CN116676174A - 一种基于RPA结合CRISPR/Cas12恒温扩增技术核酸检测装置 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物技术和分子诊断医学检测领域，提供了一种基于RPA结合CRISPR/Cas12恒温扩增技术核酸检测装置，本发明设计理念为即时检验POCT(Point‑Of‑CareTesting)装置，是分子诊断POCT设备的应用典型。本发明公开一种基于RPA结合CRISPR/Cas12恒温扩增技术核酸检测装置，将样本采集灭活、核酸免提取、微流控芯片操控RPA恒温扩增、CRISPR/Cas12扩增和可视化层析试纸条检测进行整合的POCT装置，大大简化了检测结果的使用复杂的仪器的需求，不但可以满足即时检测快速出具结果的需求，同时还可以更好的满足不具备分子检测条件的基层或者经济较为落后的地区。
Description
技术领域
本发明属于分子生物技术和分子诊断医学检测领域，尤其涉及一种即时检验POCT(Point-Of-CareTesting)装置，具体涉及一种基于RPA结合CRISPR/Cas12恒温扩增技术核酸检测装置。
背景技术
POCT指在病人旁边进行的临床检测及床边检测(BedsideTesting)，通常不一定是临床检验师来进行。是在采样现场即刻进行分析，省去标本在实验室检验时的复杂处理程序，快速得到检验结果的一类新方法。
现场快速检验由中国医学装备协会POCT装备技术专业委员会在多次专家论证基础上统一命名，并将其定义为：在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式。
POCT含义可从两方面进行理解：空间上，在患者身边进行的检验，即“床旁检验”；时间上，可进行“即时检验”。POCT的主要标准是不需要固定的检测场所，试剂和仪器都是便携式的，并且可及时操作。POCT不需要专门临床检测服务和专门的专业技术人员。
一种好的分子POCT产品首先得满足能脱离PCR分区实验室使用。这就意味分子POCT产品的检测耗材上要能集成核酸提取、核酸扩增的功能。更重要的是，整个实现过程要全密闭，以最大程度地在没有PCR分区实验室的情况下避免PCR产物气溶胶污染。
分子诊断技术今日不同以往，着实借力突飞猛进，恒温扩增技术由于其扩增期间不需要特殊的仪器设备而更受瞩目。RPA(Recombinase PolymeraseAmplification)重组酶聚合酶扩增技术，关键技术是3种关键酶或蛋白(重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶，其中重组酶来源于T4噬菌体)，在37℃恒温下进行核酸快速扩增，工作原理要点是：
(1)在三磷酸腺苷ATP存在条件下，重组酶与引物结合,形成蛋白-核酸聚合体，并搜索配对目标；
(2)当引物寻找到配对DNA模板，ATP水解供应能量，重组酶离开引物，并在DNA聚合酶的作用下合成新DNA链；
(3)同时，单链DNA结合蛋白(SingleStrandedDNABinding，SSB)同被置换出来的DNA单链进行结合，防止DNA模板再次形成双链。
CRISPR系统作为新兴的基因编辑和调控工具，具有高度的特异性、灵敏度和灵活性。除在基因编辑和改造方面有重要作用外，在传染病诊断、环境监测、食品安全检测等方面也有着良好的前景。随着CRISPR/Cas系统的深入研究，通过其高特异性识别目标序列和反式切割能力，已经建立了多种简便、灵敏的生物传感平台，解决了传统方法在操作、灵敏度、特异性及检测周期方面存在的不足。
CRISPR/Cas系统由于优异的生物传感性能逐渐成为下一代诊断技术的焦点，有望成为开发理想诊断产品的方法。基于CRISPR/Cas系统的特异性结合活性和高效反式切割能力，将其与电化学、荧光传感技术相结合，已经成功实现了各种靶标分子的检测，检测对象也已经从最初的核酸扩展到金属离子、蛋白质、细菌、小分子等，说明了CRISPR/Cas系统在检测领域具有通用性。
微流控技术的概念被提出已有30余年，以“微型全分析系统”(μ-TAS)和“芯片实验室”(LOC)为主要形式。随着微流控技术的日臻成熟，逐步从前期技术攻关进入到产品商业化研发阶段，具有消耗试剂少、检测速度快、易于集成等优势，为其在临床检验领域提供了巨大的发展机遇。
微流控技术指的是在微米尺度下对微小量级的流体进行精准操控的一种技术，可以实现多个实验流程在一块芯片上自动完成，具有低消耗、高效率、自动化、集成化、便携化等优势。微流控平台将基于CRISPR的技术提升到生物分析和临床诊断领域的新水平。
