CN116694808A - 一种鉴定黄瓜品种京研玉甜156纯度的特异snp引物及其方法 - Google Patents
一种鉴定黄瓜品种京研玉甜156纯度的特异snp引物及其方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116694808A CN116694808A CN202310851830.4A CN202310851830A CN116694808A CN 116694808 A CN116694808 A CN 116694808A CN 202310851830 A CN202310851830 A CN 202310851830A CN 116694808 A CN116694808 A CN 116694808A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- cucumber
- purity
- snp
- sweet
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 title claims abstract description 78
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 244000299906 Cucumis sativus var. sativus Species 0.000 title 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 claims abstract description 78
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 12
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 claims description 8
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 8
- 239000010977 jade Substances 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 abstract description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 description 2
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 235000009849 Cucumis sativus Nutrition 0.000 description 1
- 241000221785 Erysiphales Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000233679 Peronosporaceae Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种鉴定黄瓜品种京研玉甜156纯度的特异SNP引物及其方法。具体地公开了鉴定黄瓜京研玉甜156杂交种纯度的SNP分子标记，该SNP分子标记为SNP位点：C18109948A。本发明还公开了用于检测该SNP分子标记的引物组，包括正向引物01F1(SEQ ID No.1)、正向引物01F2(SEQ ID No.2)和反向引物01R(SEQ ID No.3)。本发明的分子标记及其引物组对农业生产和品种选育过程中的品种纯度鉴定具有重要的应用价值。本发明的鉴定方法具有高通量、准确、成本低、操作简单等优点，能够代替田间纯度鉴定的方法，大大缩短鉴定周期，有较强的商业应用价值，前景十分广阔。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定黄瓜品种京研玉甜156纯度的特异SNP引物及其方法。
背景技术
黄瓜是我国最重要的蔬菜作物之一，我国黄瓜种植规模和产量都已位居世界第一，黄瓜品种数量也随着育种手段的多样化而逐渐增多。目前，市售黄瓜品种均为一代杂交种，其在生长势、抗逆性、产量、品质等方面均比双亲优越。但是在制种过程中很难避免母本自交和其他品种串粉而导致的种子不纯，进而影响黄瓜的品质和产量，造成经济损失，因此杂交种的纯度鉴定至关重要。
京研益农种业科技股份有限公司育成的黄瓜品种京研玉甜156瓜肉浅绿色，瓜味甜脆，抗霜霉病和白粉病。并且凭借生长势强，耐低温、弱光、耐热等特点，广受种植者的青睐，已经推广北京、山东、内蒙古、辽宁等地区，累计推广500亩。与传统的田间纯度鉴定相比，DNA分子鉴定技术从DNA水平上揭示子代与亲本间的遗传差异，不受环境的影响具有高灵敏性、能够检测微小的变异、多态性丰富、稳定性高。但是，由于同一单位育成的黄瓜品种数量较多，少量的分子标记难以对混杂亲缘关系较近的黄瓜品种的纯度进行准确鉴定，所以开发京研玉甜156品种纯度鉴定特异的分子标记具有着重要意义。
