CN116693896A - 一种可智能调控交联密度的纳米凝胶的制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可智能调控交联密度的纳米凝胶的制备方法及用途，该纳米凝胶是在紫外交联的聚乙烯醇‑缩醛‑丙烯酸酯衍生物纳米凝胶的基础上，额外加入肿瘤微环境敏感交联剂形成具有双交联结构的纳米凝胶体系。研究表明，纳米颗粒在体内递送不同阶段对颗粒机械特性的需求不同甚至相悖，本设计中的纳米凝胶在肿瘤部位可发生响应使颗粒部分解交联，实现纳米颗粒硬度在体内不同阶段的智能调控，拓展了智能型药物递送体系的范围且为设计多功能药物递送载体提供了有用的参考价值和新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及高分子材料制备方法及用途，特别涉及一种智能响应性双交联结构纳米凝胶的制备方法及用途。
背景技术
纳米凝胶因具有良好的生物相容性，独特的交联网状结构和功能性，被视为十分有潜力的药物递送载体。独特的交联网状结构赋予纳米凝胶高稳定性，有效改善了其药代动力学参数。通过在纳米凝胶结构中引入功能性基团或者链段可以得到配体修饰的纳米凝胶实现肿瘤主动靶向药物递送，刺激响应性纳米凝胶实现肿瘤部位响应性药物释放，可电荷转换纳米凝胶实现增强的肿瘤摄取，尺寸可缩小纳米凝胶实现肿瘤深层渗透以及其他多功能纳米凝胶。此外，还可以通过改变交联密度调节纳米凝胶的机械强度，赋予了纳米凝胶结构和功能的多样性。与此同时，三维网状结构的纳米凝胶因具有高含水量、良好的化学和机械性能以及较大的多价生物偶联比表面积，使其能够稳定聚合物网络中的药物、多肽/蛋白质和DNA/RNA等生物活性化合物。
目前，越来越多的研究者对纳米颗粒的物理性质如尺寸、表面性质和形状等如何影响其生物学作用进行了研究。其中有众多研究阐明了颗粒硬度对体内循环和细胞内吞的影响，例如：Mitragotri(ACS Nano 2015，9，3，3169-3177.)等人制备了硬(3000kPa)纳米凝胶显示出比软(10kPa)纳米凝胶更容易进入J774巨噬细胞，致使软颗粒有着更好的体内长循环效应；PengGuo(Nat.Commun.，2018，9，130.)等人发现乳腺癌细胞MCF-7对于软颗粒(47.7MPa)的摄取要明显多于硬颗粒(233.4MPa)，原因在于软颗粒采用的是膜融合内吞途径进入细胞，能量消耗低，效率高。
事实上，硬度对颗粒在体内运输过程的影响实验存在很多争议，甚至会出现相矛盾的结果。此外，纳米颗粒在体内递送不同阶段对颗粒机械特性的需求不同甚至相悖，例如在Mitragotri等人制备的纳米凝胶体系中，不仅巨噬细胞对硬颗粒有摄取倾向性，4T1肿瘤细胞同样存在这一倾向性，这意味着无法通过选用一定的硬度同时实现载药系统的长循环(软颗粒占优)，以及提升肿瘤细胞摄取颗粒的能力(硬颗粒占优)。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种可智能调节交联密度的纳米水凝胶的制备方法。
本发明的另一目的是提供所述可智能调节交联密度的纳米水凝胶的用途。
技术方案：本发明所述的可智能调控交联密度的纳米凝胶的制备方法：聚乙烯醇-缩醛-丙烯酸酯衍生物(PVA-VEA)经两次化学交联形成具有双交联结构的纳米凝胶。首先，在紫外作用下PVA-VEA双键发生自由基反应交联，形成稳定的初级结构。随后，肿瘤微环境敏感交联剂通过与聚乙烯醇分子之间的羟基键合，得到双交联结构的智能响应型纳米凝胶。
进一步地，所述的聚乙烯醇分子量为5～120kDa。
进一步地，所述聚乙烯醇接枝的乙烯基醚丙烯酸酯选自如下所示结构的化合物：其中，R选自H或CH3。
进一步地，所述单交联结构纳米凝胶中交联基团乙烯基醚丙酸酯基的比例为0.5％～8％。
