CN116693662A - 一种提高抗体酸性异构体比例的方法 - Google Patents

一种提高抗体酸性异构体比例的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116693662A
CN116693662A CN202310709547.8A CN202310709547A CN116693662A CN 116693662 A CN116693662 A CN 116693662A CN 202310709547 A CN202310709547 A CN 202310709547A CN 116693662 A CN116693662 A CN 116693662A
Authority
CN
China
Prior art keywords
medium
culture
fermentation
cysteine
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310709547.8A
Other languages
English (en)
Inventor
刘学明
蒋仁材
曹春来
黄润佳
韦梦娟
唐鹏
刘唯
贝海康
李靖
陈宗梦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhuhai United Biopharmaceutical Co ltd
United Biotechnology Zhuhai Hengqin Co ltd
Original Assignee
Zhuhai United Biopharmaceutical Co ltd
United Biotechnology Zhuhai Hengqin Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhuhai United Biopharmaceutical Co ltd, United Biotechnology Zhuhai Hengqin Co ltd filed Critical Zhuhai United Biopharmaceutical Co ltd
Priority to CN202310709547.8A priority Critical patent/CN116693662A/zh
Publication of CN116693662A publication Critical patent/CN116693662A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种提高抗体酸性异构体比例的方法，所述方法包括：将可分泌表达抗体的真核细胞接种于含铁元素和半胱氨酸的发酵基础培养基中，其中所述培养基中铁元素的浓度为150～200mg/L，半胱氨酸浓度为1.5～2mM。本发明提供了一种适用于工业化大规模生产、可显著提高抗体酸性异构体比例的方法。

Description

一种提高抗体酸性异构体比例的方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种提高抗体酸性异构体比例的方法。
背景技术
类似其他功能性蛋白质，抗体蛋白具有诸如末端氨基酸残基的改变、糖基化、脱酰氨基、异构化、氧化、分裂以及聚合等许多翻译后修饰，而几乎所有的这些修饰都会引起单抗表面电荷集团数目或构象的改变，导致抗体蛋白的电荷异质性。基于抗体蛋白的电荷差异，采用离子交换色谱法可以分离出主峰、酸峰和碱峰，也称为主要成分、酸性异构体和碱性异构体。这些电荷变异体可以通过改变抗体蛋白与靶蛋白或细胞膜靶点的结合活性，影响了抗体蛋白分子的组织穿透、组织分布、生物学活性、药代动力学、免疫原性以及结构稳定性等特性，从而影响药物的有效性、安全性和保质期，因此有必要在抗体药物生产过程中，对电荷异质性进行调控。
抗体蛋白的酸性异构体一般包括脱酰胺化、二硫键错配、三硫键形成、糖化以及糖基化中的唾液酸和高甘露糖等。对于电荷异质性的调控，有从基因组学细胞分子层面进行调控的，但更多选择调整容易操作的细胞培养工艺参数，如温度控制、pH控制、葡萄糖控制等。改变细胞培养基成分也是其中一种手段，但这需要明确培养基的组分、充分了解电荷体之间的差异属性，因此，相比调整工艺而言，其较难预测和实施。
CN108823267A中公开了在细胞培养过程中添加调节剂半胱氨酸，从而获得提高酸性峰的效果，但该方法的不足在于酸性峰仅从初始的20％提高到23％，仅提高了3％，而且在整个发酵培养过程中，半胱氨酸需要每两天添加一次，添加频率较多，每次加入后还需调节pH，增加了工艺流程。
因此，亟需开发一种适合工业化大规模细胞培养、可显著提高抗体酸性异构体比例的方法。
发明内容
针对以上技术现状，本发明提供了一种适用于工业化大规模生产、可显著提高抗体酸性异构体比例的方法。
具体发明如下：