SNP作为第三代分子标记，具有分布密度高、遗传稳定性好、易于实现自动化等优势。黄瓜种质资源变异组大数据为筛选黄瓜品种纯度鉴定的特异SNP位点提供可能。SNP检测方法众多，其中KASP(Kompetitive Allele Specific PCR)，即竞争性等位基因特异性PCR技术，是国际上主流的SNP检测方法之一，该技术准确度高，可以实现自动化操作，简单便捷，并且将使用SNP标记的成本降至最低，已被广泛应用于高通量分子辅助育种和品种鉴定。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种可用于快速鉴定黄瓜品种京研玉甜156纯度的分子标记、特异SNP引物及方法。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为了实现上述目的，本发明首先提供了鉴定黄瓜京研玉甜156杂交种纯度的SNP分子标记，所述SNP分子标记可为SNP位点：C18109948A。
所述SNP位点：C18109948A为黄瓜第1号染色体上的第18109948位核苷酸。
本发明还提供了用于扩增或检测所述SNP分子标记的引物组。
进一步地，所述引物组可包括正向引物01F1、正向引物01F2和反向引物01R，所述正向引物01F1的核苷酸序列可如SEQ ID No.1的第22-42位所示，所述正向引物01F2的核苷酸序列可如SEQ ID No.2的第22-43位所示，所述反向引物01R的核苷酸序列可如SEQ IDNo.3所示。
进一步地，所述正向引物01F1和正向引物01F2的5’端可连接不同的荧光标签序列。
进一步地，所述正向引物01F1的5’端可连接FAM荧光标签序列，所述正向引物01F2的5’端可连接HEX荧光标签序列。
所述FAM荧光标签序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(SEQ ID NO：4)；所述HEX荧光标签序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(SEQ ID NO：5)。
进一步地，所述引物组可包括正向引物01F1、正向引物01F2和反向引物01R，所述正向引物01F1的核苷酸序列可如SEQ ID No.1所示，所述正向引物01F2的核苷酸序列可如SEQ ID No.2所示，所述反向引物01R的核苷酸序列可如SEQ ID No.3所示。
本文所述引物可为KASP引物。
所述引物组用于扩增含有所述SNP位点：C18109948A(第1号染色体上的第18109948位核苷酸)的DNA片段。
本发明还提供了试剂盒或DNA芯片，所述试剂盒或DNA芯片可包含本文中任一所述的引物组。
所述试剂盒或DNA芯片可用于鉴定黄瓜品种京研玉甜156的纯度。
本发明还提供了所述SNP分子标记、文本中任一所述的引物组或所述试剂盒或DNA芯片在鉴定黄瓜品种京研玉甜156纯度中的应用。
本发明还提供了本文中任一所述的引物组在制备用于检测所述SNP分子标记的产品中的应用。
所述产品可为试剂、试剂盒、芯片或试纸。
本发明还提供了一种鉴定黄瓜品种京研玉甜156纯度的方法，所述方法可包括采用本文中任一所述的引物组或所述试剂盒或DNA芯片来鉴定黄瓜品种京研玉甜156的纯度。
进一步地，所述方法可包括如下步骤：
B1)提取待测黄瓜基因组DNA；
B2)以所述基因组DNA为模板，利用本文中任一所述的引物组进行PCR扩增，采集荧光信号；
B3)根据所述荧光信号确定待测黄瓜的基因型。
进一步地，所述引物组中，正向引物01F1、正向引物01F2和反向引物01R的摩尔比为2:2:5。
进一步地，所述方法还包括根据所述待测黄瓜的基因型进一步鉴定黄瓜品种京研玉甜156的纯度。
进一步地，可根据所述待测黄瓜的基因型统计纯合基因型数、缺失基因型数，进而计算待测黄瓜杂交种的品种纯度。所述测黄瓜杂交种的品种纯度计算公式可为：品种纯度＝(检测总数-异型株个数-缺失个数)/(检测总数-缺失个数)*100％
本发明基于京研玉甜156及其父母本共3份样本的全基因组重测序数据筛选出了鉴定黄瓜京研玉甜156杂交种纯度的特异SNP位点(即SNP分子标记)及其KASP引物组，并建立了鉴定黄瓜京研玉甜156杂交种纯度的方法。
本发明提供的SNP引物组可用于鉴定黄瓜品种京研156的纯度，对农业生产和品种选育过程中的品种纯度鉴定具有重要的应用价值。本发明所提供的鉴定方法具有高通量、准确、成本低、操作简单等优点，能够代替田间纯度鉴定的方法，大大缩短鉴定周期，有较强的商业应用价值，前景十分广阔。
附图说明
图1为京研玉甜156纯度鉴定特异SNP位点在其亲本中的一代测序结果。
图2为建立在京研玉甜156纯度鉴定特异SNP引物组上的94份黄瓜商品种及京研玉甜156亲本SNP分型结果。
图3为京研玉甜156杂交种纯度鉴定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的黄瓜京研玉甜156来源于京研益农种业科技股份有限公司。
实施例1、用于鉴定京研玉甜156纯度的特异SNP引物组合的获得
一、京研玉甜156特异SNP位点的发现
基于京研玉甜156及其父母本共3份样本的全基因组重测序数据，进行目标SNP位点的筛选，筛选条件为：特异于黄瓜变异组大数据VegSNPDB网站中的460万个SNP；符合亲子遗传规律；两翼30bp序列无其它变异，基因组特异；变异类型为非同义突变，最终获得1个SNP位点。
