CN116675765A - 冠状病毒n蛋白单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了冠状病毒N蛋白单克隆抗体及其应用，涉及生物技术领域。本发明公开了冠状病毒N蛋白的单克隆抗体N1，包括氨基酸序列为WAS的轻链CDR2，分别如SEQ ID NO.3‑4所示的轻链CDR1和轻链CDR3，和分别如SEQ ID NO.7‑9所示的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3。本发明还公开冠状病毒N蛋白的单克隆抗体N4，包括氨基酸序列为WAS的轻链CDR2，分别如SEQ ID NO.12‑13所示的轻链CDR1和轻链CDR3，和分别如SEQ ID NO.16‑18所示的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3。本发明提供的冠状病毒N蛋白单克隆抗体与冠状病毒N蛋白的结合能力强。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及冠状病毒N蛋白单克隆抗体及其应用。
背景技术
核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N蛋白)是冠状病毒重要的结构蛋白，与RNA紧密结合，参与基因组复制和细胞信号通路调节。N蛋白在冠状病毒中含量丰富，序列较保守，而且具有高度免疫原性，对新冠病毒的诊断和排查具有重要价值。
新冠筛查主要有三种手段，包括核酸检测、抗体检测以及抗原检测。核酸检测是筛查新冠的主流手段，该方法相对准确，但所需条件较高、时间较长，抗体检测(IgG或IgM检测)一般在发病7天后才能测出。抗原检测是通过检测N蛋白而实现的，当样品中含有病毒N蛋白时，在T线与特异性抗体相结合，呈现阳性结果。抗原检测有利于早发现，而且操作简单，非常适用于早期自测。
N蛋白及其单克隆抗体是抗原检测的最重要的原材料，鉴于此，本发明的主要目的在于制备N蛋白单克隆抗体，为制备冠状病毒检测试剂盒打下基础。
发明内容
本发明的目的是提供冠状病毒N蛋白单克隆抗体及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的冠状病毒N蛋白单克隆抗体与冠状病毒N蛋白的结合能力强，为制备冠状病毒检测试剂盒打下基础。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种冠状病毒N蛋白的单克隆抗体N1，包括氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的轻链CDR1、氨基酸序列为WAS的轻链CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的轻链CDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的重链CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的重链CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的重链CDR3。
进一步地，所述单克隆抗体N1由保藏编号为CGMCC No.45537的杂交瘤细胞株产生；所述单克隆抗体N1的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步地，所述轻链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供上述的单克隆抗体N1在制备新冠状病毒ELISA检测试剂盒中的应用。
本发明还提供一种新冠状病毒ELISA检测试剂盒，包括上述的单克隆抗体N1。
本发明还提供一种冠状病毒N蛋白的单克隆抗体N4，包括氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示的轻链CDR1、氨基酸序列为WAS的轻链CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的轻链CDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的重链CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示的重链CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示的重链CDR3。
进一步地，所述单克隆抗体N4由保藏编号为CGMCC No.45538的杂交瘤细胞株产生；所述单克隆抗体N4的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
进一步地，所述轻链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述重链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
本发明还提供上述的单克隆抗体N4在制备新冠状病毒ELISA检测试剂盒中的应用。
本发明还提供一种新冠状病毒ELISA检测试剂盒，包括上述的单克隆抗体N4。
本发明公开了以下技术效果：
本发明制备并筛选了4种冠状病毒N蛋白单克隆抗体，通过ELISA检测这些单克隆抗体与冠状病毒N蛋白的结合能力，选择得到2种与N蛋白具有较强结合能力的单克隆抗体N1和N4，为制备冠状病毒检测试剂盒打下基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为N蛋白单克隆抗体在ELISA水平上结合纯化的N蛋白；
图2为N蛋白单克隆抗体N1轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列；图中黑色阴影区域标出了CDR1区(SEQ ID NO.3)、CDR2区(WAS)和CDR3区(SEQ ID NO.4)；