微流体系统有几个优点：
(1)由于严格的模块分离和密封，交叉污染的风险最小；
(2)试剂消耗少，降低了成本；
(3)无需任何额外的手动操作即可实现进样和出样；
(4)一种通用检测平台，受样品特性(如密度、pH、电导率等)影响较小；
(5)通过合理设计微通道可以实现多重检测；
(6)在一次芯片测定中，可以依次进行多个级联反应，而不会相互影响。
为了解决上述分子POCT产品的多功能一体化全密闭的难题，本发明设计了一种基于RPA结合CRISPR/Cas12恒温扩增技术核酸检测装置，该装置集样本采集灭活、核酸免提取、RPA+CRISPR/Cas12扩增、可视化检测的多功能全密闭的一体机。
发明内容
本申请的目的在于提供一种基于RPA结合CRISPR/Cas12恒温扩增技术核酸检测装置，解决了背景技术中所提出的问题。
为实现上述目的，本申请提供如下技术方案：一种基于RPA结合CRISPR/Cas12恒温扩增技术核酸检测装置，包括：样本采集灭活装置、核酸免提取装置、离心微流控芯片盘操控加样装置、RPA恒温扩增装置、CRISPR/Cas12信号放大装置和可视化层析试纸条检测装置。此外，整个装置使用离心微流控芯片盘进行精细控制和准确操控，保证整个检测过程能够以密闭的自动化和相对独立的方式进行。
作为本申请技术方案的一可选方案，所述样本采集灭活装置：进行生物样本的采集和灭活功能，生物样本主要包含口腔拭子和鼻咽拭子。更进一步的，将生物样本放入一种免核酸提取的灭活型样本保存液中进行裂解和灭活，更进一步的，样本保存管内设有2层嵌入式夹板装置，上宽下窄，在一次性采集拭子旋出保存管时，可以起到有效的挤压和刮取采集拭子，保证细胞能有效的转移至样本保存液中裂解和灭活。更进一步的，样本保存液是一种免核酸提取的灭活型保存液，可以通过调节按压进样按钮的档位，使样本保存管底部的针刺穿保存管底部的力度不同，将不同足量的灭活后核酸样本转移至离心微流控芯片盘操控加样装置。
作为本申请技术方案的一可选方案，所述离心微流控芯片盘操控加样装置：基于微流控芯片盘操控技术，将足量的核酸提取产物注入预先放置的RPA扩增体系的冻干球中；
作为本申请技术方案的一可选方案，所述RPA恒温扩增装置：基于微流控芯片盘操控技术进行RPA恒温扩增反应；
作为本申请技术方案的一可选方案，所述CRISPR/Cas12扩增装置：基于微流控芯片盘操控技术，将足量的扩增产物注入预先放置的CRISPR/Cas12扩增体系的冻干球中反应；
作为本申请技术方案的一可选方案，所述可视化层析试纸条装置：基于微流控芯片盘操控技术，将足量的扩增产物注入可视化层析试纸条的加样孔中进行层析操作和最终的检测结果的呈现。
与现有技术相比，本申请的有益效果如下：
1.本申请通过得益于RPA恒温扩增技术整个反应非常速度，约25-40min左右就可以得到结果(RPA：25-30分钟，CRISPR/Cas12：5-10分钟)；灵敏度可达10Copies/μL；扩增引物长度30-35bp，扩增期间不需要复杂的仪器和设备；本发明公开的一种基于RPA结合CRISPR/Cas12恒温扩增技术核酸检测装置，将样本采集灭活、核酸免提取、离心微流控芯片操控加样、RPA恒温扩增、CRISPR/Cas12信号放大和可视化层析试纸条检测进行整合的POCT装置。为了便于床旁测试应用，在离心微流控芯片盘核酸检测装置中实施了RPA和CRISPR/Cas12a反应，以实现多种病毒的自动化和一体化检测。整个过程在仪器中旋转，加热和光学检测组件的定制紧凑型机器中运行，大大简化了检测结果的使用复杂仪器，不但可以满足快速出具结果的需求，同时可以更好的满足不具备分子检测条件的基层或者经济较为落后的地区使用。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明的000外观整体结构示意图；
图2为本发明的000外观局部结构示意图；
图3为本发明的000俯视结构示意图；
图4为本发明的000内部立体结构示意图；
图5为本发明的000加热膜立体结构示意图；
图6为本发明中100样本采集灭活装置结构示意图；
图7为本发明中200样本采集流程示意图；
图8为本发明中300微流控芯片盘操控加样装置结构示意图；
图9为本发明中400RPA扩增和500CRISPR/Cas12信号放大结构示意图；
图10为本发明中600可视化层析试纸条装置反应原理图；
图11为本发明中600可视化检测窗口结构示意图。
图中：000整体结构示意图：001、旋钮；002、上盖子；003、检测窗口；004、固定底座；005、减震垫；006、电机；007、转盘；008、控制板；009、电源开关；010、加热膜；