本发明提供了一种提高抗体酸性异构体比例的方法，其特征在于，所述方法包括：将可分泌表达抗体的真核细胞接种于含150～200mg/L铁元素和1.5～2mM半胱氨酸的发酵基础培养基中，在发酵培养过程中添加半胱氨酸继续培养，所述半胱氨酸以在培养基中提供0.375mM/天～0.5mM/天的量添加。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述铁元素来源于有机铁或无机铁，优选氯化铁、硫酸铁、柠檬酸铁、柠檬酸铁铵和葡萄糖酸铁，进一步优选柠檬酸铁铵。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述含铁元素的发酵基础培养基中，铁元素的浓度为150mg/L或200mg/L。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述发酵基础培养基中半胱氨酸的浓度为1.5mM或2mM，在发酵培养过程中，所述半胱氨酸以在培养基中提供0.375mM/天或0.5mM/天的量添加。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述半胱氨酸的添加方式为每四天一次，每次以在培养基中提供1.5mM或2mM的量添加。本发明中半胱氨酸的添加方式包括但不限于每四天一次。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述发酵基础培养基选自CD063或VegaCHO，优选CD063。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述发酵基础培养基中进一步含有4～8mM、优选6mM L-Gln，抗结团剂和0.5～1％、优选1％ PF-68；所述抗结团剂选自0.1～0.3g/L葡聚糖硫酸钠或1:100～1:1000V/V Anti-Clumping Agent，优选0.2g/L葡聚糖硫酸钠或1:500V/V /> Anti-Clumping Agent。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述可分泌表达抗体的真核细胞是CHO细胞，所述CHO细胞包括CHO-S、CHO-K1、DG44或NSO细胞，优选可分泌表达Dupilumab的CHO-S细胞。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括：在发酵培养过程中添加补料培养基，所述补料培养基为VegaCHO Feed和AFS01。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述补料培养基VegaCHO Feed/AFS01的添加方式为：细胞发酵培养3天后，按照每天2.0％/0.2％～2.5％/0.25％、优选2％/0.2％V/V(体积比)添加。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法包括：
将可分泌表达Dupilumab的CHO-S细胞接种于含150mg/L或200mg/L柠檬酸铁铵和1.5mM或2mM半胱氨酸的发酵基础培养基中，在发酵培养过程中添加半胱氨酸和补料培养基继续培养，所述半胱氨酸以在培养基中提供0.375mM/天或0.5mM/天的量添加；及
细胞发酵培养3天后，补料培养基VegaCHO Feed/AFS01按照每天2.0％/0.2％～2.5％/0.25％、优选2％/0.2％V/V(体积比)添加。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述发酵基础培养基为CD063，进一步含有6mML-Gln、0.2g/L葡聚糖硫酸钠或1:500V/V Anti-Clumping Agent、1％ PF-68。
本发明方法中，作为实施方案之一，可分泌表达抗体的CHO细胞的发酵培养周期为13-16天。
技术效果：
1、本发明方法对提高抗体酸性异构体比例的效果显著，采用CEX检测时，Dupilumab抗体中酸性异构体的比例能够达到22.39％-25.30％；
2、本发明方法中添加的物质化学结构简单，来源易得，无毒无害，基本不影响细胞生长和抗体蛋白的表达；
3、本发明方法的添加策略简易，只需在发酵基础培养基中添加柠檬酸铁铵和半胱氨酸，在发酵培养过程中每四天补加一次半胱氨酸，柠檬酸铁铵和半胱氨酸母液的pH接近中性，可直接添加，不需要调pH，从而工艺放大难度小。
附图说明
图1：实施例1中的细胞密度生长曲线；
图2：实施例1中的细胞活率曲线；
图3：实施例1中的抗体的比生成速率；
图4：实施例1中的CEX检测图谱；
图5：实施例2中的细胞密度生长曲线；
图6：实施例2中的细胞活率曲线；
图7：实施例2中的抗体的比生成速率；
图8：实施例2中的CEX检测图谱；
图9：实施例3中的细胞密度生长曲线；
图10：实施例3中的细胞活率曲线；
图11：实施例3中的抗体的比生成速率；
图12：实施例3中的CEX检测图谱；
图13：实施例4中的细胞密度生长曲线；
图14：实施例4中的细胞活率曲线；
图15：实施例4中的抗体的比生成速率；
图16：实施例4中的CEX检测图谱。
具体实施方式
以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。
以下实施例所采用的仪器、试剂信息具体如下表所示：
序号 名称 厂家
1 CD02培养基 QuaCell Biotechnology公司
2 L-Gln Sigma公司
3 葡聚糖硫酸钠 WAKO和光纯药
4 CD063培养基 上海奥浦迈公司
5 PF-68 Gibco公司
