CN116693660A - 一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，属于食用蛋白质加工技术领域。该提取方法，包括以豆清水为原料制备初提物的步骤，所述制备初提物包括以下步骤：S01，预处理：澄清豆清水中的不溶物，得到预处理豆清水；S02，浓缩：将所述预处理豆清水浓缩，得到浓缩豆清水；S03，分离：将所述浓缩豆清水析出豆清蛋白，得到蛋白聚合物，即所述初提物；S01中，所述澄清中使用的助滤剂为豆渣。本发明大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，预处理中，使用隔膜压滤，豆渣作为助滤剂。本发明的预处理方法，一步处理操作简单，豆渣作为助滤剂无新废弃物产生，相比之下使用膜设备，占地空间大，在膜清洗时需要大量的水资源，产生大量碱性废水。
Description
技术领域
本发明属于食用蛋白质加工技术领域，特别是涉及一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法。
背景技术
大豆乳清废水（下称豆清水）是生产大豆分离蛋白得到的副产物，豆清水中含有大量可回收利用的物质，如大豆乳清蛋白、大豆低聚糖和大豆异黄酮等，还有尚未完全沉淀的大豆球蛋白，少量脂肪以及磷脂、植酸等物质。
大豆乳清蛋白是残存于大豆乳清中不能为酸所沉淀的蛋白质，在大豆乳清蛋白中2S组分所占的比重较大；乳清蛋白质中除含有球蛋白、白蛋白之外，还主要含有：①Kunitz胰蛋白酶抑制剂（KTI，pH3 .0~10 .0，20kDa）；②Bowman-Brik胰蛋白酶抑制剂（BBI，pH3 .0~10 .0，8KDa）；③β-淀粉酶（61 .7KDa）；④凝集素（pH2 .2~10 .8，120KDa）；⑤脂氧合酶（LOX，102KDa）等多种生理活性物质，约占大豆蛋白的9%-15.3%。随着研究的不断深入，发现胰蛋白酶抑制剂医药领域具有很大的潜在价值。
豆清水在大豆分离蛋白生产过程中作为废水处理，存在处理过程复杂，费用高，处理过程固废难处理等问题。
CN114560928A公开了一种基于大豆深加工废液以豆清水为原料粗提SBTI蛋白工艺，CN110551208A公开了一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，CN110551209A公开了一种基于大豆深加工废液以豆清水为原料粗提SBTI蛋白工艺。其预处理步骤使用碟片离心机+膜处理，其沉淀离心步骤为盐析法。
发明内容
本发明的大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，包括以豆清水为原料制备初提物的步骤，所述制备初提物包括以下步骤：
S01，预处理：澄清豆清水中的不溶物，得到预处理豆清水；
S02，浓缩：将所述预处理豆清水浓缩，得到浓缩豆清水；
S03，分离：将所述浓缩豆清水析出豆清蛋白，得到蛋白聚合物，即所述初提物；
S01中，所述澄清中使用的助滤剂为豆渣。
在本发明的一些实施方式中，S01中，所述澄清为板框压滤澄清或隔膜压滤澄清。
在本发明的一些实施方式中，S01中，以豆清水的重量为基准，加入2.0-10.0‰的豆渣。
在本发明的一些实施方式中，S01中，以豆清水的重量为基准，加入3.0-8.0‰的豆渣。
在本发明的一些实施方式中，S03中，调节所述浓缩豆清水pH，使豆清蛋白析出。
在本发明的一些实施方式中，S03中，豆清蛋白析出后，加入聚丙烯酸，搅拌后静置，收获蛋白聚合物，得到所述初提物。
在本发明的一些实施方式中，S03中，调节所述浓缩豆清水pH至2.5-4.5。
在本发明的一些实施方式中，S03中，调节所述浓缩豆清水pH至3.0-4.0。
在本发明的一些实施方式中，S03中，以所述浓缩豆清水的重量为基准，加入4-6‰的聚丙烯酸。
在本发明的一些实施方式中，S02中，所述浓缩为对所述预处理豆清水采用超滤法进行蛋白浓缩，并将豆清水中的小分子物质去除。
在本发明的一些实施方式中，还包括以下步骤：
S04，蛋白聚合物分散，溶解；
S05，脱盐、浓缩；
所述浓缩结束后，得到大豆胰蛋白酶抑制剂粗提溶液。
在本发明的一些实施方式中，S04中，将所述蛋白聚合物加入水分散，调节pH，离心去除聚合物和部分非目标蛋白得到大豆胰蛋白酶抑制剂粗提溶液。
在本发明的一些实施方式中，S05中，使用水置换超滤浓缩，得到固形物含量大于10%（w/w）的大豆胰蛋白酶抑制剂粗提溶液。
在本发明的一些实施方式中，还包括以下步骤：
S6、层析纯化；
S7、浓缩干燥。
有益效果
本发明的大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，预处理中，使用隔膜压滤，豆渣作为助滤剂。本发明的隔膜压滤加豆渣助滤的方法，与碟片离心机+膜处理相比，一步处理操作简单，豆渣作为助滤剂无新固体废弃物产生。相比之下使用膜设备，占地空间大，在膜清洗时需要大量的水资源，产生大量碱性废水。
