CN116656530A - 一种栖海鞘粘着杆菌及其筛选、培养方法和应用 - Google Patents

一种栖海鞘粘着杆菌及其筛选、培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及环境微生物技术领域，特别涉及一种栖海鞘粘着杆菌及其筛选、培养方法和应用。本发明提供了一种栖海鞘粘着杆菌，所述栖海鞘粘着杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M 20221419，该栖海鞘粘着杆菌能够以细胞直接接触溶藻的方式杀灭米氏凯伦藻，并且避免抑藻物质的二次环境污染，从而实现对有害赤潮的有效防治。

Description

一种栖海鞘粘着杆菌及其筛选、培养方法和应用
技术领域
本发明涉及环境微生物技术领域，特别涉及一种栖海鞘粘着杆菌及其筛选、培养方法和应用。
背景技术
赤潮是海洋中的一些微藻、原生动物或细菌在一定环境条件下爆发性增殖或聚集达到某一水平，引起水体变色或对海洋中其他生物产生危害的一种生态异常现象。对于赤潮的治理方法目前主要有物理学、化学以及生物学方法。其中，物理法主要是借助超声、吸附原理和紫外光等物理方式治理藻类，物理法对局部赤潮有效但无法大面积地处理赤潮具有很大的局限性，且费用昂贵，对机器设备要求高；化学法主要是通过化学试剂来治理赤潮，目前用于治理赤潮的化学试剂主要包括无机、有机药剂以及胶体物质，由于化学治理赤潮时添加了化学试剂，这些化学试剂的残余会导致海洋的二次污染，而化学试剂使用量过少又达不到除藻的目的；生物学法是利用微生物控制法治理有害赤潮，如利用溶藻细菌或细菌与微藻间的相互作用来防治赤潮，该方法由于具有高效、选择性高以及对环境友好等特点而备受青睐。溶藻方式分为直接溶藻和间接溶藻，其中，间接溶藻是通过分泌有害抑藻物质来实现对除藻，溶藻效率较低，并且容易造成海洋环境二次污染；而直接通过细胞接触溶藻的方式不仅可以增强溶藻效率，还可以避免抑藻物质的二次环境污染，具有更广阔的应用前景，因此，研发直接溶藻的菌类也受到了本领域的重视。
全球范围内海域水体的富营养化问题是引发赤潮产生的重要因素，近年来我国近海域水体富营养化引起的赤潮发生频率呈明显上升趋势，其中米氏凯伦藻是引起我国近海鱼毒性赤潮的典型代表，米氏凯伦藻的毒素包含溶血性毒素、细胞毒素和活性氧物质等，并且有研究表明这些毒素可能是其致死生物的主要因素，溶血性毒素可影响鱼类的呼吸功能，致使鱼类大量死亡或经食物链最终传递到人类，对人类健康造成威胁，以及破坏海洋生态环境，因此，对米氏凯伦藻的防治受到了世界范围的广泛关注。
然而，现有技术中针对米氏凯伦藻的溶藻菌均是以间接溶藻方式治理赤潮，不仅溶藻效率较低，并且容易造成海洋环境二次污染，因此，急需发现一种以直接溶藻模式杀灭米氏凯伦藻的菌株。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种栖海鞘粘着杆菌及其筛选、培养方法和应用，该栖海鞘粘着杆菌能以细胞直接接触溶藻方式杀灭米氏凯伦藻，具有良好的赤潮防治效果。
本发明第一方面提供了一种栖海鞘粘着杆菌，所述栖海鞘粘着杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M 20221419。
优选地，所述栖海鞘粘着杆菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明第二方面提供了一种栖海鞘粘着杆菌的筛选方法，包括以下步骤：
步骤1：将水样经100μm滤膜预过滤以去除大颗粒杂质，然后用消毒海水稀释后在培养基上进行培养，直到形成明显的菌落；
步骤2：将所述菌落进行分离，分别接种到培养基上进行培养，得到培养物，然后将所述培养物加入到米氏凯伦藻培养物中，继续培养，选取溶藻效率最高的菌株进行纯化，得到栖海鞘粘着杆菌。
本发明第三方面提供了一种栖海鞘粘着杆菌的培养方法，包括以下步骤：
取纯化后的栖海鞘粘着杆菌单菌落一颗，接种于第一斜面培养基上，直到菌苔生长稳定后，由第一斜面培养基转接于第二斜面培养基上直至培养稳定。