6 VegaCHO Feed 上海奥浦迈公司
7 AFS01 上海奥浦迈公司
8 葡萄糖 Sigma公司
9 柠檬酸铁铵 Aladdin公司
10 半胱氨酸 Sigma公司
11 活率分析仪 Beckman
12 Cedex Bio生化分析仪 Roche
13 ProteinA磁珠 金斯瑞公司
14 甘氨酸 Sigma公司
15 Dupilumab单抗 赛诺菲公司
实施例1：
1.1、细胞种子复苏：从液氮罐中取出一支冻存的CHO-S细胞种子，根据FreedomTMCHO-STMKit USER GUIDE(https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/freedom_cho_s_kit_man.pdf)获得重组的可分泌表达Dupilumab单抗的CHO-S细胞，用37℃预热的复苏培养基CD02培养基重悬，同时培养体系中含有6mM L-Gln(左旋谷氨酰胺)以及0.2g/L的抗结团剂葡聚糖硫酸钠，于125ml摇瓶中培养，培养总体积为25ml，最后置于5％ CO2，37℃，150rpm振荡摇床上培养；
1.2、细胞传代扩增：种子细胞培养3～4天后，随后细胞按0.5×106个/ml的密度接种于提前预热37℃的发酵基础培养基CD063培养基中，同时培养体系中含有6mM L-Gln以及0.2g/L的抗结团剂葡聚糖硫酸钠，培养总体积为60ml，最后置于5％ CO2，37℃，150rpm振荡摇床上避光培养；如此再培养一代；
1.3、细胞发酵培养：种子细胞培养3～4天后，随后细胞按0.7×106个/ml的密度接种于提前预热37℃的发酵基础培养基CD063培养基中，同时初始发酵培养体系中含有6mML-Gln，0.2g/L抗结团剂葡聚糖硫酸钠，1％PF-68以及不同浓度的柠檬酸铁铵和半胱氨酸，在发酵培养的第6天，半胱氨酸以提供与初始培养基浓度相同的量添加，具体添加浓度见下表1，培养总体积均为60ml，最后置于5％ CO2，37℃，150rpm振荡摇床上避光培养；
表1
摇瓶编号 柠檬酸铁铵(mg/L) 半胱氨酸(mM)
SF01 15 0
SF02 30 0
SF03 60 0
SF04 0 0
SF05 0 0.4
SF06 0 0.8
SF07 30 0.4
1.4、补料分批培养：细胞发酵培养3天后，细胞密度一般为3～5×106个/ml，此时开始每天从发酵摇瓶中取500μL的发酵样品，检测细胞培养过程中的细胞密度(106个/ml)，细胞活率(％)，细胞直径(μm)，葡萄糖浓度(mg/L)，乳酸浓度(mg/L)，铵根浓度(mM)，L-Gln浓度(mM)，渗透压以及目标产物Titer(mg/L)；并按照每天2％/0.2％V/V加入两种发酵补料培养基VegaCHO Feed和AFS01，补糖按照低于4g/L补足到4g/L，降温后按照低于6g/L补足到6g/L的原则进行葡萄糖添加，补料操作延续到第13天；当细胞密度达到12～16×106个/ml，此时将细胞转移到5％CO2，33℃，150rpm振荡摇床上避光培养；
1.5、培养结束并收获：细胞发酵培养第14天，从培养摇床中取出，依次将所有培养液转移至50ml离心管中，并检测最终的pH以及步骤1.4中的检测项目，随后样品按照第一次：1500rpm，15min；第二次：8000rpm，15min进行两次离心，并保留上清于干净的50ml离心管中；
其中细胞密度和活率采用Vi-CELL XR细胞计数及活率分析仪进行测定，单克隆抗体浓度采用光计免疫比浊法进行测定，检测仪器为Cedex Bio生化分析仪，检测结果如图1-3所示，根据图1的细胞密度生长曲线图，15mg/L、30mg/L、60mg/L柠檬酸铁铵和0.4mM Cys的细胞密度生长趋势和最大细胞密度与对照组相似，影响相对很小，0.8mM Cys和30mg/L柠檬酸铁铵+0.4mM Cys对于细胞的生长具有一定的影响，具体表现在发酵后期细胞密度下降相对较快；图2细胞活率曲线表明，15mg/L、30mg/L、60mg/L柠檬酸铁铵和0.4mM Cys的细胞活率与对照组相当，最终活率为80％左右，0.8mM Cys和30mg/L柠檬酸铁铵+0.4mM Cys对细胞后期活率的维持有轻微影响，最终活率为75％左右；图3抗体的比生成速率表明，各浓度条件下不影响单个细胞表达抗体的能力，qmAb均与对照组相当或不低于对照组。
1.6、ProteinA磁珠纯化：将上述离心好的5ml样品上清，加入到3ml ProteinA磁珠悬液的15ml离心管中，25℃，90rpm摇床中孵育2～3h，并最终用3ml pH 3.4的甘氨酸溶液洗脱，用1M Tris溶液将得到的洗脱液pH调整至5～7，分装后保存于-80℃冰箱中；
1.7、质量属性检测：对目标产品进行CEX(阳离子交换色谱)检测；
对照样品上样制备：取3μl 150mg/L的Dupilumab原研注射液(Lot#9L816H)加入至222μl的流动相A中，混匀得到2mg/ml的对照样品上样溶液。
供试品上样制备：将步骤1.6所得纯化后的供试品溶液分别用0.22μm的滤膜过滤，过滤后按40μg的上样量进样。
检测体系：
色谱柱：QDK-72BioPro IEX SF 100*4.6mm I.D.5μm
流动相：
A相：30mM MES(4-吗啉乙磺酸)溶液(pH6.0)+5％ ACN(乙腈)溶液
