CN116660361A - 基于唾液代谢指纹谱图筛选代谢生物标志物的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于唾液代谢指纹谱图筛选代谢生物标志物的方法及应用，涉及生物样本代谢分析技术领域。包括以下步骤：步骤1、利用无机纳米颗粒增强激光解吸电离飞行时间质谱技术，对帕金森病人和健康志愿者的唾液样本进行代谢检测，获得唾液代谢指纹谱图；步骤2、将步骤1获得的唾液代谢指纹谱图，采用机器学习算法，对唾液样本进行多种模型训练，并通过交叉验证方法，对多种模型进行评价，根据验证结果筛选最终预测模型；步骤3、根据步骤2的预测模型对帕金森病人和健康志愿者的唾液样本进行预测，获得预测结果，根据预测结果，对唾液样本中的代谢生物标志物进行筛选。本发明筛选效率高，结果准确可靠，筛选出的代谢生物标志物可以用于帕金森疾病的预测。
Description
技术领域
本发明涉及生物样本代谢分析技术领域，具体涉及一种基于唾液代谢指纹谱图筛选代谢生物标志物的方法及应用。
背景技术
帕金森是一种常见的退行性疾病，2016年全球患者人数达到610万，病程可长达数十年。全球疾病负担研究显示，帕金森的发病率和患病率迅速增加，预计到2030年全球患者人数将达到1000万。由于帕金森的发展逐渐加剧，有效的管理需要在寻求医学建议之前及时准确地进行诊断。目前尚无确诊帕金森的诊断性试验，因此正确判断患者是否患有帕金森取决于四种主要症状的一个或多个组合，如节律性震颤、运动减缓、僵硬或姿势不稳。然而，由于这些临床症状可能与其他神经退行性疾病重叠，诊断仍具有挑战性。例如，2011年获得美国食品药品监督管理局批准的多巴胺转运蛋白单光子发射计算机断层扫描成像技术也无法区分帕金森和其他帕金森综合症(如进行性核上性麻痹和多系统萎缩)。因此，构建简单有效的方法对帕金森的管理具有重要意义，具有巨大的社会和经济效益。
在帕金森的临床症状出现之前检测到疾病的最早阶段可能会增强药物治疗的效果，从而减缓疾病进程。生物标志物和检测方法的选择对于设计诊断检测方法至关重要。生物体液中基因组/蛋白质组/代谢水平的分子生物标志物是识别与病理过程相关的生物系统改变的有效指标，并且生物体液的获取具有更小的侵入性。基因组和蛋白质组生物标志物位于代谢通路的上游，通常能够反映的是生物系统的间接信息。相比之下，代谢生物标志物作为通路的终产物，可以直接表征疾病表型和进展。
质谱技术已经成为筛选代谢生物标志物的主要工具。然而，大多数使用气相色谱/液相色对生物样品进行检测的方法，都需进行富集和严格的纯化预处理程序，包括同位素处理，衍生化，蛋白沉淀以及色谱分离等复杂的预处理操作，一般需要0.5-3小时，以解决分子丰度和样品复杂性问题；同时，在进行检测时需要较大的样本量，一般需要10-500μL/样本。这些处理程序需要大量的时间和资源，并且可能导致代谢物的丢失或污染。近年来，基质辅助激光解吸/电离质谱技术的发展，使得无需富集或纯化的情况下直接检测超低体积生物体液中的代谢物成为可能。这种方法具有高通量筛选的优势，可以用于准确的非靶向代谢分析，从而允许识别特异性疾病生物标志物以反映患者的真实状况。
唾液生物标志物作为一种非侵入性和成本效益较高的方法，已引起对帕金森病诊断的关注。最近的研究表明，唾液中某些代谢物与帕金森疾病的发展可能存在相关性，然而，暂未有筛选与帕金森病相关的代谢生物标志物方法的报道。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种使用基质辅助激光解吸/电离质来获取唾液中的代谢指纹图谱，使其可能成为唾液生物标志物筛选的重要工具，用于帕金森疾病的诊断。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种使用基质辅助激光解吸/电离质来获取唾液中的代谢指纹图谱，用于帕金森疾病的诊断。