图3为N蛋白单克隆抗体N1重链可变区的核苷酸和氨基酸序列；图中黑色阴影区域标出了CDR1区(SEQ ID NO.7)、CDR2区(SEQ ID NO.8)和CDR3区(SEQ ID NO.9)；
图4为N蛋白单克隆抗体N4轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列；图中黑色阴影区域标出了CDR1区(SEQ ID NO.12)、CDR2区(WAS)和CDR3区(SEQ ID NO.13)；
图5为N蛋白单克隆抗体N4重链可变区的核苷酸和氨基酸序列；图中黑色阴影区域标出了CDR1区(SEQ ID NO.16)、CDR2区(SEQ ID NO.17)和CDR3区(SEQ ID NO.18)；
图6为N蛋白单克隆抗体N1轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)和小鼠氨基酸序列(SEQ ID NO.19)的对比结果；
图7为N蛋白单克隆抗体N1重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)和小鼠氨基酸序列(SEQ ID NO.20)的对比结果；
图8为N蛋白单克隆抗体N4轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO.11)和小鼠氨基酸序列(SEQ ID NO.19)的对比结果；
图9为N蛋白单克隆抗体N4重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO.15)和小鼠氨基酸序列(SEQ ID NO.21)的对比结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中使用的pUC57载体载体购自擎科生物，大肠杆菌TOP10感受态细胞购自北京博迈德基因技术有限公司；大肠杆菌表达株BL21(DE3)购自promega公司。
实施例1构建重组N蛋白表达菌株
1.重组N蛋白基因合成
将编码重组N蛋白的氨基酸序列转化成对应的核苷酸序列，在其上下游分别添加BamHI和Hind III酶切位点，由擎科生物公司合成。合成的目的基因克隆于pUC57载体上，得到pUC57-N载体。
2.重组N蛋白表达载体构建
(1)将含有目的基因的pUC57-N载体和pET-Duet1载体通过限制性酶切位点BamHI和Hind III于37℃双酶切2小时，将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收N蛋白基因和pET-Duet1载体。
(2)使用T4连接酶将步骤(1)获得的N蛋白基因与pET-Duet1载体于16℃连接过夜。
(3)将步骤(2)获得的连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，并涂布于含卡那霉素抗性的LB平板，于37℃培养过夜。
(4)于平板上挑取单克隆菌落至含有卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃摇床培养12小时。
(5)提取质粒，通过酶切鉴定后得到正确的重组N蛋白表达载体。
3.重组N蛋白表达菌株构建
(1)将构建成功的重组表达载体转化大肠杆菌表达株BL21(DE3)中，并涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板，于37℃培养过夜。
(2)于平板上挑取单克隆菌落至含有卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃摇床培养至OD600值为0.8后，加入诱导剂丙基硫代-β-D-半乳糖苷(终浓度为1mM)诱导表达6小时。
(3)通过离心收集菌体，制备蛋白样品，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果表明N蛋白成功表达。
实施例2重组N蛋白的纯化
将实施例1中收集的菌体进行超声破碎。裂解后的菌体经低温高速离心，取上清经过Ni柱亲和层析，分别用含有30、80和300mM咪唑的缓冲液洗脱，并收集300mM咪唑洗脱液，洗脱液通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。洗脱液经TEV酶切过夜，然后反挂Ni柱，去掉His标签。将去掉标签的蛋白液用Superose 6increase 10/300分子筛进行进一步纯化。测定蛋白浓度，备用。
实施例3重组N蛋白杂交瘤细胞制备
1.BalB/C小鼠的免疫
以实施例2纯化的重组N蛋白作为免疫原免疫小鼠。具体步骤如下：将等体积的含有5μg重组N蛋白的PBS和完全弗氏佐剂配制成200μL乳化液，通过皮下注射方式免疫6周龄BalB/C小鼠。4周后用等体积的含5μg重组N蛋白的PBS和不完全弗氏佐剂配制成200μL乳化液再次皮下注射。每个月免疫一次，共免疫4次。最后，用200μL含有10μg重组N蛋白的PBS腹腔注射加强免疫，并在3天后进行杂交瘤融合。
2.杂交瘤的融合
将免疫后待融合的小鼠处死，取出脾脏细胞。通过细胞计数，将小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(ATCC，CRL1581)按照1:3生物比例进行混合，并使用50％PEG(聚乙二醇)融合细胞。将融合后的细胞加入到60mL含1×HAT[次黄嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin)]的RPMI 1640培养基(含有10％胎牛血清)中，按照每孔2滴的量加入到96孔细胞培养板中。随后，将杂交瘤细胞在37℃，5％CO2条件下进行培养，3天进行半量换液。10天后进行抗体筛选。
3.单克隆抗体的筛选