B相：30mM MES+0.5M氯化钠溶液(pH6.0)+5％ ACN溶液
检测波长：280nm
柱温：40℃
流速：0.4ml/min
梯度洗脱：
时间 流动相A 流动相B
0min 93％ 7％
2min 93％ 7％
47min 84％ 16％
40min 40％ 60％
52min 40％ 60％
53min 93％ 7％
60min 93％ 7％
1.8、CEX检测结果
表2
60mg/L的柠檬酸铁铵和30mg/L柠檬酸铁铵+0.4mM半胱氨酸能在一定程度上提高样品的酸性异构体比例，单独加入半胱氨酸和单独加入低浓度的柠檬酸铁铵对酸性异构体的提高没有明显效果；图4的CEX检测图谱显示，所有实验组的峰型与原研高度相似。结果表明：柠檬酸铁铵与半胱氨酸可能存在的潜在相互作用，有利于提高酸性异构体，因此对柠檬酸铁铵和半胱氨酸联合添加的浓度以及添加策略作进一步的探究。
实施例2：
2.1、细胞种子复苏：从液氮罐中取出一支冻存的CHO-S细胞种子，根据FreedomTMCHO-STMKit USER GUIDE(https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/freedom_cho_s_kit_man.pdf)获得重组的可分泌表达Dupilumab单抗的CHO-S细胞，用37℃预热的复苏培养基CD02培养基重悬，同时培养体系中含有6mM L-Gln以及0.2g/L的抗结团剂葡聚糖硫酸钠，于125ml摇瓶中培养，培养总体积为25ml，最后置于5％ CO2，37℃，150rpm振荡摇床上培养；
2.2、细胞传代扩增：种子细胞培养3～4天后，随后细胞按0.5×106个/ml的密度接种于提前预热37℃的发酵基础培养基CD063培养基中，同时培养体系中含有6mM L-Gln以及0.2g/L的抗结团剂葡聚糖硫酸钠，培养总体积为60ml，最后置于5％ CO2，37℃，150rpm振荡摇床上避光培养；如此再培养一代；
2.3、细胞发酵培养：种子细胞培养3～4天后，随后细胞按0.7×106个/ml的密度接种于提前预热37℃的发酵基础培养基CD063培养基中，同时初始培养体系中含有6mM L-Gln，0.2g/L抗结团剂葡聚糖硫酸钠，1％PF-68以及不同浓度的柠檬酸铁铵和半胱氨酸，在发酵培养的第4、8、12天，半胱氨酸以提供与初始培养基浓度相同的量添加，具体添加浓度见下表3，培养总体积均为60ml，最后置于5％ CO2，37℃，150rpm振荡摇床上避光培养；
表3
摇瓶编号 柠檬酸铁铵(mg/L) 半胱氨酸(mM)
SF01 0 0
SF02 100 0
SF03 150 0
SF04 200 0
SF05 100 1
SF06 150 1
SF07 150 2
2.4、补料分批培养：细胞发酵培养3天后，细胞密度一般为3～5×106个/ml，此时开始每天从发酵摇瓶中取500μL的发酵样品，检测细胞培养过程中的细胞密度(106个/ml)，细胞活率(％)，细胞直径(μm)，葡萄糖浓度(mg/L)，乳酸浓度(mg/L)，铵根浓度(mM)，L-Gln浓度(mM)，渗透压以及目标产物Titer(mg/L)；并按照每天2％/0.2％V/V加入两种发酵补料培养基VegaCHO Feed和AFS01，补糖按照低于4g/L补足到4g/L，降温后按照低于6g/L补足到6g/L的原则进行葡萄糖添加，补料操作延续到第13天；当细胞密度达到12～16×106个/ml，此时将细胞转移到5％CO2，33℃，150rpm振荡摇床上避光培养；
2.5、培养结束并收获：细胞发酵培养第14天，从培养摇床中取出，依次将所有培养液转移至50ml离心管中，并检测最终的pH以及步骤2.4中的检测项目，随后样品按照第一次：1500rpm，15min；第二次：8000rpm，15min进行两次离心，并保留上清于干净的50ml离心管中；
其中细胞密度和活率采用Vi-CELLXR细胞计数及活率分析仪进行测定，单克隆抗体浓度采用光计免疫比浊法进行测定，检测仪器为Cedex Bio生化分析仪，检测结果如图5-7所示，根据图5的细胞密度生长曲线图，100mg/L、150mg/L、200mg/L柠檬酸铁铵一定程度上影响了细胞生长以及峰值密度，其峰值密度为对照组的85％～90％，100mg/L柠檬酸铁铵+1mM Cys、150mg/L柠檬酸铁铵+1mM Cys以及150mg/L柠檬酸铁铵+2mM Cys对于细胞生长的影响相对明显，其表现为细胞生长更缓慢，峰值密度约为对照组的65％～75％；图6细胞活率曲线表明，100mg/L、150mg/L、200mg/L柠檬酸铁铵的细胞活率与对照组相当，最终活率为80％左右，100mg/L柠檬酸铁铵+1mM Cys、150mg/L柠檬酸铁铵+1mM Cys以及150mg/L柠檬酸铁铵+2mM Cys对细胞后期活率的维持有轻微影响，最终活率为75％左右；图7抗体的比生成速率表明，各浓度条件下不影响单个细胞表达抗体的能力，qmAb均与对照组相当或不低于对照组。
2.6、ProteinA磁珠纯化：将上述离心好的5ml样品上清，加入到3ml ProteinA磁珠悬液的15ml离心管中，25℃，90rpm摇床中孵育2～3h，并最终用3ml pH 3.4的甘氨酸溶液洗脱，用1M Tris溶液将得到的洗脱液pH调整至5～7，分装后保存于-80℃冰箱中；
