CN116693537A - 作为蛋白质聚集抑制剂的四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪衍生物 - Google Patents

作为蛋白质聚集抑制剂的四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪衍生物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抑制蛋白质聚集的四氢咪唑并[1,2‑a]吡嗪衍生物、其药物组合物，以及这些化合物在治疗或预防以蛋白质聚集为特征的神经退行疾病中的用途，如阿尔茨海默病、帕金森病、额颞痴呆、路易体病、帕金森病痴呆、多系统萎缩症、肌萎缩侧索硬化和亨廷顿病。

Description

作为蛋白质聚集抑制剂的四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪衍生物
技术领域
本发明涉及抑制蛋白质聚集的四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪衍生物、其药物组合物，以及这些化合物在治疗或预防以蛋白质聚集为特征的神经退行疾病中的用途，如阿尔茨海默病、帕金森病、额颞痴呆、路易体病、帕金森病痴呆、多系统萎缩症、肌萎缩侧索硬化和亨廷顿病。
背景技术
神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病和额颞痴呆，是老年人死亡的重要原因之一。这些神经退行性疾病之间的共同特点是蛋白质长期积累成神经毒性聚集体。
蛋白质聚集的初始阶段涉及靶蛋白的突变或翻译后修饰(如亚硝化、氧化)，其继而生成异常构象，促进与类似错误折叠的蛋白质发生相互作用。异常蛋白随后聚集以形成二聚体、三聚体和更高级的多聚体(也称作“可溶性低聚体”)，其可能破坏突触功能。此外，随后聚集体会固定在细胞膜中并形成球形低聚体(其进而会在膜中形成孔)和/或原纤维或纤丝。这些较大的不溶性纤丝可能用作生物活性低聚体的储器。
研究表明，蛋白质聚集体的累进积聚与神经退行性疾病的发病有因果关系。多种其他蛋白质可在神经退行性疾病的患者脑部积聚，如α-突触核蛋白(SYN)、Aβ蛋白、Tau和TDP43。这些患者的认知障碍与新皮层和边缘系统突触损失紧密相关并且增加的蛋白质聚集水平可能导致这些突触损失。许多研究聚焦于详细说明α-突触核蛋白和其他淀粉样前体蛋白代谢产物积累促进突触损伤和神经变性的机制。同时许多研究支持了小聚集体(也称为低聚体)的形成在神经毒性中起主要作用的假设。这些肽低聚体可组织成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等高级聚集体。高含量的这类低聚体预示着患者痴呆和突触损失。多种证据表明低聚体而非较小的前体纤丝是毒性物质，因此以特异性方式靶向这些早期聚集过程的化合物可用作治疗或预防阿尔茨海默病、帕金森病等相关病症的潜在新药物。
各种神经退行性疾病涉及基于神经毒性蛋白质聚集体的累积。在特发性帕金森病、路易体痴呆、帕金森病痴呆和多系统萎缩症中，神经毒性聚集体由α-突触核蛋白组成，其是正常条件下处于胞内的突触蛋白。在额颞痴呆和肌萎缩侧索硬化中，神经毒性聚集体源自其他胞内蛋白(如tau、TDP-43或SOD1)。对于某些疾病(如阿尔茨海默病)中，α-突触核蛋白与其它主要蛋白质(例如，Aβ蛋白)聚集。在亨廷顿氏病中，聚集体由Htt蛋白的裂解产物形成。
这些蛋白质累积过程涉及示两种机制。在第一种机制中，错误折叠和/或聚集的蛋白质固定至多种细胞膜结构。错误折叠或聚集的分子与质膜或细胞器(如线粒体或溶酶体)膜的结合会干扰蛋白质转录、自体吞噬、线粒体功能和孔的形成。例如，神经毒性α-突触核蛋白通过突触核蛋白C端区域的特定部分聚集并与细胞膜中的脂质相互作用。结合至该区域的化合物可抑制蛋白质-蛋白质或蛋白质-脂质相互作用，因此可用于阻断α-突触核蛋白或其他蛋白质的神经毒性低聚化及其与膜相互作用。在第二种机制中，聚集的蛋白质从固定的亚基中释放并传播至相邻细胞。毒性蛋白聚集体在细胞至细胞间的传播可能是神经退行性病变进一步恶化的原因。因此与靶蛋白相互作用的小分子药物可限制其释放和传播，从而减少聚集蛋白质的神经毒性作用。
WO2011084642A1、WO2013148365A1和WO2013134371A1公开描述了一系列抑制蛋白质聚集的化合物及其在治疗神经退行性疾病中的用途。尽管在本领域中，治疗神经退休性疾病的药物取得一定的进展，仍然有必要进一步开发满足临床需求的蛋白质聚集抑制剂。
发明内容
一方面，本发明提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
其中，
R1和R3各自独立地选自H、卤素和C1-6烷基；
R2选自C1-6烷基、C2-6烯基、-C1-4亚烷基-O-C1-4烷基和-C1-4亚烷基-NRaRb；
R4选自：
(a)其中，
Y选自不存在和C1-3亚烷基；
A环选自含1或2个独立选自O和N杂原子的4、5或6元杂环基、C3-7环烷基、苯基、5或6元杂芳基；
R5和R6各自独立地选自不存在、H、卤素、羟基、氰基、羧基、-NRaRb、C1-6烷基、-CF3、-CHF2、-CH2F、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、含1或2个独立选自O和N杂原子的4、5或6元杂环基；
(b)C1-6烷基,其任选地被以下基团取代：卤素、羟基、氰基、羧基、-NRaRb、-CF3、-CHF2和-CH2F；
Ra和Rb各自独立地选自H和C1-6烷基。
另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
另一方面，本发明提供治疗与蛋白质聚集相关的神经退行性疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的至少一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐。
另一方面，本发明提供干扰细胞中蛋白质或肽聚集的累积或调节、预防、延缓、逆转或抑制细胞中蛋白质或肽聚集体的方法，所述方法包括将细胞与有效量的至少一种式(I)化合物或其盐和/或与至少一种本发明的药物组合物接触，其中所述接触是体外、离体或体内。
另一方面，本发明提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗与蛋白质聚集相关的神经退行性疾病的药物中的用途。
具体实施方式
在进一步描述本发明之前，应理解，本发明不限于所述的具体实施方案，因为它们当然可能变化。还应理解，本文所用术语的目的仅是描述具体实施方案，不用来构成限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。
除非另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。本文中引用的所有专利、申请、公开申请和其他出版物都全文参考结合于本文。如果该部分中的定义与引用纳入本文的专利、申请和其他出版物中所列的定义相反或不一致，该部分中的定义将压倒引用纳入本文的定义。
本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。还应注意到，权利要求书可撰写成排除任何任选要素。同样，这种说明应用作引用权利要求元素相关地使用这类排除性术语，如“只有”、“仅仅”等，或使用“负”限制的前提基础。
本文所用术语“包含”、“含有”和“包括”以其开放、非限定的含义使用。
为提供更简明的描述，本文中的一些定量表达前不使用术语“约”。应理解无论是否明确地使用术语“约”，本文中的每个含量均表示实际给定的数值，且其还表示基于本领域普通技术所能合理推断的给定数值的近似值，包括由于实验和/或测量条件产生的这类给定数值的等同值和近似值。无论何时以百分比表示产率时，这类产率表示在特定的化学计量比条件下用于计算产率的实体质量与同一实体所能获得的最大量的比值。百分比形式的浓度表示质量比率，除非另有说明。
除非另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。虽然也可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但以下描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用纳入本文，与所引用出版物相关联来公开和描述这些方法和/或材料。
除非另有说明，本发明实施方案的方法和技术一般遵循本领域熟知的传统方法进行并如若干一般的或更特定的参考文献中所述，所述参考文献贯穿本说明书引用和讨论。参见，例如，Loudon,Organic Chemistry,第四版,New York:Oxford University Press,2002,第360-361、1084-1085页；Smith和March,March's Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and structure,第五版,Wiley-Interscience,2001。
应理解，为清楚起见，在单独的各实施方案的内容中描述的本发明的一些特征还可以合并在单个的实施方案中提供。反之，在单个实施方案的内容中简短描述的本发明的各特征也可以单独提供或以任何合适的子组合的形式提供。与由可变形式代表的化学基团相关的实施方案的所有组合均特定包含在本发明范围内并由本文公开，形同本文单独且明确地公开每个和各个组合以至此类组合包含自身为稳定化合物的化合物(即，可分离、表征和检测生物学活性的化合物)。此外，描述此类可变形式的实施方案中所列的化学基团的所有子组合也具体包含在本发明范围内并由本文公开，形同本文单独且明确地公开化学基团的每个和各个此类子组合。
定义
如本文中所使用，术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
如本文中所使用，术语“烷基”是指具有直链或支链的饱和一价烃基。例如，“C1-6烷基”是指链中具有1至6个碳原子的烷基。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基。
如本文中所使用，术语“亚烷基”是指通过从如上定义的烷基除去氢原子而获得的二价基团。亚烷基可以是直链或支链二价烷基。例如，“C1-4亚烷基”是指具有1至4个碳原子的亚烷基。亚烷基的实例包括但不限于亚甲基(即-CH2-)、亚乙基(即-CH2CH2-或-CH(CH3)-)和亚丙基(即-CH2-CH2-CH2-、-CH(CH2CH3)-或-CH2CH(CH3)-)。
如本文中所使用，术语“烯基”是指含有一个或多个双键的直链或支链烃基，通常长度为2至20个碳原子。例如，“C2-6烯基”含有2至6个碳原子。烯基的实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、2-甲基-2-丁烯-1-基等。
如本文中所使用，术语“环烷基”是指饱和或部分饱和的单环、稠合的多环、桥连的多环、或螺环多环碳环，每个碳环具有3至12个环原子。例如，“C3-7环烷基”是指具有3至7个成员原子的环烷基。环烷基的说明性实例包括适当键合部分的形式的以下实体：
如本文中所使用，术语“杂环基”或“杂环”是指含有一个或多个环杂原子的未取代和取代的单环或多环非芳环系统，其包括单环的杂环(基)、双环的杂环(基)、桥环的杂环(基)、稠环的杂环(基)及螺环的杂环(基)。杂原子选自N、O和S，包括N-氧化物、硫氧化物和二氧化物。该杂环(基)是完全饱和的或具有一个或多个不饱和度的三至十元环。当前杂环(基)的定义包括多个取代度，优选一个、两个或三个取代度。杂环基或杂环的实例包括但不限于以下适当键合部分形式的实体：