具体包括以下步骤：取琼脂平板上四区划线的纯培养物单菌落一颗，接种于斜面培养基上，待该斜面菌苔生长稳定后，由该斜面转接另外的斜面培养基上直至培养稳定。
本发明第四方面提供了一种栖海鞘粘着杆菌在制备溶藻产品中的应用。
优选地，所述溶解的藻类为米氏凯伦藻。
本发明第五方面提供了一种栖海鞘粘着杆菌在赤潮治理方面的应用。
本发明第六方面提供了一种赤潮治理的方法，将所述栖海鞘粘着杆菌在培养基中进行培养，得到栖海鞘粘着杆菌发酵液，将所述栖海鞘粘着杆菌发酵液加入到米氏凯伦藻培养液中进行共培养。
优选地，所述培养基为2216E液体培养基；
所述培养条件为27℃、140rpm；
所述培养时长为18小时。
优选地，所述栖海鞘粘着杆菌发酵液与所述米氏凯伦藻培养液的体积比为1～10:100。
从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种栖海鞘粘着杆菌，所述栖海鞘粘着杆菌的保藏编号为CCTCCNO:M 20221419，该栖海鞘粘着杆菌能够以细胞直接接触溶藻方式杀灭米氏凯伦藻，并且避免抑藻物质的二次环境污染，从而实现对有害赤潮的有效防治。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例1中提供的栖海鞘粘着杆菌的电镜观察图；
图2为本发明实施例2中提供的不同浓度的栖海鞘粘着杆菌发酵液对米氏凯伦藻的杀灭率对比分析图；
图3为本发明实施例2中提供的栖海鞘粘着杆菌发酵液、无细胞滤液和清洗后细菌细胞重悬液对米氏凯伦藻的杀灭率对比分析图。
具体实施方式
本发明提供了一种栖海鞘粘着杆菌及其应用，该栖海鞘粘着杆菌对米氏凯伦藻具有杀灭及抑制作用，能实现对由米氏凯伦藻引起的有害赤潮现象的防治。
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
其中，以下实施例所用原料或试剂均为市售或自制。
实施例1
本实施例提供了一种栖海鞘粘着杆菌，该菌株名称为栖海鞘粘着杆菌(Tenacibaculum ascidiaceicola)GDUTW01，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学校内；保藏编号为，CCTCC NO:M20221419，保藏日期为2022年9月13日。
本实施例的栖海鞘粘着杆菌GDUTW01分离自广西北部湾赤潮爆发海域，其分离纯化及筛选方法如下：
①溶藻细菌的分离：将广西北部湾赤潮爆发海域水样经100μm滤膜预过滤以去除大颗粒杂质，然后用消毒海水稀释，再通过稀释电镀法对细菌菌株进行分离和分类。
具体的，用无菌海水将滤液连续稀释(10倍)7次，将每次稀释液的200μL等分试样均匀地铺在2216E琼脂培养基上，该2216E琼脂培养基的成分为：蛋白胨5.0g/L、酵母粉1.0g/L、柠檬酸铁0.1g/L、氯化钠19.45g/L、氯化镁5.98g/L、硫酸钠3.24g/L、氯化钙1.8g/L、氯化钾0.55g/L、碳酸钠0.16g/L、溴化钾0.08g/L、氯化锶0.034g/L、硼酸0.022g/L、硅酸钠0.004g/L、氟化钠0.0024g/L、硝酸铵0.0016g/L、磷酸氢二钠0.008g/L、琼脂15.0g/L，培养基的pH值为7.6±0.2，然后在27℃下培养48小时，直到形成明显的菌落，然后选择不同形状、大小和颜色的菌落进行分离。
②溶藻细菌筛选：将步骤①中挑出的单个菌落，分别接种到2216E液体培养基中，该2216E液体培养基的成分为：蛋白胨5.0g/L、酵母粉1.0g/L、柠檬酸铁0.1g/L、氯化钠19.45g/L、氯化镁5.98g/L、硫酸钠3.24g/L、氯化钙1.8g/L、氯化钾0.55g/L、碳酸钠0.16g/L、溴化钾0.08g/L、氯化锶0.034g/L、硼酸0.022g/L、硅酸钠0.004g/L、氟化钠0.0024g/L、硝酸铵0.0016g/L、磷酸氢二钠0.008g/L、培养基的pH值为7.6±0.2，然后在27℃、140rpm下培养18小时，直到指数增长期(即浓度达到1.7×107cfu/mL)。之后按照1％、3％、5％、7％和10％体积(体积/体积)的菌种培养物加入到50mL的米氏凯伦藻(5.39×104cells/mL)藻类培养物中，然后在27℃的光照培养箱中黑暗培养8h，其中，造成藻细胞大量死亡的菌株认定为溶藻菌，选取溶藻效率最高的菌株进行纯化。
③溶藻细菌的纯化或培养：取琼脂平板上四区划线的纯培养物单菌落一颗，接种于斜面培养基上，待该斜面菌苔生长稳定后，由该斜面转接另外的斜面培养基上直至培养稳定。
将上述纯化得到的菌落进行鉴定，鉴定结果如下：
(1)菌体的形态特性：
a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，所筛选的栖海鞘粘着杆菌的细胞染色为革兰氏阴性；在电子显微镜下观察，其形态为杆状，无鞭毛，如图1所示；
b.菌落的形态特性：在2216E培养基上27℃培养48h，形状圆形，浅黄色半透明。表面光滑隆起，边缘不整齐。菌落直径为1～2mm；
c.主要的生理生化特征如表1所示：
表2栖海鞘粘着杆菌的各项生理生化特征
从表1可知，本发明所筛选的细菌与栖海鞘粘着杆菌的生理生化特性很相似。
(2)提取细菌基因组DNA，采用细菌的16S rRNA通用引物：
上游引物：F27(5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3')
下游引物：R1492(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)
扩增其16S rDNA全部基因，测序结果如SEQ ID NO：1所示。
将测序结果在NCBI数据库中进行比对。结果显示其与Tenacibaculumascidiaceicola strain RSS1-6相似度最高，达到97％。命名为Tenacibaculumascidiaceicola GDUTW01(以下均称菌株GDUTW01)。
综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列结果，本发明所筛选的菌株应归属芽孢杆菌属的一个新变种，命名为栖海鞘粘着杆菌(Tenacibaculum ascidiaceicola)GDUTW01。
该栖海鞘粘着杆菌(Tenacibaculum ascidiaceicola)GDUTW01于2022年9月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC NO:M 20221419。
实施例2
本实施例为栖海鞘粘着杆菌(Tenacibaculum ascidiaceicola)GDUTW01在治理赤潮中的应用，实现有效的杀灭抑制米氏凯伦藻。
下面对本发明筛选得到的栖海鞘粘着杆菌(Tenacibaculum ascidiaceicola)GDUTW01的溶藻能力进行试验验证的方法如下：
①制备米氏凯伦藻培养液：米氏凯伦藻测试株由暨南大学赤潮生物研究中心提供，选用f/2海水培养基进行培养。将藻种接种到规格为500mL的锥形瓶后置于光照培养箱进行培养，设置光照培养箱的常规温度为23±2℃，光暗比为12h:12h，光照强度为2000Lux，持续培养到米氏凯伦藻的对数生长期(即细胞浓度为5.39×104cells/mL)。米氏凯伦藻的培养基由添加营养盐的天然海水经高温高压灭菌而制得，培养基经高温高压(121℃，20分钟)灭菌后冷却至室温后使用。
②制备GDUTW01发酵液：挑取纯化后的菌落，放至50mL的2216E液体培养基中，在27℃、140rpm下培养18小时，直到指数增长期(1.7×107cfu/mL，OD在1.0～1.2之间)。
共培养：将GDUTW01发酵液分别以1％、3％、5％、7％、10％的体积比加入到米氏凯伦藻培养液中进行8小时共培养，每小时记录叶绿素a的变化，并计算杀藻率。
得到的结果如图2所示，从不同浓度的栖海鞘粘着杆菌发酵液对米氏凯伦藻的杀灭率对比分析图可知，1％菌株GDUTW01发酵液为最低抑制浓度，即滤液开始表现出抑藻效果；其中10％菌株GDUTW01发酵液为杀藻抑制率最高，8小时达到92％以上。