2.7、质量属性检测：对目标产品进行CEX(阳离子交换色谱)检测；
对照样品上样制备：取3μl 150mg/L的Dupilumab原研注射液(Lot#9L816H)加入至222μl的流动相A中，混匀得到2mg/ml的对照样品上样溶液。
供试品上样制备：将步骤2.6所得纯化后的供试品溶液分别用0.22μm的滤膜过滤，过滤后按40μg的上样量进样。
检测体系：
色谱柱：QDK-72BioPro IEX SF 100*4.6mm I.D.5μm
流动相：
A相：30mM MES(4-吗啉乙磺酸)溶液(pH6.0)+5％ ACN(乙腈)溶液
B相：30mM MES+0.5M氯化钠溶液(pH6.0)+5％ ACN溶液
检测波长：280nm
柱温：40℃
流速：0.4ml/min
梯度洗脱：
时间 流动相A 流动相B
0min 93％ 7％
2min 93％ 7％
47min 84％ 16％
40min 40％ 60％
52min 40％ 60％
53min 93％ 7％
60min 93％ 7％
2.8CEX检测结果
表4
CEX检测结果表明100mg/L、150mg/L和200mg/L高浓度的柠檬酸铁铵均能将酸性异构体提高3％左右，提高的效果接近，认为铁离子浓度基本达到上限，而联合添加柠檬酸铁铵和Cys添加能够明显提高酸峰的比例，其中150mg/L柠檬酸铁铵+2mM Cys的酸峰比例得到显著的提高，与原研接近。图8的CEX检测图谱显示，所有实验组的峰型与原研高度相似。
实施例3：
3.1、细胞种子复苏：从液氮罐中取出一支冻存的CHO-S细胞种子，根据FreedomTMCHO-STMKit USER GUIDE(https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/freedom_cho_s_kit_man.pdf)获得重组的可分泌表达Dupilumab单抗的CHO-S细胞，用37℃预热的复苏培养基CD02培养基重悬，同时培养体系中含有6mM L-Gln以及0.2g/L的抗结团剂葡聚糖硫酸钠，于125ml摇瓶中培养，培养总体积为25ml，最后置于5％ CO2，37℃，150rpm振荡摇床上培养；
3.2、细胞传代扩增：种子细胞培养3～4天后，随后细胞按0.5×106个/ml的密度接种于提前预热37℃的发酵基础培养基CD063培养基中，同时培养体系中含有6mM L-Gln以及0.2g/L的抗结团剂葡聚糖硫酸钠，培养总体积为60ml，最后置于5％ CO2，37℃，150rpm振荡摇床上避光培养；如此再培养一代；
3.3、细胞发酵培养：种子细胞培养3～4天后，随后细胞按0.7×106个/ml的密度接种于提前预热37℃的发酵基础培养基CD063培养基中，同时初始培养体系中含有6mM L-Gln，0.2g/L抗结团剂葡聚糖硫酸钠，1％PF-68以及200mg/L柠檬酸铁铵和不同浓度的半胱氨酸，半胱氨酸在发酵培养过程中的具体添加浓度以及添加策略见下表5，培养总体积均为60ml，最后置于5％ CO2，37℃，150rpm振荡摇床上避光培养；
表5
摇瓶编号 柠檬酸铁铵(mg/L) 半胱氨酸(mM)
SF01 200 1(基础培养基+第4、8和12天)
SF02 200 1.5(基础培养基+第4、8和12天)
SF03 200 0.25(基础培养基+每天)
3.4、补料分批培养：细胞发酵培养3天后，细胞密度一般为3～5×106个/ml，此时开始每天从发酵摇瓶中取500μL的发酵样品，检测细胞培养过程中的细胞密度(106个/ml)，细胞活率(％)，细胞直径(μm)，葡萄糖浓度(mg/L)，乳酸浓度(mg/L)，铵根浓度(mM)，L-Gln浓度(mM)，渗透压以及目标产物Titer(mg/L)；并按照每天2％/0.2％V/V加入两种发酵补料培养基VegaCHO Feed和AFS01，补糖按照低于4g/L补足到4g/L，降温后按照低于6g/L补足到6g/L的原则进行葡萄糖添加，补料操作延续到第13天；当细胞密度达到12～16×106个/ml，此时将细胞转移到5％CO2，33℃，150rpm振荡摇床上避光培养；
3.5、培养结束并收获：细胞发酵培养第14天，从培养摇床中取出，依次将所有培养液转移至50ml离心管中，并检测最终的pH以及步骤3.4中的检测项目，随后样品按照第一次：1500rpm，15min；第二次：8000rpm，15min进行两次离心，并保留上清于干净的50ml离心管中；
其中细胞密度和活率采用Vi-CELL XR细胞计数及活率分析仪进行测定，单克隆抗体浓度采用光计免疫比浊法进行测定，检测仪器为Cedex Bio生化分析仪，检测结果如图9-11所示，3个实验组的细胞生长及峰值密度接近，活率变化趋势也类似，单个细胞表达抗体的能力相当。
3.6、ProteinA磁珠纯化：将上述离心好的5ml样品上清，加入到3ml ProteinA磁珠悬液的15ml离心管中，25℃，90rpm摇床中孵育2～3h，并最终用3ml pH 3.4的甘氨酸溶液洗脱，用1M Tris溶液将得到的洗脱液pH调整至5～7，分装后保存于-80℃冰箱中；
3.7、质量属性检测：对目标产品进行CEX(阳离子交换色谱)检测；
对照样品上样制备：取3μl 150mg/L的Dupilumab原研注射液(Lot#9L816H)加入至222μl的流动相A中，混匀得到2mg/ml的对照样品上样溶液。