100样本采集灭活装置：101、一次性医用采样拭子；102、样本采集管；103、免核酸提取的灭活型样本保存液；104、双层夹板；和105、离心管底部胶塞结构；
200样本采集流程示意图：具体如采集步骤201-207；
300微流控芯片盘操控加样装置；301和302两个样品加样室、303一个稀释剂加样室、304一个混合室、305八个独立的小型RPA反应室，306八个独立的检测室和307和308两个废液室；
400RPA扩增装置；500、CRISPR/Cas12信号放大装置；
600可视化层析试纸条检测装置；601、加样孔；602、可视化窗口；603、质控线；和604、检测线。
具体实施方式
请参阅图1-11，本申请提供一种技术方案：一种基于RPA结合CRISPR/Cas12恒温扩增技术核酸检测装置，包括：000整体外观和立体结构、100样本采集灭活装置、200样本采集流程示意图、300离心微流控芯片盘操控加样装置、400RPA扩增装置、500CRISPR/Cas12信号放大装置、600可视化层析试纸条检测装置。
其中本发明的000整体外观和立体结构示意图如图1、图2、图3和图4和图5，具体包括：001旋钮、002上盖子、003检测窗口、004固定底座、005减震垫、006电机、007转盘、008控制板、009电源开关、010加热膜。其中仪器的组成：006电机固定在004固定底座上，004固定底座下方贴有005减震垫，004固定底座上设有透明003检测窗口。007转盘固定在006电机的转轴上和电机一起转动，007转盘背面有010加热膜提供加热功能。300微流控芯片盘操控加样装置放置在007转盘上并用002上盖子压住，再拧紧001旋钮锁紧。此外仪器还有用在控制电机和加热膜的008控制板，以及连接电源的009电源开关。
本发明中100样本收集灭活装置结构示意图如图6：包括101一次性医用采样拭子、102样本采集管和103免核酸提取的灭活型样本保存液，其中特别之处在于收集灭活装置内嵌有双层夹板104和离心管底部有胶塞结构105。样本为了尽可能减少样本中的干扰，采样前30min内不要吃任何食物，禁止吸烟和饮酒，可以适当嚼一颗口香糖，具体采集方法如图7：
201：旋开102样本采集管管盖，不允许拭子接触管中的103样本保存液；
202：剥掉101一次性采样拭子的外包装袋，取出采样拭子；
203：用采样拭子擦拭一侧口腔内壁，至少擦拭30S；
204：以螺旋状动作轻轻将采样拭子插入102样本采集管中，用力要轻，可能会有一些阻力；
205：在103样本保存液中上下晃动采集拭子的尖端20S，但不要超过插入处；
206：以拧开的动作向上旋转采样拭子，直至拭子完全从管中取出，丢弃用过的采样拭子；
207：重复步骤(202)至(206)，用干净的采样拭子擦拭另一侧口腔内壁。
本发明中300微流控芯片盘操控加样装置结构示意图如图8，是使用聚醚砜通过精密注塑成型制造的，该微流控芯片盘包含301两个样品加样室(用作302多个RT-RPA反应室，预储存相关的冻干试剂和干燥的引物)，303一个稀释剂加样室，304一个混合室(兼作RPA相关冻干试剂的预储存室)，305八个独立的小型RPA反应室，306八个独立的检测室(预储存冻干的CRISPR/Cas12系统)和307和308两个废液室(既没有干燥的引物也没有预加载冻干试剂工作，作为反应本身的NTC)。在混合室中预先装入两颗经过疏水表面处理(直径1.5mm)的不锈钢珠，以提高混合效果。在微流控芯片盘上测定之前，试剂上样程序如下：首先，将引物干燥(RT-RPA的再溶解后浓度为1.6μM，RPA为0.8μM)，然后将冻干球置于相应的腔室中(每个步骤试剂终浓度与溶解后的试管中的浓度相同)，最后用单面胶带密封微流控芯片盘。在微流控芯片盘上测定期间，将体积为40μL的免提取的核酸加入301和302两个样品室(每个室中20μL)，微流控芯片盘的样品入口用粘性铝箔密封。
本发明中400RPA扩增装置和500CRISPR/Cas12扩增装置结构示意图如图9，包括免提取的核酸样品注入芯片中溶解预储存试剂，第一次多重RT-RPA在39.5℃下进行10-15分钟。然后将一小部分扩增子与用于第二个RPA的试剂混合，并分配到第一排扩增室中，这些扩增室用每个靶标的引物对预先存储。在39.5℃下再次孵育第二个RPA15分钟后，将产物转移到相应的第二排检测室以溶解冻干试剂，用于基于CRISPR/Cas12a的检测。以完全密封和自动化的方式对多个靶标的整个检测，全部过程不到40分钟，消除了手动操作中存在扩增子的污染风险。还可以同时检测八个样品，这大大提高了大规模筛选期间的效率，八个独立单元的设计以更灵活的方式工作，避免在零星样品检测期间浪费试剂。