将重组N蛋白用PBS稀释至1μg/mL，取100μL稀释后的重组N蛋白加入ELISA板中，4℃孵育过夜后用PBST清洗3次。包被完毕后，加入200μL 0.2％BSA室温封闭1h，之后用PBST清洗3次。将96孔板细胞培养板中的上清吸出约100μL至ELISA板中，并在原孔补入100μL新鲜的含有1×HAT的RPMI 1640培养基，继续培养细胞，同时设Balb/c阴性血清和阳性血清(1:2000稀释)对照。室温孵育1h后，用PBST洗掉未结合的抗体。然后每孔加入100μL HRP-山羊抗小鼠IgG(1：10000稀释)，室温孵育1h后，并用PBST清洗5次。加入100μL TMB显色5min后加入50μL H2SO4终止反应，并读取450nm处吸光值。OD450值大于2倍阴性孔OD450值的孔为N蛋白结合抗体的阳性孔。
根据上述步骤，筛选出4个N蛋白单克隆杂交瘤细胞株，分别命名为N1、N2、N3和N4。
杂交瘤细胞株N1和N4，均于2023年4月12日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其中，杂交瘤细胞株N1的保藏编号为CGMCC No.45537，杂交瘤细胞株N4的保藏编号为CGMCC No.45538。
实施例4N蛋白单克隆抗体在ELISA水平上结合N蛋白。
1.将实施例2中纯化的重组N蛋白用PBS稀释至1μg/mL，取100μL稀释后的N蛋白加入ELISA板中，4℃孵育过夜后用PBST清洗3次。
2.加入200μL 0.2％BSA室温封闭1h，之后用PBST清洗3次。
3.将小鼠抗N蛋白单克隆抗体(N1、N2、N3和N4)分别稀释至0.01、0.1、1和10μg/mL，同时设阴性对照(Isotype和Balb/c)和阳性对照(Positive serum)。室温孵育1h后，用PBST清洗3次洗掉未结合的抗体。
4.每孔加入100μL HRP-山羊抗小鼠IgG(1：10000稀释)，室温孵育1h后，并用PBST清洗5次。
5.加入100μL TMB显色2-10min后加入50μLH2SO4终止反应。
6.在酶标仪上读取450nm处吸光值。
结果如图1所示。从图1中可以看出，小鼠抗N蛋白单克隆抗体可以在ELISA水平上高水平结合N蛋白。
实施例5N蛋白单克隆抗体的序列
1.RNA的提取
利用Trizol裂解杂交瘤细胞，提取杂交瘤细胞RNA。RNA提取的具体操作步骤如下：每1mLTrizol加入200μL氯仿，充分震荡后静置5min；13000rpm/4℃/15min离心；吸取400μL上清至等体积预冷的异丙醇中，混匀后13000rpm/4℃/15min离心；去除上清，加入70％乙醇清洗沉淀2次，rpm/4℃/10min离心；去除上清，加入40μL无RNA酶的水溶解得到RNA溶液。
2.cDNA的获得
将步骤1提取得到的RNA进行反转录，得到cDNA。反转录的具体步骤如下：取16μLRNA溶液，加入1μL浓度为100mM的oligo dT，70℃反应5min；立即放置冰上；分别加入1μLRNA酶抑制剂，1μL dNTPs(浓度为10mM)，1μLMLV反转录酶和5μL缓冲液，42℃反应60min；72℃处理5min。
3.PCR扩增及测序
以步骤2获得的cDNA为模板，分别采用重链引物F和重链引物R、轻链引物F和轻链引物R进行PCR扩增，分别获得编码重链的轻链的片段并对其进行测序。引物序列如下：
重链引物F：SARGTNMAGCTGSAGSAGTC；
重链引物R：ATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC；
轻链引物F：GAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA；
轻链引物R：GGATACAGTTGGTGCAGCATC；
其中，R＝a或g；Y＝c或t；M＝a或c；K＝g或t；S＝c或g；W＝a或t；V＝a、c或g；N＝a、c、g或t。
上述PCR反应条件：预变性，95℃，3min；变性，95℃，30s；退火，57℃，30s；延伸，72℃，40s，共进行30个循环；最后增加延伸10min。
测序结果如下：
N蛋白单克隆抗体N1的轻链可变区核酸和氨基酸序列显示于图2中，N1的轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。将N1的轻链可变区氨基酸序列第27-38位所示的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)命名为N1轻链CDR1，将N1的轻链可变区氨基酸序列第56-58位所示的氨基酸序列(WAS)命名为N1轻链CDR2，将N1的轻链可变区氨基酸序列第95-103位所示的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)命名为N1轻链CDR3。
N蛋白单克隆抗体N1的重链可变区核酸和氨基酸序列显示于图3中，N1的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。将N1的重链可变区氨基酸序列第26-33位所示的氨基酸序列(SEQ ID NO.7)命名为N1重链CDR1，将N1的重链可变区氨基酸序列第51-58位所示的氨基酸序列(SEQ ID NO.8)命名为N1重链CDR2，将N1的重链可变区氨基酸序列第97-107位所示的氨基酸序列(SEQ ID NO.9)命名为N1重链CDR3。
N蛋白单克隆抗体N4的轻链可变区核酸和氨基酸序列显示于图4中，N4的轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。将N4的轻链可变区氨基酸序列第27-38位所示的氨基酸序列(SEQ ID NO.12)命名为N4轻链CDR1，将N4的轻链可变区氨基酸序列第56-58位所示的氨基酸序列(WAS)命名为N4轻链CDR2，将N4的轻链可变区氨基酸序列第95-103位所示的氨基酸序列(SEQ ID NO.13)命名为N4轻链CDR3。