1个SNP位点的基本信息详见表1。其中SNP位点在染色体上的位置是基于黄瓜9930参考基因组序列比对确定的，所述黄瓜9930参考基因组序列的版本号为V2(下载地址为：http://cucurbitgenomics.org/organism/2)。
表1、1个SNP位点的基本信息
二、用于鉴定黄瓜品种京研玉甜156纯度的特异SNP引物组合的获得
基于步骤一发现的SNP位点，本发明的发明人设计并合成了1个适合用等位基因竞争性特异PCR法(KASP)鉴定黄瓜品种京研玉甜156纯度的引物组合。引物组的名称见表2中第2列。引物组由3条引物序列组成，用于扩增一个SNP位点(Chr1-9948)，该SNP位点在其亲本中的一代测序结果如图1所示。引物组中各个引物的核苷酸序列如表2中第4列所示。
表2、用于鉴定杂交种京研156纯度的SNP引物组合
注：单下划线为FAM荧光标签序列，双下划线为HEX荧光标签序列。
该SNP位点(Chr1-9948)即为鉴定黄瓜京研玉甜156杂交种纯度的SNP分子标记，所述SNP分子标记为SNP位点：C18109948A，该SNP为黄瓜第1号染色体上的第18109948位核苷酸。
实施例2、实施例1开发的SNP引物组合的有效性检验
本实施例中的94个供试黄瓜品种的基本信息见表3。94个供试黄瓜品种均为常见的市场品种。
表3、94个供试黄瓜品种的基本信息
1、供试黄瓜品种的基因组DNA的获得
采用CTAB法分别提取94个供试黄瓜品种及京研玉甜156的父、母本的幼根(混取10粒种子的幼根)的基因组DNA，得到供试黄瓜品种的基因组DNA。
供试黄瓜品种的基因组DNA的质量和浓度均须满足PCR要求，达标标准为：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；紫外分光光度计Nanodrop2000(Thermo)检测A260/A280比值在1.8左右，A260/A230比值大于1.8；供试黄瓜品种的基因组DNA的浓度在10-30ng/μL。
2、分别以94个供试黄瓜品种和京研玉甜156的父、母本的基因组DNA为模板，采用引物组01(正向引物01F1、正向引物01F2和反向引物01R)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR反应体系中，正向引物01F1、正向引物01F2和反向引物01R的浓度比为2:2:5。
PCR反应体系及试剂根据所用微孔板决定，详见下表4。
表4、KASP标记检测的PCR反应体系
| 微孔板类型 | 1536微孔板 | 384微孔板 | 96微孔板 |
| PCR体系 | 1μl | 3μl | 10μl |
| 2×PCR预混液 | 0.5μl | 1.5μl | 5μl |
| 去离子水 | 0.486μl | / | 3.36μl |
| 引物工作液 | 0.014μl | 0.042μl | 0.14μl |
| DNA工作液 | 1.5μl(烘干) | 1.5μl(烘干) | 1.5μl |
PCR反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。
3、完成步骤2后，待各个PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断供试黄瓜品种基于每个SNP位点的基因型。具体的判断原则如下：如果某供试黄瓜品种基于某SNP位点显示蓝色荧光信号，则该供试黄瓜品种基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点且名称中含有“F1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果某供试黄瓜品种基于某SNP位点显示红色荧光信号，则该供试黄瓜品种基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点且名称中含有“F2”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果某供试黄瓜品种基于某SNP位点显示绿色荧光信号，则该供试黄瓜品种基于该SNP位点的基因型为杂合型，一个碱基为“扩增该SNP位点且名称中含有“F1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”，另一个碱基“扩增该SNP位点且名称中含有“F2”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”。
需要说明的是，若PCR扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。
引物组01的SNP分型结果见图2。
结果表明，京研玉甜156的父母本在该引物组的作用下成功分型，说明该位点在京研玉甜156中具有多态性。94个黄瓜杂交种除一个未分型的品种，其余品种在此位点全部为纯合型，说明此位点在94个黄瓜杂交种内的多态性低，因此该位点可以作为京研玉甜156纯度检测的特异SNP位点。
实施例3、采用实施例1开发的SNP引物组合鉴定黄瓜品种京研玉甜156的纯度
1、采用实施例1开发的SNP引物组合鉴定黄瓜品种京研玉甜156的纯度
具体步骤如下：
(1)种植京研玉甜156及其亲本的种子，得到待测黄瓜幼苗；取待测黄瓜幼苗的叶片或根，采用CTAB法分别提取基因组DNA，获得待测黄瓜品种的基因组DNA。