层析试纸条检测核酸，准确的说是利用免疫层析技术来检测样本中核酸扩增后的核酸产物或者反应体系的信号产物，本发明中600可视化层析试纸条装置以CRISPR产物检测试纸条应用了夹心法免疫层析的原理，如图10：
(1)胶体金上标记了特异性的FITC单抗，NC膜的检测线(T线)上固定了链霉亲和素(SA)，NC膜的质控线(C线)上固定了二抗；
(2)当样本中存在一定量的FAM-生物素(或FITC-生物素)双标记探针，其与胶体金形成胶体金-FITC单抗-FAM-生物素的聚合物，该聚合物在T线被捕获，从而T线显色，C线捕获标记有FITC单抗的胶体金而显色；
(3)当靶标分子存在，Cas12蛋白受到激活发生非特异的ssDNA切割，双标记探针被降解，胶体金-FITC单抗-FAM的聚合物不能被T线捕获，则T线不显色，C线仍可捕获标记有FITC单抗的胶体金而显色。
本发明中600可视化窗口结构示意图如图11，其中下端设有601加样孔，上端设有602可视化窗口，其中含有603质控线和604检测线。
本发明的工作原理及使用流程：本发明安装好过后，使用一次性医用采集拭子采集样本，转移至样本保存液中裂解和富集，当按压样本转移按钮时，免提取核酸进入RPA冻干球中反应，CRISPR/Cas12a信号放大，扩增后的核酸产物进入加样孔，保存层析试纸条直立放置，只需扭动左右旋转按钮，以确保扩增产物和电泳缓冲液充分混合，将试纸条保持在直立位置2-5分钟，反应混合物在试纸条上进行免疫层析反应。试纸条上出现单独的质控线条带，则表明试纸条功能正常，扩增产物阳性；试纸条上出现两条条带，质控线条带和检测线条带，则表示扩增产物是阴性结果；当试纸条上没有条带，说明检测结果失控，不可信。
Claims (5)
1.一种基于RPA结合CRISPR/Cas12恒温扩增技术核酸检测装置，包括000整体外观和立体结构、100样本采集灭活装置、200样本采集流程示意图、300离心微流控芯片盘操控加样装置、400RPA扩增装置、500CRISPR/Cas12信号放大装置、600可视化层析试纸条检测装置，其特征在于：
所述000整体外观和立体结构包括，001旋钮、002上盖子、003检测窗口、004固定底座、005减震垫、006电机、007转盘、008控制板、009电源开关、010加热膜。其中仪器的组成：006电机固定在004固定底座上，004固定底座下方贴有005减震垫，004固定底座上设有透明003检测窗口；
所述100样本收集灭活装置结构包括，101一次性医用采样拭子、102样本采集管和103免核酸提取的灭活型样本保存液；
所述300微流控芯片盘操控加样装置结构包括，微流控芯片盘；
所述400RPA扩增装置和500CRISPR/Cas12扩增装置结构包括，免提取的核酸样品注入芯片中溶解预储存试剂；
所述600可视化窗口结构，其中下端设有601加样孔，上端设有602可视化窗口，其中含有603质控线和604检测线。
2.根据权利要求1所述的一种基于RPA结合CRISPR/Cas12恒温扩增技术核酸检测装置，其特征在于：所述007转盘固定在006电机的转轴上和006电机一起转动，所述007转盘背面有010加热膜提供加热功能；
所述300微流控芯片盘操控加样装置放置在007转盘上并用002上盖子压住，再拧紧001旋钮锁紧；
此外仪器还有用在控制电机和加热膜的008控制板，以及连接电源的009电源开关。
3.根据权利要求1所述的一种基于RPA结合CRISPR/Cas12恒温扩增技术核酸检测装置，其特征在于：所述100样本收集灭活装置内嵌有双层夹板104和离心管底部有胶塞结构105。
4.根据权利要求1所述的一种基于RPA结合CRISPR/Cas12恒温扩增技术核酸检测装置，其特征在于：所述300微流控芯片盘操控加样装置是使用聚醚砜通过精密注塑成型制造的。
5.根据权利要求1所述的一种基于RPA结合CRISPR/Cas12恒温扩增技术核酸检测装置，其特征在于：所述微流控芯片盘包含301两个样品加样室(用作302多个RT-RPA反应室，预储存相关的冻干试剂和干燥的引物)，303一个稀释剂加样室，304一个混合室(兼作RPA相关冻干试剂的预储存室)，305八个独立的小型RPA反应室，306八个独立的检测室(预储存冻干的CRISPR/Cas12系统)和307和308两个废液室(既没有干燥的引物也没有预加载冻干试剂工作，作为反应本身的NTC)。
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