CN116693694A - 一种荧光素酶融合蛋白的突变体及其构建的生物发光型核酸探针与应用 - Google Patents

一种荧光素酶融合蛋白的突变体及其构建的生物发光型核酸探针与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种荧光素酶融合蛋白的突变体及其构建的生物发光型核酸探针与应用。所述突变体与如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比在第144位、第148位、第339位、第353位和第366位中的至少一位发生突变。本发明的荧光素酶融合蛋白突变体能与核酸探针进行高效的生物正交偶联，从而构建生物发光型核酸探针，有效解决了现有核酸荧光探针需要专业设备进行信号激发/接收、高背景和假阳性信号等问题。并且本发明的生物发光型核酸探针具有比率型的性质，不受环境以及底物消耗等因素的影响，为环境监测和疾病诊断等领域提供新方法和新工具。

Description

一种荧光素酶融合蛋白的突变体及其构建的生物发光型核酸 探针与应用
技术领域
本发明属于基因工程与生物检测技术领域，具体涉及一种荧光素酶融合蛋白的突变体及其构建的生物发光型核酸探针与应用。
背景技术
深海虾细脚刺虾酶(Nano Luc luciferase,NLuc)是生物体内一种催化咪唑并吡嗪酮类化合物Furimazine氧化发光的一种荧光素酶，具有分子量小，发光效率高，稳定性好等特点。近年来，NLuc及其融合蛋白在科学研究和产业中得到了广泛的应用。
核酸探针(Nucleic Acid Sensor,NAS)技术是利用核苷酸碱基互补的原理，用特异的基因探针即识别特异靶标的有标记的一段单链DNA(或RNA)分子。其靶标范围非常广，可用于金属离子、小分子、核酸分子、蛋白质、细胞甚至生物组织的检测。近年来，核酸探针在环境监测(重金属离子)、疾病检测、生物成像等领域发挥了重要作用。但是，目前的核酸探针普遍利用荧光作为信号输出策略，不仅需要专用设备进行信号激发/接收，而且复杂生物样品中的自发荧光将引起强烈的假阳性信号，不利于其分析检测应用。生物发光利用荧光素酶与底物的作用产生自发光，与荧光相比，生物发光不需要外部激发，可以有效解决核酸探针所面临的光漂白、背景信号、假阳性信号以及需要专业设备进行检测的缺点。因此，发展生物发光型核酸探针，用于生物样品定量检测是十分有必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种荧光素酶融合蛋白(circular permutated Halo-tag和circular permutated luciferase的融合蛋白，简写为cpHNLuc)的突变体及其构建的生物发光型核酸探针与应用，从而解决现有核酸探针存在的需要设备进行信号激发/接收、高背景和假阳性信号的问题。本发明通过对荧光素酶融合蛋白中的部分氨基酸位点进行突变，得到新型的荧光素酶融合蛋白突变体，再将该蛋白与核酸探针进行高效的生物正交偶联，作为通用性策略用于生物发光型核酸探针的构建。本发明构建的生物发光型核酸探针的响应信号变化明显、稳定，可广泛用于生物传感、分子诊疗等领域。
为实现上述技术目的，本发明提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种荧光素酶融合蛋白的突变体，所述突变体与如SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列相比在第144位、第148位、第339位、第353位和第366位中的至少一位发生突变。
所述第144位的突变优选为E144K；所述第148位的突变优选为E148K；所述第339位的突变优选为D339K；所述第353位的突变优选为E353K；所述第366位的突变优选为E366K。
本发明中，所述E144K即第144位氨基酸由E突变为K；所述E148K即第148位氨基酸由E突变为K；所述D339K即第339位氨基酸由D突变为K；所述E353K即第353位氨基酸由E突变为K；所述E366K即第366位氨基酸由E突变为K。
较佳地，所述突变体包含E144K、E148K中任一个，或包含E144K、E148K、D339K中的任意两个。