(2)以京研玉甜156及其亲本的基因组DNA为模板，用SNP引物组(表2中的引物组01)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。各个PCR反应体系中，正向引物01F1、正向引物01F2和反向引物01R的浓度比为2:2:5。
PCR反应体系及试剂根据所用微孔板决定，详见表4。
PCR反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。
(3)完成步骤(2)后，待各个PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，得到荧光信号颜色，进行如下判断：如果待测黄瓜品种基于某SNP位点显示蓝色荧光信号，则该待测黄瓜品种基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点且名称中含有“F1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果待测黄瓜品种基于某SNP位点显示红色荧光信号，则该待测黄瓜品种基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点且名称中含有“F2”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果待测黄瓜品种基于某SNP位点显示绿色荧光信号，则该待测黄瓜品种基于该SNP位点的基因型为杂合型，一个碱基为“扩增该SNP位点且名称中含有“F1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”，另一个碱基“扩增该SNP位点且名称中含有“F2”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”。
需要说明的是，若PCR扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。
引物组在94粒京研玉甜156种子的SNP分型结果见图3。
(4)根据PCR产物信号如图3，判定94粒京研玉甜156种子的基因型，统计纯合基因型数、缺失基因型数，该待测黄瓜杂交种的品种纯度计算公式为：
品种纯度＝(检测总数-异型株个数-缺失个数)/(检测总数-缺失个数)*100％
根据SNP分型结果，得到的京研玉甜156纯度为92/(94-2)＝100％。
2、分别种植100株京研玉甜156黄瓜品种。根据表型，判断100株京研玉甜156的纯度。
2022年3月20日在北京市农林科学院蔬菜研究所温室种植100颗京研玉甜156黄瓜品种的种子，田间每株间距为35厘米、行距为60厘米，其它同一般大田管理。种植30天后，在结果期调查田间表型，根据品种特征特性检查品种杂株率，并用本品种的植株数占供检96株黄瓜的百分比计算纯度。表型结果表明，未发现异型株，京研玉甜156品种纯度100％。实施例1开发的SNP引物组合的鉴定结果与京研玉甜156表型鉴定结果完全一致。
由此可见，采用实施例1开发的SNP引物组合完全可以鉴定京研玉甜156的纯度。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.鉴定黄瓜京研玉甜156杂交种纯度的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记为SNP位点：C18109948A。
2.用于扩增或检测权利要求1所述SNP分子标记的引物组。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述引物组包括正向引物01F1、正向引物01F2和反向引物01R，所述正向引物01F1的核苷酸序列如SEQ ID No.1的第22-42位所示，所述正向引物01F2的核苷酸序列如SEQ ID No.2的第22-43位所示，所述反向引物01R的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述正向引物01F1和正向引物01F2的5’端连接不同的荧光标签序列。
5.根据权利要求3或4所述的引物组，其特征在于，所述正向引物01F1的5’端连接FAM荧光标签序列，所述正向引物01F2的5’端连接HEX荧光标签序列。
6.试剂盒或DNA芯片，其特征在于，所述试剂盒或DNA芯片包含权利要求2-5中任一所述的引物组。
7.权利要求1所述的SNP分子标记、权利要求2-5中任一所述的引物组或权利要求6所述的试剂盒或DNA芯片在鉴定黄瓜品种京研玉甜156纯度中的应用。
8.权利要求2-5中任一所述的引物组在制备用于检测权利要求1所述SNP分子标记的产品中的应用。
9.一种鉴定黄瓜品种京研玉甜156纯度的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求2-5中任一所述的引物组或权利要求6所述的试剂盒或DNA芯片来鉴定黄瓜品种京研玉甜156的纯度。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
B1)提取待测黄瓜基因组DNA；
B2)以所述基因组DNA为模板，利用权利要求2-5中任一所述的引物组进行PCR扩增，采集荧光信号；