如本文中所使用，术语“杂芳基”或“杂芳环”指单环、稠合双环或稠合多环芳族杂环(具有选自碳原子和至多四个选自氮、氧和硫的杂原子的环原子的环结构)，其具有3至12个环原子。二环杂芳基可以包括具有一个芳族环和一个非芳族环的双环基团。当杂芳基环被-OH取代时，普通技术人员将理解所得的环系统可以绘制为相应的氧代取代的互变异构体。杂芳基的说明性实例包括以下适当键合部分形式的实体：
如本文中所使用，术语“取代的”表示特定基团部分带有一个或多个取代基。术语“未取代的”表示特定基团不带有取代基。术语“任选取代的”表示特定基团是未取代的或被一个或多个取代基取代。在使用术语“取代的”描述结构系统时，取代可发生在系统上任意价态允许的位置上。
如本文中所使用，术语“独立地”是指当多于一个取代基选自许多可能的取代基时，这些取代基可以相同或不同。即，每个取代基单独选自所列举的可能的取代基的整个组。
在本文中对一类取代基使用时，命名法“Ci-j”(其中j>i)表示独立地实现从i至j(包括i和j)的碳原子数目中的每一个数目的本发明实施方案。例如，术语C1-3独立地表示具有一个碳原子(C1)的实施方案、具有两个碳原子(C2)的实施方案和具有三个碳原子(C3)的实施方案。
如本文中所使用，波浪线表示基团与分子其余部分的连接点。
如本文所使用的，术语“任选地”是指随后描述的事件可以发生或可以不发生，并且包括发生的事件和不发生的事件两者。
如本文中所使用，术语“药学上可接受的盐”表示本文所示化合物的游离酸或碱的盐，其没有毒性、生物学上可以容忍或者生物学上适于向受试者施用。通常参见，S.M.Berge,等人,“Pharmaceutical Salts,”J.Pharm.Sci.,1977,66,1-19。优选的药学上可接受的盐是药学上有效并且适于接触受试者组织而没有过多的毒性、刺激、或过敏反应的那些。本文所述的化合物可具有足够酸性的基团、足够碱性的基团、两种类型的官能团、或超过一种的各类型，并且因此与多种无机或有机碱，以及无机和有机酸反应以形成药学上可接受的盐。
如本文中所使用，术语“治疗”或“处理”包括“预防性”和“治疗性”治疗。“预防性”治疗指推迟疾病、疾病症状或医学病症的发展、抑制可能出现的症状或降低疾病或症状发展或复发的风险。“治疗性”治疗包括降低已有疾病、症状或病症的严重程度或抑制其恶化。因此，治疗包括改善或预防已有疾病症状的恶化、预防出现其他症状、改善或预防症状的根本性系统原因、抑制失调或疾病，例如阻止失调或疾病的发展、减轻失调或疾病、促使失调或疾病退行、减轻疾病或失调引起的病症或停止疾病或失调的症状。
如本文中所使用，术语“受试者”指需要该治疗的哺乳动物患者，例如人。
本领域技术人员将认识到，本文提供的定义中列出或所示的物种不是穷举性的，且还可以选择在这些定义的术语范围内的其他种类。
化合物
本发明提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐,
其中，
R1和R3各自独立地选自H、卤素和C1-6烷基；
R2选自C1-6烷基、C2-6烯基、-C1-4亚烷基-O-C1-4烷基和-C1-4亚烷基-NRaRb；
R4选自：
(a)其中，
Y选自不存在和C1-3亚烷基；
A环选自含1或2个独立选自O和N杂原子的4、5或6元杂环基、C3-7环烷基、苯基、5或6元杂芳基；
R5和R6各自独立地选自不存在、H、卤素、羟基、氰基、羧基、-NRaRb、C1-6烷基、-CF3、-CHF2、-CH2F、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、含1或2个独立选自O和N杂原子的4、5或6元杂环基；
(b)C1-6烷基,其任选地被以下基团取代：卤素、羟基、氰基、羧基、-NRaRb、-CF3、-CHF2和-CH2F；
Ra和Rb各自独立地选自H和C1-6烷基。
在式(I)的一些实施方案中，R1选自H、氟、氯、溴、碘、甲基、乙基、正丙基和异丙基；在一些实施方案中，R1选自H、氟、氯、甲基、乙基、正丙基和异丙基；在一些实施方案中，R1选自H、氟、甲基和乙基。
在式(I)的一些实施方案中，R2选自C4-6烷基、C4-6烯基、-C1-3亚烷基-O-C1-3烷基和-C1-3亚烷基-NRaRb；在一些实施方案中，R2选自C4-6烷基和C4-6烯基；在一些实施方案中，R2是C4-6烷基。
在式(I)的一些实施方案中，R2选自正丁基、异戊基、-CH2CH2OCH3、-CH2OCH2CH3、-CH2CH2OCH2CH3、-CH2CH2N(CH3)2、-CH2CHCHCH3、-CHCHCH2CH3和-CH2CHC(CH3)2。
在式(I)的一些实施方案中，R3选自H、氟、氯、溴、碘、甲基、乙基、正丙基和异丙基；在一些实施方案中，R3选自H、氟、氯、甲基、乙基、正丙基和异丙基；在一些实施方案中，R3选自H、氯、甲基和乙基。
在式(I)的一些实施方案中，R4是且Y选自不存在，A环选自含1或2个独立选自O和N杂原子的4、5或6元杂环基、C3-7环烷基、苯基、5或6元杂芳基。
在式(I)的一些实施方案中，R4是且Y是C1-3亚烷基，A环选自含1或2个独立选自O和N杂原子的4、5或6元杂环基、C3-7环烷基、苯基、5或6元杂芳基。
在式(I)的一些实施方案中，R4是且Y是亚甲基或亚乙基，A环选自含1或2个独立选自O和N杂原子的4、5或6元杂环基、C3-7环烷基、苯基、5或6元杂芳基。
在式(I)的一些实施方案中，R4是C1-6烷基,其任选地被以下基团取代：卤素、羟基、氰基、羧基、-NRaRb、-CF3、-CHF2和-CH2F。
在式(I)的一些实施方案中，A环选自氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、吡咯烷基、四氢吡喃基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、螺[2.3]己烷基、苯基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吡唑基、咪唑基、三唑基和四唑基；在一些实施方案中，A环选自氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、哌啶基、吗啉基、环丁基、环己基、螺[2.3]己烷基、哒嗪基、吡嗪基和三唑基。
在式(I)的一些实施方案中，R5和R6各自独立地选自不存在、H、氟、氯、羟基、氰基、羧基、-NRaRb、甲基、乙基、正丙基、异丙基、-CF3、-CHF2、-CH2F、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、吡咯烷基、四氢吡喃基、哌啶基、哌嗪基和吗啉基；在一些实施方案中，R5和R6各自独立地选自不存在、H、氟、羟基、羧基、-N(CH3)2、甲基、-CF3、环丙基和氧杂环丁烷基。
在式(I)的一些实施方案中，R4选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基和新戊基，且这些烷基任选地被以下基团取代：氟、氯、羟基、氰基、羧基、-NRaRb、-CF3、-CHF2和-CH2F。
在式(I)的一些实施方案中，R4选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基和新戊基，且这些烷基任选地被以下基团取代：氟、羟基、-N(CH3)2和-CF3。
在式(I)的一些实施方案中，R4选自甲基、乙基、正丙基、异丙基和异戊基，且这些烷基任选地被以下基团取代：氟、羟基、-N(CH3)2和-CF3。
在式(I)的一些实施方案中，Ra和Rb各自独立地选自H、甲基、乙基、正丙基和异丙基；在一些实施方案中，Ra和Rb各自独立地选自H和甲基。
在式(I)的一个实施方案中，式(I)化合物为具有如下结构的式(II)化合物，
其中，A环、R5和R6的定义如通式(I)中所定义。
在式(II)的一些实施方案中，A环选自氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、吡咯烷基、四氢吡喃基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、螺[2.3]己烷基、苯基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吡唑基、咪唑基、三唑基和四唑基；在一些实施方案中，A环选自氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、哌啶基、环丁基、环己基、螺[2.3]己烷基、哒嗪基、吡嗪基和三唑基。
在式(II)的一些实施方案中，R5和R6各自独立地选自不存在、H、氟、氯、羟基、氰基、羧基、-NRaRb、甲基、乙基、正丙基、异丙基、-CF3、-CHF2、-CH2F、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、吡咯烷基、四氢吡喃基、哌啶基、哌嗪基和吗啉基；在一些实施方案中，R5和R6各自独立地选自不存在、H、氟、羟基、羧基、-N(CH3)2、甲基、-CF3、环丙基和氧杂环丁烷基。
在式(II)的一些实施方案中，Ra和Rb各自独立地选自H、甲基、乙基、正丙基和异丙基；在一些实施方案中，Ra和Rb各自独立地选自H和甲基。
在式(I)的一些实施方案中，本发明的化合物选自：
除了本文所述化合物的游离碱形式，该化合物的盐形式也在本发明的范围内。本文所述化合物的盐或药学上可接受的盐可在该化合物的最终分离和纯化过程中原位制备或者通过单独地将其游离碱形式的纯化的化合物分别与合适的碱或酸反应进行制备。有关合适的药用的盐的综述参见Berge等人，J.Pharm，Sci.，66，1-19，1977；P L Gould，International Journal of Pharmaceutics，33(1986)，201-217；和Bighley等人，Encyclopedia of Pharmaceutical Technology，Marcel Dekker Inc，New York 1996，Volume 13，page 453-497。
对于含有碱性基团的式(I)化合物，可通过用合适的酸处理形成药学上可接受的酸加成盐。合适的酸包括药学上可接受的无机酸和药学上可接受的有机酸。在一些实施方案中，这些盐中的一些形成溶剂合物。在一些实施方案中，这些盐中的一些是结晶的。
对于含有羧酸或其他酸性官能团的式(I)化合物的盐可通过与合适的碱反应制备。该药学上可接受的盐可用提供药学上可接受阳离子的碱制成，其包括碱金属盐(尤其是钠盐和钾盐)、碱土金属盐(尤其是钙盐和镁盐)、铝盐和铵盐，以及由生理学上可接受的有机碱制成的盐。
在本发明中，式(I)化合物或其盐可以以立体异构形式存在(例如，它们可以含有一个或多个不对称碳原子)。单独的立体异构体(对映异构体和非对映异构体)及其混合物包括在本发明的范围内。可以通过常规方法将不同的异构形式彼此分离或拆分，或者可以通过常规合成方法或通过立体特异性或不对称合成获得任何给定的异构体。
在本发明中，式(I)化合物能以互变异构形式存在。例如，某些化合物显示酮-烯醇互变异构现象。在一些情况下，仅有一对互变异构形式中之一在式(I)中。这些可供选择的互变异构体也构成本发明的一部分。
本发明还包括同位素标记的化合物和盐，其与式(I)化合物或其盐相同，除了以下事实不同：一个或多个原子被具有与自然界中最常见的原子质量或质量数不同的原子替代。可掺入式(I)化合物或其盐的氢、碳、氮、氟的同位素的实例，例如2H、3H、13C、14C和18F。这种同位素标记的式(I)化合物或其盐用于药物和/或底物组织分布测定。例如，13C和18F同位素用于PET(正电子发射断层扫描)。PET用于脑部成像。同位素标记的式(I)化合物及其盐通常可通过进行下文公开的操作制备，用易得的同位素标记试剂替代非同位素标记的试剂。在一些实施方案中，式(I)化合物或其盐不是同位素标记的。