更佳的，所述突变体同时包含E144K、E148K和D339K，或同时包含E144K、E148K、D339K和E353K，或同时包含E144K、E148K、D339K、E353K和E366K。
本发明还提供一种分离的核酸，其编码如本发明第一方面所述的突变体；一些实施例中，所述核酸的碱基序列如SEQ ID NO:3～10任一个所示。
本发明还提供一种重组表达载体，其包含本发明所述的分离核酸。一些实施例中，所述重组表达载体的骨架为pET28a质粒。
本发明还提供一种转化体，其含有本发明所述的分离的核酸，或本发明所述的重组表达载体。一些实施例中，所述转化体构建时使用的宿主细胞为大肠杆菌。一些具体实施例中，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。
本发明还提供一种制备本发明所述突变体的方法，其包括培养本发明所述的转化体得发酵产物，并从发酵产物中获得所述突变体。
第二方面，本发明提供一种生物发光型核酸探针的制备方法，包括如下步骤：
S1.对脱氧核酶(DNAzyme)进行修饰，得到修饰后的脱氧核酶；
S2.将步骤S1修饰后的脱氧核酶与如本发明第一方面所述突变体进行正交偶联，得到偶联产物；
S3.将步骤S2偶联产物与脱氧核酶底物链进行杂交，得到所述生物发光型核酸探针。
在一些实施例中，所述步骤S1中，脱氧核酶具有金属离子特异性响应性能。
在一些实施例中，所述步骤S1中，脱氧核酶的序列(5’-3’)为：CACGT CCATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGTAGT-NH2，如SEQ ID NO：21所示。
在一些实施例中，所述步骤S1中，用HaloTag配体分子对脱氧核酶进行修饰。
在一些实施例中，所述HaloTag配体分子的结构如下式所示:
其中，n＝2或4，优选n＝4。
在一些实施例中，所述HaloTag配体分子通过商业途径购买得到或通过现有技术方法合成。
在一些具体实施例中，所述步骤S1中，用HaloTag配体分子对脱氧核酶进行修饰的具体过程为：将HaloTag配体分子与脱氧核酶溶于硼酸缓冲溶液中，于25～40℃，160～200rpm震荡过夜反应，得到修饰后的脱氧核酶。
在一些具体实施例中，所述硼酸缓冲溶液含有50mM硼酸钠，pH为8.5。
在一些实施例中，所述步骤S2中，修饰后的脱氧核酶与突变体进行正交偶联的具体过程为：将修饰后的脱氧核酶与突变体按照(1～3):1μM浓度比例在Tris-NaCl缓冲溶液中混合，室温孵育1～2h，得到偶联产物。
在一些实施例中，所述Tris-NaCl缓冲溶液含有50mM Tris与100mM NaCl，pH为7.4。
在一些实施例中，所述步骤S3中，脱氧核酶底物链序列(5’-3’)为：ACTCACTATrAGGAAGAGATGGACGTG(其中rA为腺苷)，如SEQ ID NO：22所示。
在一些实施例中，所述步骤S3中，脱氧核酶底物链5’端带有荧光团修饰，荧光团可选地为FITC(荧光素)，Cy3，TAMRA(二甲基罗丹明),优选为Cy3。
在一些实施例中，所述步骤S3中，偶联产物与脱氧核酶底物链进行杂交的具体实施过程为：将偶联产物用所述Tris-NaCl缓冲溶液稀释后，加入脱氧核酶底物链，室温孵育0.5～1h，制得所述生物发光型核酸探针。
第三方面，本发明提供一种如本发明第二方面所述制备方法制得的生物发光型核酸探针。
第四方面，本发明提供一种如本发明第三方面所述生物发光型核酸探针在构建生物发光核酸探针检测试剂盒中的应用。
第五方面，本发明提供一种如本发明第三方面所述生物发光型核酸探针在金属离子即时检测中的应用。
在一些实施例中，所述金属离子为锌离子。
在一些具体实施例中，所述生物发光型核酸探针在锌离子即时检测中的应用，包括如下步骤：将待测样品与所述生物发光型核酸探针在室温下反应，接着向反应溶液中加入Furimazine发光底物，随后在暗室中采用智能手机进行拍照，若样品中含有锌离子，则发光呈蓝色，若不含锌离子则显示相应荧光团的发光。
本发明所述生物发光型核酸探针用于即时检测锌离子的原理，如图2所示。具体为：所述生物发光型核酸探针在没有锌离子的情况下，其脱氧核酶底物链上的荧光团靠近cpHNLuc突变体，向反应溶液中加入Furimazine发光底物后，cpHNLuc突变体能催化Furimazine发光底物氧化，发射出波长在400～500nm的蓝色生物发光，此蓝色生物发光能与脱氧核酶底物链上的荧光团进行生物发光能量共振转移(BRET)，从而使检测溶液产生相应荧光团的发光，即没有金属离子的情况下，探针显示荧光团的发光。当存在锌离子时，脱氧核酶链与锌离子结合，随后对底物链上的rA(腺苷)位点进行切割，将底物链切成两个片段，由于含有荧光团的底物链片段此时与脱氧核酶链的杂交不稳定，从而解离并远离cpHNLuc突变体，从而降低了突变体与荧光团之间的生物发光能量共振转移效果，使溶液产生蓝色的生物发光。由于脱氧核酶对底物链的切割具有锌离子浓度依赖性，因此能以此进行锌离子检测。
本发明的有益效果：
1)本发明提供的cpHNLuc融合蛋白突变体，具有正交偶联核酸探针的能力，适用于构建生物发光核酸探针。本发明构建的生物发光核酸探针，有效解决了现有核酸荧光探针需要专业设备进行信号激发/接收、高背景和假阳性信号等问题，提升了现有核酸探针在生物检测中的性能。本发明构建的生物发光核酸探针，可用于构建生物发光核酸探针检测试剂盒，为环境监测和疾病诊断等领域提供新方法和新工具。
2)本发明的生物发光型核酸探针具有比率型的性质，不受环境以及底物消耗等因素的影响，并且本发明的生物发光型核酸探针无需设备激发，其发光信号能够通过相机或者手机拍照获取，适用于目标物即时(POCT)检测。
附图说明
图1为DNAzyme序列与HaloTag配体分子共价偶联产物的质谱图。
图2为本发明生物发光型核酸探针用于即时检测锌离子的原理图。
图3为cpHNLuc融合蛋白的质粒图谱。
图4为cpHNLuc融合蛋白突变体纯化后的SDS-PAGE图。
图5为cpHNLuc融合蛋白突变体与DNAzyme偶联后的SDS-PAGE图。
图6为cpHNLuc融合蛋白突变体构建的DNAzyme探针的生物发光能量转移效率图。
图7中(a)为实施例6中生物发光DNAzyme探针对不同锌离子响应的发射光谱图；(b)为实施例6中生物发光DNAzyme探针对不同锌离子响应时450nm发射峰与565nm发射峰的强度比值；(c)为实施例6中生物发光DNAzyme探针对不同锌离子响应的线性区间；(d)为实施例6中生物发光DNAzyme探针对不同离子的选择性。
图8为实施例7中生物发光DNAzyme探针对血液中锌离子响应的手机拍摄图片。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅是为了解释本发明，并非为了限制本发明。实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
在本发明的一些具体实施过程中：本发明采用的cpHNLuc融合蛋白的基因由上海生工生物工程有限公司合成。本发明采用吉布森自组装(Gibson Assembly)将cpHNLuc碱基序列构建入原核表达载体pET28a中，得到重组质粒，命名为pET28a-cpHNLuc，图谱如图3所示。将该质粒作为定向进化的模板，运用定点突变的方法，通过单点或组合突变得到cpHNLuc融合蛋白的突变体库。将此突变体库转化入BL21(DE3)感受态细胞中，并挑取单克隆进行突变体的表达与纯化。cpHNLuc融合蛋白突变体能与修饰了HaloTag配体的核酸探针进行正交偶联，从而构建生物发光核酸探针。在加入催化底物Furimazine后，突变体蛋白产生的生物发光能与核酸探针上的荧光团产生能量转移信号，该能量转移信号与目标物浓度相关，以此实现目标物的检测。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1cpHNLuc融合蛋白突变体库的构建
以pET28a-cpHNLuc为模板，其中cpHNLuc的碱基序列为如SEQ ID NO：1所示，对cpHNLuc融合蛋白的E144、E148、D339、E353、E366五个位点进行定点突变或组合突变，包括但不限于以下位点/组合：E144K、E148K、D339K、E353K、E366K。针对不同的突变位点设计对应的引物，具体为：
E144K对应的引物序列如SEQ ID NO：11-12所示；E148K对应的引物序列如SEQ IDNO：13-14所示；D339K对应的引物序列如SEQ ID NO：15-16所示；E353K对应的引物序列如SEQ ID NO：17-18所示；E366K对应的引物序列如SEQ ID NO：19-20所示。
定点突变体的制备使用PrimeSTAR Max Premix，并按照其说明书进行PCR反应体系的制备以及PCR反应，以E144K突变体的制备为例，PCR反应体系以及PCR反应条件分别见表1、表2所示。
表1 PCR反应体系
表2 PCR反应条件
反应完成后向体系中加入0.5μL Dpn I酶消化掉模板。转化入DH5α中,涂布于含终浓度为50μg/mL卡那霉素抗性的平板，次日从平板上挑取单克隆，37℃过夜扩大培养后抽提质粒。测序结果证明序列已突变。
实施例2 cpHNLuc融合蛋白突变体的表达和纯化
将质粒转入BL21(DE3)感受态细胞中，涂平板，37℃过夜培养，从平板上挑取单菌落，37℃过夜培养，后转接新培养基，1:100稀释，培养至OD值为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度1mM，16℃过夜诱导蛋白表达。
采用His标签蛋白纯化试剂盒(购自碧云天生物技术有限公司，产品编号P2226)进行cpHNLuc融合蛋白突变体纯化。收集50m1菌体，加入3ml非变性裂解液(产品编号P2226-2)，超声(10s on 10s off，50％功率)破碎8min，4℃12000rpm离心30min分离上清(细胞裂解液)和沉淀。在亲和层析柱空柱(产品编号P2226-6)中加入1mL BeyoGoldTMHis-tagPurification Resin填料，用3ml结合缓冲液冲洗平衡填料。然后加入3ml过滤后的细胞裂解液。用非变性洗涤液(产品编号P2226-3)冲洗6次(1ml/次)，然后用非变性洗脱液(产品编号P2226-4)洗脱蛋白4～5次(0.5mL/次)，收集洗脱后的蛋白。
将洗脱后的蛋白用透析缓冲液(25mM Tris，pH 8.0，250mM NaC1)4℃过夜透析，用BCA蛋白定量试剂盒(购自碧云天生物技术有限公司，产品编号P0010S)测定蛋白质浓度，12％SDS-PAGE检测洗脱得到的蛋白(如图4所示)。图4中，1代表cpHNLuc融合蛋白原始型；2代表E144K突变体；3代表E148K突变体；4代表D339K突变体；5代表E148K/D339K突变体；6代表E144K/D339K突变体；7代表E144K/E148K突变体；8代表E144K/E148K/D339K突变体；9代表E144K/E148K/D339K/E353K突变体；10代表E144K/E148K/D339K/E353K/E366K突变体。所有突变体均被成功表达，其纯度均高于95％。
实施例3DNAzyme序列上HaloTag配体的修饰和纯化
本实施例采用的HaloTag配体分子通过现有技术方法合成，其结构如下：
分别取1mg HaloTag配体分子与14OD氨基修饰的DNAzyme(购自上海生工生物工程有限公司，序列如SEQ ID NO：21所示)溶于200μL硼酸缓冲溶液中(50mM sodium borate,pH8.5)，于37℃摇床中180rpm震荡过夜反应。反应液用3KDa超滤管( Ultra，购自Sigma-Aldrich，产品编号：UFC5003)超滤去除过量的HaloTag配体分子。在200μL反应液中加入300μL超纯水使总体积达到500μL，随后加入超滤管内管中，室温8500rpm离心5min。丢弃外管中的滤液，然后将超滤管内管中的反应液补充至500μL并且再次离心，重复洗涤五次，得到DNAzyme与HaloTag配体的交联产物。测定样品在260nm处的紫外吸收，查询该序列的摩尔消光系数为398000L/(mole·cm)，根据朗伯比尔定律计算产物浓度为19.25μM。所得产物采用质谱表征，图谱如图1所示，计算分子量为13415.48，检测分子量为13411.2，结果证明DNAzyme与HaloTag配体成功交联。
实施例4生物发光DNAzyme探针的制备
取实施例3制得的DNAzyme与HaloTag配体交联产物分别与实施例2中编号为1～10的蛋白按照1：1μM的浓度比例在缓冲溶液(50mM Tris,100mM NaCl，pH 7.4)中混合，室温孵育2h，制得不同cpHNLuc-DNAzyme偶联物。期间每隔10min取样，采用12％ SDS-PAGE检测正交偶联效率，电泳所用偶联物的上样体积为10μM，电泳时间为30min，电压为160V。电泳结束后使用考马斯亮蓝快速染液对蛋白质染色1h，然后用超纯水脱色2h，最后用凝胶成像仪进行分析。结果见图5以及表3所示。
分别取不同cpHNLuc-DNAzyme偶联物，用缓冲溶液(50mM Tris,150mM NaCl，pH7.4)稀释到20nM，加入30nM含Cy3修饰的底物核酸序列(序列如SEQ ID NO：22所示)，室温孵育1h，制得不同生物发光DNAzyme探针。
表3cpHNLuc融合蛋白原始型及其突变体的正交偶联效率
实施例5生物发光DNAzyme探针的性能验证
对实施例4制得的生物发光DNAzyme探针(由所有突变体构建的探针)的性能进行考察：
将不同生物发光DNAzyme探针分别稀释于100μL反应缓冲溶液(50mM Tris,150mMNaCl，pH 7.4)，得到浓度为20nM的工作溶液。向工作溶液中加入1μL浓度为1μg/mL的Furimazine发光底物，随后采用荧光光谱仪(Edinburgh Instruments Ltd，FS5，UK)测定生物发光的发射光谱，关闭激发光源，激发狭缝宽度为0nm，发射狭缝宽度为10nm，发射信号扫描范围从400nm到700nm。同时采用手机(HUAWEI Mate 40pro)对各个样品的生物发光进行拍照，IOS 1600，曝光时间4s。结果如图6所示，由含有E144K/E148K、E144K/E148K/D339K、E144K/E148K/D339K/E353K、E144K/E148K/D339K/E353K/E366K的突变体分别构建的生物发光DNAzyme探针具有较佳的生物发光能量转移效果，其中含有E144K/E148K/D339K的突变体构建的生物发光DNAzyme探针的效果最佳，能量转移比率高达约3倍(565nm/450nm)。
实施例6生物发光DNAzyme探针用于金属离子检测
将实施例4中用E144K/E148K/D339K突变体构建的生物发光DNAzyme探针检测金属离子：
分别将一系列100μL反应缓冲溶液(50mM Tris,150mM NaCl，pH 7.4)中包含20nM生物发光DNAzyme探针和不同浓度的锌离子(0.2、0.4、0.5、1、2、3、5、10μM)，室温孵育1h后，接着向反应溶液中加入1μL浓度为1μg/mL的Furimazine发光底物，随后采用荧光光谱仪测定生物发光的发射光谱，关闭激发光源，激发狭缝宽度为0nm，发射狭缝宽度为10nm，发射信号扫描范围从400nm到700nm。结果如图7中(a)所示。随着锌离子的浓度由0.2μM升高到10μM，450nm处的发光强度升高，而565nm处的发光强度降低。其比值R450 nm/565nm由0.27升高到1.4，结果如图7中(b)所示。探针在0.6～4.0μM之间表现出良好的线性关系(R2＝0.995)，经计算其对锌离子的检测限为202nM，结果如图7中(c)所示。
在选择性实验中，以Na+，K+，Mg2+，Ba2+，Ni2+，Ca2+，Mn2+，Co2+为对照，分别考察生物发光DNAzyme探针对100μM的这些离子的响应情况。结果如图7中(d)所示，仅有Zn2+能够引起明显的发光信号变化，证明本探针对锌离子具有良好的选择性。
实施例7生物发光DNAzyme探针用于血液中锌离子检测
将实施例4中用E144K/E148K/D339K突变体构建的生物发光DNAzyme探针检测血液中的锌离子：
通过指尖采血方式获得20μL血液样本，随后经缓冲溶液(50mM Tris,150mM NaCl，pH 7.4)稀释50倍。向两个离心管中分别加入100μL稀释后的血液和40nM生物发光DNAzyme探针，其中一个加入100μM锌离子，另一个不加，室温下反应1h。分别向反应溶液中加入1μL浓度为1μg/mL的Furimazine发光底物，随后在暗室中采用智能手机(华为Mate 40Pro)进行拍照，所用ISO为1600，曝光时间为4s。结果如图8所示，含有锌离子的样品发光呈蓝色，而未加锌离子的样品发光呈红色，证明本探针可以用于血液中金属离子的检测。

Claims (10)

1.一种荧光素酶融合蛋白的突变体，其特征在于，所述突变体与如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比在第144位、第148位、第339位、第353位和第366位中的至少一位发生突变；所述第144位的突变为E144K；所述第148位的突变为E148K；所述第339位的突变为D339K；所述第353位的突变为E353K；所述第366位的突变为E366K。
2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体包含以下1)-8)中的任一种：
1)E144K；
2)E148K；
3)E144K和E148K；
4)E144K和D339K；
5)E148K和D339K；
6)E144K、E148K和D339K；
7)E144K、E148K、D339K和E353K；
8)E144K、E148K、D339K、E353K和E366K。
3.一种分离的核酸，其编码如权利要求1或2所述的突变体；所述核酸的碱基序列如SEQID NO:3～10任一个所示。
4.一种生物发光型核酸探针的制备方法，包括如下步骤：
S1.对脱氧核酶进行修饰，得到修饰后的脱氧核酶；
S2.将步骤S1修饰后的脱氧核酶与如权利要求1或2所述突变体进行正交偶联，得到偶联产物；
S3.将步骤S2偶联产物与脱氧核酶底物链进行杂交，得到所述生物发光型核酸探针。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，脱氧核酶的序列(5’-3’)为：CACGTCCATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGTAGT-NH2，如SEQ ID NO：21所示；所述HaloTag配体分子的结构如下式所示：
其中，n＝2或4；
用所述HaloTag配体分子对脱氧核酶进行修饰的具体过程为：将HaloTag配体分子与脱氧核酶溶于硼酸缓冲溶液中，于25～40℃，160～200rpm震荡过夜反应，得到修饰后的脱氧核酶；所述硼酸缓冲溶液含有50mM硼酸钠，pH为8.5。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，修饰后的脱氧核酶与突变体进行正交偶联的具体过程为：将修饰后的脱氧核酶与突变体按照(1～3)：1μM的浓度比例在Tris-NaCl缓冲溶液中混合，室温孵育1～2h，得到偶联产物；所述Tris-NaCl缓冲溶液含有50mM Tris与100mM NaCl，pH为7.4。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，脱氧核酶底物链序列(5’-3’)为：ACTCACTATrAGGAAGAGATGGACGTG，如SEQ ID NO：22所示；所述脱氧核酶底物链5’端带有荧光团修饰，荧光团为FITC、Cy3、TAMRA中的一种；偶联产物与脱氧核酶底物链进行杂交的具体实施过程为：将偶联产物用Tris-NaCl缓冲溶液稀释后，加入脱氧核酶底物链，室温孵育0.5～1h，制得所述生物发光型核酸探针；所述Tris-NaCl缓冲溶液含有50mM Tris与100mM NaCl，pH为7.4。
8.一种如权利要求4所述的制备方法制得的生物发光型核酸探针。
9.一种如权利要求8所述的生物发光型核酸探针在构建生物发光核酸探针检测试剂盒中的应用。
10.一种如权利要求8所述的生物发光型核酸探针在锌离子即时检测中的应用，包括如下步骤：将待测样品与所述生物发光型核酸探针在室温下反应后，接着向反应溶液中加入Furimazine发光底物，随后在暗室中采用智能手机进行拍照，若样品中含有锌离子，则发光呈蓝色，若不含锌离子则显示相应荧光团的发光。
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