CN116679046A - 一种抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途及试剂盒。本发明首次提出鉴别膜性肾病主要抗原PLA2R不同剪接产物的检测方法，通过尿液分离后的样品进行免疫荧光检测以及Western Blot检测，发现被肾活检和血液检测为PLA2R阴性的膜性肾病患者尿液样品中绝大多数PLA2R仍然是阳性，填补了传统检测中的一个漏洞。本发明根据尿液样品中IgG4阳性信号以及IgG与PLA2R的共定位情况将膜性肾病与其他肾病进行了分辨。同时Western Blot检测结果还鉴定出了不同样品含有不同mRNA剪切体的PLA2R蛋白。而且本发明样品采集便利，检测的可重复性更高，使得无创检测得以实现。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物和免疫检测领域，尤其涉及一种抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途及试剂盒。
背景技术
目前，中国慢性肾脏病(CKD)患病率为10.8％。其中，膜性肾病(MN)是以肾小球基底膜上皮细胞下免疫复合物沉积伴基底膜增厚为特征的一组疾病，是成人肾病综合征的常见原因，且发病率有逐年增加的趋势。在中国，膜性肾病是继IgA肾病之后原发性肾小球疾病的第二病因，同时也是导致终末期肾脏疾病(ESRD)的重要病因。2016年南方医院侯凡凡院士团队的一项大规模研究显示，膜性肾病比例达23.4％，仅次于IgA肾病(28.1％)。
目前临床常用的肾脏疾病检测方法是肾脏活检，即肾穿刺检查，膜性肾病的检测和诊断也依赖于这种检查。肾穿刺检查是一项有损伤性的检查方法，一般需要在三级以上医院及其相关检测机构配合进行，普及性较差。目前还有一种检测手段是检测患者血中的PLA2R自身抗体，但该检测法检出率(约70％)比肾活检要低很多。这两种检测法都发现还有一定比例(10％-30％)的患者是PLA2R阴性。这部分阴性病人目前被认为是另有多种其他抗原，这给临床病理检测造成一定的难度。
因此，现有技术还有待改进。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途及试剂盒，旨在解决现有技术中缺乏高效、简单、非侵入且检出率高的膜性肾病检测试剂以及方法的问题。
本发明的技术方案如下：
一种抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途，其中，所述抗体包括抗-IgG4抗体、抗-PLA2R抗体以及抗-IgG抗体，所述检测试剂用于免疫荧光染色检测受试者的IgG-PLA2R共定位信号和IgG4荧光信号，以及Western Blot检测PLA2R剪切体的分子量大小。
所述的抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途，其中，所述抗体还包括抗-THSD7A抗体、抗-Ext2抗体、抗-Ext1抗体以及抗-NELL1抗体。
所述的抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途，其中，所述检测试剂的应用方法包括步骤：
收集受试者的尿液样本；
将所述尿液样本离心或者用滤膜过滤，收集沉降物；
将所述沉降物用缓冲液重悬，得到尿液悬浮液；
将所述尿液悬浮液分成两份，一份加入多聚甲醛进行固定，得到多聚甲醛尿液悬浮液，另一份加入SDS凝胶电泳样品缓冲液，得到SDS尿液悬浮液；
将所述多聚甲醛尿液悬浮液滴于盖玻片上，干燥后得到尿液涂片样本，并对所述尿液涂片样本进行免疫荧光染色；
观察所述尿液涂片样本免疫荧光染色后的IgG-PLA2R共定位信号以及IgG4荧光信号，并根据所述IgG-PLA2R共定位信号以及IgG4荧光信号对受试者的膜性肾病进行鉴定；
对所述SDS尿液悬浮液进行Western Blot检测，进行PLA2R剪切体的鉴别，并根据PLA2R剪切体的分子量大小确定膜性肾病的PLA2R亚型。
所述的抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途，其中，根据所述IgG-PLA2R共定位信号以及IgG4荧光信号对受试者的膜性肾病进行鉴定具体为：如果受试者的尿液涂片样本中存在IgG-PLA2R共定位信号以及IgG4荧光信号，则鉴定受试者为膜性肾病。