进一步地，所述肿瘤微环境敏感的交联剂为活性氧敏感交联剂。
进一步地，所述肿瘤微环境敏感的交联剂为活性氧敏感的交联剂和基质金属蛋白酶(MMP)敏感交联剂，分别为如下所示结构的化合物：
进一步地，所述加入肿瘤微环境敏感型交联剂的比例为1％～15％。
制备上述智能响应型纳米凝胶的方法包括以下步骤：
(1)将接有一定比例乙烯基醚丙烯酸酯的聚乙烯醇在低温下溶解于水中，再缓慢分散至丙酮中，加入光引发剂后，在紫外光照的作用下，发生双键的自由基反应，得到初级结构的纳米凝胶。
(2)将(1)步骤中得到的初级结构纳米凝胶重新分散在水中，透析除尽丙酮，再将一定比例的肿瘤微环境敏感交联剂溶液滴至纳米凝胶水溶液中进一步交联，得到智能响应型双重交联纳米凝胶。
所述制得的智能响应型纳米凝胶由于独特的双交联的三维网状结构，使其可以用于多种药物的载体。
自由基反应是聚乙烯醇上连接的乙烯基醚丙烯酸酯所提供丙烯双键，在紫外光和光引发剂的作用下发生碳碳双键之间的自由基反应。
具有双交联结构的智能响应型纳米凝胶是指在紫外交联的聚乙烯醇-缩醛-丙烯酸酯衍生物纳米凝胶的基础上，加入肿瘤微环境敏感交联剂进一步与聚乙烯醇分子的羟基键合，构造出具有两种交联结构的纳米凝胶颗粒。
本发明的智能响应型纳米凝胶，是利用碳碳双键的自由基反应以及肿瘤微环境敏感交联剂的作用下，制备出具有双交联结构的聚乙烯醇-缩醛-丙烯酸酯纳米凝胶。由于颗粒中存在肿瘤微环境敏感键，当到达肿瘤部位时会发生交联键的部分断裂，使颗粒从双交联结构，转变为初级结构，在稳定的碳碳键的作用下，纳米凝胶仍能保持原来形状和大小，最终实现颗粒交联密度的智能响应。
本发明制备了一种可智能调控机械强度的纳米凝胶以实现在体内循环时的高硬度和在肿瘤摄取时的低硬度。该纳米凝胶具有两种交联键结构，在增加颗粒的内部复杂程度的同时不改变其他物理性质，在体内循环中减少了巨噬细胞的摄取；而当处于肿瘤微环境时，纳米凝胶会发生部分交联键的断裂和机械特性的改变从而利于肿瘤细胞的摄取。所述颗粒在体内可实现机械特性的智能调节，同时增强了载体的长循环和细胞摄取的能力，有效解决了一直以来顾此失彼的困境。由于独特的双交联三维网状结构，该智能响应型纳米凝胶可用作抗肿瘤药物及其他药物的载体。该发明对于研究纳米颗粒的药物释放与交联程度/机械特性的关系以及纳米颗粒内部复杂程度对其在体内递送不同阶段的影响具有重要意义。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：
本发明的智能响应型双重交联纳米凝胶在响应环境下发生敏感基团的断裂，从而改变纳米凝胶交联密度和内部复杂程度，而其表面性质和尺寸大小不发生变化，实现其在体内不同阶段机械特性的智能调控，这一特性可用于研究纳米颗粒的药物释放与交联密度的关系，以及纳米课题内部的复杂程度对其在体内的长循环、细胞内化过程以及药代动力学等生物学特性的影响。本发明中第二重交联使用的敏感型交联剂的多样性，也可用于其他疾病的治疗，该双重交联纳米凝胶体系在智能响应性和药物控制释放领域具有很大的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中聚合物聚乙二醇-缩醛-丙烯酸酯(PVA-VEA)的氢核磁谱图；
图2为实施例2中活性氧敏感交联剂TSPBA的氢核磁谱图；
图3为实施例4中可智能调控机械特性的纳米凝胶PVA-VEA-TSPBA的氢核磁谱图；
图4为实施例5中可智能调控机械特性的纳米凝胶PVA-VEA-TSPBA在50μM H2O2条件下的粒径变化结果图；
图5为实施例7所得纳米凝胶对巨噬细胞RAW264.7细胞的细胞毒性结果图。
具体实施方式
实施例1合成不同分子量的PVA-VEA