实施例3
本实施例为判定栖海鞘粘着杆菌(Tenacibaculum ascidiaceicola)GDUTW01对米氏凯伦藻的杀灭是直接溶藻模式。
将分离出的细菌接种于50mL的2216E液体培养基中，摇床37℃培养至对数增长期，以获得细菌培养液，然后取培养液5000rpm(4℃)离心15min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤器过滤三次，记为无细胞滤液。剩余沉淀用灭菌2216E液体培养基清洗三次，重悬于相同体积的2216E液体培养基中，记为清洗后细菌细胞重悬液(溶液中无潜在溶藻代谢物)。将细菌培养液、无细胞滤液和清洗后细菌细胞重悬液按10％体积分数(v/v)分别接种到50mL米氏凯伦藻藻液中。以上实验，均共培养八小时，设置三组平行，每小时测定混合液的叶绿素a浓度，计算其溶藻效率。
结果如图3所示，清洗后细菌细胞重悬液与原始细菌培养液溶藻效率相同，而无细胞滤液的溶藻效率大幅降低，证明细菌主要是以直接细胞接触方式溶藻。
综上，本发明的栖海鞘粘着杆菌在治理赤潮的应用中，能够对引起有害赤潮的鱼毒性米氏凯伦藻具有杀灭和抑制作用。在发酵液以10％的体积加入到浓度为5.39×104cells/mL的藻液中，8小时杀藻抑制率达到92.6％，并且是首个以直接溶藻方式杀灭米氏凯伦藻的菌株。
以上对本发明所提供的一种栖海鞘粘着杆菌及其筛选、培养方法和应用进行了详细介绍，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种栖海鞘粘着杆菌，其特征在于，所述栖海鞘粘着杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M20221419。
2.根据权利要求1所述的栖海鞘粘着杆菌，其特征在于，所述栖海鞘粘着杆菌的16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
3.一种权利要求1或2所述的栖海鞘粘着杆菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将水样经100μm滤膜预过滤以去除大颗粒杂质，然后用消毒海水稀释后在培养基上进行培养，直到形成明显的菌落；
步骤2：将所述菌落进行分离，分别接种到培养基上进行培养，得到培养物，然后将所述培养物加入到米氏凯伦藻培养物中，继续培养，选取溶藻效率最高的菌株进行纯化，得到栖海鞘粘着杆菌。
4.一种权利要求1或2所述的栖海鞘粘着杆菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
取纯化后的栖海鞘粘着杆菌单菌落一颗，接种于第一斜面培养基上，直到菌苔生长稳定后，由所述第一斜面培养基转接于第二斜面培养基上直至培养稳定。
5.一种权利要求1或2所述的栖海鞘粘着杆菌在制备溶藻产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述溶藻的藻类为米氏凯伦藻。
7.一种权利要求1或2所述的栖海鞘粘着杆菌在赤潮治理方面的应用。
8.一种赤潮治理的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的栖海鞘粘着杆菌在培养基中进行培养，得到栖海鞘粘着杆菌发酵液，将所述栖海鞘粘着杆菌发酵液加入到米氏凯伦藻培养液中进行共培养。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养基为2216E液体培养基；
所述培养条件为27℃、140rpm；
所述培养时长为18小时。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述栖海鞘粘着杆菌发酵液与所述米氏凯伦藻培养液的体积比为1～10:100。
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