CN116671639A - 一种大米蛋白肽-锌鳌合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品加工技术领域,尤其涉及一种大米蛋白肽‑锌鳌合物的制备方法,包括如下步骤,将大米蛋白肽溶于去离子水中配成肽液;将ZnSO4加入肽液中,涡旋混匀,混合物料中多肽与锌肽锌比为1:1~3:1,并将混合物料PH值调至5~6;进行螯合反应,反应温度为50℃~70℃,反应时间50~90min;取出后冷却至室温,用三倍无水乙醇沉淀,待沉淀析出,7000r/min离心10分钟,收集沉淀,用无水乙醇洗涤,在用真空冷冻干燥机去除残留的无水乙醇,得到干燥的,并且鳌合率高的大米蛋白肽‑锌鳌合物。本发明利用了大米蛋白肽利于人体吸收,能够促进小肠对锌的吸收并在体内蓄积,从而提高锌的吸收利用率,避免锌离子在碱性的肠道环境产生沉淀而损失进一步提高鳌合物的制备效率。
Description
技术领域
本发明涉及食品加工技术领域,尤其涉及一种大米蛋白肽-锌鳌合物的制备方法。
背景技术
大米蛋白是一种营养价值极高的谷类蛋白,其氨基酸组成较为完整且不含胆固醇,吸收率极高。其生物价为,趋谷物蛋白首位,可与鱼、虾、牛肉,等动物蛋白相媲美,同时大米蛋白具有低致敏性,大米是唯一可免于过敏试验的谷物。大米蛋白肽是从大米蛋白中得到的,大米蛋白肽继承了大米蛋白的优点,同时也具有它独特的功能优势其价值主要体现在消化吸收好具有降胆固醇、降血压作用、预防慢性疾病、增强体能和抗疲劳等功能。
锌是人体必需的微量元素之一,对人体健康状况有重要的调控作用,被医学和营养学界誉为“智能元素”。缺锌会引发人体免疫力下降、发育迟缓、食欲下降及中枢神经系统功能紊乱等问题。锌与肽螯合形成的肽螯合锌具有特殊的单环螯合结构,相对于无机锌盐,肽锌螯合物中的锌更利于被人体吸收,且稳定性更强,具有良好的补锌以及提高机体免疫力的效果。
有研究表明经蛋白水解后得到的小肽能促进小肠对锌的吸收并在体内蓄积,从而提高锌的吸收利用率且安全无毒,因此,以大米蛋白为原料使大米蛋白肽与锌离子鳌合,借助小肽吸收理论,提高多肽和锌离子的吸收利用率具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种大米蛋白肽-锌鳌合物的制备方法,克服现有锌补制剂吸收率低的缺点,促进人体对锌的吸收。
为了实现本发明的目的,本发明采用的技术方案为:
本发明公开了一种大米蛋白肽-锌鳌合物的制备方法,包括如下步骤,
(1)将大米蛋白肽溶于去离子水中配成肽液;
(2)将ZnSO4加入步骤(1)的肽液中,涡旋混匀,混合物料中多肽与锌肽锌比为1:1~3:1,并将混合物料PH值调至5~6;
(3)进行螯合反应,反应温度为50℃~70℃,反应时间50~90min;
(4)取出后冷却至室温,用三倍无水乙醇沉淀,待沉淀析出,7000r/min离心10分钟,收集沉淀,用无水乙醇洗涤,在用真空冷冻干燥机去除残留的无水乙醇,得到干燥的,并且鳌合率高的大米蛋白肽-锌鳌合物。
所述步骤(2)中混合物料中多肽与锌肽锌比为2:1。
所述步骤(2)中混合物料的PH值为5.5。
所述步骤(3)中反应温度为60℃,反应时间为70min。
一种根据权利要求1所述的方法制备的补锌制品,本方法制备的大米蛋白肽锌螯合物的纯度较高,与锌离子螯合率高,能有效促进人体对锌的吸收利用,此外,该制备工艺适合工业化生产
本发明的有益效果在于:
1.本发明以大米蛋白为原料,使大米蛋白肽与锌离子鳌合,利用了大米蛋白肽利于人体吸收,能够促进小肠对锌的吸收并在体内蓄积,从而提高锌的吸收利用率,避免锌离子在碱性的肠道环境产生沉淀而损失进一步提高鳌合物的制备效率。
附图说明
图1是肽锌比对大米蛋白肽锌鳌合能力的影响;
图2是对大米蛋白肽锌鳌合能力的影响;
图3是温度对大米蛋白肽锌鳌合能力的影响;
图4是时间对大米蛋白肽锌鳌合能力的影响;
图5是大米蛋白肽以及大米蛋白肽锌螯合物的紫外光谱;
图6是大米蛋白肽以及大米蛋白肽锌螯合物的红外光谱;
图7是大米蛋白肽的扫描电镜;
图8是大米蛋白肽锌螯合物的扫描电镜;
图9是大米蛋白肽以及大米蛋白肽锌螯合物在不同pH下的溶解率;
图10是大米蛋白肽以及大米蛋白肽锌螯合物经过胃肠消化的溶解率;
图11是大米蛋白肽以及大米蛋白肽锌螯合物经过肠消化的透析率。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明:
参见图1-图11。
本发明公开了一种大米蛋白肽-锌鳌合物的制备方法,
实施例1
本实施例说明米蛋白肽-锌鳌合物的制备工艺。
取0.05g的米蛋白肽溶于的去离子水中,配成底物浓度为5mg/ml的肽液,加入0.05gZnso4,涡旋混匀,调至PH5.5,后进行鳌合反应,反应温度为60℃,反应时间70min为,取出后冷却至室温,用三倍无水乙醇沉淀,待沉淀析出,7000r/min离心10分钟,收集沉淀,用无水乙醇洗涤,再用真空冷冻干燥机去除残留的无水乙醇,得到干燥的,并且鳌合率高的大米蛋白肽-锌鳌合物。
实施例2
本实施例说明米蛋白肽-锌鳌合物的制备工艺。
取0.1g的米蛋白肽溶于的去离子水中,配成底物浓度为10mg/ml的肽液,加入0.05gZnso4,涡旋混匀,调至PH5.0,后进行鳌合反应,反应温度为60℃,反应时间90min,取出后冷却至室温,用三倍无水乙醇沉淀,待沉淀析出,7000r/min离心10分钟,收集沉淀,用无水乙醇洗涤,再用真空冷冻干燥机去除残留的无水乙醇,得到干燥的,并且鳌合率高的大米蛋白肽-锌鳌合物。
实施例3
本实施例说明米蛋白肽-锌鳌合物的制备工艺。
取0.1g的米蛋白肽溶于的去离子水中,配成底物浓度为10mg/ml的肽液,加入0.05gZnso4,涡旋混匀,调至PH6.0,后进行鳌合反应,反应温度为50℃,反应时间90min,取出后冷却至室温,用三倍无水乙醇沉淀,待沉淀析出,7000r/min离心10分钟,收集沉淀,用无水乙醇洗涤,再用真空冷冻干燥机去除残留的无水乙醇,得到干燥的,并且鳌合率高的大米蛋白肽-锌鳌合物。
试验例1
本实施例说明实验条件的筛选
鳌合力的测定方法如下:称取一定量米蛋白肽溶于去离子水中,加入Znso4,配成肽锌比为(1:1,2:1,3:1,4:1,5:1)的肽锌溶液,充分溶解,涡旋混匀,调至PH(4.5,5,5.5,6,6.5)后进行鳌合反应。反应温度为(40℃,50℃,60℃,70℃,80℃)反应时间为(30min,50min,70min,90min,110min)。取出后冷却至室冷却至室温,用三倍无水乙醇沉淀,待沉淀析出,7000r/min离心十分钟,收集沉淀,多次醇洗上清液。再用真空冷冻干燥机去除残留的无水乙醇,得到干燥的螯合物。在考察各因素对大米蛋白肽锌鳌合能力的影响。
锌鳌合能力根据国标“GB5009.14-2017食品安全国家标准食品中锌的测定”中的火焰原子吸收光谱法中的干法灰化方法进行测定,锌鳌合能力表示为每克鳌合物中锌的毫克数(mg/g)。
准确称取固体试样0.5g~5g(精确至0.001g)或准确移取液体试样0.50mL~10.0mL于坩埚中,小火加热炭化至无烟,转移至马弗炉中,于50℃灰化3h~4h。冷却,取出,对于灰化不彻底的试样,加数滴硝酸,小火加热,小心蒸干,再转入550℃马弗炉中,继续灰化1h~2h,至试样呈白灰状,冷却,取出,用适量硝酸溶液(1+1)溶解并用水定容至25mL或50mL。同时做试剂空白试验。
标准曲线的制作
将锌标准系列溶液按质量浓度由低到高的顺序分别导入火焰原子化器,原子化后测其吸光度值,以质量浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,制作标准曲线。在与测定标准溶液相同的实验条件下,将空白溶液和试样溶液分别导入火焰原子化器,原子化后测其吸光度值,与标准系列比较定量。
螯合率:X=(ρ-ρ0)×V/m
X:试样中锌的含量,单位为毫克每千克或毫克每升(mg/kg或mg/L);ρ:试样溶液中锌的质量浓度,单位为毫克每升(mg/L);ρ0:空白溶液中锌的质量浓度,单位为毫克每升(mg/L);V:试样消化液的定容体积,单位为毫升(mL);m:试样称样量或移取体积,单位为克或毫升(g或mL)。
结果如下:
从图1可知,当米蛋白肽锌比为4:1时,由于锌离子含量过多,大量锌离子并没参与鳌合导致鳌合能力较低,但肽锌比值过高,鳌合能力反而缓慢降低,这是因为锌离子已达到饱和状态,继续增加肽锌比反而降低肽利用率。当比值2:1为时,米蛋白肽锌鳌合能力最大为116.80mg.g-1,最终选择米蛋白肽与锌的比值范围为1:1~3:1。
由图2可知,PH对鳌合能力影响较显著,这是因为为蛋白肽与微量元素形成鳌合物的重要因素。PH较低时鳌合能力也较弱,随着PH增大鳌合能力缓慢上升,当PH为5.5时鳌合能力最大为127.88mg.g-1,继续增大反而会降低锌鳌合能力,这是碱性条件下,OH-可与供电子基团竞争金属离子以形成轻基合物,最终形成氢氧化物沉淀。
从图3可知,适当升温会促进鳌合物的生成,60℃时米蛋白肽锌鳌合能力最大为126.73mg.g-1,但过度升温会使多肽发生碳氨而降低鳌合能力,因此高温不利于鳌合物的生成。最终选择温度范围是50℃-70℃。
从图4可知,时间对锌鳌合能力影响并不显著,鳌合时间在30min~70min范围内,鳌合能力呈上升趋势,70min分钟时鳌合能力最大,超过70min大米蛋白肽锌鳌合能力逐渐降低,选取70min作为大米蛋白肽-锌鳌合适宜时间。适宜的时间范围是50min~90min。
在单因素试验的基础上,选取肽锌比1:1~3:1、PH5~6、温度50℃~70℃、和时间50min~90min四个因素做正交实验,以确定最佳工艺,选取因素以及水平见表一。
表一螯合条件因素及水平表
表二.正交优化结果
从正交实验结果的极差分析(表二)可以看出,4因素对螯合率的影响大小为A>B>C>D,实验组合为A2B2C3D1螯合率最大,为130.61mg.g-1。根据均值分析,最佳试验组合为A2B2C2D2,用A2B2C2D2组合进一步实验,得螯合率为136.96mg.g-1。所以,蛋白肽锌的最佳螯合条件为A2B2C2D2,即蛋白肽与锌的摩尔比为2∶1,PH5.5、温度60℃、反映时间70min。
试验例2
本实验说明大米蛋白肽-锌鳌合物的结构表征。
1、米蛋白肽-锌鳌合物前后紫外光谱分析。
将正交优化出的最优参数制备出的大米蛋白肽锌螯合物和大米蛋白肽通过紫外光谱进行结构鉴定。将0.01g样品溶于1mL蒸馏水后放入紫外分光光度计进行全光谱扫描,波长范围为190~400nm。
由图5可知,黑色虚线是大米蛋白肽锌螯合物的紫外光谱图,黑色实现是大米蛋白肽的紫外光谱图。由图可知大米蛋白肽的紫外光谱和肽-锌螯合物的紫外光谱存在显著的差异。大米蛋白肽溶液的最大吸光出现在194.6nm。而大米蛋白肽锌螯合后的最大吸光出现197.0nm且吸收峰的强度减弱。出现这一现象的原因是锌离子与肽段末端的N、O结合,引起肽键中(C=O)的n→π*的电子跃迁引起的。270nm附近的另一个吸收带归因于苯丙氨酸的吸收。此外,该肽在266.2nm处显示出较弱的吸收带。加入锌离子后,吸收带移至262.8nm,强度增加,这可能因为肽的发色团的变化和电子的跃迁。吸收峰的迁移以及强度的变化表明,在与锌离子螯合的过程中,发色团的极化(例如C=O,COOH和NH2)已经改变。
2、米蛋白肽-锌鳌合物前后红外光谱分析
采用将正交优化出的最优参数制备出的大米蛋白肽锌螯合物和大米蛋白肽通过傅里叶变换红外光谱进行结构鉴定。首先将KBr在350℃下干燥4小时,并将其光谱记录为背景。取2mg冷冻干燥的大米蛋白肽或肽锌螯合物与200mg干燥的KBr在玛瑙研钵中研磨混匀,用压片机将混合后的样品压制成透明薄片后,用红外光谱仪在4000和400cm之间的波数区域以4cm的分辨率记录所有FTIR光谱。
由图6知,酰胺的最重要的振动模式是酰胺-Ⅰ振动(C=O拉伸振动,1690-1630cm-1)。对于纯化的大米蛋白肽,酰胺-Ⅰ带出现在1658cm-1,酰胺-Ⅱ带出现在1400cm-1。然而,在添加锌离子之后,这些带移至较高的频率(1660和1412.cm-1)分别代表反对称拉伸振动υas(COO-)和对称拉伸振动υs,这是锌离子通过羧基参加反应所致。锌离子螯合后肽带的移动,表明Zn2+与NH2结合。此外,肽在-NH-C=O中的-NH吸收峰出现在1189.82cm-1处但是在肽与Zn2+反应后此处的吸收峰失,表明Zn2+与氨基的氮原发生反应。当金属离子与有机化合物的配体原子(例如,O,N和S)结合形成螯合物时,由于配位键的振动,吸收峰通常位于远红外区域。Zn-O振动区在500至800cm-1之间,肽与锌离子之间的相互作用导致吸收带从599cm-1转移到610cm-1,一些较弱的吸收带消失了。肽-锌配合物的NH带出现在3337cm-1处;而纯化的大米蛋白肽在3353cm-1处出现。这表明由于锌离子的诱导作用或偶极场效应,大米蛋白肽中NH的电子云密度变强。综合这些结果表明,大米蛋白肽上的锌结合位点是羧基的氧,氨基的氮原子和酰胺的氮原子。
3、大米蛋白肽和大米蛋白肽-锌鳌合物的扫描电镜
分别将大米蛋白肽与肽锌螯合物粉末用双面胶粘贴于铝制样品台上,然后喷涂一薄层金膜,在扫描电镜下观察拍摄样品微观形态并照相。放大倍数为15000倍。
由图7和图8可以知道,经历过螯合作用以后,大米蛋白肽原本平滑的表面经历过螯合以后结构会发生变化,表面会变得粗糙,成颗粒状分布。
3、米蛋白肽-锌鳌合物的体外模拟消化
锌离子的可溶率的测定:将肽锌螯合物和七水合硫酸锌(对照)溶解在水中,将溶液的pH值用HCl和NaOH分别调至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0。将此溶液置于37℃水浴锅中,恒温震荡2h。反应结束后,取一定体积的溶液7000r/min离心10min,利用火焰原子吸收计算总锌含量。
模拟胃肠道条件下锌的透析性和溶解度的测定
模拟胃液的制备方法:用800mL的双蒸水溶解2g的NaCl和3.2g胃蛋白酶,将其混匀备用,用6mol/LHCl将上述溶液的pH值调至1.2,将此溶液定容至1000mL。
模拟肠液的制备方法:准确的称取0.68g的KH2PO4,用70mL的双蒸水溶解,向溶液中加入7.7mL摩尔浓度为0.2mol/L的NaOH。将两者混合均匀后加入1g胰蛋白酶和6g胆盐,待二者溶解后加入适量的NaOH溶液,使体系的pH值为7.6,将此溶液定容至100mL备用。
体外模拟胃肠道消化:取浓度为10mg/mL的大米蛋白多肽锌螯合物和七水硫酸锌,用摩尔浓度为1mol/L的HCl对样品溶液进行调节,使pH值为2.0,向调节好的溶液中加入5mL模拟胃液,混匀后,在37℃水浴振荡2h。待溶液冷却至室温,调节pH到7.2后加入5mL模拟肠液。将溶液混合均匀装入透析袋中(7000Da),在37℃摇床中水浴2h。溶解率测定方法同上。
透析率的测定:在肠液消化后,取透析袋外的水溶液,利用火焰原子吸收测定水溶液中的锌离子的含量,以表示透过模拟肠道的锌离子含量。
由图9可知,肽锌螯合物和七水硫酸锌在不同pH条件下的锌离子释放量如图9所示。在不同pH条件下,大米蛋白肽锌螯合物和七水硫酸锌的溶解度之间存在显着差异。如图所示,大米蛋白肽锌螯合物和七水硫酸锌两者的锌释放率均随pH的升高而降低。但是,在不同的pH条件下,大米蛋白肽锌螯合物的锌离子释放量均要高于七水硫酸锌的锌离子释放量。大米蛋白肽锌螯合物在3.0至6.0的pH范围内相对稳定,并且锌离子的释放百分比均高于90%。尽管在pH7时大米蛋白肽锌螯合物锌离子的释放量明显下降,但锌离子释放量的百分比仍为68.51±2.26%,显著高于七水硫酸锌的锌离子释放量。由图可知,七水硫酸锌在pH升高的同时锌离子的释放就在开始慢慢下降,并且在pH8.0时锌离子的释放的百分比降至36.61±1.39%。结果表大米蛋白肽锌螯合物在PH3.0到pH6.0都具有良好的溶解性。所以试验研究可以表明大米蛋白肽锌结合物在人体的胃肠道中具有良好的溶解性,并且不易形成沉淀。
由图10和图11可知,大米蛋白肽锌螯合物和硫酸锌经模拟胃消化后的溶解率分别75.33±0.99%、62.6±0.65%,二者差异显著(P<0.05);大米蛋白肽锌螯合物和七水硫酸锌经模拟肠道消化后的溶解率分别为40.63±3.02%、33.12±1.9%,二者差异显著(P<0.05);透析率分别为42.46±3.98%、26.92±2.86%,差异显著(P<0.05)。说明螯合物的溶解率在胃肠中均有良好的溶解性,且都高于无机锌盐。虽然无机锌盐在胃中也有较好的溶解性,但进入肠道后其溶解性显著下降,这因为肠道是偏碱性的环境,无机锌离子会形成氢氧化锌沉淀,而大米蛋白肽锌螯合物因其有较稳定的配位键,在胃肠中仍可以较稳定的存在,所以溶解性相较于无机锌盐更好一些。透析率较无机盐高的原因是锌离子与小肽结合后以分子形式直接通过透析袋,而无机锌离子较多会生成沉淀,导致无法透过。体外消化实验表明大米蛋白肽锌螯合物相较于无机锌盐有较好的生物利用率。
本发明具有如下优点:
(1)对大米蛋白肽锌鳌合物的工艺进行了优化,使大米蛋白肽可以最大程度的与锌离子进行鳌合,大大地提高了金属离子的生物利用率,弥补了一些补锌剂的缺陷。
(2)本发明以大米蛋白为原料,使米蛋白肽与锌离子鳌合,利用了大米蛋白肽利于人体吸收,能够促进小肠对锌的吸收并在体内蓄积,从而提高锌的吸收利用率,避免锌离子在碱性的肠道环境产生沉淀而损失。
(3)本发明工艺流程简单,适合工业化生产。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换或直接或间接运用在相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (5)
1.一种大米蛋白肽-锌鳌合物的制备方法,其特征在于:包括如下步骤,
将大米蛋白肽溶于去离子水中配成肽液;
将ZnSO4加入步骤(1)的肽液中,涡旋混匀,混合物料中多肽与锌肽锌比为1:1~3:1,并将混合物料PH值调至5~6;
进行螯合反应,反应温度为50℃~70℃,反应时间50~90min;
取出后冷却至室温,用三倍无水乙醇沉淀,待沉淀析出,7000r/min离心10分钟,收集沉淀,用无水乙醇洗涤,在用真空冷冻干燥机去除残留的无水乙醇,得到干燥的,并且鳌合率高的大米蛋白肽-锌鳌合物。
2.根据权利要求1所述的一种大米蛋白肽-锌鳌合物的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中混合物料中多肽与锌肽锌比为2:1。
3.根据权利要求2所述的一种大米蛋白肽-锌鳌合物的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中混合物料的PH值为5.5。
4.根据权利要求3所述的一种大米蛋白肽-锌鳌合物的制备方法,其特征在于:所述步骤(3)中反应温度为60℃,反应时间为70min。
5.一种根据权利要求1所述的方法制备的补锌制品。
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张全才 等: "米蛋白肽锌的制备工艺研究", 食品科技, no. 2, 31 December 2008 (2008-12-31), pages 110 - 113 * |
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