本领域技术人员也理解，本发明可含有式(I)化合物或其药学上可接受的盐的各种氘代形式。与碳原子相连的各可用氢原子可独立地被氘原子替代。本领域技术人员将知道如何合成式(I)化合物或其药学上可接受的盐的氘代形式。市售可得的氘代起始原料可用于制备式(I)化合物或其药学上可接受的盐的氘代形式，或它们可使用采用了氘代试剂(例如氘代氢化锂铝)的常规技术进行合成。
药物组合物
本发明的化合物或其药学上可接受的盐可在给药于受试者之前配制为药物组合物。因此，另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
治疗方法和用途
本发明提供治疗与蛋白质聚集相关的神经退行性疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的至少一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐。
另一方面，本发明提供治疗与蛋白质聚集相关的神经退行性疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予药物组合物，其包含治疗有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
特征为蛋白质聚积的示例性的神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、额颞痴呆、路易体病(路易体痴呆)、帕金森病痴呆、多系统萎缩症、肌萎缩侧索硬化和亨廷顿病。
在一些方面，本发明的化合物和药物组合物特异性靶向α-突触核蛋白、β-淀粉样蛋白和/或tau蛋白聚集体。因此，这些化合物和药物组合物可用于调节、预防、反转、延缓或抑制α-突触核蛋白、β-淀粉样蛋白和/或tau蛋白的聚集，并用于本发明的方法中以治疗聚集(如α-突触核蛋白、β-淀粉样蛋白和/或tau蛋白的聚集)相关或引起的神经变性疾病。优选地，本发明的方法靶向与α-突触核蛋白、β-淀粉样蛋白和/或tau蛋白的聚集相关的神经变性疾病。在优选的实施方案中，治疗方法靶向帕金森病、阿尔茨海默病、路易体病、或多系统萎缩症。本发明的化合物、组合物和方法还可用于减轻蛋白质聚集继发的有害作用，如神经元细胞死亡。
在一些方面中，本发明的化合物、组合物和方法用于靶向α-突触核蛋白聚集。在另一个的方面，本发明的化合物、组合物和方法用于靶向Aβ聚集。
在本发明的抑制性方法中，“有效量”指足以减少、延缓蛋白质或肽聚集的进展或反转蛋白质或肽聚集的量。可通过如下文所述的常规分析方法对聚集的量进行测量。这类修饰可用于多种环境，包括体外试验。在该方法中，所述细胞优选是神经细胞。
在根据本发明的治疗方法中，“有效量”指足以使需要这类治疗的受试者获得所需治疗益处的量或剂量。
另一方面，本发明提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗与蛋白质聚集相关的神经退行性疾病的药物中的用途。
在一些实施方案中，本发明提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗与α-突触核蛋白、β-淀粉样蛋白和/或tau蛋白的聚集相关的神经退行性疾病的药物中的用途。
在一些实施方案中，本发明提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐在制备帕金森病、阿尔茨海默病、路易体病、或多系统萎缩症的药物中的用途。
在一个实施方案中，本发明提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐在制备帕金森病的药物中的用途。
测定
本文所述的化合物可用于研究应用，包括体外、体内或离体实验系统。实验性系统可包括，但不限于，细胞样品、组织样品、细胞组分或细胞组分混合物、完整或部分器官、或生物体。研究应用包括，但不限于，用作测定试剂、生物化学通路的解析、或评估在一种或多种本文所述的化合物存在或缺失下其他试剂对实验系统的效应。
本文所述的化合物也可用于生物化学试验。在一些实施方案中，本文所述的化合物可与来自受试者的组织或细胞孵育以评价受试者对化合物施用的潜在响应，或确定本文所述的哪种化合物在特定受试者或受试者组中阐述有关最优效果。一种这类试验包括(a)从受试者获取细胞样品或组织样品，其中可测试一种或多种生物标志物的调节，(b)向细胞样品或组织样品施用一种或多种本文所述的化合物；和(c)与施用化合物前的生物标志物的状态相比，确定施用化合物后一种或多种生物标志物的调节量。任选地，在步骤(c)后，测定将包括基于步骤(c)中确定的调节量选择用于治疗与蛋白质聚集相关的疾病或医学病症的化合物的额外步骤(d)。
实施例
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。此外，本领域技术人员将认识到可通过选择合适的起始材料和试剂来修改以下合成反应和方案以获得本发明化合物。
实施例和生物实施例使用以下缩写词：
HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
DIEA：N,N-二异丙基乙胺
PE：石油醚
EA：乙酸乙酯
DMSO：二甲基亚砜
Chloroform-d：氘代氯仿
HPLC：高效液相色谱。
在实施例的制备型HPLC纯化方法中，色谱柱为：Xbridge Prep C18柱OBD(10μm，19×250mm)；流动相为：0.1％氨水溶液/乙腈。
实施例1N-[1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基]-7-(1-甲基哌啶-4-基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
第一步2-{[1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基]氨基甲酰}-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-7-羧酸叔丁酯1c
将化合物1a(240mg,1.12mmol)，化合物1b(300mg,1.12mmol)和1-甲基咪唑(280mg,3.37mmol)依次加入反应瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺(5mL)搅拌溶解后加入HATU(470mg,1.68mmol)。室温搅拌1小时后反应完全，向反应液中加入乙酸乙酯(30mL)进行稀释，用饱和碳酸氢钠溶液(30mL×2)洗涤，再用乙酸乙酯(30mL×2)萃取，合并有机相并用无水硫酸钠干燥。过滤浓缩后得到粗品，粗品通过硅胶柱层析(PE:EA＝3:1)方法纯化得到化合物1c(370mg,收率：70.42％)。
MS m/z(ESI):466[M+H]+。
第二步N-[1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基]-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺1d
向化合物1c(300mg,0.644mmol)中加入二氯甲烷(2mL)，溶解后加入三氟乙酸(0.5mL)，在室温下搅拌1小时后反应完全，旋转蒸发除去溶剂后得到化合物1d(250mg,收率：106.16％)。粗品化合物直接用于下一步反应。
MS m/z(ESI):366[M+H]+。
第三步N-[1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基]-7-(1-甲基哌啶-4-基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺1
将化合物1d(250mg，0.52mmol)和1-甲基哌啶-4-酮(78mg，0.65mmol)用甲醇(10mL)溶解，再加入乙酸(7.00mg，0.600mmol)，氰基硼氢化钠(77mg，1.20mmol)，在60℃下搅拌反应3小时。反应结束后，加入水(30mL)淬灭反应，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后经制备型HPLC方法纯化分离得到化合物1(90mg，收率48％)。
MS m/z(ESI):463[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ10.75(d,J＝2.4Hz,1H),7.57(d,J＝7.9Hz,1H),7.51(s,1H),7.41(d,J＝9.3Hz,1H),7.31(d,J＝8.0Hz,1H),7.10–7.01(m,2H),6.95(t,J＝7.4Hz,1H),4.25–4.15(m,1H),3.97(t,J＝5.3Hz,2H),3.71(d,J＝3.2Hz,2H),2.96–2.79(m,7H)，2.67(s,5H),1.96(s,2H),1.51(dd,J＝8.8,4.7Hz,2H),1.22(tt,J＝13.3,7.4Hz,6H),0.79(t,J＝6.2Hz,3H)。
实施例2N-[1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基]-7-(氧杂环丁烷-3-基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
将化合物1d(250mg，0.52mmol)和3-氧杂环丁酮(55mg，0.65mmol)用甲醇(10mL)溶解，再加入乙酸(7.00mg，0.600mmol)，氰基硼氢化钠(77mg，1.20mmol)，在60℃下搅拌反应3小时。反应结束后，加入水(30mL)淬灭反应，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后经制备型HPLC方法纯化分离得到化合物2(101mg，收率50.4％)。
MS m/z(ESI):422.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.97(s,1H),7.69(d,J＝7.8Hz,1H),7.46(s,1H),7.33(d,J＝8.0Hz,1H),7.20–7.14(m,1H),7.13–7.05(m,2H),6.89(s,1H),4.75(t,J＝6.5Hz,2H),4.65(t,J＝6.1Hz,2H),4.43(d,J＝5.2Hz,1H),4.07(t,J＝5.5Hz,2H),3.77(t,J＝6.4Hz,1H),3.58(s,2H),3.07(dd,J＝14.7,5.8Hz,1H),2.95(dd,J＝14.6,6.8Hz,1H),2.83–2.77(m,2H),1.40–1.23(m,6H),0.83(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例3N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-(4,4-二氟环己基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
将化合物1d(250mg，0.52mmol)和4,4-二氟环己烷-1-酮(120mg，0.65mmol)用甲醇(10mL)溶解，再加入乙酸(7.00mg，0.600mmol)，氰基硼氢化钠(77mg，1.20mmol)，在60℃下搅拌反应3小时。反应结束后，加入水(30mL)淬灭反应，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后经制备型HPLC方法纯化分离得到化合物3(45mg，收率36.4％)。
MS m/z(ESI):484.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.69(d,J＝7.8Hz,1H),7.33(dd,J＝8.0,1.0Hz,1H),7.16(ddd,J＝8.1,7.0,1.3Hz,1H),7.13–7.03(m,2H),6.90(d,J＝9.3Hz,1H),4.00(t,J＝5.4Hz,2H),3.78(s,2H),3.06(dd,J＝14.6,5.9Hz,1H),2.99–2.89(m,3H),1.88(d,J＝11.4Hz,3H),1.75(d,J＝8.5Hz,3H),1.65–1.59(m,0H),1.52–1.16(m,3H),0.82(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例4 7-(1-环丙基哌啶-4-基)-N-[1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基]-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
将化合物1d(250mg，0.52mmol)和1-环丙基哌啶-4-酮(135mg，0.75mmol)用甲醇(10mL)溶解，再加入乙酸(7.00mg，0.600mmol)，氰基硼氢化钠(77mg，1.20mmol)，在60℃下搅拌反应3小时。反应结束后，加入水(30mL)淬灭反应，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后经制备型HPLC方法纯化分离得到化合物4(65mg，收率41.3％)。
MS m/z(ESI):489.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.98(s,1H),7.69(d,J＝7.9Hz,1H),7.42(s,1H),7.33(d,J＝8.0Hz,1H),7.17(t,J＝7.5Hz,1H),7.13–7.05(m,2H),6.90(d,J＝9.4Hz,1H),4.43(s,1H),3.99(t,J＝5.4Hz,2H),3.79(s,2H),3.19–3.03(m,3H),2.96(d,J＝6.3Hz,4H),2.51(s,1H),2.21(t,J＝11.2Hz,2H),1.82(d,J＝12.4Hz,2H),1.50–1.19(m,9H),0.82(t,J＝7.1Hz,3H),0.51–0.35(m,4H)。
实施例5N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-(2-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
采用与实施例1类似的合成方法，将1-甲基哌啶-4-酮替换为2-甲基四氢-4H-吡喃-4-酮，制得化合物5，收率47.3％。
MS m/z(ESI):464.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.01(s,1H),7.69(d,J＝7.8Hz,1H),7.43(s,1H),7.33(d,J＝8.0Hz,1H),7.20–7.14(m,1H),7.13–7.04(m,2H),6.89(d,J＝9.4Hz,1H),4.43(d,J＝5.0Hz,1H),4.08(dd,J＝11.7,4.3Hz,1H),4.00(t,J＝5.4Hz,2H),3.80(s,2H),3.52–3.41(m,2H),3.07(dd,J＝14.6,5.9Hz,1H),2.96(q,J＝8.0,7.0Hz,3H),2.76–2.66(m,1H),1.81(dd,J＝31.4,12.7Hz,2H),1.58–1.53(m,1H),1.47–1.20(m,10H),0.82(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例6N-[1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基]-7-[4-(三氟甲基)环己基]-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
将化合物1d(250mg，0.52mmol)和4-(三氟甲基)环己烷-1-酮(115mg，0.65mmol)用甲醇(10mL)溶解，再加入乙酸(7.00mg，0.600mmol)，氰基硼氢化钠(77mg，1.20mmol)，在60℃下搅拌反应3小时。反应结束后，加入水(30mL)淬灭反应，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后经制备型HPLC方法纯化分离得到化合物6(33mg，收率25.4％)。
MS m/z(ESI):516.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.01(s,1H),7.69(d,J＝7.8Hz,1H),7.43(s,1H),7.33(d,J＝8.0Hz,1H),7.17(t,J＝7.5Hz,1H),7.13–7.04(m,2H),6.89(d,J＝9.3Hz,1H),4.43(s,1H),4.00(t,J＝5.4Hz,2H),3.80(s,2H),3.07(dd,J＝14.6,5.8Hz,1H),2.99–2.85(m,3H),2.52(t,J＝11.0Hz,1H),2.04(d,J＝11.1Hz,5H),1.48–1.18(m,10H),0.82(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例7N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-(四氢-2H-吡喃-3-基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
采用与实施例1类似的合成方法，将1-甲基哌啶-4-酮替换为二氢-2H-吡喃-3(4H)-酮，制得化合物7，收率41.7％。
MS m/z(ESI):450.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.02(s,1H),7.68(d,J＝7.9Hz,1H),7.42(s,1H),7.33(d,J＝8.0Hz,1H),7.21–7.13(m,1H),7.12–7.02(m,2H),6.90(d,J＝9.3Hz,1H),4.48–4.36(m,1H),4.09–3.96(m,3H),3.93–3.79(m,3H),3.40–3.29(m,2H),3.10–2.90(m,4H),2.63(t,J＝10.1Hz,1H),2.05(d,J＝12.6Hz,1H),1.78(d,J＝13.7Hz,1H),1.56–1.22(m,8H),0.83(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例8N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-(3-羟基-3-甲基丁基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
/>
采用与实施例1类似的合成方法，将1-甲基哌啶-4-酮替换为3-羟基-3-甲基丁醛，制得化合物8，收率21.6％。
MS m/z(ESI):452.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.10(s,1H),7.78(d,J＝7.9Hz,1H),7.52(s,1H),7.41(d,J＝8.0Hz,1H),7.31–7.22(m,1H),7.12–7.02(m,2H),6.90(d,J＝9.3Hz,1H),4.48–4.36(m,1H),4.09–3.96(m,3H),3.93–3.79(m,3H),3.40–3.29(m,2H),3.10–2.90(m,4H),2.63(t,J＝10.1Hz,1H),2.05(d,J＝12.6Hz,1H),1.56–1.22(m,8H),1.20(s,6H),0.83(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例9 4-(2-((1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)氨基甲酰)-5,6-二氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-7(8H)-基)-1-甲基环己烷-1-羧酸
采用与实施例1类似的合成方法，将1-甲基哌啶-4-酮替换为1-甲基-4-羰基环己羧酸，制得化合物9，收率14.7％。
MS m/z(ESI):506.4[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.10(s,1H),7.78(d,J＝7.9Hz,1H),7.52(s,1H),7.41(d,J＝8.0Hz,1H),7.31–7.22(m,1H),7.12–7.02(m,2H),6.90(d,J＝9.3Hz,1H),4.48–4.36(m,1H),4.09–3.96(m,3H),3.93–3.79(m,3H),3.62(s,2H),3.40–3.29(m,2H),2.84–2.57(m,3H),1.90(m,4H),1.65(s,3H),1.56–1.22(m,8H),1.20(m,4H),0.83(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例10N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-(4-羟基-4-甲基环己基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
采用与实施例1类似的合成方法，将1-甲基哌啶-4-酮替换为4-羟基-4-甲基环己烷-1-酮，制得化合物10，收率16.4％。
MS m/z(ESI):478.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.02(s,1H),7.63(d,J＝7.9Hz,1H),7.42(s,1H),7.45(d,J＝8.0Hz,1H),7.31–7.22(m,1H),7.12–7.02(m,2H),6.90(d,J＝9.3Hz,1H),4.48–4.36(m,1H),4.09–3.96(m,3H),3.93–3.79(m,3H),3.62(s,2H),3.40–3.29(m,2H),2.84–2.57(m,3H),1.73-1.62(m,4H),1.65(s,3H),1.56–1.22(m,8H),1.32-1.22(m,4H),1.20(s,3H),0.83(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例11N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-(四氢呋喃-3-基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
采用与实施例1类似的合成方法，将1-甲基哌啶-4-酮替换为二氢呋喃-3(2H)-酮，制得化合物11，收率17.4％。
MS m/z(ESI):478.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.11(s,1H),7.71(d,J＝7.9Hz,1H),7.52(s,1H),7.52(d,J＝8.0Hz,1H),7.32–7.21(m,1H),7.12–7.02(m,2H),6.90(d,J＝9.3Hz,1H),4.48–4.36(m,1H),4.09–3.96(m,3H),3.88–3.67(m,9H),3.62(s,2H),2.98–2.84(m,3H),2.84–2.57(m,3H),2.65–2.52(m,2H)，1.78-1.62(m,2H),1.32-1.22(m,4H),0.83(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例12N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-(1-(氧杂环丁烷-3-基)哌啶-4-基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
采用与实施例1类似的合成方法，将1-甲基哌啶-4-酮替换为1-(氧杂环丁烷-3-基)哌啶-4-酮，制得化合物12，收率14.1％。
MS m/z(ESI):505.2[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.11(s,1H),7.71(d,J＝7.9Hz,1H),7.52(s,1H),7.52(d,J＝8.0Hz,1H),7.32–7.21(m,1H),7.12–7.02(m,2H),6.90(d,J＝9.3Hz,1H),4.71–4.62(m,4H),4.21–4.10(m,2H),3.88–3.72(m,2H),2.88–2.81(m,4H),2.63–2.52(m,3H)，1.78-1.62(m,2H),1.44-1.32(m,4H),1.25-1.20(m,6H),0.83(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例13N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-(1-羟基丙烷-2-基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
采用与实施例1类似的合成方法，将1-甲基哌啶-4-酮替换为1-羟基丙烷-2-酮，制得化合物13，收率12.8％。
MS m/z(ESI):424.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.05(s,1H),7.66(d,J＝7.9Hz,1H),7.48(s,1H),7.42(d,J＝8.0Hz,1H),7.32–7.21(m,1H),7.12–7.02(m,2H),6.90(d,J＝9.3Hz,1H),3.92–3.74(m,3H),3.11–3.02(m,2H),2.84–2.56(m,5H)，1.51-1.42(m,2H),1.25-1.20(m,4H),0.83(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例14N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-(四氢-2H-吡喃-4-基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
采用与实施例1类似的合成方法，将1-甲基哌啶-4-酮替换为四氢-4H-吡喃-4-酮，制得化合物14，收率12.8％。
MS m/z(ESI):424.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.10(s,1H),7.62(d,J＝7.9Hz,1H),7.53(s,1H),7.41(d,J＝8.0Hz,1H),7.31–7.24(m,1H),7.14–7.01(m,2H),6.91(d,J＝9.3Hz,1H),4.11–3.92(m,2H),3.88–3.82(m,1H),3.62–3.51(m,6H),2.84–2.73(m,4H)，2.56–2.43(m,1H),1.53-1.42(m,4H),1.31-1.25(m,4H),0.83(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例15N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
将化合物1d(150mg,0.85mmol)和3-溴-1-甲基-1H-1,2,4-三唑(110mg,1.02mmol)分别加入反应瓶中，然后加入3mL二甲基亚砜，溶解后加入DIEA(300mg,3.10mmol)，120℃搅拌2小时后反应完毕。旋转蒸发除去溶剂后加入乙酸乙酯(50mL×3)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩得到粗品，粗品经制备型HPLC方法纯化分离得到化合物15(45mg,收率14.1％)。
MS m/z(ESI):447[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.10(s,1H),7.55(d,J＝7.9Hz,1H),7.32(dt,J＝8.2,0.9Hz,1H),7.12(ddd,J＝8.2,7.0,1.2Hz,1H),7.02(ddd,J＝8.0,7.1,1.1Hz,1H),6.95(d,J＝2.4Hz,1H),6.85(s,1H),4.32-4.23(m,4H),4.10-4.05(m,2H),3.88-3.75(m,1H),3.72(s,3H),2.85-2.72(m,2H),1.47(m,2H),1.31–1.22(m,4H),0.87(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例16N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-(哒嗪-3-基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
将化合物1d(150mg,0.85mmol)和3-氯哒嗪(100mg,1.02mmol)分别加入反应瓶中，然后加入二甲基亚砜(3mL)，溶解后加入DIEA(300mg,3.10mmol)，120℃搅拌2小时后反应完毕。旋转蒸发除去溶剂后加入乙酸乙酯(50mL×3)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩得到粗品，粗品经制备型HPLC方法纯化分离得到化合物16(35mg,收率12.1％)。
MS m/z(ESI):444.2[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.60(d,J＝2.4Hz,1H)),8.10(s,1H),7.55(d,J＝7.9Hz,1H),7.32(dt,J＝8.2,0.9Hz,1H),7.24-7.18(m,2H),7.12(ddd,J＝8.2,7.0,1.2Hz,1H),7.02(ddd,J＝8.0,7.1,1.1Hz,1H),6.95(d,J＝2.4Hz,1H),6.85(s,1H),4.32-4.23(m,4H),4.10-4.05(m,2H),3.88-3.75(m,1H),2.85-2.72(m,2H),1.47(m,2H),1.31–1.22(m,4H),0.87(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例17N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-(吡嗪-2-基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
将化合物1d(150mg,0.85mmol)和2-氯吡嗪(210mg,1.2mmol)分别加入反应瓶中，然后加入二甲基亚砜(3mL)，溶解后加入DIEA(300mg,3.10mmol)，120℃搅拌2小时后反应完毕。旋转蒸发除去溶剂后加入乙酸乙酯(50mL×3)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥后过滤浓缩得到粗品，粗品经制备型HPLC方法纯化分离得到化合物17(35mg,收率12.1％)。
MS m/z(ESI):444.2[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.40(d,J＝2.4Hz,1H)),8.21(s,1H),7.65(d,J＝7.9Hz,1H),7.43(dt,J＝8.2,0.9Hz,1H),7.32-7.22(m,2H),7.12(ddd,J＝8.2,7.0,1.2Hz,1H),7.02(ddd,J＝8.0,7.1,1.1Hz,1H),6.95(d,J＝2.4Hz,1H),6.85(s,1H),4.32-4.23(m,4H),4.10-4.05(m,2H),3.88-3.75(m,1H),2.85-2.72(m,2H),1.47(m,2H),1.31–1.22(m,4H),0.87(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例18N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-(1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
将化合物1d(150mg,0.85mmol)和4-溴-1-甲基-1H-1,2,3-三唑(110mg,1.02mmol)分别加入反应瓶中，然后加入二甲基亚砜(3mL)，溶解后加入DIEA(300mg,3.10mmol)，120℃搅拌2小时后反应完毕。旋转蒸发除去溶剂后加入乙酸乙酯(50mL×3)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥后过滤浓缩得到粗品，粗品经制备型HPLC方法纯化分离得到化合物18(62mg,收率25.6％)。
MS m/z(ESI):447[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.12(s,1H),7.52(d,J＝7.9Hz,1H),7.30(dt,J＝8.2,0.9Hz,1H),7.22(ddd,J＝8.2,7.0,1.2Hz,1H),7.12(ddd,J＝8.0,7.1,1.1Hz,1H),6.92(d,J＝2.4Hz,1H),6.82(s,1H),4.42-4.32(m,4H),4.10-4.05(m,2H),3.85-3.72(m,1H),3.72(s,3H),2.85-2.72(m,2H),1.47(m,2H),1.31–1.22(m,4H),0.87(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例19N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-(2,2,2-三氟乙基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
将化合物1d(150mg,0.85mmol)和2,2,2-三氟乙基三氟甲烷磺酸酯(210mg,1.02mmol)分别加入反应瓶中，然后加入乙腈(3mL)，溶解后加入DIEA(300mg,3.10mmol)，80℃搅拌2小时后反应完毕。旋转蒸发除去溶剂后加入乙酸乙酯(50mL×3)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩得到粗品，粗品经制备型HPLC方法纯化分离得到化合物19(62mg,收率25.6％)。
MS m/z(ESI):447[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.12(s,1H),7.52(d,J＝7.9Hz,1H),7.30(dt,J＝8.2,0.9Hz,1H),7.22(ddd,J＝8.2,7.0,1.2Hz,1H),7.12(ddd,J＝8.0,7.1,1.1Hz,1H),6.92(d,J＝2.4Hz,1H),6.82(s,1H),4.42-4.32(m,4H),4.10-4.05(m,2H),3.85-3.72(m,1H),3.72(s,3H),2.88-2.85(m,2H),2.82-2.72(m,2H),1.47(m,2H),1.31–1.22(m,4H),0.87(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例20N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)甲基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
将化合物1d(250mg，0.52mmol)和3-甲基氧杂环丁烷-3-甲醛(120mg，0.65mmol)用甲醇(10mL)溶解，再加入乙酸(7.00mg，0.600mmol)，氰基硼氢化钠(77mg，1.20mmol)，在60℃下搅拌反应3小时。反应结束后，加入水(30mL)淬灭反应，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后经制备型HPLC方法纯化分离得到化合物20(24mg，收率13.5％)。
MS m/z(ESI):450.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.12(s,1H),7.52(d,J＝7.9Hz,1H),7.30(dt,J＝8.2,0.9Hz,1H),7.22(ddd,J＝8.2,7.0,1.2Hz,1H),7.12(ddd,J＝8.0,7.1,1.1Hz,1H),6.92(d,J＝2.4Hz,1H),6.82(s,1H),4.42-4.32(m,4H),3.85-3.72(m,1H),3.62(s,2H),2.88-2.81(m,4H),2.22(s,2H),1.47(m,2H),1.31–1.22(m,4H),0.87(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例21N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-(2-(二甲氨基)乙基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
将化合物1d(150mg,0.85mmol)和2-溴-N,N-二甲基乙烷-1-胺(210mg,1.02mmol)分别加入反应瓶中，然后加入乙腈(3mL)，溶解后加入DIEA(300mg,3.10mmol)，80℃搅拌2小时后反应完毕。旋转蒸发除去溶剂后加入乙酸乙酯(50mL×3)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩得到粗品，粗品经制备型HPLC方法纯化分离得到化合物21(31mg,收率14.2％)。
MS m/z(ESI):437.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.12(s,1H),7.52(d,J＝7.9Hz,1H),7.30(dt,J＝8.2,0.9Hz,1H),7.22(ddd,J＝8.2,7.0,1.2Hz,1H),7.12(ddd,J＝8.0,7.1,1.1Hz,1H),6.92(d,J＝2.4Hz,1H),6.82(s,1H),4.42-4.32(m,2H),3.85-3.72(m,1H),3.62(s,2H),2.88-2.81(m,4H),2.37(s,4H),2.21(s,6H),1.47(m,2H),1.31–1.22(m,4H),0.87(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例22N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-(3,3-二氟环丁基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
将化合物1d(250mg，0.52mmol)和3,3-二氟环丁烷-1-酮(100mg，0.65mmol)用甲醇(10mL)溶解，再加入乙酸(7.00mg，0.600mmol)，氰基硼氢化钠(77mg，1.20mmol)，在60℃下搅拌反应3小时。反应结束后，加入水(30mL)淬灭反应，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后经制备型HPLC方法纯化分离得到化合物22(43mg，收率21.4％)。
MS m/z(ESI):456.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.12(s,1H),7.52(d,J＝7.9Hz,1H),7.30(dt,J＝8.2,0.9Hz,1H),7.22(ddd,J＝8.2,7.0,1.2Hz,1H),7.12(ddd,J＝8.0,7.1,1.1Hz,1H),6.92(d,J＝2.4Hz,1H),6.82(s,1H),4.42-4.32(m,2H),3.85-3.72(m,1H),3.62(s,2H),3.21-3.10(m,1H)2.88-2.81(m,4H),1.95-1.82(m,4H),1.47(m,2H),1.31–1.22(m,4H),0.87(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例23N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-(3-羟基-3-甲基环丁基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
将化合物1d(250mg，0.52mmol)和3-羟基-3-甲基环丁烷-1-酮(120mg，0.65mmol)用甲醇(10mL)溶解，再加入乙酸(7.00mg，0.600mmol)，氰基硼氢化钠(77mg，1.20mmol)，在60℃下搅拌反应3小时。反应结束后，加入水(30mL)淬灭反应，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后经制备型HPLC方法纯化分离得到化合物23(33mg，收率18.4％)。
MS m/z(ESI):450.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.21(s,1H),7.54(d,J＝7.9Hz,1H),7.30(dt,J＝8.2,0.9Hz,1H),7.32(ddd,J＝8.2,7.0,1.2Hz,1H),7.21(ddd,J＝8.0,7.1,1.1Hz,1H),6.94(d,J＝2.4Hz,1H),6.81(s,1H),4.42-4.32(m,2H),3.85-3.72(m,1H),3.62(s,2H),3.21-3.10(m,1H)2.88-2.81(m,4H),1.85-1.72(m,4H),1.47(m,2H),1.31–1.22(m,4H),1.20(s,3H),,0.87(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例24N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-(4-(二甲氨基)环己基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
将化合物1d(250mg，0.52mmol)和4-(二甲氨基)环己烷-1-酮(120mg，0.65mmol)用甲醇(10mL)溶解，再加入乙酸(7.00mg，0.600mmol)，氰基硼氢化钠(77mg，1.20mmol)，在60℃下搅拌反应3小时。反应结束后，加入水(30mL)淬灭反应，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后经制备型HPLC方法纯化分离得到化合物24(42mg，收率21.4％)。
MS m/z(ESI):491.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.21(s,1H),7.54(d,J＝7.9Hz,1H),7.30(dt,J＝8.2,0.9Hz,1H),7.32(ddd,J＝8.2,7.0,1.2Hz,1H),7.21(ddd,J＝8.0,7.1,1.1Hz,1H),6.94(d,J＝2.4Hz,1H),6.81(s,1H),4.42-4.32(m,2H),3.85-3.72(m,1H),3.62(s,2H),3.21-3.10(m,1H),2.88-2.81(m,4H),2.57-2.44(m,1H),2.32-2.21(s,6H),1.57-1.42(m,10H),0.87(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例25N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-(2-吗啉代乙基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
将化合物1d(150mg,0.85mmol)和4-(2-溴乙基)吗啉(210mg,1.02mmol)分别加入反应瓶中，然后加入乙腈(3mL)，溶解后加入DIEA(300mg,3.10mmol)，80℃搅拌2小时后反应完毕。旋转蒸发除去溶剂后加入乙酸乙酯(50mL×3)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩得到粗品，粗品经制备型HPLC方法纯化分离得到化合物25(13mg,收率15.6％)。
MS m/z(ESI):479.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.21(s,1H),7.54(d,J＝7.9Hz,1H),7.30(dt,J＝8.2,0.9Hz,1H),7.32(ddd,J＝8.2,7.0,1.2Hz,1H),7.21(ddd,J＝8.0,7.1,1.1Hz,1H),6.94(d,J＝2.4Hz,1H),6.81(s,1H),4.42-4.32(m,2H),3.85-3.72(m,1H),3.62(s,2H),3.59-3.51(m,4H),3.21-3.10(m,1H),2.42-2.31(m,6H),1.57-1.42(m,6H),0.87(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例26N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-(2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
将化合物1d(150mg,0.85mmol)和4-(2-溴乙基)四氢-2H-吡喃(210mg,1.02mmol)分别加入反应瓶中，然后加入乙腈(3mL)，溶解后加入DIEA(300mg,3.10mmol)，80℃搅拌2小时后反应完毕。旋转蒸发除去溶剂后加入乙酸乙酯(50mL×3)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩得到粗品，粗品经制备型HPLC方法纯化分离得到化合物26(14.5mg,收率17.4％)。
MS m/z(ESI):478.2[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.21(s,1H),7.54(d,J＝7.9Hz,1H),7.30(dt,J＝8.2,0.9Hz,1H),7.32(ddd,J＝8.2,7.0,1.2Hz,1H),7.21(ddd,J＝8.0,7.1,1.1Hz,1H),6.94(d,J＝2.4Hz,1H),6.81(s,1H),4.42-4.32(m,2H),3.85-3.72(m,1H),3.70-3.62(m,6H),2.84-2.56(m,4H),1.57-1.29(m,13H),0.87(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例27N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-(2,2-二甲基氧杂环丁烷-3-基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
将化合物1d(250mg，0.52mmol)和2,2-二甲基氧杂环丁烷-3-酮(120mg，0.65mmol)用甲醇(10mL)溶解，再加入乙酸(7.00mg，0.600mmol)，氰基硼氢化钠(77mg，1.20mmol)，在60℃下搅拌反应3小时。反应结束后，加入水(30mL)淬灭反应，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后经制备型HPLC方法纯化分离得到化合物27(52mg，收率25.4％)。
MS m/z(ESI):450.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.21(s,1H),7.54(d,J＝7.9Hz,1H),7.30(dt,J＝8.2,0.9Hz,1H),7.32(ddd,J＝8.2,7.0,1.2Hz,1H),7.21(ddd,J＝8.0,7.1,1.1Hz,1H),6.94(d,J＝2.4Hz,1H),6.81(s,1H),4.82-4.71(m,2H),3.88-3.72(m,3H),3.65-3.61(m,1H),3.62(s,2H),2.88-2.81(m,4H),1.47-1.42(m,2H),1.31-1.25(m,4H),1.20(s,6H),0.87(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例28N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-3-氯-7-(氧杂环丁烷-3-基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
第一步2-((1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)氨基甲酰)-3-氯-5,6-二氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-7(8H)-羧酸叔丁酯28b
将化合物1a(240mg,1.12mol)，化合物28a(330mg,1.12mol)和1-甲基咪唑(280mg,3.37mol)依次加入反应瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺(5mL)搅拌溶解后加入HATU(470mg,1.68mol)。室温搅拌1小时后反应完全，向反应液中加入乙酸乙酯(30mL)进行稀释，用饱和碳酸氢钠溶液(30mL×2)洗涤，再用乙酸乙酯(30mL×2)萃取，合并有机相并用无水硫酸钠干燥。过滤浓缩后得到粗品，粗品通过硅胶柱层析(PE:EA＝3:1)方法纯化得到化合物28b(250mg,收率62.4％)。
MS m/z(ESI):500.2[M+H]+。
第二步N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-3-氯-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺28c
向化合物28b(250mg,0.644mmol)中加入二氯甲烷(2mL)，溶解后加入三氟乙酸(0.5mL)，在室温下搅拌1小时后反应完全，旋转蒸发除去溶剂后得到化合物28c(230mg,收率106.16％)。粗品化合物直接用于下一步反应。
MS m/z(ESI):400.3[M+H]+。
第三步N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-3-氯-7-(氧杂环丁烷-3-基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺28
将化合物28c(230mg，0.45mmol)和3-氧杂环丁酮(78mg，0.65mmol)用甲醇(10mL)溶解，再加入乙酸(7.00mg，0.600mmol)，氰基硼氢化钠(77mg，1.20mmol)，在60℃下搅拌反应3小时。反应结束后，加入水(30mL)淬灭反应，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后经制备型HPLC方法纯化分离得到化合物28(46mg，收率24％)。
MS m/z(ESI):456.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.97(s,1H),7.69(d,J＝7.8Hz,1H),7.46(s,1H),7.33(d,J＝8.0Hz,1H),7.20–7.14(m,1H),7.13–7.05(m,2H),4.75(t,J＝6.5Hz,2H),4.65(t,J＝6.1Hz,2H),4.43(d,J＝5.2Hz,1H),4.07(t,J＝5.5Hz,2H),3.77(t,J＝6.4Hz,1H),3.58(s,2H),3.07(dd,J＝14.7,5.8Hz,1H),2.95(dd,J＝14.6,6.8Hz,1H),2.83–2.77(m,2H),1.40–1.23(m,6H),0.83(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例29N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-3-甲基-7-(氧杂环丁烷-3-基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
将化合物28(150mg，0.32mmol)和三甲基环三硼氧烷(120mg，0.65mmol)用1,4-二氧六环(6mL)溶解，再加入碳酸钠溶液(0.45mL，0.900mmol，2.0M)，四(三苯基膦)钯(24mg，0.03mmol)，在100℃下搅拌反应3小时。反应结束后，加入水(30mL)淬灭反应，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后经制备型HPLC方法纯化分离得到化合物29(22mg，收率15.2％)。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.97(s,1H),7.69(d,J＝7.8Hz,1H),7.46(s,1H),7.33(d,J＝8.0Hz,1H),7.20–7.14(m,1H),7.13–7.05(m,2H),4.75(t,J＝6.5Hz,2H),4.65(t,J＝6.1Hz,2H),4.43(d,J＝5.2Hz,1H),4.07(t,J＝5.5Hz,2H),3.77(t,J＝6.4Hz,1H),3.58(s,2H),3.07(dd,J＝14.7,5.8Hz,1H),2.95(dd,J＝14.6,6.8Hz,1H),2.83–2.77(m,2H),2.23(s,3H),1.40–1.23(m,6H),0.83(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例30N-(1-(1H-吲哚-3-基)己烷-2-基)-7-(螺[2.3]己烷-5-基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-甲酰胺
采用与实施例1类似的合成方法，将1-甲基哌啶-4-酮替换为螺[2.3]己烷-5-酮，制得化合物30，收率16.5％。
MS m/z(ESI):446.4[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.10(s,1H),7.78(d,J＝7.9Hz,1H),7.52(s,1H),7.41(d,J＝8.0Hz,1H),7.31–7.22(m,1H),7.12–7.02(m,2H),6.90(d,J＝9.3Hz,1H),4.24–4.12(m,2H),4.09–3.96(m,1H),3.10–3.03(m,1H),2.84–2.57(m,4H),1.90-1.82(m,4H),1.72–1.31(m,10H),0.83(t,J＝7.1Hz,3H),0.42(s,4H)。
对比例1
按照WO2015116663A1实施例1的合成方法制备得到对比化合物1。
生物实施例1用HPLC检测化合物抑制α-突触核蛋白自聚集的能力
将测试化合物(对于难溶性化合物先用适量DMSO溶解)与新鲜的α-突触核蛋白单体(购于义翘神州公司，Sino Biological)一起加入到纯水中，使蛋白的终浓度为250μg/mL，测试化合物浓度为200μg/mL，随后在37℃下孵育9天，利用HPLC检测孵育后α-突触核蛋白多聚体的峰面积并计算抑制率。分析显示，相比于模型组(无测试化合物)，测试化合物组(即实施例组)在孵育后，α-突触核蛋白多聚体的峰面积显著减小。抑制率＝(模型组峰面积-实施例组峰面积)/模型组峰面积×100％。
本发明实施例化合物抑制α-突触核蛋白聚集的抑制率见下表1。
表1
表1表明，本发明化合物能够显著抑制α-突触核蛋白的自聚集。
生物实施例2用免疫荧光法检测化合物抑制α-突触核蛋白自聚集的能力(细胞实验)
构建表达α-突触核蛋白突变体的慢病毒表达质粒，包装病毒感染SH-SY5Y细胞，筛选稳转细胞株，用免疫荧光法检测化合物对α-突触核蛋白聚集体的影响。同时侵染空载体作为对照。使用α-突触核蛋白磷酸化抗体，检测蛋白在细胞中的聚集情况。具体步骤如下：
提前在24孔板中放入圆形爬片，细胞长满后，进行分组，分别为模型组(慢病毒感染SH-SY5Y细胞)，实施例组(慢病毒感染SH-SY5Y细胞，测试化合物浓度为10μM，干预48小时)，之后停止培养。在24孔板中加入PBS(磷酸盐缓冲液)，放于摇床上缓慢晃洗3分钟。室温下，用4％的多聚甲醛固定30分钟。再用PBS晃洗三次，每次3分钟。加入含有10％马血清的PBST(磷酸盐缓冲液加吐温80)，37℃中孵育1小时。配制抗体稀释液，按比例要求加入一抗(pSer129)。37℃中孵育1小时后再放入冰箱过夜。取出24孔板，PBS摇床上洗三次，每次3分钟。配制二抗稀释液，加入所需比例的二抗，在37℃中孵育1小时后取出。室温下用核染色剂染色15分钟。PBS洗三次，每次3分钟。用甘油和PBS混合液(1:1)封片，晾干后显微镜下观察，用Image J软件统计各个组的荧光强度，荧光强度越高，蛋白聚集能力越强。
实验结果表明本发明化合物能够显著抑制细胞内α-突触核蛋白的自聚集。
生物实施例3用MTT法检测化合物对瞬转细胞存活率的影响
MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其吸光度值(OD值)，可间接反映活细胞数量。OD值越大，细胞存活率越高。
为检测测试化合物对细胞存活率的影响，采用MTT法检测化合物对瞬转细胞存活率的影响。方法如下：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL,铺板使待测细胞调密度至10000个/孔(边缘孔用无菌磷酸盐缓冲液填充)。在5％CO2，37℃细胞培养箱孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),细胞贴壁后，实施例组随即加入测试化合物，使其终浓度为10μM，正常组和模型组则不加入测试化合物；其中正常组采用不做任何处理的细胞，模型组和实施例组则采用转入了α-突触核蛋白质粒的细胞。每组设3个复孔。在细胞培养箱中孵育48小时，倒置显微镜下观察；之后每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4小时后，小心吸去孔内培养液；每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10分钟，使结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪在490nm波长处测量各孔的吸光度值。
实验结果表明本发明化合物能提高细胞的存活率。
生物实施例4脑/血浆比值测定
一、试验目的
以雄性C57BL/6小鼠为研究对象，采用脑灌流技术考察本发明化合物经血脑屏障转运的药代动力学特征，并检测其在小鼠0.25h，1h，4h和8h后血和脑组织样品中的药物浓度，计算脑组织与血浆的平均药物浓度的比值。
二、材料与方法
1、给药制剂
本发明化合物口服给药溶液(1.000mg·mL-1)配制：
称量3.116mg化合物置于EP管中，之后加入DMSO 0.156mL、Solutol 0.312mL和超纯水2.648mL(三者体积比为5：10：85，v:v:v)，涡旋超声使其充分溶解，最终实际浓度为1.000mg·mL-1的澄清给药溶液。
3.116mg×100％÷3.116mL＝1.000mg·mL-1
2、试验动物
C57BL/6小鼠(雄性)，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2019-0010。
禁食：隔夜禁食，不禁水，药后4小时后提供饲料。
3、动物试验方案
选择合格的健康C57BL/6小鼠，每组3只。口服给药(10mg/kg)后，于药后0.25h，1h，4h和8h小鼠眼眶静脉丛采集全血约150μL，置于含有EDTA-K2抗凝的离心管中。给药后，在接近预定时间点前约1分钟，将小鼠麻醉，分别于给药后0.25h，1h，4h和8h进行脑灌流，灌流完成后，用眼科剪和眼科镊剖取小鼠脑组织样品，5min内立即用超纯水冲洗组织表面余血，擦干、称重，加入4倍体积的乙腈-水溶液(10:90，v:v)并匀浆，之后将匀浆液放置-20℃冰箱中待测。所收集的样品在整个试验操作过程中均放在冰浴中。
4、全血样品收集
按上述试验方案中规定的时间点，给药后从C57BL/6小鼠眼眶静脉丛采集全血约150μL，置于含有EDTA-K2的1.5mL离心管中。收集到的全血在2000g，4℃条件下离心10min，分装全部血浆，置于另一干净离心管内，然后置于-20℃冰箱保存，待测。
5、脑灌流方式
调节蠕动泵装置，确保其正常工作，液体稳定顺畅流出，流路内没有空气。用70％CO2和30％O2混合麻醉剂将给药后的小鼠麻醉，待动物处于完全麻醉状态后，迅速用手术剪打开胸腔暴露心脏。用止血钳夹住上腔静脉和下腔静脉，用针头刺入心室，在心房处剪一小口。打开蠕动泵开关，灌流2-5min，灌流液为100U/1000mL肝素钠生理盐水。灌流完成后，用眼科剪和眼科镊剖取小鼠脑组织样品，5min内立即用超纯水冲洗组织表面余血，擦干、称重，加入4倍体积的乙腈-水溶液(10:90，v:v)并匀浆，之后将匀浆液放置-20℃冰箱中待测。
计算脑组织与血浆的平均药物浓度的比值，即脑/血浆比值；
实验结果表明本发明化合物易透过血脑屏障，进入脑内发挥药效。
生物实施例5MPTP诱导小鼠PD模型的行为学及组织学检测
一、试验目的
通过C57BL/6J小鼠连续20天腹腔注射MPTP对黑质、纹状体多巴胺能通路产生可靠和重复性的损害诱导帕金森疾病(Parkinson’s disease，PD)动物模型，在行为学(转棒、抓力测试)，组织学(TH免疫荧光染色)角度开展受试化合物(包括本发明化合物及对照化合物1)对PD治疗作用的药效评估。
二、材料与方法
1、试验动物
C57BL/6J小鼠，8周龄，雄性，每组10只。
2、给药制剂配制
溶剂原液：DMSO，HS 15，超纯水三者体积比为5：10：85。
受试化合物：配制浓度为0.008,0.024,0.08,0.4mg/mL，分别称取0.0004,0.0012,0.0040,0.0200g于EP管中，依次加入DMSO 2.5mL，HS 15 5mL，超纯水42.5mL，涡旋使其溶解。
3、给药方式
MPTP，Day1-2(10mg/kg)，Day3-4(15mg/kg)，Day5-6(20mg/kg)，Day7-20(25mg/kg)，腹腔给药，一天一次；
受试化合物，Day-7-20(0.1，0.3，1，5mg/kg)，灌胃给药，一天一次。
三、行为学检测
1、转棒测试
适应环境：动物测试前放置于测试房间适应环境30-60min；
适应训练：将每只实验动物放置于转棒疲劳仪上适应性训练5min；
正式检测：转棒疲劳仪参数设置为转速：20rpm/min，测试时间：5min，将小鼠分批放置于转棒上进行测试，每结束一轮务必要清除粪便尿液，并用75％酒精消毒擦干；
结果分析：统计各动物在棒时间。
2、抓力测试
将小鼠放置于平台上，双前肢放在抓力竿上。
抓住小鼠尾部，向后直线拉拽。动物在非本意的向后移动时会本能地抓任何物体以阻止后退，直到拉力超过他们的抓力。
动物失去抓力后，前置放大器自动记录拉力的最大值，并显示在液晶屏上，放大器可提供数字或模拟输出。
测量完成后，统计各动物拉力最大值的平均数。
四、免疫组化
行为学结束后每组取3只动物进行心脏灌流；采集部位：纹状体(Str)、黑质(SN)。
1、灌流-固定-沉糖-切片
小鼠进行异氟烷呼吸麻醉。
直剪剪开腹腔及胸腔，暴露心脏，先用生理盐水灌流冲尽血液，再用多聚甲醛进行灌流初固定。
剪下头部，镊子小心拨开脑壳，取出脑组织并放在多聚甲醛溶液中固定24h。
第二天取出放入20％蔗糖溶液24h。
第三天取出放入30％蔗糖溶液24h。
第四天取出放入35％蔗糖溶液24h。
取出脑组织，用OCT包埋剂包埋，冰冻切片机切16μm脑片。
2、免疫荧光染色(TH)
切片复温30min；
封闭：10％血清+0.3％ TritonX-100【每张片约50μl】，室温1h；
甩片，加一抗(PBS稀释)，4℃过夜；
复温30min；
洗一抗(PBS)，5min×3次；
背光加二抗(PBS稀释)，室温2h；
洗二抗(PBS)，5min×3次；
加DAPI封片剂。
实验结果表明本发明化合物具有较低的起效浓度。

Claims (12)

1.式(I)化合物或其药学上可接受的盐,
其中，
R1和R3各自独立地选自H、卤素和C1-6烷基；
R2选自C1-6烷基、C2-6烯基、-C1-4亚烷基-O-C1-4烷基和-C1-4亚烷基-NRaRb；
R4选自：
(a)其中，
Y选自不存在和C1-3亚烷基；
A环选自含1或2个独立选自O和N杂原子的4、5或6元杂环基、C3-7环烷基、苯基、5或6元杂芳基；
R5和R6各自独立地选自不存在、H、卤素、羟基、氰基、羧基、-NRaRb、C1-6烷基、-CF3、-CHF2、-CH2F、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、含1或2个独立选自O和N杂原子的4、5或6元杂环基；
(b)C1-6烷基,其任选地被以下基团取代：卤素、羟基、氰基、羧基、-NRaRb、-CF3、-CHF2和-CH2F；
Ra和Rb各自独立地选自H和C1-6烷基。
2.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，R1和R3各自独立地选自H、氟、氯、甲基、乙基、正丙基和异丙基。
3.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，R2选自C4-6烷基、C4-6烯基、-C1-3亚烷基-O-C1-3烷基和-C1-3亚烷基-NRaRb。
4.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，R2选自选自正丁基、异戊基、-CH2CH2OCH3、-CH2OCH2CH3、-CH2CH2OCH2CH3、-CH2CH2N(CH3)2、-CH2CHCHCH3、-CHCHCH2CH3和-CH2CHC(CH3)2。
5.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物是式(II)所示的化合物，
6.权利要求1-5中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，A环选自氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、吡咯烷基、四氢吡喃基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、螺[2.3]己烷基、苯基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吡唑基、咪唑基、三唑基和四唑基。
7.权利要求1-5中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，R5和R6各自独立地选自不存在、H、氟、氯、羟基、氰基、羧基、-NRaRb、甲基、乙基、正丙基、异丙基、-CF3、-CHF2、-CH2F、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、吡咯烷基、四氢吡喃基、哌啶基、哌嗪基和吗啉基。
8.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，R4选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基，且这些烷基任选地被以下基团取代：氟、氯、羟基、氰基、羧基、-NRaRb、-CF3、-CHF2和-CH2F。
9.权利要求1-8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，Ra和Rb各自独立地选自H、甲基、乙基、正丙基和异丙基。
10.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物选自：
11.药物组合物，包含权利要求1-10中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
12.权利要求1-10任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备与蛋白质聚集相关的神经退行性疾病的药物中的用途。
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