所述的抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途，其中，将所述尿液样本在1000-4000转/分的转速下离心10min-20min，或者用孔径0.4μm的滤膜过滤，收集沉降物。
所述的抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途，其中，所述沉降物包含细胞、细胞碎片、附着在细胞或细胞碎片上的免疫复合物中的一种或多种。
所述的抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途，其中，所述PLA2R亚型包括X1型、X3型和X5型。
所述的抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途，其中，所述X1型PLA2R剪切体的分子量大小为180kd，所述X3型PLA2R剪切体的分子量大小为100kd，所述X5型PLA2R剪切体的分子量大小为85kd。
一种用于膜性肾病检测的试剂盒，其中，所述试剂盒包含：载片试剂、抗-IgG4抗体、抗-PLA2R抗体、抗-IgG抗体、荧光标记的二抗，以及多聚甲醛、缓冲液和Western Blot检测试剂；所述试剂盒用于免疫荧光染色检测受试者的IgG-PLA2R共定位信号和IgG4荧光信号，以及Western Blot检测PLA2R剪切体的分子量大小。
所述的用于膜性肾病检测的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括抗-THSD7A抗体、抗-Ext2抗体、抗-Ext1抗体以及抗-NELL1抗体。
有益效果：本发明提供了一种抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途及试剂盒。本发明通过尿液分离后的样品进行免疫荧光检测以及Western Blot检测，发现被肾活检和血液检测为PLA2R阴性的膜性肾病患者尿液样品中PLA2R仍然是阳性。本发明根据尿液样品中IgG4阳性信号以及IgG与PLA2R的共定位情况将膜性肾病与其他肾病进行了分辨。同时Western Blot检测结果还鉴定出了PLA2R蛋白的不同mRNA剪切体。与传统方法相比，本发明首次提出了PLA2R抗原分型鉴别法，结合荧光信号确定免疫复合物、Western Blot鉴别抗原分子量大小和非侵入式的检测方式对膜性肾病进行准确诊断。利用尿作为检测样品使得样品采集更加便利，检测的可重复性更高和无创检测得以实现；利用离心过滤分离后的免疫复合物进行检测减少了背景干扰；利用免疫荧光和Western Blot相结合的方法不但能起到相互验证的效果，同时还鉴别出PLA2R抗原的多样性。本发明还进一步发现肾活检等方法判别为PLA2R阴性的患者(约占10％-30％)，使用本方法检测仍然为阳性，填补了传统检测中的一个漏洞。
附图说明
图1为本发明实施例提供的所述检测试剂的检测流程示意图。
图2为本发明实施例提供的膜性肾病患者(MN)尿样与对照尿样(IgAN)中IgG与PLA2R的共定位情况。
图3为本发明实施例提供的膜性肾病患者(MN)尿样与对照尿样(IgAN)中IgG4的荧光信号。
图4为本发明实施例提供的其他肾病患者尿样的IgG4荧光信号以及IgG与PLA2R的共定位情况。
图5为本发明实施例提供的肾活检PLA2R阳性的样品中PLA2R水平与尿样检测荧光强度的比较。
图6为本发明实施例提供的肾活检PLA2R阴性的样品中PLA2R水平与尿样检测荧光强度的比较。
图7为本发明实施例提供的肾活检PLA2R阴性的样品中Ext1、Ext2和NELL1抗体与IgG4或PLA2R的共定位情况。
图8为本发明实施例提供的Western Blot检测结果示意图以及PLA2R存在的剪切体产物示意图。
具体实施方式
本发明提供一种抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途及试剂盒，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途，所述抗体包括抗-IgG4抗体、抗-PLA2R抗体以及抗-IgG抗体，所述检测试剂用于免疫荧光染色检测受试者的IgG-PLA2R共定位信号和IgG4荧光信号，以及Western Blot检测PLA2R剪切体的分子量大小。