本发明大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，采用等电点聚丙烯酸沉降法，与盐析法相比，所得初提物值重量大致相同，酶活更高，经处理的浓缩豆清水产生价值后仍可按照豆清水进行处理，无需额外投入。而且盐析法产生高盐废水需额外投入高盐废水处理设备，本发明降低了助剂原料成本和助剂废水处理成本。分离过程中通过调节pH值，改变蛋白水化层带电情况，使蛋白析出，通过聚丙烯酸使析出蛋白凝聚，从而更好分离。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
若非特别指出，实施例和对比例为组分、组分含量、制备步骤、制备参数相同的平行试验。若非特别指出，以下实施例中的比例和百分比均基于重量。
一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，包括以豆清水为原料制备初提物的步骤，所述制备初提物包括以下步骤：
S01，预处理：澄清豆清水中的不溶物，得到预处理豆清水；
接收豆清水后静置，豆清水中残余的酸沉蛋白析出。豆清水的澄清方法：隔膜压滤澄清，压滤过程使用助滤剂为大豆分离蛋白生产过程中产生的豆渣。
S02，浓缩：将所述预处理豆清水浓缩，得到浓缩豆清水；
采用3kDa超滤膜进行将豆清水体积浓缩至原体积的1/2。
S03，沉淀离心：调节所述浓缩豆清水pH，使豆清蛋白析出，加入聚丙烯酸，搅拌后静置，收获蛋白聚合物，得到初提物。
向浓缩豆清水中加入缓慢0.5mol/L的醋酸调节浓缩豆清水pH，使蛋白析出；以浓缩后的豆清水的重量为基准，加入聚丙烯酸，搅拌30分钟，静置4小时，去除上层清液后，管式离心收获蛋白聚合物，即初提物。
按表1的方式制备浓缩豆清水。实施例2制备的浓缩豆清水，浓缩处理后，按照表2的方式制备初提物。
制备过程的参数影响如表1、2所示。
表1 初提物制备中预处理步骤的参数影响
| 序号 | 处理方式 | 过滤面积 m2 | 处理量m³ | 过滤前浊度NTU | 助滤剂添加比例 | 平均处理速度 m³/小时 | 滤液浊度NTU | 清洗用水m³ |
| 实施例1 | 隔膜压滤 | 6 | 12 | 2200 | 3‰豆渣 | 4.5 | 4.0 | 2 |
| 实施例2 | 隔膜压滤 | 6 | 12 | 2200 | 5‰豆渣 | 4.0 | 2.7 | 2 |
| 实施例3 | 隔膜压滤 | 6 | 12 | 2200 | 8‰豆渣 | 3.5 | 1.8 | 2 |
| 实施例4 | 隔膜压滤 | 6 | 12 | 2200 | 2‰豆渣 | 5.0 | 11.8 | 2 |
| 实施例5 | 隔膜压滤 | 6 | 12 | 2200 | 10‰豆渣 | 2.0 | 1.5 | 2 |
| 对比例1 | 隔膜压滤 | 6 | 12 | 2200 | 5‰硅藻土 | 3.5 | 2.5 | 2 |
| 对比例2 | 碟片离心机+膜过滤 | - | 12 | 2200 | - | 3.0 | 3.0 | 17 |
“-”表示不添加。“过滤面积”指的是隔膜压滤机的过滤面。
综合实施例与对比例相比，相同处理量，隔膜压滤加豆渣助滤的方法，不产生新的固体废弃物，运行结束后不会产生大量碱性清洗废水。通过实施例对比，综合考虑处理速度与滤液浊度优选3-8‰豆渣作为助滤剂的添加比例。
实施例中所采用的豆渣为目前的大豆低温豆粕萃取工艺后的不溶物，主要成分为酸碱状态下都不可溶的大豆膳食纤维。其在豆清水澄清过程中是优秀的助滤剂，助滤结束后仍可加工为大豆膳食纤维等。
表2 初提物制备中沉淀离心步骤的参数影响
| 序号 | 浓缩豆清水Kg | 浓缩豆清水A280 | 析出方法 | 聚丙烯酸添加量 | 处理后浓缩豆清水A280 | 初提物Kg | 初提物糜蛋白酶抑制剂活性 mg/mg | 初提物胰蛋白酶抑制剂活性mg/mg | 产生废液Kg |
| 实施例6 | 600 | 33.0 | 调节pH2.5 | 5‰ | 31.0 | 1.7 | 0.25 | 0.28 | 600 |
| 实施例7 | 600 | 33.0 | 调节pH3.0 | 5‰ | 28.4 | 4.8 | 0.47 | 0.54 | 600 |
| 实施例8 | 600 | 33.0 | 调节pH3.5 | 5‰ | 27.5 | 5.8 | 0.52 | 0.45 | 600 |
| 实施例9 | 600 | 33.0 | 调节pH4.0 | 5‰ | 28.6 | 5.2 | 0.45 | 0.33 | 600 |
| 实施例10 | 600 | 33.0 | 调节pH4.5 | 5‰ | 32.0 | 1.0 | 0.40 | 0.40 | 600 |
| 对比例3 | 600 | 33.0 | 调节pH2.0 | 5‰ | 32.0 | 1.2 | 0.10 | 0.15 | 600 |
