稳定混悬。卵磷脂是一种天然表面活性剂，用卵磷脂作为稳定剂通过高压均质处理的咪喹莫特微米颗粒具有很好的稳定性，即使在高咪喹莫特浓度下高温灭菌，其混悬液依然不会团聚保持稳定混悬。
表1咪喹莫特/表面活性剂混悬液制备工艺与数据
气流粉碎联合高压均质或气流粉碎联合高剪切法的新的技术路线，制备了微米尺度的脂溶性免疫佐剂微米颗粒混悬液。该制备方法克服了微米颗粒的制备工艺中的技术偏见和实际的技术问题，高压均质工艺或高剪切法工艺是一种液相的加工方法，而脂溶性免疫佐剂是一种半固态药剂，实验发现如果直接对脂溶性免疫佐剂进行高压均质或高剪切工艺，会造成均质阀的堵塞从而无法获得微米颗粒；而直接采用高剪切法虽然可以部分的得到微米颗粒，但是得到的微粒均匀性极差，大部分微粒无法达到预期的颗粒化粉碎效果和产率；而本发明中 首先通过气流粉碎工艺后获得初级粉体，再在加入表面活性剂的溶液条件下进行中进行高压均质或高剪切法，可以对高压均质或高剪切的微米颗粒进行快速的表面修饰和表面改性，因为有了表面活性剂的存在，使得脂溶性免疫佐剂可以离散化的分散在液相之中，从而使得脂溶性免疫佐剂的初级粉体得以利用液相微纳工艺进行加工且获得尺寸均一性好的脂溶性免疫佐剂微米级颗粒混悬液。
表2将气流粉碎后的咪喹莫特微米颗粒粉体加入不同表面活性剂水溶液(咪喹莫特：表面活性剂质量比＝1:3)再进行高压均质处理后咪喹莫特的水分散性
表3上述添加不同表面活性剂的咪喹莫特混悬液(6.0mg/mL)高压灭菌后的再分散性(咪喹莫特：表面活性剂质量比＝1:3)
由于该微米级颗粒混悬液在注射到瘤内前需要进行标准的高压灭菌操作以满足无菌的要求，需要确保微米级颗粒在约121摄氏度的条件下不发生显著的团聚，要求表面活性剂与颗粒表面具有足够强的吸附能力，主要依靠疏水相互作用，因此所选表面活性剂的疏水结构对于保护该微米级混悬液高压灭菌下的稳定性有重要作用，本发明选择的所述表面活性剂的疏水结构部分含总数不少于15个碳原子的一条或多条碳氢链或面活性剂的疏水结构部分含不少于20个的氧丙烯基单元。如表2和表3中，泊洛沙姆P124，因疏水结构不足，在高压灭菌后出现不稳定现象。
表4加入不同比例P188分散的咪喹莫特混悬液(灭菌时R837浓度＝6.0mg/mL)在高压灭菌后的混悬稳定性
| 泊洛沙姆188:R837 | 高压灭菌后的混悬稳定性 |
| 0.5:1 | 出现大量颗粒状聚集体 |
| 1:1 | 出现少量颗粒状聚集体 |
| 2:1 | 出现少量颗粒状聚集体 |
| 3:1 | 均匀分散且未出现颗粒状聚集体 |
| 5:1 | 均匀分散且未出现颗粒状聚集体 |
虽然理论上，分散剂越多，分散性越好，但比例一般不超过5:1，原因是：泊洛沙姆188(P188)本身有粘性，浓度过高粘度很大；且避免分散剂过多引入杂质。
表5 P188分散的不同浓度咪喹莫特混悬液在高压灭菌后的混悬稳定性(P188：咪喹莫特R837质量比＝3:1)。P188包覆的咪喹莫特混悬液在低R837浓度下高压灭菌能保持较好稳定性，但在高R837浓度下高压灭菌稳定性显著下降。
| 灭菌时R837浓度 | 高压灭菌后的混悬稳定性 |
| 3.0mg/mL | 均匀分散且未出现颗粒状聚集体 |
| 6.0mg/mL | 均匀分散且未出现颗粒状聚集体 |
| 9.0mg/mL | 出现部分颗粒状聚集体 |
| 12.0mg/mL | 出现大量颗粒状聚集体 |
| 15.0mg/mL | 出现大量颗粒状聚集体 |
| 18.0mg/mL | 出现大量颗粒状聚集体 |
表6加入不同比例卵磷脂分散的咪喹莫特混悬液(灭菌时R837浓度＝6.0mg/mL或18mg/mL)在高压灭菌后的混悬稳定性。卵磷脂哪怕在较低的比例下都可以使高浓度咪喹莫特悬液高压灭菌后保持很好的混悬稳定性。
| 卵磷脂:R837 | 灭菌时R837浓度 | 高压灭菌后的混悬稳定性 |
| 0.025:1 | 6.0mg/mL | 均匀分散且未出现颗粒状聚集体 |
| 0.05:1 | 6.0mg/mL | 均匀分散且未出现颗粒状聚集体 |
| 0.1:1 | 6.0mg/mL | 均匀分散且未出现颗粒状聚集体 |
| 0.25:1 | 6.0mg/mL | 均匀分散且未出现颗粒状聚集体 |
| 0.5:1 | 6.0mg/mL | 均匀分散且未出现颗粒状聚集体 |
| 1:1 | 6.0mg/mL | 均匀分散且未出现颗粒状聚集体 |
| 0.025:1 | 18.0mg/mL | 均匀分散且未出现颗粒状聚集体 |
| 0.05:1 | 18.0mg/mL | 均匀分散且未出现颗粒状聚集体 |
| 0.1:1 | 18.0mg/mL | 均匀分散且未出现颗粒状聚集体 |
| 0.25:1 | 18.0mg/mL | 均匀分散且未出现颗粒状聚集体 |
| 0.5:1 | 18.0mg/mL | 均匀分散且未出现颗粒状聚集体 |
| 1:1 | 18.0mg/mL | 均匀分散且未出现颗粒状聚集体 |
实施例A2：
称取一定量的脂溶性免疫佐剂雷西莫特(R848)固体进行气流粉碎处理，粉碎气压6-10bar，得到微米级雷西莫特(R848)。
按比例1：(0.025～5)称取微米级免疫佐剂雷西莫特(R848)和表面活性剂泊洛沙姆407，优选0.2g R848，加入适量的泊洛沙姆407(0.005g，0.01g，0.2g，0.4g，0.8g，1g)，加200mL注射用水，100-500rpm搅拌0.5-2小时，获得悬浊液。
将上述悬浊液于750-1200bar压力下高压均质2-4次获得混悬液，以蠕动泵吸取混悬液灌装到10mL安瓿瓶中，每瓶6mL，共30瓶。熔封后得到微米悬液，105℃～150℃湿热灭菌15-20分钟。
泊洛沙姆407是一种一类新型的高分子非离子表面活性剂，有多种用途包括：作乳化剂，稳定剂和增溶剂，可以进一步增强R848的水分散性和稳定性。
实施例A3：