B3)根据所述荧光信号确定待测黄瓜的基因型。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310851830.4A CN116694808A (zh) | 2023-07-12 | 2023-07-12 | 一种鉴定黄瓜品种京研玉甜156纯度的特异snp引物及其方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310851830.4A CN116694808A (zh) | 2023-07-12 | 2023-07-12 | 一种鉴定黄瓜品种京研玉甜156纯度的特异snp引物及其方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116694808A true CN116694808A (zh) | 2023-09-05 |
Family
ID=87827775
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310851830.4A Pending CN116694808A (zh) | 2023-07-12 | 2023-07-12 | 一种鉴定黄瓜品种京研玉甜156纯度的特异snp引物及其方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116694808A (zh) |
-
2023
- 2023-07-12 CN CN202310851830.4A patent/CN116694808A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114134247B (zh) | 与谷子株高性状紧密连锁的分子标记及其引物序列和应用 | |
| CN111961749B (zh) | 检测番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-3和Ty-3a的KASP引物及其应用 | |
| CN111961750A (zh) | 检测番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1的KASP引物及其应用 | |
| CN112195265B (zh) | 一种鉴定辣椒杂交种纯度的snp位点、引物组及应用 | |
| CN102242219B (zh) | 一种鉴定白菜紫色性状的方法及专用引物对 | |
| CN109609687B (zh) | 用于检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合及其应用 | |
| CN114164294B (zh) | 与大白菜持绿性相关的snp位点及其应用 | |
| CN114836563B (zh) | 一种鉴定欧洲水果型黄瓜的方法及其专用snp引物组和应用 | |
| CN116516054A (zh) | 一种与甘蓝型油菜矮秆性状相关的snp分子标记及其应用 | |
| CN114752702B (zh) | 一种与油菜钙含量性状QTL紧密连锁的分子标记BnCa-2C2及其应用 | |
| CN114480721B (zh) | 一种鉴定待测甜瓜品种为薄皮甜瓜还是厚皮甜瓜的方法及其专用snp引物组合 | |
| CN113005213A (zh) | 与小麦茎基腐病抗性相关的snp分子标记及其应用 | |
| CN113832251B (zh) | 用于检测番茄花叶病毒病抗性的snp位点组合及其应用 | |
| CN111996280B (zh) | 与甘蓝型油菜矮杆紧凑性状共分离的snp标记及应用 | |
| CN116694808A (zh) | 一种鉴定黄瓜品种京研玉甜156纯度的特异snp引物及其方法 | |
| CN113817865A (zh) | 白菜a09染色体上与叶片低温黄化相关的snp分子标记及其应用 | |
| CN111485032A (zh) | 一种鉴定黄瓜雌性系的方法及其使用的snp引物组合 | |
| CN116751890B (zh) | 一种鉴定黄瓜品种线粒体dna指纹和杂交种纯度的方法及其引物组合 | |
| CN114908183B (zh) | 一种鉴定黄瓜黑星病抗性的方法及snp专用引物组和应用 | |
| CN116875726A (zh) | 一种检测黄瓜品种京研109纯度的方法及其专用的snp引物组 | |
| CN112080580B (zh) | 一种用于鉴定青花菜品种‘浙青60’的snp标记 | |
| CN117512175B (zh) | 一种与甘蓝型油菜矮杆基因BnA03.IAA7紧密连锁的SNP分子标记及其应用 | |
| CN117683938B (zh) | 与番茄果实宽度紧密连锁的kasp分子标记及其应用 | |
| CN114686614B (zh) | 用于检测豌豆叶片构型的kasp分子标记及其应用 | |
| CN116732232A (zh) | 一种检测黄瓜品种圣研迷你w2118纯度的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |