CN1166687C

CN1166687C - 胆汁中的生长因子和愈伤因子的分子组合药物

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Publication number: CN1166687C
Application number: CNB981025811A
Authority: CN
Inventors: 徐建兴; 康健
Original assignee: Individual
Current assignee: Beijing Calendar Biotechnology Co Ltd
Priority date: 1998-07-03
Filing date: 1998-07-03
Publication date: 2004-09-15
Anticipated expiration: 2018-07-03
Also published as: CN1240792A

Abstract

本发明公开胆汁来源的生长因子：胆汁多糖、胆汁糖蛋白和胆汁多肽，它们具有刺激巨噬细胞和上皮细胞等多种细胞生长和增殖的能力。利用胆汁糖蛋白、胆汁多肽和胆汁多糖或它们与胆汁酸胆色素的分子组合制成愈伤因子可用医疗为目的，治疗各种溃疡、创伤、各种皮疹、炎症和用于化妆品添加剂。

Description

胆汁中的生长因子和愈伤因子的分子组合药物

生长因子是一类能促进细胞增生的生物大分子，可用于临床促进创伤的愈合。本发明涉及胆汁来源的生长因子，它们是多糖、糖蛋白和多肽，能促进上皮细胞和巨噬细胞等多种细胞的生长和增殖，因而在创伤愈合中起关键作用。本发明还涉及愈伤因子，它是胆汁来源生长因子为主药的分子组合药物，适用于各种慢性难愈合溃疡的愈合、各种创伤的愈合、和美容。

国际医学界把解决创伤和慢性溃疡治疗的办法寄托在对各种生长因子的研究与开发上。但是，生长因子用于临床有三个难点：一是量少，必须经基因工程手段扩增才能形成产业；二是到目前为止还没有一个生长因子能给出满意的临床效果，因而一些科学家正在试图把不同的生长因子进行分子组合，以期达到比单一因子更好的临床效果；三是促进细胞增生的生长因子能否引发细胞癌变的问题没有解决，因此也有科学家把颉抗细胞增生的因子加入到生长因子的组合中。显然，这些组合掺入了很多人为的因素，按照什么样的原则进行分子组合是个首先需要解决的理论问题。

本发明的一个目的是提供了胆汁来源的促进创伤愈合的天然分子组合物，分子组合物中促进细胞生长和增殖的生长因子，即多糖、糖蛋白和多肽。

本发明的另一个目的是提供了从胆汁中分离的生长因子，包括胆汁多糖、胆汁糖蛋白和胆汁多肽。

本发明的又一个目的是提出胆汁多糖、糖蛋白和多肽及其与胆汁酸胆色素按比例的分子组合物，具有天然药物的作用。可治疗各种溃疡、各种创伤、和皮肤疱疹，还可作为功能性化妆品的添加剂用于美容。

申请人从各种动物胆汁中经生化分离手段，分离出促进细胞增生的生长因子：胆汁糖蛋白，胆汁多糖和胆汁多肽，并对它们进行分子组合制成愈伤因子。所述胆汁可以是牛胆汁、羊胆汁、猪胆汁、熊胆汁、狗胆汁等哺乳动物的胆汁。

一种用生化方法从胆汁中制备的生长因子，它是糖蛋白，其特征在于：分子中含有各种糖，各种氨基酸和一定量的烷基，具有刺激多种细胞生长和增殖的能力。

一种用生化方法从胆汁中制备的生长因子，它是多肽，其特征在于：分子中含有各种氨基酸，其中甘氨酸丰富，还含有牛黄酸，但缺少色氨酸。

一种用生化方法从胆汁中制备的生长因子，它是多糖，其特征在于：其分子量分布较广，色暗黄，质粘稠，有刺激多种细胞生长的能力。

所述胆汁来源的生长因子，它来自于牛胆汁、羊胆汁、猪胆汁、熊胆汁、狗胆汁等哺乳动物的胆汁。

一种愈伤因子，它由胆汁糖蛋白，胆汁多肽和胆汁多糖为主药，以胆汁酸和胆色素为辅助药制备得到。其中主药和辅药的重量比例是：40-90％∶60-10％。其中主药中胆汁糖蛋白与胆汁多肽和胆汁多糖的重量比例是：1∶(1-3)∶(0.5-1.5)。其中辅药中胆汁酸和胆色素的重量比例是(10-60)∶1。

所述的愈伤因子药物，它由单纯的胆汁糖胆白为主药，以胆汁酸和胆色素为辅药，其胆汁糖胆白的重量比例为75％，辅药胆汁酸和胆色素的重量比例为25％，且胆汁酸∶胆色素为20∶1(重量)。

所述的愈伤因子药物，它以胆汁糖胆白和胆汁多糖等量比例的混合物为主药，胆汁酸和胆色素重量比例20∶1为辅药，且所述主药与辅药重量比为75％∶25％。

具体分离过程如下：

无菌条件下取出胆汁后于3000-5000转离心20-30分钟，所得上清液进行Sephadex柱层析分离可得一含糖和蛋白的混合峰，收集混合峰(ERF)再按下述方法进一步分离纯化。

方法1：待分离样液先用乙酸分成沉淀和上清液两部分，沉淀(ERF-A)难溶于水，易溶于乙醇，含糖量低于上清液部分。上清液(ERF-B)能溶于水，不溶于乙醇。

ERF-B用DEAE-Sephadex A-25层析分离，结果(图1)分成四个组分：

B1：定性检测表明不是糖类；

B2：保留时间21.4min；

B3：主要含糖组分，有杂质，主要峰保留时间16.33min；

B4：组成类似于B3。

B3用Sephacryl S-300凝胶过滤法纯化，主要组分用HPLC分析纯度(图2)，结果表明在分离过程中发生了降解，可能是由于加入了乙醇引起的。

B3为分离、纯化的目的产物。

方法2：ERF加热溶于水后直接用DEAE-Sephadex A-25分离(图3)，所得到的ERF-3相应于方法一中的B3。HPLC检测纯度为85％。

方法3：直接用Sephacryl S-300柱进行层析结果(图4)：出现两个峰ERF-I ERF-II。

以方法3的效果最好。

收集柱层析分离的各目标样品峰经冰冻干燥制成冻干粉。

临床证明胆汁来源的生长因子和它们的分子组合具有多种主治功能：如胃肠道溃疡及其引起的各种不适症；各种原因如糖尿病、淋巴结核、下肢脉管炎和静脉炎、术后感染等引起的体表慢性溃疡；烧烫伤、刀枪伤、化学烧伤、冻伤、皮肤干裂等；痤疮、粉刺、青春疙瘩和各种皮肤疱疹和炎症等。

图1：ERF-B的DEAE-Sephadex A-25层析图。

图2：分离组分B3的HPLC分析。

图3：DEAE-Sephadex A-25分离ERF。

图4：Sephacryl S-300柱进行层析结果。

图5：分子筛柱层析洗脱图谱。

实施例1：

胆汁来源的生长因子：胆汁糖蛋白、胆汁多肽和胆汁多糖的分离纯化和性质分析。

1、胆汁糖蛋白的纯化

收集方法1和2的含糖产物峰(B3和ERF-3)，再经Sephacryl S-300柱层析可得到胆汁糖蛋白。所分离的糖蛋白表观分子量40-50KD，测得各项分析指标如下：

比旋光度：[α]²⁰D＝-11.7°(c0.35，H₂O)

糖含量(硫酸-苯酚法)：4.7％

蛋白含量(Folin-Lowry法)：30.3％

糖的组成和比例：

L-鼠李糖(1.8)∶L-阿拉伯糖(14.0)∶D-木糖(17.5)∶

D-甘露糖(4.0)∶D-半乳糖(2.7)。

蛋白的氨基酸组成

氨基酸含量	氨基酸含量
氨基酸含量	氨基酸含量	牛黄酸 0.7天冬氨酸 7.7苏氨酸 6.3丝氨酸 12.7谷氨酸 6.8甘氨酸 21.6丙氨酸 8.5颉氨酸 5.7异亮氨酸 5.9	亮氨酸 6.3酪氨酸 1.6苯丙氨酸 3.0鸟氨酸 4.0赖氨酸 1.7组氨酸 1.5精氨酸 3.5脯氨酸 2.5

糖蛋白红外IR特征峰：

3400cm^-1(OH或NH)，2920cm^-1(甲氧基)，2850cm^-1(甲氧基)，1739.5cm^-1(羰基)，1469.6cm^-1，1242.0cm^-1，1105.0cm^-1，964.2cm^-1，842.8cm^-1。

核磁共振氢谱(¹H-NMR)：

Chemical shiftsAssigrments(ppm)	Chemical shiftsAssigments(ppm)
Chemical shiftsAssigrments(ppm)	Chemical shiftsAssigments(ppm)	4.95(m) -O-CH-O4.82(m) -O-CH-O4.29(w)4.00(m) -CH₂-O3.64(m) -CH₂-O3.45(m) -CH₂-O3.19(s) CH₃-O-R	3.16(s) CH₃-O-R2.12(m) CH₃-CO-R2.00(m) C-CH₂-C-O-1.50(s) C-CH₂-C1.29(s) C-CH₂-C0.94(s) CH₃-C注：s强，m中，w弱。

2、胆汁多肽的分离纯化

胆汁离心1000-5000转20-30分钟所得上清液用Sephadex G-25柱分离，所得第二个洗脱峰即是胆汁多肽，见图5。

胆汁多肽也具有刺激细胞生长的作用，是个多肽生长因子，其氨基酸组成分析如下：

氨基酸含量	氨基酸含量
氨基酸含量	氨基酸含量	门冬氨酸 1.63苏氨酸 1.06丝氨酸 1.14谷氨酸 1.84甘氨酸 21.09丙氨酸 1.47胱氨酸 0.19颉氨酸 1.12旦氨酸 0.16	异亮氨酸 0.75亮氨酸 1.64酪氨酸 0.48苯丙氨酸 0.72赖氨酸 0.98组氨酸 0.37精氨酸 0.72脯氨酸 0.72牛黄酸 4.05

3、胆汁多糖的分离

收集图5含糖混合峰B1，经冷冻干燥法或旋转蒸发法浓缩10-20倍，出现不溶物，离心3000-5000转20分钟，所得沉淀即是胆汁多糖。胆汁多糖是复杂的糖链混合物，色暗黄，质粘稠。

实施例2：

愈伤因子是以胆汁来源的生长因子糖蛋白、多肽和多糖为主药，以胆汁酸和胆色素为辅助药制成的分子组合。它们的组合比例可以是以下各种情况：

1.单纯的胆汁糖蛋白含少量胆汁酸和胆色素，其糖蛋白的重量比例为75％，胆汁酸和胆色素(20∶1)比例为25％。

2.单纯的胆汁多糖含少量胆汁酸和胆色素，其多糖的重量比例为75％，胆汁酸和胆色素(20∶1)比例为25％。

3.单纯的胆汁多肽含少量胆汁酸和胆色素，其多肽的重量比例为75％，胆汁酸和胆色素(20∶1)比例为25％。

4.以胆汁糖蛋白和胆汁多糖等量比例的混合物为主药成份，含少量胆汁酸和胆色素，其糖蛋白和多糖主药的重量比例为75％，胆汁酸和胆色素(20∶1)比例为25％。

5.以胆汁糖蛋白，胆汁多糖和胆汁多肽等量混合物为主药成份，含少量胆汁酸和胆色素，其糖蛋白、多糖和多肽的混合物重量比例为75％，胆汁酸和胆色素(20∶1)比例为25％。

Claims

1.一种用生化方法从胆汁中制备的生长因子，它是糖蛋白，其特征在于：

所分离的糖蛋白表观分子量40-50KD，测得各项分析指标如下：

比旋光度：[α]²⁰D＝-11.7°(c0.35，H₂O)

糖含量(硫酸-苯酚法)：4.7％

蛋白含量(Folin-Lowry法)：30.3％

糖的组成和比例：

L-鼠李糖∶L-阿拉伯糖∶D-木糖∶D-甘露糖∶D-半乳糖为1.8∶14.0∶17.5∶4.0∶2.7；

蛋白的氨基酸组成氨基酸含量氨基酸含量牛黄酸 0.7天冬氨酸 7.7苏氨酸 6.3丝氨酸 12.7谷氨酸 6.8甘氨酸 21.6丙氨酸 8.5缬氨酸 5.7异亮氨酸 5.9 亮氨酸 6.3酪氨酸 1.6苯丙氨酸 3.0鸟氨酸 4.0赖氨酸 1.7组氨酸 1.5精氨酸 3.5脯氨酸 2.5

糖蛋白红外IR特征峰：

3400cm^-1(OH或NH)，2920cm^-1(甲氧基)，2850cm^-1(甲氧基)，1739.5cm^-1(羰基)，1469.6cm^-1，1242.0cm^-1，1105.0cm^-1，964.2cm^-1，842.8cm^-1；

核磁共振氢谱(¹H-NMR)： Chemical shiftsAssigrments(ppm) Chemical shiftsAssigments(ppm) 4.95(m) -O-CH-O4.82(m) -O-CH-O4.29(w)4.00(m) -CH₂-O3.64(m) -CH₂-O3.45(m) -CH₂-O3.19(s) CH₃-O-R 3.16(s) CH₃-O-R2.12(m) CH₃-CO-R2.00(m) C-CH₂-C-O-1.50(s) C-CH₂-C1.29(s) C-CH₂-C0.94(s) CH₃-C注：s强，m中，w弱，

所述糖蛋白的分离制备方法如下：

无菌条件下取出胆汁后于3000-5000转离心20-30分钟，所得上清液进行Sephadex柱层析分离可得一含糖和蛋白的混合峰，收集混合峰ERF再按下述方法进一步分离纯化；

方法1：待分离样液先用乙酸分成沉淀和上清液两部分，沉淀ERF-A难溶于水，易溶于乙醇，含糖量低于上清液部分；上清液ERF-B能溶于水，不溶于乙醇；

ERF-B用DEAE-Sephadex A-25层析分离，结果分成四个组分：

B1：定性检测表明不是糖类；

B2：保留时间21.4min；

B3：主要含糖组分，有杂质，主要峰保留时间16.33min；

B4：组成类似于B3；

B3用Sephacryl S-300凝胶过滤法纯化，主要组分用HPLC分析纯度，结果表明在分离过程中发生了降解，可能是由于加入了乙醇引起的；

B3为分离、纯化的目的产物；

方法2：ERF加热溶于水后直接用DEAE-Sephadex A-25分离，所得到的ERF-3相应于方法1中的B3；HPLC检测纯度为85％；

收集方法1和2的含糖产物峰B3和ERF-3，再经Sephacryl S-300柱层析可得到胆汁糖蛋白。

2.一种用生化方法从胆汁中制备的生长因子，它是多肽，其特征在于：其氨基酸组成分析如下：氨基酸含量氨基酸含量门冬氨酸 1.63苏氨酸 1.06丝氨酸 1.14谷氨酸 1.84甘氨酸 21.09丙氨酸 1.47胱氨酸 0.19缬氨酸 1.12蛋氨酸 0.16 异亮氨酸 0.75亮氨酸 1.64酪氨酸 0.48苯丙氨酸 0.72赖氨酸 0.98组氨酸 0.37精氨酸 0.72脯氨酸 0.72牛黄酸 4.05

所述的多肽的分离制备方法如下：

胆汁离心1000-5000转20-30分钟所得上清液用Sephadex G-25柱分离，所得第二个洗脱峰即是胆汁多肽。

3.一种用生化方法从胆汁中制备的生长因子，它是多糖，其特征在于：收集分子筛柱层析洗脱含糖混合峰B1，经冷冻干燥法或旋转蒸发法浓缩10-20倍，出现不溶物，离心3000-5000转20分钟，所得沉淀即是胆汁多糖，色暗黄，质粘稠，有刺激多种细胞生长的能力。

4.根据权利要求1-3任一项所述胆汁来源的生长因子，它来自于牛胆汁、羊胆汁、猪胆汁、熊胆汁、狗胆汁，非人哺乳动物的胆汁。

5.一种愈伤药物，它由胆汁糖蛋白，胆汁多肽和胆汁多糖为主药，以胆汁酸和胆色素为辅助药制备得到；其中胆汁糖蛋白是指所分离的糖蛋白表观分子量40-50KD，具有刺激多种细胞生长和增殖的能力；其中胆汁多肽指其氨基酸组成分析如下：氨基酸含量氨基酸含量门冬氨酸 1.63苏氨酸 1.06丝氨酸 1.14谷氨酸 1.84甘氨酸 21.09丙氨酸 1.47胱氨酸 0.19缬氨酸 1.12蛋氨酸 0.16 异亮氨酸 0.75亮氨酸 1.64酪氨酸 0.48苯丙氨酸 0.72赖氨酸 0.98组氨酸 0.37精氨酸 0.72脯氨酸 0.72牛黄酸 4.05

其中胆汁多糖是指收集分子筛柱层析洗脱含糖混合峰B1，经冷冻干燥法或旋转蒸发法浓缩10-20倍，出现不溶物，离心3000-5000转20分钟，所得沉淀即是胆汁多糖，色暗黄，质粘稠，有刺激多种细胞生长的能力。

6.根据权利要求5所述的愈伤药物，其中主药和辅药的重量比例是：40-90％∶60-10％。

7.根据权利要求5或6所述的愈伤药物，其中主药中胆汁糖蛋白与胆汁多肽和胆汁多糖的重量比例是：1∶(1-3)∶(0.5-1.5)。

8.根据权利要求5或6所述的愈伤药物，其中辅药中胆汁酸和胆色素的重量比例是(10-60)∶1。

9.根据权利要求5所述的愈伤药物，它由单纯的胆汁糖胆白为主药，以胆汁酸和胆色素为辅药，其胆汁糖胆白的重量比例为75％，辅药胆汁酸和胆色素的重量比例为25％，且胆汁酸∶胆色素为20∶1(重量)。

10.根据权利要求6所述的愈伤药物，它以胆汁糖胆白和胆汁多糖等量比例的混合物为主药，胆汁酸和胆色素重量比例20∶1为辅药，且所述主药与辅药重量比为75％∶25％。