称取一定量的脂溶性免疫佐剂吡喃葡糖苷脂质A(MPLA)；选用的表面活性剂为泊洛沙姆188与卵磷脂的质量比9:1的混合表面活性剂，其他制备方法与实施例A2相同。
实施例A4：
其他制备方法与实施例A1相同，称取一定量的脂溶性免疫佐剂咪喹莫特(R837)；选用的表面活性剂为泊洛沙姆188与卵磷脂的质量比3:1的混合表面活性剂。不同表面活性剂的投料浓度对R837高压灭菌后的混悬稳定性有一定影响，结果如表7所示。在有卵磷脂存在的条件下，R837高压灭菌后的长期稳定性单独P188增溶R837的效果，获得颗粒的粒径更小且均一性更好。并且投料浓度的影响可等比例扩大，从而达到增加R837最终浓度的技术效果。
表7加入不同浓度表面活性剂的R837高压灭菌后的混悬稳定性
| R837:泊洛沙姆188:卵磷脂 | 高压灭菌后的长期稳定性 |
| 12mg/mL:36mg/mL:0mg/mL | 出现大量颗粒状聚集体 |
| 12mg/mL:36mg/mL:12mg/mL | 均匀分散且未出现颗粒状聚集体 |
| 18mg/mL:54mg/mL:0mg/mL | 出现大量颗粒状聚集体 |
| 18mg/mL:54mg/mL:18mg/mL | 均匀分散且未出现颗粒状聚集体 |
可见，两种表面活性剂的混合，可进一步增加自缓释免疫佐剂混悬液在高压灭菌中的混悬稳定性表现，尤其是较高的表面活性剂浓度时，表现突出。两种及以上的亲水亲油平衡值(HLB值)不同的表面活性剂组合或两种疏水结构部分不同的表面活性剂(例如，一种表面活性剂含不少于20个的氧丙烯单元，或一种表面活性剂含有总数不少于15个碳原子的一条或多条碳氢链)作为微米颗粒的包覆层。两种不同溶解性的表面活性剂并不是完全均质的相互分散，而是形成相对均匀和局部聚集的分散结构，形成的包覆层复合颗粒进入瘤体后，HLB值较大的表面活性剂首先溶解，从而在微米颗粒的包覆层表面形成一些微小开口或者微小的缺陷区域，从而使内层脂溶性免疫佐剂微米颗粒的表面积逐步变化，有效成分逐步释放，更可根据不同瘤体及人体的实际需要，通过调配两种或多种表面活性剂的选择或配比关系的调配，获得多种型号的药剂组合方案。
表8加入不同比例的表面活性剂的R837高压灭菌后的粒径变化
同时，如表8所示，卵磷脂和P188同时存在得到的R837灭菌前后粒径变化最小，且粒径分布范围更小，即卵磷脂和P188同时存在更有助于样品在灭菌处理中的稳定性。其中，D50为样品中累计粒度分布达到50％时对应的粒径，D90为样品中累计粒度分布达到90％时对应的粒径，Dmax为样品中颗粒的最大粒径，三者差异越小，样品颗粒的均一度越高。在实验中还观察到，P188和卵磷脂同时存在的混悬液样品，久置后不会出现挂壁现象。值得说明的是，微米颗粒尺寸均一性是保证药物在体内具有稳定可重复的释放行为的一个重 要参数。
实施例A5：
第一组合物制备：
称取一定量的脂溶性免疫佐剂咪喹莫特R837固体进行气流粉碎处理，粉碎气压6-10bar，得到微米级咪喹莫特R837粉体。
按比例1：(0.025～5)称取微米级免疫佐剂咪喹莫特R837和表面活性剂泊洛沙姆188，优选2g R837，加入适量的泊洛沙姆188(0.05g，0.3g，0.6g，1g，2g，4g，6g，8g，10g)，加100mL注射用水，100-500rpm搅拌0.5-2小时，获得悬浊液。
将上述悬浊液于750-1200bar压力下高压均质2-4次获得混悬液，加入注射用水定容至咪喹莫特浓度6.0mg/mL，以蠕动泵吸取混悬液灌装到10mL安瓿瓶中，每瓶6mL，共30瓶。熔封后得到微米悬液，105℃～150℃湿热灭菌15-20分钟。
第二组合物制备：
按比例1:(1～5)配制海藻酸钠/甘露醇或海藻酸钠/乳糖溶液，其中，海藻酸钠溶液浓度为10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL,甘露醇或乳糖最终浓度为1～50mg/mL、20～100mg/mL、40～200mg/mL，海藻酸钠溶液搅拌均匀后再加入甘露醇或乳糖，分装于西林瓶中，预冷后，冻干，充氮气后封瓶。
实验前，将两种组合物充分混合，再置于透析袋(透过分子量12000-14000Da)中，随即在不同pH的缓冲溶液中进行透析。对照组将咪喹莫特悬液直接置于透析袋(透过分子量12000-14000Da)中，在不同pH值的缓冲液中透析，监测咪喹莫特的释放情况。其中，pH7.4的缓冲溶液为加入2mM CaCl
2的磷酸缓冲液，pH4.0的缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲溶液。
咪喹莫特从海藻酸钠/钙离子水凝胶(ALG)释放的比例随时间的变化如表9所示。咪喹莫特在酸性条件下会有更快的释放速度，而在两种pH值条件下，海藻酸钠/钙离子凝胶的存在均能够明显降低咪喹莫特的释放速率，达到缓释的效果。
表9咪喹莫特从海藻酸钠/钙离子水凝胶中的释放数据
实施例B 助悬剂考察
实施例B1：咪喹莫特混悬液的制备
制备各种助悬剂的咪喹莫特混悬液制剂。
以含有高级脂肪酸链的表面活性剂卵磷脂为例，制备咪喹莫特混悬液。
S1：将卵磷脂制备为不同浓度的均匀悬浊液，加入咪喹莫特粉末，使咪喹莫特的浓度为1～18mg/mL，搅拌混悬液；
S2：将S1步骤得到的混悬液进行均质处理；
S3：将均质后的混悬液进行灌装，并封盖，进行高温高压灭菌处理。高温高压灭菌的条件为：110℃～145℃高温高压灭菌10～30分钟。
实施例B2：不同助悬剂咪喹莫特混悬液稳定性的影响
助悬剂的选择应基于几个因素的考量，首先，作为一种应用于注射剂型的助悬剂，首选已经批准的注射级药用辅料，从而避免助悬剂本身的安全性隐患；其次，助悬剂本身不能和药物分子发生化学反应使药物活性改变或者毒性增加。
主要从三方面判断助悬剂是否有助于咪喹莫特混悬液终端灭菌后的稳定。