在一些实施方式中，所述抗体还包括抗-THSD7A抗体、抗-Ext2抗体、抗-Ext1抗体以及抗-NELL1抗体。
PLA2R为膜性肾病患者的标志检测物，但其特异性不强，检出率约70％。因此，本发明实施例还检测了THSD7A(另外一种膜性肾病抗原)，以及后继发现的新抗原Ext1、Ext2和NELL1。同时，有报道称抗原可部分地结合于膜性肾病患者尿中的免疫复合物上，也就是与PLA2R信号部分重叠。故而本发明实施例首次提出了PLA2R抗原分型鉴别法，结合荧光信号确定免疫复合物、Western Blot鉴别抗原分子量大小和非侵入式的检测方式对膜性肾病进行准确诊断。本发明利用尿作为检测样品，使得样品采集更加便利，检测的可重复性更高和无创检测得以实现；利用离心过滤分离后的免疫复合物进行检测减少了背景干扰；利用免疫荧光和Western Blot相结合的方法不但能起到相互验证的效果，同时还鉴别出PLA2R抗原的多样性。这一方案可以填补现有检测技术的明显漏洞。
在一些实施方式中，所述检测试剂的应用方法包括步骤：
S100、收集受试者的尿液样本；
S200、将所述尿液样本离心或者用滤膜过滤，收集沉降物；
S300、将所述沉降物用缓冲液重悬，得到尿液悬浮液；
S400、将所述尿液悬浮液分成两份，一份加入多聚甲醛进行固定，得到多聚甲醛尿液悬浮液，另一份加入SDS凝胶电泳样品缓冲液，得到SDS尿液悬浮液；
S500、将所述多聚甲醛尿液悬浮液滴于盖玻片上，干燥后得到尿液涂片样本，并对所述尿液涂片样本进行免疫荧光染色；
S600、观察所述尿液涂片样本免疫荧光染色后的IgG-PLA2R共定位信号以及IgG4荧光信号，并根据所述IgG-PLA2R共定位信号以及IgG4荧光信号对受试者的膜性肾病进行鉴定；
S700、对所述SDS尿液悬浮液进行Western Blot检测，进行PLA2R剪切体的鉴别，并根据PLA2R剪切体的分子量大小确定膜性肾病的PLA2R亚型。
在一些实施方式中，步骤S100中，受试者包括正常人、膜性肾病患者、其他肾病患者，或者肾活检和血液检测为PLA2R阴性的膜性肾病患者等等。
在一些实施方式中，步骤S200中，将所述尿液样本在1000-4000转/分的转速下离心10min-20min，收集沉降物；或者用孔径0.4μm的滤膜过滤，收集沉降物。
在一些实施方式中，收集到的所述沉降物包含细胞、细胞碎片、附着在细胞或细胞碎片上的免疫复合物中的一种或多种。
PLA2R作为膜性肾病的主要抗原已有大量的文献，但用尿作为检测样品至今未见报道。膜性肾病患者由于出现大量尿蛋白，这些蛋白均为非选择性地排出尿中，包括大量免疫球蛋白和抗原蛋白，这为特异性检测免疫复合物带来了困难。本发明通过离心与过滤的方式将可溶性的抗体与抗原分子去除，以检测免疫复合物的形式进行检测，使得特异性检出成为可能。
在一些实施方式中，步骤S300中，所述缓冲液为PBS缓冲液，或者其他磷酸盐缓冲液。缓冲液的体积可根据具体需要进行确定。例如，可按浓缩10倍的比例向沉降物中加入PBS缓冲液悬浮。
在一些实施方式中，步骤S400中，可将所述尿液悬浮液平均分成两份，一份加入等体积的多聚甲醛进行固定，另一份加入等体积的SDS凝胶电泳样品缓冲液；也可根据具体需要各取一定体积的尿液悬浮液，再各自加入等体积的多聚甲醛或者SDS凝胶电泳样品缓冲液。
具体的，加入4％多聚甲醛固定30min。将固定后的尿液悬浮液滴于盖玻片上，干燥后得到尿液涂片样本，用于免疫荧光染色。
具体的，加入SDS凝胶电泳样品缓冲液后的尿液悬浮液可于-20℃保存，用于Western Blot检测。
在一些实施方式中，步骤S500中，对所述尿液涂片样本进行免疫荧光染色包括IgG-PLA2R免疫复合物染色、IgG4免疫复合物染色、THSD7A染色、PLA2R-Ext2-NELL1共染色以及IgG4-Ext1-NELL1共染色。
在一些实施方式中，步骤S600中，用显微镜观察免疫荧光染色的荧光信号，并根据荧光信号确定IgG和PLA2R阳性和共定位信号，IgG4阳性信号，PLA2R与Ext2和NELL1共定位信号，IgG4与Ext1和NELL1共定位信号。同时，还可以通过DIC图像识别细胞和颗粒状物的形态与位置。
在一些实施方式中，步骤S600中，根据所述IgG-PLA2R共定位信号以及IgG4荧光信号对受试者的膜性肾病进行鉴定具体为：如果受试者的尿液涂片样本中存在IgG-PLA2R共定位信号以及IgG4荧光信号，则鉴定受试者为膜性肾病。
PLA2R为膜性肾病患者的标志检测物，但其特异性不强，检出率约70％。因此，本发明实施例还检测了THSD7A(另外一种膜性肾病抗原)，以及后继发现的新抗原Ext1、Ext2和NELL1。同时，有报道称抗原可部分地结合于膜性肾病患者尿中的免疫复合物上，也就是与PLA2R信号部分重叠。故而本发明实施例还通过免疫荧光和Western Blot对尿中PLA2R免疫复合物进行检测，鉴定肾脏中沉积的免疫复合物。这一方案可以填补现有检测技术的明显漏洞。
在一些实施方式中，步骤S700中，所述PLA2R亚型包括X1型、X3型和X5型。
具体的，所述X1型PLA2R剪切体的分子量大小为180kd，所述X3型PLA2R剪切体的分子量大小为100kd，所述X5型PLA2R剪切体的分子量大小为85kd。
具体的，Western Blot检测中，采用正常人尿样和其他肾病患者尿样作为阴性对照，用PLA2R阳性的膜性肾病患者尿样作为阳性对照进行SDS-PAGE和转膜，对PLA2R阴性的膜性肾病患者尿样进行WB检测，并根据条带分子量大小确定PLA2R亚型：X1型(180kd)，X3型(100kd)和X5型(85kd)。
NCBI数据库中人PLA2R可分为X1、X2、X3、X4和X5共5种不同剪切体。X2和X4由于没有跨膜结构，可以排除不会出现于细胞表面。X1、X3和X5有跨膜区为受体型蛋白。X3和X5虽然缺少N-末端一段氨基酸序列，但根据已报道患者血清抗原表位，这两种异构体均可成为有效抗原。全长分子X1(1463aa)分子量约180kd，X3和X5估计在85-110kd之间，这与WesternBlot中膜性肾病患者尿中出现的三种不同Kd蛋白带相一致。
在另一些实施方式中，还可以利用流式细胞仪技术，利用抗人IgG和PLA2R共染色的方法进行鉴别膜性肾病。
在另一些实施方式中，还可以利用RT-PCR技术鉴别PLA2R的不同剪接体产物以鉴定抗原类型。
图1所示即为本发明实施例所述检测试剂的检测流程示意图。收集受试者(包括正常人、膜性肾病患者、其他肾病患者，或者肾活检和血液检测为PLA2R阴性的膜性肾病患者)尿液后，2000g离心10min或者孔径0.4μm滤膜过滤，将得到的沉降物分成两部分，一部分用4％多聚甲醛固定30min，用于免疫荧光染色，另一部分用PBS缓冲液悬浮后加入SDS凝胶电泳样品缓冲液中混匀，进行Western Blot检测。通过荧光染色和Western Blot检测对膜性肾病进行鉴定：首先，根据尿液样品中IgG与PLA2R的阳性信号及其共定位情况将膜性肾病与其他肾病进行分辨；之后，根据样品中IgG4阳性信号进一步确定膜性肾病；然后，根据PLA2R信号强弱、颗粒大小和数量多少确定PLA2R的半定量标准(+、++、+++)；最后，根据Western Blot PLA2R分子量大小确定患者的PLA2R亚型，180kd为X1型，100kd为X3型，85kd为X5型。本发明通过免疫荧光和Western Blot对尿中PLA2R免疫复合物的检测，可以填补现有检测技术的明显漏洞。
本发明实施例还提供一种用于膜性肾病检测的试剂盒，所述试剂盒包含：载片试剂、抗-IgG4抗体、抗-PLA2R抗体、抗-IgG抗体、荧光标记的二抗，以及多聚甲醛、缓冲液和Western Blot检测试剂；所述试剂盒用于免疫荧光染色检测受试者的IgG-PLA2R共定位信号和IgG4荧光信号，以及Western Blot检测PLA2R剪切体的分子量大小。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括抗-THSD7A抗体、抗-Ext2抗体、抗-Ext1抗体以及抗-NELL1抗体。
下面通过具体实施例对本发明一种抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途及试剂盒做进一步的解释说明。
实施例1样品处理
本实施例所采用的样品为肾活检PLA2R阳性和阴性的膜性患者、其他肾病患者和正常人的尿液样品。
(1)取40mL尿液样品，经4000转/分离心10min，得到沉降物，并按浓缩10倍的比例加入4mL的PBS缓冲液悬浮；
(2)用一次性lml注射器取0.5ml悬浮液，经0.4μm孔径滤膜过滤，用50μl PBS重悬后移至1.5ml小管中，加入等量4％多聚甲醛，并按每个盖玻片30μl滴于准备用于染色的盖玻片上，干燥后用于免疫荧光染色；
(3)取0.5ml悬浮液加进含有0.5ml的2×SDS凝胶电泳样品缓冲液中混匀，-20℃保存待用于Western Blot检测。
实施例2荧光染色
取实施例1准备的用于染色的盖玻片，进行免疫荧光染色，操作步骤与所用试剂参照本领域常规技术。
荧光染色方案如下：
A.IgG和PLA2R免疫复合物染色：用兔抗人IgG抗体和鼠抗人PLA2R为一抗，Cy2标记的驴抗兔和Cy5标记的驴抗鼠IgG为二抗进行共染色。一抗和二抗温育时间均为1.5小时，染色最后5分钟时加DAPI进行核染色，PBS洗5遍后封片；
B.IgG4免疫复合物染色：用鼠抗人IgG4为一抗，Cy5标记的驴抗鼠IgG为二抗进行染色，染色最后5分钟时加DAPI进行核染色，PBS洗5遍后封片；
C.THSD7A染色：病例血清的THSD7A抗体检测(通过试剂盒染色)；
D.PLA2R与Ext2和NELL1的共染色:用鼠抗人PLA2R、兔抗人Ext2和NELL作为一抗，Cy5标记的驴抗鼠IgG和Cy2标记的驴抗兔IgG为二抗进行共染色；
E.IgG4与Ext1和NELL1的共染色：用鼠抗人IgG4、兔抗人Ext1和NELL1作为一抗，Cy5标记的驴抗鼠IgG和Cy2标记的驴抗兔IgG为二抗进行共染色。
染色之后，通过荧光显微镜观察荧光信号：
A.确定IgG和PLA2R阳性和共定位信号；
B.确定IgG4阳性信号；
C.确定PLA2R与Ext2和NELL1共定位信号；
D.确定IgG4与Ext1和NELL1共定位信号。
并通过DIC图像识别细胞和颗粒状物的形态与位置。
实施例3Western Blot检测
取实施例1准备的用于WB检测的样品，采用正常人尿样、其他肾病患者尿样作为阴性对照，用PLA2R阳性的膜性肾病患者尿样作为阳性对照进行SDS-PAGE和转膜；用鼠抗人PLA2R抗体作为一抗，酶标羊抗鼠作为二抗进行检测。根据条带分子量大小确定PLA2R亚型：X1型(180kd)，X3型(100kd)和X5型(85kd)。
实施例4膜性肾病鉴定
根据实施例2的荧光染色结果以及实施例3的Western Blot检测结果进行膜性肾病的鉴定。
(1)根据样品中IgG4阳性信号以及IgG与PLA2R的共定位情况鉴定膜性肾病
图2所示为用兔抗人IgG和鼠抗人PLA2R两种抗体双染，膜性肾病患者(MN)尿样与对照尿样(IgAN)中IgG与PLA2R的共定位情况。由图可知，膜性肾病患者尿样中IgG(绿色)与PLA2R(红色)高度重合，证明它们以免疫复合物形式存在。而PLA2R免疫复合物在对照的IgAN样品中不存在。
图3所示为用鼠抗人IgG4单染，膜性肾病患者(MN)尿样与对照尿样(IgAN)中IgG4的荧光信号。由图可知，膜性肾病尿样中IgG4呈阳性(红色)，以点状和块状形式存在，样品中有大量小圆颗粒(见上排图)。对照样品IgG4阴性细胞较多(见下排图)。
图4所示为其他肾病患者尿样的IgG4荧光信号以及IgG与PLA2R的共定位情况。对膜性肾病之外的其他肾病患者，包括糖尿病肾病(DN)、FSGS、狼疮(LN)和微小病变(MCD)患者尿样进行了IgG4染色，以及PLA2R与IgG共染色。由图可知，IgG4几乎在所有样品中均显阴性。IgG信号存在于狼疮样品中，PLA2R普遍存在于狼疮样品中和少数其他疾病中，但都不与IgG共定位。
(2)肾活检PLA2R阳性以及阴性的样品中PLA2R水平与尿样检测荧光强度的比较
图5所示为肾活检PLA2R阳性的样品中PLA2R水平与尿样检测荧光强度的比较。用肾活检PLA2R分别为+、++和+++(逐渐增加浓度)的病人尿样进行IgG和PLA2R共染或IgG4单染。图中，上、中、下三排分别为肾活检+、++和+++的患者尿液染色结果。左侧两列图为PLA2R和IgG共染结果，右侧一列图为IgG4染色结果。三个样品都显示出PLA2R和IgG的完全重合，同时染色颗粒数量与亮度与肾活检结果基本一致。同一样品的IgG4与PLA2R水平也几乎一样。这说明肾活检样品PLA2R水平与尿样检测荧光强度相测吻合。
图6所示为肾活检PLA2R阴性的样品中PLA2R水平与尿样检测荧光强度的比较。其中，8例肾活检PLA2R为阴性的病人尿样检查结果全部出现了PLA2R阳性结果(图6a，1-8)。按PLA2R水平由低到高排列为1-8号，其中大多数的样品PLA2R信号明显，阳性颗粒大而多。8个病例的血清THSD7A(另外一种膜性肾病抗原，试剂盒染色)抗体检测结果全为阴性(图6b，1-8)。这说明肾活检PLA2R为阴性的膜性肾病患者的尿样PLA2R仍为阳性。
(3)肾活检PLA2R阴性的样品中Ext1、Ext2和NELL1抗体的共定位检测
利用兔抗人Ext1、Ext2和NELL1抗体分别与鼠抗人IgG4或PLA2R对肾活检PLA2R阴性的尿液进行共染色，结果如图7所示。由图可知，Ext1和Ext2阳性样品各1个，Ext1和Ext2的信号与IgG和PLA2R的信号部分重合(第一和第二排箭头所示)。8个样品NELL1全为阳性，也同样与IgG4和PLA2R信号部分共定位(第三和第四排箭头所示)。
(4)根据Western Blot检测PLA2R分子量大小确定患者的PLA2R亚型
用抗人PLA2R抗体对肾活检PLA2R阳性(MN-2R-positive)和阴性(MN-2R-Negative)的膜性肾病患者、其他肾病患者和正常人的尿样进行Western Blot检测，结果如图8a所示。三位PLA2R阳性患者的尿样品出现了180kd条带，其中有一位患者还出现了另外一条在100kd左右的条带。两个PLA2R阴性患者则出现于了85kd左右的条带。图8b所示为膜性肾病患者的主要抗原PLANR存在的多种剪切体产物。NCBI数据库中人PLA2R可分为X1、X2、X3、X4和X5共5种不同剪切体。X2和X4由于没有跨膜结构，可以排除不会出现于细胞表面。X1、X3和X5有跨膜区为受体型蛋白。X3和X5虽然缺少N-末端一段氨基酸序列，但根据已报道患者血清抗原表位，这两种异构体均可成为有效抗原。全长分子X1(1463aa)分子量约180kd，X3和X5估计在85-110kd之间，这与Western Blot中膜性肾病患者尿中出现的三种不同Kd蛋白带相一致。
由上可知，本发明实施例采用尿液分离后的样品进行免疫荧光检测，结果表明，绝大多数被肾活检和血液检测为PLA2R阴性的膜性肾病患者PLA2R仍然是阳性。这一结果也被用来Western Blot检测方法进一步证实。通过数据库查询发现，人体中表达的PLA2R蛋白是5种不同的mRNA剪切体的产物，其中有跨膜结构的三种蛋白的分子量与本发明的WesternBlot结果吻合。本发明进一步用针对后继发现的新抗原Ext1、Ext2和NELL1的抗体进行实验，发现这些抗原普遍存在于尿样中，并非特异地出现在只有膜性肾病的患者中。这些报道的新抗原可部分地结合于膜性肾病患者尿中的免疫复合物上，也就是与PLA2R信号部分重叠。利用Ext1、Ext2和NELL1进行检测也能检测到肾脏中沉积的免疫复合物，但敏感度和准确度要低一些。因此，通过免疫荧光和Western Blot对尿中PLA2R免疫复合物的检测，可以填补现有检测技术的明显漏洞。
综上所述，本发明提供了一种抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途及试剂盒。通过尿液分离后的样品进行免疫荧光检测以及Western Blot检测，发现被肾活检和血液检测为PLA2R阴性的膜性肾病患者尿液样品中PLA2R仍然是阳性。本发明根据尿液样品中IgG4阳性信号以及IgG与PLA2R的共定位情况将膜性肾病与其他肾病进行了分辨。同时WesternBlot检测结果还鉴定出了PLA2R蛋白的不同mRNA剪切体。与传统方法相比，本发明首次提出了PLA2R抗原的分型检测法，结合荧光信号确定免疫复合物、Western Blot鉴别抗原分子量大小和非侵入式的检测方式对膜性肾病进行准确诊断。本发明利用尿作为检测样品，使得样品采集更加便利，检测的可重复性更高和无创检测得以实现；利用离心过滤分离后的免疫复合物进行检测减少了背景干扰；利用免疫荧光和Western Blot相结合的方法不但能起到相互验证的效果，同时还鉴别出PLA2R抗原的多样性。同时，本发明还进一步发现肾活检等方法判别为PLA2R阴性的患者(约占10％-30％)，使用本发明方法检测仍然为阳性，这一方案可以填补现有检测技术的明显漏洞。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途，其特征在于，所述抗体包括抗-IgG4抗体、抗-PLA2R抗体以及抗-IgG抗体，所述检测试剂用于免疫荧光染色检测受试者的IgG-PLA2R共定位信号和IgG4荧光信号，以及Western Blot检测PLA2R剪切体的分子量大小。
2.根据权利要求1所述的抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途，其特征在于，所述抗体还包括抗-THSD7A抗体、抗-Ext2抗体、抗-Ext1抗体以及抗-NELL1抗体。
3.根据权利要求1所述的抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途，其特征在于，所述检测试剂的应用方法包括步骤：
收集受试者的尿液样本；
将所述尿液样本离心或者用滤膜过滤，收集沉降物；
将所述沉降物用缓冲液重悬，得到尿液悬浮液；
将所述尿液悬浮液分成两份，一份加入多聚甲醛进行固定，得到多聚甲醛尿液悬浮液，另一份加入SDS凝胶电泳样品缓冲液，得到SDS尿液悬浮液；
将所述多聚甲醛尿液悬浮液滴于盖玻片上，干燥后得到尿液涂片样本，并对所述尿液涂片样本进行免疫荧光染色；
观察所述尿液涂片样本免疫荧光染色后的IgG-PLA2R共定位信号以及IgG4荧光信号，并根据所述IgG-PLA2R共定位信号以及IgG4荧光信号对受试者的膜性肾病进行鉴定；
对所述SDS尿液悬浮液进行Western Blot检测，进行PLA2R剪切体的鉴别，并根据PLA2R剪切体的分子量大小确定膜性肾病的PLA2R亚型。
4.根据权利要求3所述的抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途，其特征在于，根据所述IgG-PLA2R共定位信号以及IgG4荧光信号对受试者的膜性肾病进行鉴定具体为：如果受试者的尿液涂片样本中存在IgG-PLA2R共定位信号以及IgG4荧光信号，则鉴定受试者为膜性肾病。
5.根据权利要求3所述的抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途，其特征在于，将所述尿液样本在1000-4000转/分的转速下离心10min-20min，或者用孔径0.4μm的滤膜过滤，收集沉降物。
6.根据权利要求3所述的抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途，其特征在于，所述沉降物包含细胞、细胞碎片、附着在细胞或细胞碎片上的免疫复合物中的一种或多种。
7.根据权利要求3所述的抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途，其特征在于，所述PLA2R亚型包括X1型、X3型和X5型。
8.根据权利要求7所述的抗体在制备膜性肾病检测试剂中的用途，其特征在于，所述X1型PLA2R剪切体的分子量大小为180kd，所述X3型PLA2R剪切体的分子量大小为100kd，所述X5型PLA2R剪切体的分子量大小为85kd。
9.一种用于膜性肾病检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：载片试剂、抗-IgG4抗体、抗-PLA2R抗体、抗-IgG抗体、荧光标记的二抗，以及多聚甲醛、缓冲液和Western Blot检测试剂；所述试剂盒用于免疫荧光染色检测受试者的IgG-PLA2R共定位信号和IgG4荧光信号，以及Western Blot检测PLA2R剪切体的分子量大小。
10.根据权利要求9所述的用于膜性肾病检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括抗-THSD7A抗体、抗-Ext2抗体、抗-Ext1抗体以及抗-NELL1抗体。
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