为实现上述目的，本发明提供了一种基于唾液代谢指纹谱图筛选代谢生物标志物的方法，包括以下步骤：
步骤1、利用无机纳米颗粒增强激光解吸电离飞行时间质谱技术，对帕金森病人和健康志愿者的唾液样本进行代谢检测，获得唾液代谢指纹谱图；
步骤2、将步骤1获得的唾液代谢指纹谱图，采用机器学习算法，对唾液样本进行多种模型训练，并通过交叉验证方法，对多种模型进行评价，根据验证结果筛选最终预测模型；
步骤3、根据步骤2的预测模型对帕金森病人和健康志愿者的唾液样本进行预测，获得预测结果，根据预测结果，对唾液样本中的代谢生物标志物进行筛选。
在本发明的较佳实施方式中，所述步骤1包括：
步骤1、1：用去离子水将帕金森病人和健康志愿者的唾液样本进行稀释；
步骤1、2：用去离子水将无机纳米颗粒配成基质溶液；
步骤1、3：将稀释后的唾液样本点样到质谱靶板上，室温下自然干燥，完成质谱靶板上唾液样品制备；
步骤1、4：再将基质溶液点样到质谱靶板上，室温下自然干燥；完成质谱靶板上基质制备；
步骤1、5：通过使用激光解吸电离飞行时间质谱技术，采集帕金森病人和健康志愿者的唾液代谢指纹，获得唾液代谢指纹谱图。
进一步的，所述步骤1、1中，将帕金森病人和健康志愿者的唾液样本用去离子水稀释10倍；步骤1、3中，稀释后的唾液样本点样1μL到质谱靶板上。
进一步的，所述步骤1、2中，用去离子水将无机纳米颗粒配成1mg/mL基质溶液，步骤1、4中，1mg/mL基质溶液点样1μL到质谱靶板上。
在本发明的另一较佳实施方式中，所述步骤2包括：
步骤2、1：在MATLAB R2020a上，将帕金森病人和健康志愿者的唾液代谢指纹谱图进行预处理，采集每个唾液样本的m/z信号；
步骤2、2：将采集到的帕金森病人和健康志愿者的唾液样本划分成对应的训练集和测试集；
步骤2、3：在训练集上使用机器学习算法，对唾液样本进行多种模型训练，筛选最终预测模型。
进一步的，所述步骤2、1中，所述预处理包括谱线平滑、基线校正和谱峰联配。
进一步的，所述步骤2、3中，所述机器学习算法包括套索回归、极端梯度提升、支持向量机、随机森林、自适应增强及深度学习，共6种机器学习算法。
在本发明的另一较佳实施方式中，所述步骤3包括：
步骤3、1：对健康志愿者和帕金森病人唾液指纹图谱进行倍数变化Fold-change分析，比较两组代谢数据的差异，筛选其中倍数变化Fold-change值大1.20或者小于0.83的代谢物；
步骤3、2：对健康志愿者和帕金森病人唾液指纹图谱进行学生T检验Student's t-test分析，对帕金森组和健康对照组之间的代谢物水平是否存在显著差异进行比较，筛选其中P小于0.05的代谢物；
步骤3、3：对健康志愿者和帕金森病人唾液指纹图谱进行积分梯度IntegratedGradient分析，用于解释预测模型的预测结果，计算出每个代谢物对于模型预测结果的贡献程度，筛选出贡献度大于0.2的代谢物；
步骤3、4：对倍数变化Fold-change和学生T检验Student's t-test以及积分梯度Integrated Gradient筛选出来的代谢物做交叉匹配，最终筛选差异代谢物，并鉴定代谢生物标志物。
进一步的，所述代谢生物标志物C4H7N3O、C4H9N3O2、C6H12O6、C21H30O3、C24H38O3、C23H42NO4、C10H15N5O10P2。
本发明还提供了一种基于上述的唾液代谢指纹谱图筛选代谢生物标志物的方法筛选出的代谢生物标志物在预测帕金森疾病中的用途，所述代谢生物标志物C4H7N3O、C4H9N3O2、C6H12O6、C21H30O3、C24H38O3、C23H42NO4、C10H15N5O10P2。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明利用无机纳米颗粒增强激光解吸电离飞行时间质谱技术，每小时可以处理300个样本，每个样本的检测时间约为30秒；检测下限可达0.3pmol；处理效率高；同时，经过处理后的结果具有高可重复性，变异系数小于10％，结果准确；
本发明在训练集上使用6种机器学习算法(算法1套索回归，算法2极端梯度提升，算法3支持向量机，算法4随机森林，算法5自适应增强，算法6深度学习)进行模型评价，筛选到最终预测模型结果更加准确；
本发明通过Fold-change(倍数变化)和Student's t-test(学生T检验)以及Integrated Gradient(积分梯度)筛选出7个差异代谢物，并通过引入IntegratedGradient(积分梯度)来解释预测模型中每个代谢物的贡献度，确保筛选出的代谢物结果可靠，可用于帕金森疾病的预测或诊断。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是采用本发明的较佳实施例1方法采集的125个健康志愿者和187个帕金森患者唾液样本的代谢指纹谱图谱；
图2是本发明实施例2中利用MATLAB R2020a对312个唾液样本的唾液代谢指纹谱图进行预处理后，采集到的405个m/z信号对应热图；
图3是本发明实施例2中采用6种机器学习算法(算法1套索回归，算法2极端梯度提升，算法3支持向量机，算法4随机森林，算法5自适应增强，算法6深度学习)对于帕金森的预测效率图；
图4是采用深度学习(算法6)对于帕金森和健康志愿者(测试集)的受试者工作特征曲线；
图5是本发明实施例3中采用Integrated Gradient(积分梯度)分析用于评价每个代谢物在预测模型中的贡献值。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
在附图中，结构相同的部件以相同数字标号表示，各处结构或功能相似的组件以相似数字标号表示。附图所示的每一组件的尺寸和厚度是任意示出的，本发明并没有限定每个组件的尺寸和厚度。为了使图示更清晰，附图中有些地方适当夸大了部件的厚度。
实施例1
使用无机纳米颗粒增强激光解吸电离飞行时间质谱技术，对帕金森病人和健康志愿者的唾液样本进行代谢检测，获得唾液代谢指纹谱图。激光解吸电离飞行时间质谱具有检测速度快，通量高的优点，具体包括以下步骤：
步骤1、1：用去离子水将帕金森病人和健康志愿者的唾液样本稀释10倍；
步骤1、2：用去离子水将无机纳米颗粒配成1mg/mL的基质溶液；
步骤1、3：将稀释后的唾液样本(1μL)点样到质谱靶板上，室温下自然干燥，完成质谱靶板上唾液样品制备；
步骤1、4：再将1mg/mL的基质溶液(1μL)点样到质谱靶板上，室温下自然干燥；完成质谱靶板上基质制备；
步骤1、5：通过使用激光解吸电离飞行时间质谱技术，采集帕金森病人和健康志愿者的唾液代谢指纹，获得唾液代谢指纹谱图。
实施例2
利用实施例1的方法对健康志愿者对照组和帕金森病人唾液样本进行代谢指纹谱图分析，采集唾液代谢指纹图谱，使用机器学习算法对帕金森病人和健康对照组的唾液样本进行6种模型训练；使用交叉验证等方法，对多种模型进行评价，并根据验证结果筛选最终预测模型；使用已经建立好的模型，对新的唾液样本进行预测，判断该样本是否属于帕金森病人或健康志愿者对照组。该方法可用于实现对帕金森人群的唾液代谢指纹谱图的筛查和预测，具体包括以下步骤：
步骤1：将125个健康志愿者对照组唾液样本和187个帕金森患者唾液样本采用实施例1的方法进行代谢指纹谱图谱采集，采集谱图如图1所示；
步骤2：在MATLAB(R2020a)上，将312个样本的唾液代谢指纹谱图进行预处理，包括谱线平滑、基线校正和谱峰联配等，最终每个样本采集到405个m/z信号，如图2所示；
步骤3：将312个唾液样本划分成训练集和测试集，其中训练集包括85个健康对照唾液样本和127个帕金森唾液样本，测试集包括40个健康对照唾液样本和60个帕金森唾液样本；
步骤4：在训练集上使用6种机器学习算法(算法1套索回归，算法2极端梯度提升，算法3支持向量机，算法4随机森林，算法5自适应增强，算法6深度学习)进行模型评价，筛选到最终预测模型；将测试集在最终预测模型中进行测试，获取预测效能，其中训练集和测试集在训练模型上的诊断性能如图3和表1所示；
表1.405个m/z信号在预测模型中使用深度学习(算法6)的诊断性能
由图3和表1可知，算法6(深度学习)具有最高的置信区间和灵敏度，因此，选择算法6为最终预测模型。采用算法6对帕金森和健康志愿者对照(测试集)的受试者工作特征曲线如图4所示。
实施例3
根据预测模型的预测结果，对帕金森病人和健康志愿者的唾液样本进行预测，获得预测结果，根据预测结果，对唾液样本中的代谢生物标志物进行筛选。具体包括以下步骤：
步骤1：对健康志愿者对照组和帕金森病人唾液指纹图谱进行Fold-change(倍数变化)分析，来比较两组代谢数据的差异，筛选其中Fold-change(倍数变化)值大1.20或者小于0.83的代谢物；
步骤2：对健康对照组和帕金森病人唾液指纹图谱进行Student's t-test(学生T检验)分析，对帕金森组和健康对照组之间的代谢物水平是否存在显著差异进行比较，筛选其中P小于0.05的代谢物；
步骤3：对健康对照组和帕金森病人唾液指纹图谱进行Integrated Gradient(积分梯度)分析，用于解释预测模型的预测结果，计算出每个代谢物对于模型预测结果的贡献程度，筛选出贡献度大于0.2的代谢物，如图5所示；
步骤4：对Fold-change(倍数变化)和Student's t-test(学生T检验)以及Integrated Gradient(积分梯度)筛选出来的代谢物做交叉匹配，最终筛选下来7个差异代谢物，并鉴定出7个代谢生物标志物，如表2所示。
表2.7个代谢生物标志物相关信息
因此，采用上述7个代谢生物标志物，可以用于预测或诊断帕金森疾病。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于唾液代谢指纹谱图筛选代谢生物标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、利用无机纳米颗粒增强激光解吸电离飞行时间质谱技术，对帕金森病人和健康志愿者的唾液样本进行代谢检测，获得唾液代谢指纹谱图；
步骤2、将步骤1获得的唾液代谢指纹谱图，采用机器学习算法，对唾液样本进行多种模型训练，并通过交叉验证方法，对多种模型进行评价，根据验证结果筛选最终预测模型；
步骤3、根据步骤2的预测模型对帕金森病人和健康志愿者的唾液样本进行预测，获得预测结果，根据预测结果，对唾液样本中的代谢生物标志物进行筛选。
2.根据权利要求1所述的基于唾液代谢指纹谱图筛选代谢生物标志物的方法，其特征在于，所述步骤1包括：
步骤1、1：用去离子水将帕金森病人和健康志愿者的唾液样本进行稀释；