(1)合成PVA-VEA(5kDa)
在氮气保护下，将分子量为5kDa聚乙烯醇PVA(2.00g，33.8mmol的羟基)溶于50mL的无水二甲亚砜中，加入30％羟基量的乙烯基乙醚丙烯酸酯VEA(1.43mL，10mmol)，并加入催化量的PTSA，室温反应6h。反应结束后，加入300μL三乙胺(TEA)终止反应。反应液经甲醇透析，减压蒸发浓缩，冰乙醚沉淀洗涤三次后可得到产物，其氢核磁图谱如图1所示。
(2)合成PVA-VEA(15kDa)
在氮气保护下，将分子量为15kDa聚乙烯醇PVA(2.00g，33.8mmol的羟基)溶于50mL的无水二甲亚砜中，加入30％羟基量的乙烯基乙醚丙烯酸酯VEA(1.43mL，10mmol)，并加入催化量的PTSA，室温反应6h。反应结束后，加入300μL三乙胺(TEA)终止反应。反应液经甲醇透析，减压蒸发浓缩，冰乙醚沉淀洗涤三次后可得到产物。
(3)合成PVA-VEA(50kDa)
在氮气保护下，将分子量为50kDa聚乙烯醇PVA(2.00g，33.8mmol的羟基)溶于50ml的无水二甲亚砜中，加入30％羟基量的乙烯基乙醚丙烯酸酯VEA(1.43mL，10mmol)，并加入催化量的PTSA，室温反应6h。反应结束后，加入300μL三乙胺(TEA)终止反应。反应液经甲醇透析，减压蒸发浓缩，冰乙醚沉淀洗涤三次后可得到产物，
实施例2合成活性氧敏感交联剂TSPBA
将4-(溴甲基)苯基硼酸(500mg，2.3mmol)分散在10mL丙酮中，50℃下搅拌溶解，加入N1，N1，N3，N3-四甲基丙烷-1，3-二胺(0.1g，0.75mmol)，50℃下搅拌反应12h。反应结束后加至100mL四氢呋喃中沉淀洗涤三次，经真空干燥后得到白色固体TSPBA。氢核磁图谱如图2所示。
实施例3单交联结构纳米凝胶(PVA-VEA)的制备
PVA-VEA单交联结构纳米凝胶采用反向纳米沉淀法制备。在氮气保护条件下，将200μL PVA-VEA(10mg/mL)水溶液，低温下缓慢滴至10mL快速搅拌的丙酮中，之后加入5％聚合物质量的光引发剂I2959，紫外光照三十分钟后，加入4mL高纯水，经旋蒸和透析后得到0.5mg/ml的PVA-VEA纳米凝胶水溶液。动态光散射仪测得单交联纳米凝胶平均粒径为166.67nm，粒径分布指数为0.12，平均Zeta电位为-3.5mV。
实施例4可智能调控机械特性的纳米凝胶(PVA-VEA-TSPBA)的制备
将TSPBA配制为2mg/mL的水溶液，在搅拌条件下，向PVA-VEA纳米凝胶溶液中缓慢加入5％羟基摩尔量的TSPBA溶液，反应1h后，透析除去多余反应物。动态光散射仪测得双交联纳米凝胶平均粒径为156.80nm，粒径分布指数为0.09，平均Zeta电位为-2.55mV。对图3中8ppm左右的峰进行积分，可计算得出二次交联的交联效率达80％以上。双交联凝胶核磁谱图中芳基氢特征峰的出现(图3)，以及敏感交联剂加入前后颗粒粒径与电荷无明显差异(表1)，说明了颗粒的二次交联仅改变了纳米凝胶的内部结构，对其他物理性质几乎没有影响，实现了对机械特性的单一调控。
表1.双交联纳米凝胶的表征a
a纳米凝胶最终浓度为0.5mg/mL。
b平均粒径(nm)和粒径分布在25℃、pH7.4条件下通过动态光散射仪测定。
实施例5智能可调控机械特性的纳米凝胶(PVA-VEA-TSPBA)在H2O2溶液中的响应性实验
向1mL PVA-VEA-TSPBA纳米凝胶溶液中加入10μL(5mmol/L)H2O2溶液，充分搅拌后，静置2h。动态光散射仪检测过氧化氢溶液处理前后溶液中颗粒粒径变化(图4)。过氧化氢溶液处理前，双交联结构凝胶平均粒径为156.80nm，粒径分布为0.09；过氧化氢溶液处理后，粒径结果出现两个粒径峰，小粒径峰对应的是交联键断裂产生小分子的粒径峰，平均粒径为5.76nm，大粒径峰对应的是颗粒在活性氧响应后形成的单交联结构凝胶颗粒的粒径峰，平均粒径为160.12nm，与之前双交联结构粒径变化不大(图4)，说明在H2O2作用下使氧化敏感基团断裂减弱了内部的复杂结构，而未改变纳米凝胶的尺寸大小，进一步证明了该纳米凝胶体系可以实现颗粒机械特性的单一智能调控，这一特性可应用于肿瘤高活性氧条件下纳米颗粒机械特性的智能响应。
实施例6可智能调控机械特性的纳米凝胶(PVA-VEA-TSPBA)对RAW 264.7细胞毒性测试
纳米凝胶(PVA-VEA-TSPBA)在RAW264.7细胞中的毒性通过MTT法测定。首先将100μL细胞的DMEM悬浮液(DMEM培养基中含10％胎牛血清、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素)铺于96孔培养板中，并置于37℃，5％二氧化碳条件下培养12h使单层细胞的覆盖率达到70～80％。然后向每孔中加入10μL不同浓度的纳米凝胶的水溶液。待继续培养24h后，向每孔中加入10μL 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)的PBS溶液(5mg/mL)，并放入培养箱继续培养4h以使MTT与活细胞作用。随后移除含有MTT的培养液，向每孔中加入150μL DMSO以溶解活细胞与MTT产生的紫色甲瓒结晶，并使用酶标仪(SpectraMax i3x)测定每个孔在570nm处的吸收。细胞相对存活率通过与只有空白细胞的对照孔在570nm处的吸收相比得到。实验数据均是平行三组进行的。
细胞存活率(％)＝(OD570样品/OD570对照)×100％
图5为智能可调控机械特性的纳米凝胶(PVA-VEA-TSPBA)对RAW264.7细胞毒性结果图。结果表明：初级结构以及双交联的纳米凝胶在设置浓度下对细胞都几乎没有毒性，说明本设计的纳米凝胶生物相容性好，可用作药用载体的研究。
Claims (9)
1.一种可智能调控交联密度的纳米凝胶的制备方法，其特征在于：由聚乙烯醇-缩醛-丙烯酸酯衍生物(PVA-VEA)进行两次化学交联形成的纳米凝胶，首先，在紫外作用下PVA-VEA的双键发生自由基反应形成稳定的单交联结构纳米凝胶，再额外加入肿瘤微环境敏感的交联剂，进一步反应形成双交联结构的智能响应型纳米凝胶。
2.根据权利要求1所述的可智能调控交联密度的纳米凝胶的制备方法，其特征在于：所述的聚乙烯醇分子量为5～120kDa。
3.根据权利要求1所述的可智能调控交联密度的纳米凝胶的制备方法，其特征在于：所述聚乙烯醇接枝的乙烯基醚丙烯酸酯选自如下所示结构的化合物：
其中，R选自H或CH3。
4.根据权利要求1所述的可智能调控交联密度的纳米凝胶的制备方法，其特征在于：所述单交联结构纳米凝胶中交联基团乙烯基醚丙酸酯基的比例为0.5％～8％。
5.根据权利要求1所述的可智能调控交联密度的纳米凝胶的制备方法，其特征在于：所述肿瘤微环境敏感的交联剂为活性氧敏感交联剂。
6.根据权利要求5所述的可智能调控交联密度的纳米凝胶的制备方法，其特征在于：所述活性氧敏感交联剂为苯硼酸结构和草酸酯结构交联剂或MMP-9酶敏感交联剂分别为如下所示结构的化合物：
7.根据权利要求5所述的可智能调控交联密度的纳米凝胶的制备方法，其特征在于：加入肿瘤微环境响应交联剂的比例为1％～15％。
8.权利要求1-7任一项制备得到的可智能调控交联密度的纳米凝胶在制备药物载体中的应用。
9.权利要求1-7任一项制备得到的可智能调控交联密度的纳米凝胶在制备抗肿瘤药物中的应用。
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