N蛋白单克隆抗体N4的重链可变区核酸和氨基酸序列显示于图5中，N4的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。将N4的重链可变区氨基酸序列第26-33位所示的氨基酸序列(SEQ ID NO.16)命名为N4重链CDR1，将N4的重链可变区氨基酸序列第51-58位所示的氨基酸序列(SEQ ID NO.17)命名为N4重链CDR2，将N4的重链可变区氨基酸序列第97-107位所示的氨基酸序列(SEQ ID NO.18)命名为N4重链CDR3。
4.抗体序列分析
将步骤3测序所得核酸片段在抗体序列分析工具igBlast tool(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast)中进行分析发现：
N蛋白单克隆抗体N1的轻链编码基因的V基因和J基因分别对应于小鼠IGKV8-30基因和IGKJ1基因，N蛋白单克隆抗体N1轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)与小鼠VJ区氨基酸序列(SEQ ID NO.19)的对比结果如图6所示。
N蛋白单克隆抗体N1的重链编码基因的V基因、D基因和J基因分别对应于小鼠IGHV9-2-1基因、IGHD2-2基因和IGKJ4基因，N蛋白单克隆抗体N1重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)与小鼠VDJ区氨基酸序列(SEQ ID NO.20)的对比结果如图7所示。
N蛋白单克隆抗体N4的轻链编码基因的V基因和J基因分别对应于小鼠IGKV8-30基因和IGKJ1基因，N蛋白单克隆抗体N4轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO.11)与小鼠VJ区氨基酸序列(SEQ ID NO.19)的对比结果如图8所示。
N蛋白单克隆抗体N1的重链编码基因的V基因、D基因和J基因分别对应于小鼠IGHV1-14基因、IGHD2-1基因和IGKJ4基因，N蛋白单克隆抗体N4重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO.15)与小鼠VDJ区氨基酸序列(SEQ ID NO.21)的对比结果如图9所示。
SEQ ID NO.1：
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAATTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGTAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTTTTACTGTCAGCAATATTATAGGTATCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAC。
SEQ ID NO.2：
DIVMSQSPSSLAVSIGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWAST RESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVFYCQQYYRYPPTFGGGTKLEIK。
SEQ ID NO.3：QSLLYSSNQKNY。
SEQ ID NO.4：QQYYRYPPT。
SEQ ID NO.5：
CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGTTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTATATCTTCACAGACTATGCAATGCACTGGGTGAAACAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACTGAGACTGGTGAGCCAACATATGCAGAAGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAACACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCTAGAGGGGGTTACTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAG。
SEQ ID NO.6：
QVQLQQSGAELTRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQALEWIGTIYPGDGD TRYTQIFKGKVTLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCARSYDNYFDYWGQGTTLTVSS。
SEQ ID NO.7：GYIFTDYA。
SEQ ID NO.8：INTETGEP。
SEQ ID NO.9：ARGGYYYAMDY。
SEQ ID NO.10：
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGTAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTTTTACTGTCAGCAATATTATAGGTATCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAC。
SEQ ID NO.11：
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVFYCQQYYRYPPTFGGGTKLEIK。
SEQ ID NO.12：QSLLYSSNQKNY。
SEQ ID NO.13：QQYYRYPPT。
SEQ ID NO.14：
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATTTTAATCTTTACAATGATGGTATTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCACGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCCGGTAACTACGTAGTTCCCATACTAGGCACAGTAGTGCTTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAG。
SEQ ID NO.15：
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYFNLYNDGIKYNEKFKGTATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARSGNYVVPILGTVVLYYAMDYWGQGTSVTVSS。
SEQ ID NO.16：GYTFTSYV。
SEQ ID NO.17：FNLYNDGI。
SEQ ID NO.18：ARSGNYVVPILGTVVLYYAMDY。
SEQ ID NO.19：
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPPTFGGGTKLEIK。
SEQ ID NO.20：
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARGGYYYAMDYWGQGTSVTVSS。
SEQ ID NO.21：
EFQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYIYPYND GTKYNEKFKGTATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARSGNYVVPILGTVVLYYAMD YWGQGTSVTVSS。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种冠状病毒N蛋白的单克隆抗体N1，其特征在于，包括氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的轻链CDR1、氨基酸序列为WAS的轻链CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的轻链CDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的重链CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的重链CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的重链CDR3。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体N1，其特征在于，所述单克隆抗体N1由保藏编号为CGMCCNo.45537的杂交瘤细胞株产生；
所述单克隆抗体N1的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体N1，其特征在于，所述轻链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体N1在制备新冠状病毒ELISA检测试剂盒中的应用。
5.一种新冠状病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体N1。
6.一种冠状病毒N蛋白的单克隆抗体N4，其特征在于，包括氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的轻链CDR1、氨基酸序列为WAS的轻链CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的轻链CDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的重链CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示的重链CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示的重链CDR3。
7.根据权利要求6所述的单克隆抗体N4，其特征在于，
所述单克隆抗体N4由保藏编号为CGMCCNo.45538的杂交瘤细胞株产生；
所述单克隆抗体N4的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
8.根据权利要求7所述的单克隆抗体N4，其特征在于，所述轻链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述重链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
9.一种如权利要求6-8任一项所述的单克隆抗体N4在制备新冠状病毒ELISA检测试剂盒中的应用。
10.一种新冠状病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求6-8任一项所述的单克隆抗体N4。
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Denomination of invention: Monoclonal antibodies against coronavirus N protein and their applications Granted publication date: 20231124 Pledgee: Hebei Baoding Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: Baoding Guolan Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2024980012103 |
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