步骤1、2：用去离子水将无机纳米颗粒配成基质溶液；
步骤1、3：将稀释后的唾液样本点样到质谱靶板上，室温下自然干燥，完成质谱靶板上唾液样品制备；
步骤1、4：再将基质溶液点样到质谱靶板上，室温下自然干燥；完成质谱靶板上基质制备；
步骤1、5：通过使用激光解吸电离飞行时间质谱技术，采集帕金森病人和健康志愿者的唾液代谢指纹，获得唾液代谢指纹谱图。
3.根据权利要求2所述的基于唾液代谢指纹谱图筛选代谢生物标志物的方法，其特征在于：所述步骤1、1中，将帕金森病人和健康志愿者的唾液样本用去离子水稀释10倍；步骤1、3中，稀释后的唾液样本点样1μL到质谱靶板上。
4.根据权利要求2所述的基于唾液代谢指纹谱图筛选代谢生物标志物的方法，其特征在于：所述步骤1、2中，用去离子水将无机纳米颗粒配成1mg/mL基质溶液，步骤1、4中，1mg/mL基质溶液点样1μL到质谱靶板上。
5.根据权利要求1所述的基于唾液代谢指纹谱图筛选代谢生物标志物的方法，其特征在于，所述步骤2包括：
步骤2、1：在MATLAB R2020a上，将帕金森病人和健康志愿者的唾液代谢指纹谱图进行预处理，采集每个唾液样本的m/z信号；
步骤2、2：将采集到的帕金森病人和健康志愿者的唾液样本划分成对应的训练集和测试集；
步骤2、3：在训练集上使用机器学习算法，对唾液样本进行多种模型训练，筛选最终预测模型。
6.根据权利要求5所述的基于唾液代谢指纹谱图筛选代谢生物标志物的方法，其特征在于，所述步骤2、1中，所述预处理包括谱线平滑、基线校正和谱峰联配。
7.根据权利要求5所述的基于唾液代谢指纹谱图筛选代谢生物标志物的方法，其特征在于，所述步骤2、3中，所述机器学习算法包括套索回归、极端梯度提升、支持向量机、随机森林、自适应增强及深度学习，共6种机器学习算法。
8.根据权利要求1所述的基于唾液代谢指纹谱图筛选代谢生物标志物的方法，其特征在于，所述步骤3包括：
步骤3、1：对健康志愿者和帕金森病人唾液指纹图谱进行倍数变化Fold-change分析，比较两组代谢数据的差异，筛选其中倍数变化Fold-change值大1.20或者小于0.83的代谢物；
步骤3、2：对健康志愿者和帕金森病人唾液指纹图谱进行学生T检验Student's t-test分析，对帕金森组和健康对照组之间的代谢物水平是否存在显著差异进行比较，筛选其中P小于0.05的代谢物；
步骤3、3：对健康志愿者和帕金森病人唾液指纹图谱进行积分梯度IntegratedGradient分析，用于解释预测模型的预测结果，计算出每个代谢物对于模型预测结果的贡献程度，筛选出贡献度大于0.2的代谢物；
步骤3、4：对倍数变化Fold-change和学生T检验Student's t-test以及积分梯度Integrated Gradient筛选出来的代谢物做交叉匹配，最终筛选差异代谢物，并鉴定代谢生物标志物。
9.根据权利要求8所述的基于唾液代谢指纹谱图筛选代谢生物标志物的方法，其特征在于，其特征在于：所述代谢生物标志物C4H7N3O、C4H9N3O2、C6H12O6、C21H30O3、C24H38O3、C23H42NO4、C10H15N5O10P2。
10.基于权利要求1-9任一项所述的唾液代谢指纹谱图筛选代谢生物标志物的方法筛选出的代谢生物标志物在预测帕金森疾病中的用途，所述代谢生物标志物C4H7N3O、C4H9N3O2、C6H12O6、C21H30O3、C24H38O3、C23H42NO4、C10H15N5O10P2。
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