| 对比例4 | 600 | 33.0 | 调节pH5.0 | 5‰ | 32.5 | 0.6 | 0.20 | 0.15 | 600 |
| 对比例5 | 600 | 33.0 | 加入硫酸铵125kg | - | 28.0 | 6.0 | 0.40 | 0.35 | 725 * |
“-”表示不添加。“*”表示为高盐废水。“初提物”中包括300克聚丙烯酸。
综合实施例8与对比例5相比，实施例所得初提物值重量大致相同，酶活更高，经处理的浓缩豆清水产生价值后仍可按照豆清水进行处理，无需额外投入。对比例5产生高盐废水需额外投入高盐废水处理设备。综合对比实施例6-10，优选调节pH3.0-4.0作为析出方法。
得到的初提物的纯化，采用常规的纯化方法即可。比如，可以采用以下方法：
S4、蛋白聚合物分散，溶解；
向20kg初提物（即蛋白聚合物）中按照固液比1:10加入纯水200kg分散，并加入饱和碳酸钙溶液调节pH值6.5，得到分散液，搅拌30分钟，使用管式离心机去除聚合物和不溶物，收集所得清液210kg。
S5、脱盐、浓缩；
使用纯水置换超滤浓缩，浓缩结束后，0.25um过滤器过滤得到电导率13.5ms/cm，固形物含量10%的大豆胰蛋白酶抑制剂粗提溶液30kg。
S6、层析纯化；
阴离子填料为DEAE Sepharose FF填料，并用pH值6.0磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液按照固液比1:40稀释粗提物溶液，经离心后所得清液进行上样后用100mmol/L-400mmol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，分别得到BBI蛋白组分溶液和KTI蛋白组分溶液。
S7、浓缩干燥；
按照固形物重量比1:1混合BBI蛋白组分溶液和KTI蛋白组分溶液，得到SBTI溶液，进行3KD超滤脱盐与浓缩，得到固形物含量7%（w/w）的SBTI浓缩液12.5kg，经低温喷雾干燥或冷冻干燥得到SBTI干粉820g。
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。
Claims (10)
1.一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，包括以豆清水为原料制备初提物的步骤，其特征在于，所述制备初提物包括以下步骤：
S01，预处理：澄清豆清水中的不溶物，得到预处理豆清水；
S02，浓缩：将所述预处理豆清水浓缩，得到浓缩豆清水；
S03，分离：将所述浓缩豆清水析出豆清蛋白，得到蛋白聚合物，即所述初提物；
S01中，所述澄清中使用的助滤剂为豆渣。
2.根据权利要求1所述的大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，其特征在于，S01中，所述澄清为板框压滤澄清或隔膜压滤澄清。
3.根据权利要求1或2所述的大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，其特征在于，S01中，以豆清水的重量为基准，加入2.0-10.0‰的豆渣。
4.根据权利要求3所述的大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，其特征在于，S01中，以豆清水的重量为基准，加入3.0-8.0‰的豆渣。
5.根据权利要求1所述的大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，其特征在于，S03中，调节所述浓缩豆清水pH，使豆清蛋白析出。
6.根据权利要求5所述的大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，其特征在于，S03中，豆清蛋白析出后，加入聚丙烯酸，搅拌后静置，收获蛋白聚合物，得到所述初提物。
7.根据权利要求5或6所述的大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，其特征在于，S03中，调节所述浓缩豆清水pH至2.5-4.5。
8.根据权利要求7所述的大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，其特征在于，S03中，调节所述浓缩豆清水pH至3.0-4.0。
9.根据权利要求1所述的大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，其特征在于，S03中，以所述浓缩豆清水的重量为基准，加入4-6‰的聚丙烯酸。
10.根据权利要求1所述的大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，其特征在于，S02中，所述浓缩为对所述预处理豆清水采用超滤法进行蛋白浓缩，并将豆清水中的小分子物质去除。
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