其一，观察高压灭菌前后混悬液的外观变化，并根据外观变化定义样品为稳定性较好、一般、不稳定。具体的，观察是否出现肉眼可见的颗粒或结块、粘壁、无法重新分散的情况，并对相应情况进行记录。当该样品无上述现象出现时，视为该样品在灭菌后稳定性较好；当样品在灭菌后出现上述现象，但经晃动或震摇后可重新分散得到均匀混悬液时，视为该样品在灭菌后状态一般；当样品在灭菌后出现以上现象且经过不同程度的晃动或震摇后均得不到重新分散的混悬液时，视为该样品不稳定。
其二，检测实施例B1中S3步骤前后的咪喹莫特混悬液制剂中的粒径分布，检测手段为动态光散射。检测中关键参数为D50、D90。其中D50是混悬剂中颗粒的中值粒径，意为混悬液中有50％的颗粒粒径在该值以下，是表示粒度大小的经典值，常被用于表示颗粒的平均粒径；D90意为体系中有90％的颗粒粒径在该值以下。D50与D90的差值可以说明粒径分布的跨度，及粒径均一性的优劣。分析检测数据时，主要判断样品D50和D90数值的大小和在灭菌前后D50和D90的变化：D50和D90数值越大，说明颗粒分散性不好；D50和D90数 值增加越大，说明该样品稳定性越差；因此，D50和D90数值越大和这两个数值量增加越大都说明该样品中使用的助悬剂不能够有效助悬，以得到可湿热灭菌的制剂产品。
其三，将灭菌后的样品长期放置，观察样品的状态及检测样品平均粒径，如果样品仍能够重悬并D50、D90未明显增加或D90与D50差别较小，可视为该助悬剂有助于增加微米级咪喹莫特混悬液的稳定性。在本案中，长期放置的条件为2～8℃，时间为12个月。
基于以上两个评判标准，将不同样品灭菌前后、长期放置的粒径数值及现象记录如表1所示，并将不同样品状态拍照记录如图2所示。
图2中1°～9°样品中加入的不同类型表面活性剂分别为：卵磷脂、吐温-80、吐温-20、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、聚氧乙烯蓖麻油、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯、油酸钠、磷脂酰甘油。
图2中1°、8°、9°样品为均匀分散的混悬液，其余样品出现不同程度的粘壁、结块甚至沉淀现象。
表10加入不同类型助悬剂的咪喹莫特混悬液在灭菌前后及灭菌后长期放置的粒径变化及现象记录表(其中，灭菌后为灭菌后到1周内；长期放置指放置12个月)。
选取了9种表面活性剂，其中例如吐温-80和吐温-20、聚氧乙烯蓖麻油等聚氧乙烯类非离子表面活性剂，在溶液温度升高到一定程度时，会出现起昙现象，即表面活性剂与水之间的作用力被高温破坏，溶液变得不稳定，当体系温度下降至昙点以下，有些溶液会重新恢复透明，有些则不会。同样作为聚氧乙烯类表面活性剂，泊洛沙姆一般被认为具有较好的水溶性，在常压下加热不会出现昙点。但在实验中发现，使用泊洛沙姆188或泊洛沙姆407作为表面活性剂进行高压灭菌时，短期稳定性一般，长期稳定性不易控制，没有达到预期的稳定效果。综合来看，所有的非离子型表面活性剂均不能达到预期的稳定混悬液的效果，即不能帮助灭菌后的混悬液能够均匀分散。
与非离子型表面活性剂相比，离子型表面活性剂，包括阴离子型表面活性剂和两性离子型表面活性剂，作为助悬剂加入体系中，能够保证咪喹莫特混悬液灭菌后的长期稳定性。进一步分析可稳定混悬液的助悬剂的结构发现，这些离子型表面活性剂均包含高级脂肪链结构，并且，疏水端的分子量远大于亲水端。因此，选用此类含有高级脂肪链的离子型表面活性剂，能够有效地帮助微米级咪喹莫特混悬液保持终端灭菌后的稳定性。
实施例B3：其他比例的表面活性剂对咪喹莫特的稳定作用
通常情况下，在保证成药性的前提下，药物制剂的非活性成分越少，使用及储存的安全性风险越低。因此，我们进一步以卵磷脂为例，尝试使用更低比例的含有高级脂肪酸链的表面活性剂，验证助悬效果。用实施例B1的方法制备不同卵磷脂与R837微米颗粒质量比的混 悬液，R837的浓度为15mg/mL在高温高压灭菌后检测混悬液中微米颗粒的粒径，并观察混悬液稳定性状态，记录如表11所示。
表11低比例卵磷脂对R837混悬液的助悬效果评价。
从结果可以看出，低比例的卵磷脂依然能够保证混悬液在高温高压灭菌后的稳定性，并且，咪喹莫特微米颗粒的粒径没有发生更大的变化，甚至较加入更高比例的离子型表面活性剂的样品，其粒径分布更加集中，即粒径更加均匀。因此，含有高级脂肪酸链的表面活性剂与咪喹莫特的的质量比可以在0.025～3：1。优选地，磷脂类离子型表面活性剂和咪喹莫特的质量比可以为0.025～1：1。
实施例B4：咪喹莫特混悬液制剂分散介质种类研究
临床上进行大体积注射液给药时，通常使用添加等渗调节剂来避免渗透压改变带来的局部组织损伤或微环境紊乱，因此，考察常用等渗调节剂对咪喹莫特混悬液制剂灭菌稳定性的影响。
使用实施例B1的方法制备咪喹莫特混悬液制剂，浓度为1mg/mL，区别在于：步骤S1中使用生理盐水或5％葡萄糖配制溶液，并与咪喹莫特微米颗粒混合均质。观察高压灭菌前后混悬液制剂的外观状态，均未发现结块情况，说明该制剂的分散介质可以直接使用生理盐水或5％葡萄糖溶液。
进一步的，扩大制备规模，并进行制剂产品稳定性的考察，湿热灭菌后未出现结块情况，且长期放置依然能够分散良好，粒径变化小，进一步验证了前述条件的可行性。
实施例C 微米颗粒的动物实验及对比
实施例C1：
本实施例说明的咪喹莫特制剂在体内的分布行为如下：
实验方法：在小鼠背部种植小鼠结肠癌(CT26)肿瘤，并将小鼠随机分为3组，每组3只小鼠做药物的分布行为研究。
第一组：小鼠进行瘤内注射小分子咪喹莫特盐酸盐，注射剂量为6mg/kg
第二组：小鼠进行瘤内注射聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)包裹的咪喹莫特纳米颗粒(平均粒径约100nm)，注射剂量为6mg/kg；
第三组：小鼠进行瘤内注射咪喹莫特微米颗粒(本制剂)，注射剂量为6mg/kg；在注射后72h牺牲小鼠，并解剖主要器官和瘤体，检测器官和肿瘤组织中的药物含量。
实验结果：从咪喹莫特在小鼠主要器官和肿瘤组织的含量图(图3)可以看出，小分子咪喹莫特盐酸盐和咪喹莫特/PLGA纳米制剂均不能保证大部分滞留在肿瘤部位，其中小分子咪喹莫特盐酸盐在瘤内注射后72h整体的滞留量极低，咪喹莫特纳米制剂则更多的滞留在其他器官中。相较于小分子咪喹莫特盐酸盐和咪喹莫特纳米制剂，本发明中咪喹莫特微米制剂在肿瘤组织中滞留量显著提高，咪喹莫特微米制剂在瘤内滞留时间最长。说明瘤内注射咪喹莫特微米剂型更有利于后续治疗。
癌症治疗是一个非常复杂的综合结果，因为无论是机体的免疫系统，以及癌细胞的生长机制都是非常复杂的。本实验之所以能够取得比较优异的治疗效果，除了本专利其他部分的解释外，可能还包括如下原因，采用了咪喹莫特R837微米颗粒。将不溶于水的R837粉末制备为1-3微米粒径的微米颗粒，瘤内注射后监测药代动力学和瘤内滞留时间，结果如表12所示，结果显示微米颗粒能够显著延长咪喹莫特的在肿瘤部位的滞留时间和血液循环半衰期，达到了缓释的效果，从而长效地刺激免疫系统。
表12不同剂型咪喹莫特的滞留时间对比数据；
实施例C2：
本实施例说明的咪喹莫特制剂在体内的药代动力学如下：
实验方法：在小鼠背部种植小鼠结肠癌(CT26)肿瘤，并将小鼠随机分为3组，每组3只做药物的药代动力学研究。
第一组：小鼠瘤内注射小分子咪喹莫特盐酸盐；注射剂量为6mg/kg，在注射后5h、6h、12h、24h、48h、72h进行静脉采血，并统一进行咪喹莫特浓度测定，检测血液中咪喹莫特浓度。
第二组：小鼠瘤内注射咪喹莫特/PLGA纳米颗粒(平均粒径约100nm)，注射剂量为6mg/kg，在注射后5h、6h、12h、24h、48h、72h进行静脉采血，并统一进行咪喹莫特浓度测定，检测血液中咪喹莫特浓度。
第三组：小鼠瘤内注射咪喹莫特微米颗粒(本制剂)，注射剂量为6mg/kg，在注射后5h、6h、12h、24h、48h、72h进行静脉采血，并统一进行咪喹莫特浓度测定，检测血液中咪喹莫特浓度。
实验结果：从血液药物浓度随时间的变化曲线(图4)及血液循环统计分析表(表)可以看出，小分子咪喹莫特盐酸盐很快被清除，其48h和72h的血药浓度已低于检测限，与咪喹莫特纳米制剂相比，微米制剂的血液循环半衰期和药物平均滞留时间更长。
实施例C3：
本实施例用于增强放射治疗的具体效果如下：
实验方法：在小鼠背部左右两端分别种植小鼠结肠癌肿瘤(右边视为原位肿瘤，左边视为远端肿瘤)，并将荷瘤小鼠分为6组，每组6只做放疗免疫治疗联合的治疗实验。
第一组：小鼠肿瘤不做任何处理，不进行试剂的注射和放疗治疗；
第二组：小鼠原位肿瘤进行单纯放疗治疗，对小鼠原位肿瘤进行每天1次，连续5天的放射治疗，远端肿瘤不做任何处理；
第三组：对小鼠原位肿瘤进行瘤内注射小分子咪喹莫特盐酸盐，剂量为6mg/kg；在给药后第0、1、2、3、4天进行1.5Gy的放疗，对小鼠左侧肿瘤不做任何处理；
第四组：对小鼠原位肿瘤进行瘤内注射咪喹莫特的PLGA纳米颗粒(粒径100nm左右)，剂量为6mg/kg；在给药后第0、1、2、3、4天进行每次1.5Gy的放疗，小鼠远端肿瘤不做任何处理；
第五组：小鼠瘤内注射咪喹莫特微米颗粒(本制剂)，剂量为6mg/kg；给药后第0、1、2、3、4天进行每次1.5Gy的放疗，小鼠远端肿瘤不做任何处理；
第六组：小鼠瘤内注射咪喹莫特微米颗粒(本制剂)，剂量为12mg/kg；给药后第0、1、2、3、4天进行每次1.5Gy的放疗，小鼠远端肿瘤不做任何处理；
每两天用游标卡尺测量原位肿瘤和远端肿瘤的长和宽，肿瘤的体积为(长乘以(宽的 平方))除以2。
图5是咪喹莫特盐酸盐、纳米颗粒、微米颗粒注射到肿瘤内后进行放疗后，原位肿瘤的生长曲线对比图，图6是咪喹莫特盐酸盐、纳米颗粒、微米颗粒注射到肿瘤内后进行放疗后，远端肿瘤的生长曲线对比图。
治疗效果：从原位肿瘤生长曲线(图5)和远端肿瘤生长曲线(图6)可以看出，第六组小鼠的原位瘤和远端肿瘤都得到了有效的抑制，几乎不再生长，因此具有非常好的应用前景与价值。其他对应的治疗组，部分具有一定的治疗效果，也有一些实验组的治疗效果是非常有限的。所有组别小鼠的体重变化曲线如图7所示，均在正常范围，实验组小鼠与对照组小鼠体重无差异，说明本制剂具有一定的安全性。
放疗可以诱导远端效应虽然已有报道，但是这种效应并不是很显著。我们在实验中发现，将免疫佐剂注射进入肿瘤内，再用射线辐照肿瘤，可以有效增强放疗诱导的免疫原性细胞死亡；其体现的效果是一方面可以提升放疗对原位肿瘤的疗效，另一方面获得更强的远端效应，抑制远端没有被照射肿瘤的生长。
实施例C4：
本实施例用于肿瘤微波消融联合治疗的效果如下：
实验方法：在小鼠背部左右两端分别种植小鼠结肠癌肿瘤(右边视为原位肿瘤，左边视为远端肿瘤)，并将荷瘤小鼠分为3组，每组5只做微波治疗免疫治疗联合的治疗实验。
第一组：小鼠肿瘤不做任何处理，不进行试剂的注射和微波治疗；
第二组：小鼠原位肿瘤进行单纯微波热消融治疗，微波功率为7W，肿瘤局部温度达到53℃，左侧肿瘤不做任何处理；
第三组：对小鼠右侧肿瘤进行瘤内注射咪喹莫特微米制剂，剂量为6mg/kg；在给药后进行微波热消融治疗，微波功率为7W，肿瘤局部温度达到53℃，对小鼠左侧肿瘤不做任何处理；
每两天用游标卡尺测量原位肿瘤和远端肿瘤的长和宽，肿瘤的体积为(长乘以(宽的平方))除以2。
治疗效果：从原位肿瘤生长曲线(图8)和远端肿瘤生长曲线(图9)可以看出，第三组小鼠肿瘤的双侧肿瘤都受到了很好的抑制，而单纯进行微波热消融治疗的小鼠，只有原位瘤被消灭，远端肿瘤仍然在生长，说明本发明的咪喹莫特微米制剂对微波热消融疗法的远端效应增益明显。
实施例C5：
本实施例用于肿瘤化疗免疫治疗联合治疗的效果如下：
实验方法：在小鼠背部左右两端分别种植小鼠结肠癌CT26肿瘤(右边视为原位肿瘤，左边视为远端肿瘤)，并将荷瘤小鼠分为3组，每组5只做化疗免疫治疗联合的治疗实验。
第一组：小鼠原位肿瘤瘤内注射生理盐水，远端瘤不做任何处理；
第二组：小鼠原位肿瘤瘤内注射奥沙利铂化疗药物，远端瘤不做任何处理；
第三组：小鼠原位肿瘤瘤内注射奥沙利铂化疗药物和咪喹莫特微米制剂混合物，远端瘤不做任何处理；
定期测量小鼠中立的长和宽，肿瘤的体积为(长乘以(宽的平方))除以2。
治疗效果：从原位肿瘤生长曲线(图10)和远端肿瘤生长曲线(图11)可以看出，化疗药物的使用能够抑制原位肿瘤的生长，但对远端肿瘤的生长抑制不明显，加入咪喹莫特微米制剂后，能够有效抑制远端肿瘤的生长，说明本发明所述咪喹莫特微米制剂能够有效增强化疗的远端效应。
实施例D 动物实验
实施例D1：生物分布
在小鼠背部接种CT26肿瘤细胞，建立小鼠CT26皮下瘤模型，将肿瘤大小一致的小鼠平均分为3组，每组3只小鼠，分组情况如下：
PLGA-R837：装载R837的PLGA纳米颗粒；
R837·HCl：R837盐酸盐的水溶液，该体系中R837分散性极好；
咪喹莫特混悬液制剂：本发明所述经终端灭菌的咪喹莫特微米级混悬液(助悬剂为卵磷脂)。
根据分组，向每组小鼠瘤内注射含有相同剂量R837的不同制剂，按照一般方法，研究其注射后72h内的药代动力学特征，统计不同组别小鼠血液中药物浓度的达峰时间(T
max)、达峰浓度(C
max)和半衰期(t
1/2)，结果如表13所示。
C
max和T
max反映药物从某制剂吸收进入全身血循环的速度，三种剂型的达峰时间(T
max)一致，但是，PLGA纳米颗粒包裹的R837很快就在血液中大量暴露，而瘤内注射微米级咪喹莫特混悬液制剂后，未出现短时间内药物的大量暴露；此外，三种剂型的血液循环半衰期相差甚远，与纳米制剂和小分子制剂相比，微米级咪喹莫特混悬剂的半衰期显著延长，即微米级咪喹莫特混悬液经瘤内给药的方式施用，具有明显的缓释效果。
表13不同组别小鼠的药代动力学参数均值统计表。
免疫佐剂在肿瘤内的长滞留，理论上能够更有效地刺激抗肿瘤免疫反应，为证明缓释剂型的抗肿瘤免疫增强效果，设计实验验证微米级咪喹莫特混悬液在肿瘤外放射或酒精消融疗法联合免疫治疗中的应用。
实施例E 微米级咪喹莫特混悬液增效放疗、酒精消融疗法
实施例E1：微米级咪喹莫特混悬液制剂联合放疗的治疗实验
在小鼠背部接种CT26结肠癌肿瘤细胞，建立小鼠结肠癌皮下双肿瘤模型，分别为原位肿瘤和远端肿瘤，当原位肿瘤体积约100mm
3时，将小鼠随机分为6组。分组如下：
Vehicle：溶媒对照组，对原位瘤进行瘤内注射分散介质的操作，注射体积为25μL；
RT：外放射治疗组，对原位瘤进行X射线辐照处理，放射剂量为4Gy，分别于治疗开始的当天和第3天进行；
R837：本发明所述咪喹莫特微米级混悬液制剂，其中R837的浓度为6mg/mL，注射剂量为25μL；
R837+RT：对原位瘤进行瘤内注射25μL的6mg/mL咪喹莫特微米级混悬液制剂后，进行与RT组相同的X射线辐照处理。
在R837+RT组别中，对原位肿瘤进行瘤内注射咪喹莫特混悬液制剂后半小时，对每只小鼠的原位肿瘤进行外放射治疗，远端肿瘤不做任何处理，监测小鼠原位肿瘤和远端肿瘤的体积，并制作肿瘤生长曲线，结果如图12(原位瘤生长曲线)和图13(远端瘤生长曲线)所示，并计算抑瘤率，结果如表14所示。表14为原位肿瘤和远端肿瘤的抑瘤率统计表。根据金氏公式q＝E(A+B)/(EA+EB-EA*EB)计算药物协同作用，其中E(A+B)为联合治疗组的抑瘤率，EA和EB分别为两种手段单独使用时的抑瘤率，当q≥1时，说明两种手段具有协同效果。计算可得，原位瘤的q值为1.17，远端瘤的q值为1.63，均具有协同效果。
同时，从图中可以观察到，多次放疗可以在一定程度上抑制肿瘤生长，瘤内注射咪喹莫特，能够进一步提高肿瘤放射治疗效果。微米级咪喹莫特混悬液制剂，由于其在肿瘤部位的 长滞留，和在体内的高生物利用度，刺激了最强烈的系统性抗肿瘤免疫反应，远端肿瘤生长被抑制，与外放射治疗手段达到了协同效果。
表14咪喹莫特混悬液制剂联合放疗治疗小鼠皮下肿瘤模型，治疗终点的抑瘤率。
| 组别 | 溶媒对照组 | RT | R837 | RT+R837 |
| 原位瘤 | 0 | 71.15％ | 38.73％ | 96.44％ |
| 远端瘤 | 0 | 29.67％ | 17.23％ | 68.14％ |
综上，微米级咪喹莫特混悬液制剂可以和外放射治疗联合，增强体内抗肿瘤免疫反应，尤其是放大了放疗中的远端效应，抑制远端肿瘤的生长。
实施例E2：微米级咪喹莫特混悬液制剂联合酒精消融的治疗实验。
酒精消融是肿瘤局部化学消融疗法的一种，通过将无水乙醇注射到肿瘤内部，使肿瘤组织凝固坏死，从而达到治疗的目的。但是单纯通过注射酒精或盐酸等化学消融手段，在不影响周边正常组织的剂量下，很难做到肿瘤的完全清除。本实施例中，将微米级咪喹莫特混悬液制剂联合酒精消融疗法，证明本发明所述微米级咪喹莫特混悬液制剂联合化学疗法的抗肿瘤效果。
首先建立小鼠皮下肿瘤模型。具体地，将肿瘤细胞接种至小鼠背部，待肿瘤体积生长至100mm
3时，将小鼠随机分为5组，每组5只小鼠，分组情况如下：
Control：空白对照组；
R837：瘤周注射微米级咪喹莫特混悬液；
ETOH：瘤内注射无水乙醇；
ETOH+R837(25)：瘤周注射25μL微米级咪喹莫特混悬液，瘤内注射无水乙醇；
ETOH+R837(50)：瘤周注射50μL咪喹莫特混悬液，瘤内注射无水乙醇。
其中微米级咪喹莫特混悬液的浓度为12mg/mL，无水乙醇的注射剂量为30μL。联合治疗组中，先将微米级咪喹莫特混悬液制剂注射在肿瘤周围的皮下部位，间隔10分钟左右，再将无水乙醇通过瘤内注射的方式进行给药。监测小鼠肿瘤体积变化，制作肿瘤生长曲线，结果如图14所示。
在实验中发现，仅施用无水乙醇组的小鼠，其肿瘤中心部位出现肿瘤纤维化并结痂，但由于外围肿瘤组织未被完全消除，后逐渐发展，外径继续增加，导致该组别肿瘤体积的数值与对照组差异不大，因此肿瘤生长曲线中，酒精消融组与空白对照组的肿瘤生长曲线几乎重合。除该特殊情况外，可从图14中看出，联合施用微米级咪喹莫特混悬剂和酒精消融组别的小鼠肿瘤生长被明显抑制，施用不同剂量的微米级咪喹莫特，均能提高酒精消融的疗效，达 到更好的肿瘤治疗效果，抑制肿瘤生长，说明微米级咪喹莫特混悬剂能够增强肿瘤的酒精消融治疗效果。
实施例F 咪喹莫特混悬液可帮助实现铂类化药的缓释，增强免疫原性细胞死亡引起的抗肿瘤免疫反应的效果
实施例F1：验证奥沙利铂与咪喹莫特混悬液混合使用，对奥沙利铂的缓释效果
在小鼠肿瘤背部接种结肠癌(CT26)肿瘤细胞，建立小鼠皮下肿瘤模型，待接种部位形成肿块约一周，小鼠随机分为两组，分别为：
OXA：奥沙利铂溶液
OXA-R837：与微米级咪喹莫特混悬液混合后的奥沙利铂溶液
对应地，向每组小鼠瘤内注射奥沙利铂溶液或混合有微米级咪喹莫特混悬液制剂的奥沙利铂溶液，然后在不同时间点(10min、30min、1h、3h、6h、9h、12h、24h、48h、72h)取小鼠血液样本，并于终点处死小鼠，获得主要器官及肿瘤，用电感耦合等离子质谱(ICP-MS)检测血液样本和脏器中铂离子的相对含量并制作统计图。结果如图15、图16所示。
图15是奥沙利铂的生物分布情况，较游离的奥沙利铂相比，与咪喹莫特微米级混悬液预混后进行给药，能够显著增加铂药在肿瘤部位的滞留量，注射药物72h后，混合注射组中，小鼠肿瘤部位的铂含量是游离组中的数十倍，说明咪喹莫特微米级混悬液能够增加铂类化药在肿瘤部位的滞留，减缓奥沙利铂的释放。
图16是奥沙利铂在血液中的浓度随时间变化的情况。与游离的奥沙利铂药物溶液相比，混合了微米级咪喹莫特混悬液的奥沙利铂，缓释效果更明显，具体表现在，达峰浓度更低、达峰时间更迟，在血液中存在的时间更长。具体的达峰时间(Tmax)、达峰浓度(Cmax)及曲线下面积(AUC)情况如表14所示，与微米级咪喹莫特混悬液混合后，延长了奥沙利铂在循环系统中的暴露时间，增加了奥沙利铂的生物利用度。
表14奥沙利铂药代动力学数据
| 组别 | T max(h) | C max(ng/g) | AUC all |
| OXA | 3 | 638.685 | 7850.866 |
| OXA+R837 | 6 | 565.728 | 10438.525 |
实施例F2：奥沙利铂与微米级咪喹莫特混悬液制剂联合使用增效抗肿瘤效果
在小鼠背部左右两侧分别接种不同数量(左侧是右侧接种量的1/5，)结肠癌(CT26)肿瘤细胞，建立小鼠皮下双边肿瘤模型，右侧视为原位肿瘤，左侧视为远端肿瘤。待原位肿瘤大小约100mm
3，将小鼠随机分为4组，分别进行治疗。分组情况如下：
VEHICAL：溶媒组，注射生理盐水30μL
OXA：注射奥沙利铂溶液30μL
R837：注射微米级咪喹莫特混悬液30μL
OXA+R837：注射微米级咪喹莫特混悬液和奥沙利铂混合后的混悬液30μL
在治疗第一天进行原位肿瘤的瘤内注射给药，其中，奥沙利铂的浓度为4mg/mL，咪喹莫特的浓度为6mg/mL，给药后记录小鼠肿瘤体积并制作肿瘤生长曲线，结果如图17(原位肿瘤生长曲线)、图18(远端肿瘤生长曲线)所示。图17为小鼠原位肿瘤生长曲线，经过计算，治疗组的抑瘤率如表15所示。
表15治疗后第15天不同组别的抑瘤率
| 组别 | VEHICAL | OXA | R837 | OXA+R837 |
| 原位瘤 | 0 | 69.56％ | 43.94％ | 86.26％ |
| 远端瘤 | 0 | 41.87％ | 22.94％ | 69.95％ |
根据金氏公式q＝E(A+B)/(EA+EB-EA*EB)计算药物协同作用，其中E(A+B)为联合治疗组的抑瘤率，EA和EB分别为两种组分单独使用时的抑瘤率，当q≥1时，说明两种成分具有协同效果。计算得到原位瘤抑瘤率的q约为1.1，远端瘤的q约为1.27，说明微米级咪喹莫特混悬液具有协同增效奥沙利铂化疗的效果。
同时，奥沙利铂能够引起肿瘤免疫原性死亡，咪喹莫特的加入会增强抗肿瘤免疫效果，引起全身抗肿瘤免疫反应，从而抑制远端肿瘤生长，与单独使用每一种组分相比，奥沙利铂和咪喹莫特同时进行瘤内注射后能够有效抑制远端肿瘤的生长，图18中的联合治疗组小鼠肿瘤生长最慢且组内差异越小。
实施例G 咪喹莫特微米级混悬液制剂对蒽环类化药缓释作用的考察
实施例G1：咪喹莫特微米级混悬液制剂与多柔比星(DOX)混合后，多柔比星的体外释放实验。
分组及样品制备：
1)DOX：多柔比星的水溶液，浓度为3mg/mL；
2)DOX+R837：用1mL咪喹莫特微米级混悬液制剂(含卵磷脂且已灭菌完成的样品，其中咪喹莫特的浓度为12mg/mL)溶解3mg多柔比星。
具体实验步骤：将配制好的各组溶液分别加入透析袋(截留分子量为3500D)中，置于500mL的PBS溶液中透析，在不同时间点检测透析液中药物浓度，检测手段为检测药物所在波段的紫外吸光度，计算药物含量，并与起始药物含量做比值，制作不同样品透析液的药物相对含量变化曲线，结果如图19所示。其中微米级咪喹莫特混悬液与多柔比星混合后，其药物释放曲线趋势明显减缓，说明微米级咪喹莫特混悬液能够显著降低药物的释放速率，达到缓释的效果。体外模拟释放实验能够在一定程度上反应药物在体内的行为，说明微米级咪喹莫特混悬液制剂与多柔比星预混后注射，能够减缓药物在原位注射后的释放速率，能够延长化疗药物在肿瘤部位的滞留时间、增加药物在肿瘤部位的滞留量，从而加强药物在肿瘤部位的作用效果、降低药物对系统的毒副作用。
实施例G2：改变咪喹莫特微米级混悬液制剂和多柔比星的混合比例，验证缓释效果。
分组及样品制备：
1)DOX：多柔比星的水溶液，浓度为3mg/mL；
2)DOX+R837：用微米级咪喹莫特混悬液制剂溶解多柔比星，咪喹莫特混悬液制剂的浓度为12mg/mL，多柔比星的终浓度为3mg/mL；
3)DOX+R837(1/3)：用微米级咪喹莫特混悬液制剂溶解多柔比星，咪喹莫特混悬液制剂的浓度为4mg/mL，多柔比星的终浓度为3mg/mL。
用与实施例G1相同的检测方法和数据处理方式绘制三组的药物释放曲线，结果如图20所示。降低了咪喹莫特微米级混悬液的用量之后，药物的释放速率有所增加，但相较于单纯的多柔比星的水溶液，释放速率仍然减缓，进一步说明微米级咪喹莫特混悬液制剂能够减缓多柔比星的释放，该缓释效果与两者的比例相关，微米级咪喹莫特混悬液制剂的浓度越高，缓释效果越好，多柔比星与咪喹莫特的浓度比例为1：1～1：18。
实施例G3：表柔比星(EPI)与微米级咪喹莫特混悬液制剂混合后的体外释放实验。
分组及样品制备：
1)EPI：表柔比星的水溶液，浓度为2mg/mL；
2)EPI+R837：用微米级咪喹莫特混悬液制剂溶解表柔比星，表柔比星的终浓度为2mg/mL；
与实施例G1相同，将样品至于透析袋(截留分子量为3500D)中，缓释体系为500mL的PBS溶液，检测不同时间点的药物释放量，计算释放百分比并绘制药物释放曲线，结果如 图21所示。结果显示，在体外释放实验的早期(6h之前)，不同组别的药物释放趋势近似，但随着时间的延长，与微米级咪喹莫特混悬液制剂混合的表柔比星释放减缓。
与多柔比星的缓释效果相比，表柔比星的缓释效果略有降低，发明人推测认为，混合液中的蒽环类化药可能与咪喹莫特微米颗粒之间形成了一定的π-πstacking作用力，而多柔比星和表柔比星互为异构体，从分析结构上看，多柔比星容易和咪喹莫特形成更稳定的π-πstacking作用力，因此会表现出更强的缓释作用。
当药物与混悬剂的相对浓度过高时，多余的药物处于游离的状态，该部分药物会在短时间内快速释放，而通过与咪喹莫特微米颗粒之间的π-π相互作用稳定的化药，其药物代谢的行为变化与微米级咪喹莫特颗粒相关联，瘤内注射混合液后，化药与咪喹莫特微米级颗粒的药代动力学相似，滞留增强，释放变缓。
实施例G4：磷脂酰甘油作为助悬剂得到的微米级咪喹莫特混悬液制剂对表柔比星的缓释作用
分组及样品制备：
EPI：表柔比星的水溶液，浓度为2mg/mL；
EPI+R837(0.25PG)：用磷脂酰甘油助悬得到的微米级咪喹莫特混悬液制剂溶解表柔比星，其中磷脂酰甘油和咪喹莫特的质量比为0.25：1，表柔比星的终浓度为2mg/mL；
EPI+R837(3PG)：用磷脂酰甘油助悬得到的微米级咪喹莫特混悬液制剂溶解表柔比星，其中磷脂酰甘油和咪喹莫特的质量比为3：1，表柔比星的终浓度为2mg/mL。
同实施例G1相似的办法，用透析实验检测药物的释放情况，结果如图22所示，微米级咪喹莫特混悬液制剂溶解的表柔比星，药物溶出速率明显放缓，24小时药物释放量，仅为对照组的1/4左右，增加磷脂酰甘油的比例，药物的释放更加缓慢，磷脂酰甘油表面的负电荷与表柔比星表面的正电荷形成了静电作用力，因此表现出更强的缓释效果。
对所公开的实施例的上述说明，使得本技术领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的。本发明不会被限制于本文所示的这些实施例，只需要符合与本文所公开的原理与特点一致即可。
Claims (45)
- 一种自缓释免疫佐剂混悬液，其由脂溶性免疫佐剂和表面活性剂组成，余量为分散介质，所述表面活性剂包覆所述脂溶性免疫佐剂形成微米级颗粒，并分散在所述分散介质中形成混悬液。
- 根据权利要求1所述的自缓释免疫佐剂混悬液，其中所述脂溶性免疫佐剂包括咪喹莫特(R837)、雷西莫特(R848)或吡喃葡糖苷脂质A(MPLA)中的至少一种。
- 根据权利要求1-2中任一项所述的自缓释免疫佐剂混悬液，其中所述脂溶性免疫佐剂颗粒为粒径为0.5-5微米的核壳复合颗粒。
- 根据权利要求1-3中任一项所述的自缓释免疫佐剂混悬液，其中所述脂溶性免疫佐剂核壳复合微米颗粒的粒径为1-2微米。
- 根据权利要求1-4中任一项所述的自缓释免疫佐剂混悬液，其中所述脂溶性免疫佐剂为咪喹莫特微米颗粒。
- 根据权利要求5所述的自缓释免疫佐剂混悬液，其中所述咪喹莫特微米颗粒的平均粒径为0.5～5微米。
- 根据权利要求1-6中任一项所述的自缓释免疫佐剂混悬液，其中所述表面活性剂为含有高级脂肪酸链的表面活性剂。
- 根据权利要求7所述的自缓释免疫佐剂混悬液，其中所述含有高级脂肪酸链的表面活性剂包括阴离子型表面活性剂。
- 根据权利要求8所述的自缓释免疫佐剂混悬液，其中所述阴离子型表面活性剂包括油酸钠、十二烷基硫酸钠、硬脂酸钠、N-月桂酰肌胺酸钠、椰油酰基甲基牛磺酸钠、N-月桂酰基谷胺酸钠、月桂醇聚氧乙烯醚羧酸钠、十二烷基磷酸酯的至少一种。
- 根据权利要求7所述的自缓释免疫佐剂混悬液，其中所述含有高级脂肪酸链的表面活性剂包括两亲性离子型表面活性剂。
- 根据权利要求7所述的自缓释免疫佐剂混悬液，其中所述含有高级脂肪酸链的表面活性剂包括磷脂类离子型表面活性剂。
- 根据权利要求11所述的自缓释免疫佐剂混悬液，其中所述磷脂类离子型表面活性剂包括卵磷脂、大豆磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇中的至少一种。
- 根据权利要求1-6中任一项所述的自缓释免疫佐剂混悬液，其中所述表面活性剂的疏水结构部分含不少于20个的氧丙烯基单元。
- 根据权利要求13所述的自缓释免疫佐剂混悬液，其中所述表面活性剂包括泊洛沙姆188，泊洛沙姆237，泊洛沙姆338，泊洛沙姆407中的至少一种。
- 根据权利要求1-6中任一项所述的自缓释免疫佐剂混悬液，其中所述表面活性剂的疏水结构部分含总数不少于15个碳原子的一条或多条碳氢链。
- 根据权利要求15所述的自缓释免疫佐剂混悬液，其中所述表面活性剂包括倍半油酸山梨坦，大豆磷脂，单硬脂酸甘油酯，聚山梨酯40，聚山梨酯60，聚山梨酯65，聚山梨酯80，聚山梨酯85，硬脂山梨坦(司盘60)，硬脂酸盐，维生素E聚琥珀酸乙二醇酯，聚氧乙烯烷基醚，硬脂酸聚氧乙烯酯，硬脂酸聚烃氧(40)酯，蔗糖硬脂酸酯，聚氧乙烯蓖麻油衍生物，聚西托醇1000，卵磷脂中的至少一种。
- 根据权利要求1-6中任一项所述的自缓释免疫佐剂混悬液，其中所述表面活性剂为两种亲水亲油平衡值不同的表面活性剂的混合物。
- 根据权利要求1-12、16-17中任一项所述的自缓释免疫佐剂混悬液，其包括咪喹莫特混悬液制剂，所述咪喹莫特混悬液制剂包括：咪喹莫特微米颗粒、含有高级脂肪酸链的表面活性剂和分散介质。
- 根据权利要求18所述的自缓释免疫佐剂混悬液，其中所述咪喹莫特微米颗粒的浓度为1～18mg/mL，所述含有高级脂肪酸链的表面活性剂与咪喹莫特微米颗粒的质量比为0.025～3：1。
- 根据权利要求19所述的自缓释免疫佐剂混悬液，其中所述含有高级脂肪酸链的表面活性剂与咪喹莫特微米颗粒的质量比为0.1～1：1。
- 一种自缓释免疫佐剂混悬液的制备方法，其包括如下步骤：S1：将表面活性剂和脂溶性免疫佐剂分散在同一分散体系中，搅拌得到混悬液；S2：对上述制得的混悬液进行均质处理/进行高剪切工艺处理；S3：对均质后/高剪切工艺处理后的混悬液进行灭菌处理。
- 根据权利要求21所述的制备方法，其包括如下步骤：S1：将脂溶性免疫佐剂通过气流粉碎工艺形成初级微米级粉体；S2：向S1步骤获得的脂溶性免疫佐剂初级微米级粉体中按照脂溶性免疫佐剂：表面活性剂质量比(1：0.025～5)加入表面活性剂的水溶液，进行高压均质工艺处理，处理结束后取出匀浆；或S2’：向S1步骤获得的脂溶性免疫佐剂微米粉体中按脂溶性免疫佐剂：表面活性剂质量比(1：0.025～5)加入表面活性剂的水溶液，进行高剪切工艺处理，处理结束后取出匀浆；S3：高压灭菌处理。
- 根据权利要求22所述的制备方法，其中步骤S2中所述的表面活性剂包括两种溶解度不 同表面活性剂。
- 根据权利要求22所述的制备方法，其中所述高压灭菌处理的条件为105℃～150℃下处理10-20分钟。
- 一种咪喹莫特混悬液制剂的制备方法，其包括如下步骤：S1：将含有高级脂肪酸链的表面活性剂和咪喹莫特微米颗粒分散在同一分散体系中，搅拌得到混悬液；S2：将上述制得的混悬液进行均质处理；S3：对均质后的混悬液进行灌装，封闭后进行高温高压灭菌。
- 根据权利要求25所述的制备方法，其中所述高温高压灭菌的条件为：110～145℃，5～30min。
- 权利要求21-26中任一项所述的制备方法获得的自缓释免疫佐剂混悬液在制备肿瘤辅助治疗药物中的应用。
- 一种自缓释免疫佐剂组合物，其包括第一组合物和第二组合物；所述第一组合物由脂溶性免疫佐剂和表面活性剂组成，余量为分散剂，所述表面活性剂包覆所述脂溶性免疫佐剂形成微米级颗粒，并分散在所述分散剂中形成混悬液；所述第二组合物包括易溶性海藻酸盐和保护填充剂，形成的冻干粉。
- 根据权利要求28所述的自缓释免疫佐剂组合物，其中所述脂溶性免疫佐剂包括咪喹莫特(R837)、雷西莫特(R848)或吡喃葡糖苷脂质A(MPLA)中的至少一种。
- 根据权利要求28所述的自缓释免疫佐剂组合物，其中所述表面活性剂的疏水结构部分含不少于20个的氧丙烯基单元。
- 根据权利要求30所述的自缓释免疫佐剂组合物，其中所述表面活性剂包括泊洛沙姆188，泊洛沙姆237，泊洛沙姆338和泊洛沙姆407中的至少一种。
- 根据权利要求28所述的自缓释免疫佐剂组合物，其中所述表面活性剂的疏水结构部分含总数不少于15个碳原子的一条或多条碳氢链。
- 根据权利要求32所述的自缓释免疫佐剂组合物，其中所述表面活性剂包括倍半油酸山梨坦，大豆磷脂，单硬脂酸甘油酯，聚山梨酯40，聚山梨酯60，聚山梨酯65，聚山梨酯80，聚山梨酯85，硬脂山梨坦(司盘60)，硬脂酸盐，维生素E聚琥珀酸乙二醇酯，聚氧乙烯烷基醚，硬脂酸聚氧乙烯酯，硬脂酸聚烃氧(40)酯，蔗糖硬脂酸酯，聚氧乙烯蓖麻油衍生物，聚西托醇1000和卵磷脂中的至少一种。
- 根据权利要求28所述的自缓释免疫佐剂组合物，其中所述表面活性剂为两种亲水亲油平衡值不同的表面活性剂的混合物。
- 根据权利要求28-34中任一项所述的自缓释免疫佐剂组合物，其中所述分散剂为水或生理盐水。
- 根据权利要求28-35中任一项所述的自缓释免疫佐剂组合物，其中所述保护填充剂为甘露醇或乳糖。
- 根据权利要求28-36中任一项所述的自缓释免疫佐剂组合物，所述第二组合物还包括pH调节剂。
- 权利要求1-20中任一项所述的自缓释免疫佐剂混悬液或权利要求28-37中任一项所述的自缓释免疫佐剂组合物在制备抗肿瘤联合免疫治疗制剂中的应用。
- 根据权利要求38所述的应用，其中所述自缓释免疫佐剂包含咪喹莫特混悬液制剂。
- 根据权利要求39所述的应用，其中所述咪喹莫特混悬液制剂与铂类化药预混，协助铂类化药的缓释。
- 根据权利要求39所述的应用，其中所述咪喹莫特混悬液制剂与蒽环类化药预混，协助蒽环类化药的缓释。
- 权利要求1-20中任一项所述的自缓释免疫佐剂混悬液或权利要求28-37中任一项所述的自缓释免疫佐剂组合物在制备放疗增敏剂中的应用。
- 权利要求1-20中任一项所述的自缓释免疫佐剂混悬液或权利要求28-37中任一项所述的自缓释免疫佐剂组合物在制备化疗增敏剂中的应用。
- 权利要求1-20中任一项所述的自缓释免疫佐剂混悬液或权利要求28-37中任一项所述的自缓释免疫佐剂组合物在制备热疗增敏剂中的应用。
- 权利要求1-20中任一项所述的自缓释免疫佐剂混悬液或权利要求28-37中任一项所述的自缓释免疫佐剂组合物在制备酒精消融增敏剂中的应用。
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