供试品上样制备：将步骤3.6所得纯化后的供试品溶液分别用0.22μm的滤膜过滤，过滤后按40μg的上样量进样。
检测体系：
色谱柱：QDK-72BioPro IEX SF 100*4.6mm I.D.5μm
流动相：
A相：30mM MES(4-吗啉乙磺酸)溶液(pH6.0)+5％ ACN(乙腈)溶液
B相：30mM MES+0.5M氯化钠溶液(pH6.0)+5％ ACN溶液
检测波长：280nm
柱温：40℃
流速：0.4ml/min
梯度洗脱：
3.8CEX检测结果
表6
CEX检测结果表明在相同浓度200mg/L柠檬酸铁铵的存在下，以不同策略(1mM每4天和0.25mM每天)添加相同总浓度的Cys，其酸性异构体的比例基本相近，酸性异构体比例与Cys总浓度更相关。图12的CEX检测图谱显示，所有实验组的峰型与原研高度相似。为了验证柠檬酸铁铵与Cys在提高酸峰的协同作用，将进一步研究单独加入高浓度Cys在提升酸峰比例上的效果。
实施例4：
4.1、细胞种子复苏：从液氮罐中取出一支冻存的CHO-S细胞种子，根据FreedomTMCHO-STMKit USER GUIDE(https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/freedom_cho_s_kit_man.pdf)获得重组的可分泌表达Dupilumab单抗的CHO-S细胞，用37℃预热的复苏培养基CD02培养基重悬，同时培养体系中含有6mM L-Gln以及0.2g/L的抗结团剂葡聚糖硫酸钠，于125ml摇瓶中培养，培养总体积为25ml，最后置于5％ CO2，37℃，150rpm振荡摇床上培养；
4.2、细胞传代扩增：种子细胞培养3～4天后，随后细胞按0.5×106个/ml的密度接种于提前预热37℃的发酵基础培养基CD063培养基中，同时培养体系中含有6mM L-Gln以及0.2g/L的抗结团剂葡聚糖硫酸钠，培养总体积为60ml，最后置于5％ CO2，37℃，150rpm振荡摇床上避光培养；如此再培养一代；
4.3、细胞发酵培养：种子细胞培养3～4天后，随后细胞按0.7×106个/ml的密度接种于提前预热37℃的发酵基础培养基CD063培养基中，同时初始培养体系中含有6mM L-Gln，0.2g/L抗结团剂葡聚糖硫酸钠，1％PF-68以及不同浓度的半胱氨酸，在发酵培养的第4、8、12天，半胱氨酸以提供与初始培养基浓度相同的量添加，具体添加浓度见下表7，培养总体积均为60ml，最后置于5％ CO2，37℃，150rpm振荡摇床上避光培养；
表7
摇瓶编号 柠檬酸铁铵(mg/L) 半胱氨酸(mM)
SF01 0 0
SF02 0 1
SF03 0 2
4.4、补料分批培养：细胞发酵培养3天后，细胞密度一般为3～5×106个/ml，此时开始每天从发酵摇瓶中取500μL的发酵样品，检测细胞培养过程中的细胞密度(106个/ml)，细胞活率(％)，细胞直径(μm)，葡萄糖浓度(mg/L)，乳酸浓度(mg/L)，铵根浓度(mM)，L-Gln浓度(mM)，渗透压以及目标产物Titer(mg/L)；并按照每天2％/0.2％V/V加入两种发酵补料培养基VegaCHO Feed和AFS01，补糖按照低于4g/L补足到4g/L，降温后按照低于6g/L补足到6g/L的原则进行葡萄糖添加，补料操作延续到第13天；当细胞密度达到12～16×106个/ml，此时将细胞转移到5％CO2，33℃，150rpm振荡摇床上避光培养；
4.5、培养结束并收获：细胞发酵培养第14天，从培养摇床中取出，依次将所有培养液转移至50ml离心管中，并检测最终的pH以及步骤4.4中的检测项目，随后样品按照第一次：1500rpm，15min；第二次：8000rpm，15min进行两次离心，并保留上清于干净的50ml离心管中；
其中细胞密度和活率采用Vi-CELL XR细胞计数及活率分析仪进行测定，单克隆抗体浓度采用光计免疫比浊法进行测定，检测仪器为Cedex Bio生化分析仪，检测结果如图9-11所示，根据图13的细胞密度生长曲线图，1mM的Cys一定程度上减缓了细胞密度生长、降低了最大细胞密度，峰值密度为对照组的90％左右，2mM的Cys对于细胞的生长影响较为明显，表现为细胞生长缓慢，峰值密度为对照组的50％；图14细胞活率曲线表明，1mM Cys和2mMCys会轻度影响细胞后期活率的维持，最终活率为75％左右；图15抗体的比生成速率表明，各浓度条件下的半胱氨酸不影响单个细胞表达抗体的能力，qmAb均与对照组相当或不低于对照组。
4.6、ProteinA磁珠纯化：将上述离心好的5ml样品上清，加入到3ml ProteinA磁珠悬液的15ml离心管中，25℃，90rpm摇床中孵育2～3h，并最终用3ml pH 3.4的甘氨酸溶液洗脱，用1M Tris溶液将得到的洗脱液pH调整至5～7，分装后保存于-80℃冰箱中；
4.7、质量属性检测：对目标产品进行CEX(阳离子交换色谱)检测；
对照样品上样制备：取3μl 150mg/L的Dupilumab原研注射液(Lot#9L816H)加入至222μl的流动相A中，混匀得到2mg/ml的对照样品上样溶液。
供试品上样制备：将步骤3.6所得纯化后的供试品溶液分别用0.22μm的滤膜过滤，过滤后按40μg的上样量进样。
检测体系：
色谱柱：QDK-72BioPro IEX SF 100*4.6mm I.D.5μm
流动相：
A相：30mM MES(4-吗啉乙磺酸)溶液(pH6.0)+5％ ACN(乙腈)溶液
B相：30mM MES+0.5M氯化钠溶液(pH6.0)+5％ ACN溶液
检测波长：280nm
柱温：40℃
流速：0.4ml/min
梯度洗脱：
时间 流动相A 流动相B
0min 93％ 7％
2min 93％ 7％
47min 84％ 16％
40min 40％ 60％
52min 40％ 60％
53min 93％ 7％
60min 93％ 7％
4.8CEX检测结果
表8
CEX检测结果表明1mM和2mM Cys在提升效果上不如与柠檬酸铁铵的联合添加，其中1mM Cys仅提高了1％，2mM Cys提高2％。图16的CEX检测图谱显示，所有实验组的峰型与原研高度相似。因此认为柠檬酸铁铵与Cys在提高酸峰上具有协同作用。

Claims (12)

1.一种提高抗体酸性异构体比例的方法，其特征在于，所述方法包括：将可分泌表达抗体的真核细胞接种于含150～200mg/L铁元素和1.5～2mM半胱氨酸的发酵基础培养基中，在发酵培养过程中添加半胱氨酸继续培养，所述半胱氨酸以在培养基中提供0.375mM/天～0.5mM/天的量添加。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述铁元素来源于有机铁或无机铁，优选氯化铁、硫酸铁、柠檬酸铁、柠檬酸铁铵和葡萄糖酸铁，进一步优选柠檬酸铁铵。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含铁元素的发酵基础培养基中，铁元素的浓度为150mg/L或200mg/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵基础培养基中半胱氨酸的浓度为1.5mM或2mM，在发酵培养过程中，所述半胱氨酸以在培养基中提供0.375mM/天或0.5mM/天的量添加。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵培养过程中，所述半胱氨酸的添加方式为每四天一次，每次以在培养基中提供1.5mM或2mM的量添加。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵基础培养基选自CD063或VegaCHO，优选CD063。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵基础培养基中进一步含有4～8mM、优选6mM L-Gln，抗结团剂和0.5～1％、优选1％PF-68；所述抗结团剂选自0.1～0.3g/L葡聚糖硫酸钠或1:100～1:1000V/V Anti-Clumping Agent，优选0.2g/L葡聚糖硫酸钠或1:500V/V /> Anti-Clumping Agent。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可分泌表达抗体的真核细胞是CHO细胞，所述CHO细胞包括CHO-S、CHO-K1、DG44或NSO细胞，优选可分泌表达Dupilumab的CHO-S细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：在发酵培养过程中添加补料培养基，所述补料培养基为VegaCHO Feed和AFS01。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述补料培养基VegaCHO Feed/AFS01的添加方式为：细胞发酵培养3天后，按照每天2.0％/0.2％～2.5％/0.25％、优选2％/0.2％V/V(体积比)添加。
11.根据权利要求1-10任一所述的方法，其特征在于，包括：
将可分泌表达Dupilumab的CHO-S细胞接种于含150mg/L或200mg/L柠檬酸铁铵和1.5mM或2mM半胱氨酸的发酵基础培养基中，在发酵培养过程中添加半胱氨酸和补料培养基继续培养，所述半胱氨酸以在培养基中提供0.375mM/天或0.5mM/天的量添加；及
细胞发酵培养3天后，补料培养基VegaCHO Feed/AFS01按照每天2.0％/0.2％～2.5％/0.25％、优选2％/0.2％V/V(体积比)添加。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述发酵基础培养基为CD063，进一步含有6mM L-Gln、0.2g/L葡聚糖硫酸钠或1:500V/V Anti-Clumping Agent、1％PF-68。
CN202310709547.8A 2023-06-15 2023-06-15 一种提高抗体酸性异构体比例的方法 Pending CN116693662A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310709547.8A CN116693662A (zh) 2023-06-15 2023-06-15 一种提高抗体酸性异构体比例的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310709547.8A CN116693662A (zh) 2023-06-15 2023-06-15 一种提高抗体酸性异构体比例的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116693662A true CN116693662A (zh) 2023-09-05

Family

ID=87844738

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310709547.8A Pending CN116693662A (zh) 2023-06-15 2023-06-15 一种提高抗体酸性异构体比例的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116693662A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019202259B2 (en) Cell culture compositions and methods for polypeptide production
KR102671089B1 (ko) 세포 배양 배지
JP6982578B2 (ja) 細胞培養培地
JP7034236B2 (ja) 組換えタンパク質のグリコシル化を調節するためのｎ－グリコシル化経路制御因子の過剰発現
EP2638064A2 (en) Cell culture medium and process for protein expression, said medium and process comprising a pam inhibitor
CN101663391A (zh) 使用含高浓度氨基酸的培养基的细胞培养方法
JP2016527911A (ja) ポリペプチドのα−アミド化および／またはＣ末端アミノ酸開裂を制御するための細胞培養用培地およびプロセス
EP3400241A1 (en) Modulation of afucosylated species in a monoclonal antibody composition
CN114616321A (zh) 细胞培养方法
EP3400242A1 (en) Reduction of high molecular weight species, acidic charge species, and fragments in a monoclonal antibody composition
CN116693662A (zh) 一种提高抗体酸性异构体比例的方法
US10196665B2 (en) Cell culture medium and methods for enhancing recombinant antibody purity
CN109946410A (zh) 一种分析单克隆抗体电荷异质性的离子交换色谱检测方法
US20220356258A1 (en) Method for Producing Spesolimab
RU2672318C1 (ru) Способ получения моноклональных антител терапевтического назначения с помощью непрерывного культивирования клеток сно
RU2759602C2 (ru) Процесс крупномасштабного производства кэпированных и некэпированных цистеинов антител и их применение для конъюгации терапевтических белков
US10526631B1 (en) Method of reducing serine for asparagine misincorporation
CN106661557B (zh) 用于增加真核细胞的比生产率的方法
RU2717038C1 (ru) Штамм клеток cho-se-9/4 - продуцент химерного антитела против эритропоэтина человека и химерное антитело, продуцируемое данным штаммом
US20240150723A1 (en) Reducing host cell impurities during recombinant protein production
CN115038793A (zh) 含有抑制着色的多肽的组合物的制备方法
WO2023242238A1 (en) Cell culture processes
CN112980796A (zh) 用于降低cho细胞中表达重组蛋白的氧化的液体培养基
KR20180009760A (ko) 핵산 함유 배지를 이용한 세포 배양 방법
KR20240093910A (ko) 세포 배양 배지

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination