CN116655792A - 靶向Siglec-15的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种特异性结合Siglec‑15的抗体或其抗原结合部分，以及一种靶向Siglec‑15的单克隆抗体及其应用。
Description
通过援引并入
本申请是2023年2月3日提交的中国专利申请CN202310080778.7的分案申请，其全部内容通过引用的方式整体并入本文。本申请要求2022年3月21日提交的PCT申请PCT/CN2022/082035的优先权，全部内容通过引用的方式整体并入本文。本文引用或参考的所有文件(包括但不限于本文引用的所有文献文件、专利、公开的专利申请)(“本文引用的文件”)，以及本文引用的文件中所引用或参考的所有文件，连同本文或通过援引并入本文的任何文件中提及的针对任何产品的任何制造商说明、描述、产品规格及产品说明书都通过援引特此并入本文，并可用于实践本发明。更具体地，所有参考的文件都通过援引并入，其程度如同每个个别文件都具体且单独地指示通过援引并入一般。本披露中提及的任何Genbank序列均通过援引并入，其中Genbank序列为本披露的最早有效提交日期的序列。
本申请的序列表标记为“SequenceListing”，其创建于2023年5月6日并且大小为154KB。该序列表的全部内容通过援引整体并入本文。
技术领域
本披露涉及与Siglec-15特异性结合的抗体或其抗原结合部分，以及其在抑制、减少或逆转Siglec-15介导的免疫抑制及在治疗或缓解Siglec-15相关疾病中的用途。
背景技术
免疫球蛋白超家族(IgSF)为一大类细胞表面蛋白和可溶性蛋白，其参与细胞的识别、结合或粘附过程。唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素或Siglec是该超家族的子集，各自在其胞外区域含有N末端唾液酸结合V-set免疫球蛋白结构域和一个或多个C2-set免疫球蛋白结构域，并参与免疫稳态调节(Crocker,P.等人,(2007)Nat Rev Immunol 7(4):255–266)。
Siglec-15是独特的Siglec成员，其在骨髓细胞(主要为巨噬细胞)和破骨细胞上选择性地表达(Sun J等人,(2021)Clin Cancer Res.27(3):680-688)。与大多数其他成员不同，其在胞内区域中不具有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)或ITIM样基序，而是与含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的DAP12或DAP10蛋白结合并经由其进行信号传导(Angata T等人,(2007)Glycobiology 17:838-846；Ishida-Kitagawa N等人,(2012)J Biol Chem 287:17493-17502)。
Siglec-15最初在21世纪一十年代初期以破骨细胞调节剂来表征。破骨细胞前体上的Siglec-15分子识别相邻破骨细胞前体上的CD44，并经由DAP12-SYK通路转导信号，并且发现用抗Siglec-15抗体治疗可抑制破骨细胞分化和骨吸收(Sato D等人,(2018)Bone116:172–80)。DS-1501(Daiichi Sankyo)，一种Siglec-15靶向分子，正处于用于缓解骨质疏松症的I期临床试验中。
Siglec-15随后经报道参与免疫调节，尤其是癌症免疫。研究已表明，Siglec-15表达在大多数正常组织中受限，但在人肿瘤细胞和肿瘤基质细胞中上调，包括肿瘤相关巨噬细胞，在例如结肠癌、子宫内膜样癌、甲状腺癌、膀胱癌、肾癌、肺癌和肝癌中(Wang J.等人,(2019)Nat Med 25:656–666)。骨髓细胞或巨噬细胞上的Siglect-15优先结合唾液酸-Tn(一种碳水化合物癌症标志物)，从而导致骨髓细胞或巨噬细胞的TGF-β产量增加，最终建立有利于肿瘤细胞的肿瘤微环境(TME)。例如，增强的TGF-β释放可能会促进癌细胞的上皮细胞-间质转变和转移(Takamiya R等人,(2013)Glycobiology 23(2):178–87)。还发现巨噬细胞或骨髓细胞上的Siglec-15在体内抑制抗原特异性T应答，并且抗体对Siglec-15的阻断可逆转T细胞抑制并减缓小鼠模型中的肿瘤生长。在Siglec-15敲除模型中，肿瘤浸润性CD8+T细胞、NK细胞和几个炎症性骨髓细胞群显著扩增，而MHC-II低肿瘤相关巨噬细胞和MDSC水平下降(Wang J.等人,(2019)同上文)。巨噬细胞和肿瘤相关的Siglec-15均可有助于免疫抑制性肿瘤微环境(TME)。
尽管仍有许多问题有待阐明，但由于Siglec-15具有免疫抑制活性、在TME中的选择性上调、跨肿瘤类型的广泛上调及在TME中与PD-L1的相互排斥的表达模式，Siglec-15作为用于肿瘤治疗的有前景的治疗靶点引起了人们的关注。靶向Siglec-15可能会产生更有益的毒性应答概况，并可能与抗PD-L1疗法协同作用(Wang J.等人,(2019)同上文)。首创抗Siglec-15抗体NC318在一项针对实体瘤(包括非小细胞肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、结直肠癌和乳腺癌)的多中心临床试验中显示出良好的安全性和令人鼓舞的抗肿瘤功效(Shum E等人,(2021)Journal for ImmunoTherapy of Cancer 9(增刊2):A1-A1054)。
仍然需要用于调节Siglec-15和由此引发的信号传导的工具和技术。
本申请中的任何文件的引用或标识并不承认该文件可作为本发明的现有技术获得。
发明内容
本申请的发明人已发现几种抗体或其抗原结合部分，其与现有技术抗Siglec-15抗体(比如NC318)相比，具有i)相当的(如果不是更高)与人和猴Siglec-15的结合活性/亲和力，和ii)相当的(如果不是更高)对Siglec-15免疫抑制活性的抑制作用。这些抗体或其抗原结合部分可用于调节Siglec-15和由此引发的信号传导，以增加免疫应答，或减少或逆转免疫抑制。这些抗体或其抗原结合部分可用于调节破骨细胞分化以减少骨吸收或增加骨形成。这些抗体或其抗原结合部分也可用于治疗与Siglec-15信号传导相关的疾病和病症。
在一方面，本披露提供了一种与Siglec-15特异性结合的经分离的单克隆小鼠、嵌合或人源化抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含(i)重链可变区，该重链可变区可包含分别含有以下氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3：(1)SEQ ID NO:1、2和3；(2)SEQ ID NO:7、8和9；(3)SEQ ID NO:13、14和15；(4)SEQ ID NO:19、20和21；(5)SEQID NO:25、26和27；(6)SEQ ID NO:34、35和36；(7)SEQ ID NO:40、41和42；(8)SEQ ID NO:46、47和48；(9)SEQ ID NO:52、53和54；或(10)SEQ ID NO:58、59和60；和/或(b)轻链可变区，该轻链可变区可包含分别含有以下氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3：(1)SEQID NO：4、5和6；(2)SEQ ID NO:10、11和12；(3)SEQ ID NO:16、17和18；(4)SEQ ID NO:22、23和24；(5)SEQ ID NO:28、29和30；(6)SEQ ID NO:31、32和33；(7)SEQ ID NO:37、38和39；(8)SEQ ID NO:43、44和45；(9)SEQ ID NO:49、50和51；(10)SEQ ID NO:55、56和57；或(11)SEQID NO:61、62和63。还提供了这些抗体或抗原结合部分的变体，其在CDR中的每一个中包含最多约3个氨基酸取代(例如，一个、两个或三个氨基酸取代)。
本披露的经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可包含(i)含有VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3的重链可变区，和(ii)含有VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的轻链可变区，其中VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3可分别包含以下氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6；(2)SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12；(3)SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18；(4)SEQ ID NO:19、20、21、22、23和24；(5)SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30；(6)SEQID NO:25、26、27、31、32和33；(7)SEQ ID NO:34、35、36、37、38和39；(8)SEQ ID NO:40、41、42、43、44和45；(9)SEQ ID NO:46、47、48、49、50和51；(10)SEQ ID NO:52、53、54、55、56和57；或(11)SEQ ID NO:58、59、60、61、62和63。在某些实施例中，本披露的经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可包含重链可变区和轻链可变区，其中VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3可分别包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6的氨基酸序列。在某些实施例中，本披露的经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可包含重链可变区和轻链可变区，其中VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3可分别包含SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12的氨基酸序列。还提供了这些抗体或抗原结合部分的变体，其在CDR中的每一个中包含最多约3个氨基酸取代(例如，一个、两个或三个氨基酸取代)。
重链可变区可包含与SEQ ID NO:64、66、68、70、72、75、77、79、81、83、85、86、87、88、93、94、95或96具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
轻链可变区可包含与SEQ ID NO:65、67、69、71、73、74、76、78、80、82、84、89、90、91、92、97、98、99或100具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:85至100的氨基酸序列可分别由SEQ ID NO:101至116的核酸序列编码。
本披露的经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可包含重链可变区和轻链可变区，其可包含分别与以下具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:64和65；(2)SEQ ID NO:66和67；(3)SEQ ID NO:68和69；(4)SEQ ID NO:70和71；(5)SEQ ID NO:72和73；(6)SEQ ID NO:72和74；(7)SEQ ID NO:75和76；(8)SEQ ID NO:77和78；(9)SEQ ID NO:79和80；(10)SEQ ID NO:81和82；(11)SEQ ID NO:83和84；(12)SEQ ID NO:85和91；(13)SEQID NO:85和92；(14)SEQ ID NO:86和89；(15)SEQ ID NO:86和90；(16)SEQ ID NO:86和91；(17)SEQ ID NO:86和92；(18)SEQ ID NO:87和89；(19)SEQ ID NO:87和90；(20)SEQ ID NO:87和91；(21)SEQ ID NO:87和92；(22)SEQ ID NO:88和89；(23)SEQ ID NO:88和90；(24)SEQID NO:88和91；(25)SEQ ID NO:88和92；(26)SEQ ID NO:93和97；(27)SEQ ID NO:93和98；(28)SEQ ID NO:93和99；(29)SEQ ID NO:93和100；(30)SEQ ID NO:94和97；(31)SEQ IDNO:94和98；(32)SEQ ID NO:94和99；(26)SEQ ID NO:94和100；(33)SEQ ID NO:95和97；(34)SEQ ID NO:95和98；(35)SEQ ID NO:95和99；(36)SEQ ID NO:95和100；(37)SEQ IDNO:96和97；(38)SEQ ID NO:96和98；(39)SEQ ID NO:96和99；或(40)SEQ ID NO:96和100。
本披露的经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可包含重链可变区和轻链可变区，其可包含分别与以下具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:64和65；(2)SEQ ID NO:66和67；(3)SEQ ID NO:68和69；(4)SEQ ID NO:70和71；(5)SEQ ID NO:72和73；(6)SEQ ID NO:72和74；(7)SEQ ID NO:75和76；(8)SEQ ID NO:77和78；(9)SEQ ID NO:79和80；(10)SEQ ID NO:81和82；(11)SEQ ID NO:83和84；(12)SEQ ID NO:85和92；(13)SEQID NO:86和92；(14)SEQ ID NO:87和91；(15)SEQ ID NO:94和98；(16)SEQ ID NO:94和100；或(17)SEQ ID NO:95和97。
在某些实施例中，本披露的经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可包含重链可变区和轻链可变区，其中VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3可分别包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6的氨基酸序列。重链可变区可包含与SEQ ID NO:64、85、86、87或88具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。轻链可变区可包含与SEQ ID NO:65、89、90、91或92具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，本披露的经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可包含重链可变区和轻链可变区，其包含分别与以下具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:64和65；(2)SEQ ID NO:85和92；(3)SEQ ID NO:86和92；或(4)SEQ ID NO:87和91。
在某些实施例中，本披露的经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可包含重链可变区和轻链可变区，其中VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3可分别包含SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12的氨基酸序列。重链可变区可包含与SEQ ID NO:66、93、94、95或96具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。轻链可变区可包含与SEQ ID NO:67、97、98、99或100具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，本披露的经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可包含重链可变区和轻链可变区，其包含分别与以下具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:66和67；(2)SEQ ID NO:94和98；(3)SEQ ID NO:94和100；或(4)SEQ ID NO:95和97。
本披露的经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可包含重链恒定区和/或轻链恒定区，其中重链可变区的C末端连接至重链恒定区的N末端，并且轻链可变区的C末端连接至轻链恒定区的N末端。重链恒定区可为IgG、IgD、IgA、IgM或IgE重链恒定区，比如IgG1、IgG2(比如IgG2a)、IgG3或IgG4重链恒定区，其优选为天然的或经工程化以具有减少的或最小的FcR和/或补体系统蛋白结合亲和力；或其功能片段，例如人IgG4重链恒定区或其功能片段。在某些实施例中，重链恒定区可为人IgG4重链恒定区或其功能片段，其具有例如SEQ IDNO:117的氨基酸序列。在某些实施例中，免疫球蛋白重链恒定区可包含免疫球蛋白重链恒定区的铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。轻链恒定区可为κ或λ轻链恒定区，比如人κ轻链恒定区；或其功能片段。在某些实施例中，轻链恒定区可为人κ轻链恒定区，其具有例如SEQ ID NO:118的氨基酸序列。
本披露的抗体或抗原结合部分可为抗体片段，比如Fab、F(ab’)2、Fv、scFv或(scFv)2。
本披露还提供了一种双特异性分子，其可包含本披露的抗体或其抗原结合部分，其连接至具有与该抗体或其抗原结合部分不同的结合特异性的第二功能部分(例如，第二抗体或其抗原结合部分)。本披露还提供了一种溶瘤病毒，其配备有例如经工程化以表达本披露的抗体或其抗原结合部分。
编码本披露的抗体或其抗原结合部分或双特异性分子的核酸分子，以及可包含此类核酸分子的表达载体和可包含表达载体或将核酸分子整合到其基因组中的宿主细胞也由本披露涵盖。还提供了一种用于使用宿主细胞制备本披露的抗体或其抗原结合部分或双特异性分子的方法，其可包括以下的步骤：(i)在宿主细胞中表达主题分子和(ii)从宿主细胞或其细胞培养物中分离主题分子。
本披露还提供了一种组合物，其可包含本披露的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、溶瘤病毒、核酸分子、表达载体或宿主细胞，以及药学上可接受的载剂。该组合物可进一步包含抗肿瘤剂、抗骨质疏松剂或类似物。本披露同时提供了上述组合物在治疗或缓解与Siglec-15信号传导相关的疾病中的用途。
在另一方面，本披露提供了一种用于在体外或体内调节Siglec-15信号传导的方法，其包括使本披露的组合物与表达Siglec-15的细胞接触。在某些实施例中，Siglec-15信号传导减少。
在某些实施例中，本披露提供了一种用于在有需要的受试者中调节Siglec-15信号传导的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本披露的组合物。在某些实施例中，Siglec-15信号传导减少。
本披露还提供了一种用于在有需要的受试者中增加免疫应答或逆转免疫抑制的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本披露的组合物。在某些实施例中，免疫应答经增加，或免疫抑制经减少或消除。
在其他方面，本披露提供了一种用于在有需要的受试者中调节破骨细胞分化的方法，其包括向受试者施用本披露的组合物。在某些实施例中，该方法用于减少或消除骨吸收。在某些实施例中，该方法用于促进骨形成。
在另一方面，本披露提供了一种用于在有需要的受试者中治疗或缓解与Siglec-15信号传导相关的疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本披露的组合物。在某些实施例中，该疾病是骨质疏松症。可以向受试者进一步施用抗骨质疏松剂。在某些实施例中，该疾病是肿瘤。该肿瘤可以是实体瘤，包括但不限于子宫内膜样癌、甲状腺癌、膀胱癌、肾癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC))、肝癌、卵巢癌、黑色素瘤、结直肠癌和乳腺癌。可以向受试者进一步施用抗肿瘤剂。受试者可对PD-L1疗法具抗性。
本披露的其他特征和优点将从下面的详细描述和实例中显而易见，这些详细描述和实例不应被解释为限制。本申请全文所引用的所有参考文献、GenBank条目、专利和已公开的专利申请的内容通过援引明确并入本文。
因此，本发明的一目标为不在本发明内涵盖任何先前已知的产品、制造该产品的工艺或使用该产品的方法，因此申请人保留权利并特此披露任何先前已知的产品、工艺或方法的免责声明。应进一步注意，本发明并不旨在在本发明的范围内涵盖不符合USPTO(35U.S.C.§112，第一段)或EPO(EPC第83条)的书面描述和能够实现要求的任何产品、工艺或产品的制造或使用产品的方法，因此申请人保留权利并特此披露任何先前描述的产品、制造产品的工艺或使用产品的方法的免责声明。在本发明的实践中，符合EPC第53(c)条和EPC第28(b)和(c)条规可能是有利的。明确放弃作为申请人在本申请的系列或任何其他系列或任何第三方先前提交的任何申请中的任何已授权专利的主题的任何实施例的所有权利均被明确保留。本文中的任何内容均不得解释为承诺。
需要注意的是，在本披露中并且特别是在权利要求书和/或段落中，比如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”和类似术语的术语可具有美国专利法赋予其的含义；例如，其可意指“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(including)”和类似术语；并且比如“基本上由...组成(consisting essentially of)”和“基本上由...组成(consists essentially of)”的术语具有美国专利法赋予其的含义，例如，其允许未明确叙述的要素，但排除现有技术中发现或影响本发明的基本或新颖特征的要素。
附图说明
以下的详细描述，借助于实例给出但并非旨在将本发明仅限于所描述的特定实施例，可结合附图最好地理解。
图1.具有4轮免疫接种的经免疫的野生型小鼠的血清滴度曲线。
图2.本披露的抗体与在CHO-K1细胞上表达的人Siglec-15的结合曲线(A至D)。
图3.本披露的抗体与在CHO-K1细胞上表达的食蟹猴Siglec-15的结合曲线(A至D)。
图4.本披露的抗体与在CHO-K1细胞上表达的小鼠Siglec-15的结合曲线(A至C)。
图5.IFN-γ(A)和IL-2(B)(作为两种活化标志物)的水平，这些标志物通过用Siglec-15和本披露的抗体处理的抗CD3活化的PBMC释放。
图6.用Siglec-15和本披露的抗体处理的抗CD3活化的T细胞的萤光素酶表达水平。
图7.IFN-γ(A至E)和IL-2(F至J)(作为两种活化标志物)的水平，这些标志物通过用Siglec-15和本披露的抗体(最终浓度为10μg/ml或50μg/ml)处理的抗CD3活化的PBMC释放。
具体实施方式
为了确保可以更容易地理解本披露，在整个详细描述中阐述了某些术语。
如本文所用的术语“一(a)”和“一(an)”是指冠词的语法对象的一个或超过一个(即，至少一个)。举例来说，“抗体”意指一种抗体或超过一种抗体。
术语“Siglec-15”是指唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素15。术语“Siglec-15”包含变体、异构体、同系物、直向同源物和横向同源物。例如，在某些情况下，对人Siglec-15蛋白具有特异性的抗体可与来自除人之外的物种(比如猴子)的Siglec-15蛋白交叉反应。在其他实施例中，对人Siglec-15蛋白具有特异性的抗体可对人Siglec-15蛋白具有完全特异性，并且不表现出对其他物种或其他类型的交叉反应性，或可与来自某些其他物种但并非所有其他物种的Siglec-15交叉反应。
术语“人Siglec-15”是指具有来自人的氨基酸序列(比如具有Genbank登录号AAY40743.1的人Siglec-15的氨基酸序列)的Siglec-15蛋白(Angata T.等人,(2007)Glycobiology 17(8):838-846)。术语“猴或恒河猴Siglec-15”和“小鼠Siglec-15”分别指猴和小鼠Siglec-15序列。
如本文所用，术语“抗体”是指经由至少一个抗原结合位点识别并特异性结合靶点(比如Siglec-15)的免疫球蛋白分子，其中抗原结合位点通常在免疫球蛋白分子的可变区内。如本文所用，该术语涵盖完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、单链Fv(scFv)抗体、重链抗体(HCAb)、轻链抗体(LCAb)、多特异性抗体、双特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白以及包含抗原结合位点的任何其他经修饰的免疫球蛋白分子(例如，双可变结构域免疫球蛋白分子)，只要这些抗体表现出所需的生物学活性。抗体还包括但不限于小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。抗体可为五大类免疫球蛋白中的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同种型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，分别基于其称为α、δ、ε、γ和μ的重链恒定结构域的同一性。不同类别的免疫球蛋白具有不同且众所周知的亚基结构和三维构型。抗体可为裸抗体或与其他分子结合，这些其他分子包括但不限于毒素和放射性同位素。除非另有明确说明，否则如本文所用的术语“抗体”包括完整抗体的“抗原结合部分”。IgG是一种糖蛋白，其可包含通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链可包含重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区(CH)。重链恒定区可包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链可包含轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区可包含一个结构域CL。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，其按以下顺序从氨基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。重链恒定区的“功能片段”是指恒定区的一部分，其保留了全长恒定区的特征，比如介导抗体与免疫细胞和/或补体系统蛋白的结合的能力。轻链恒定区的“功能片段”是指恒定区的一部分，其保留全长恒定区的特征。
如结合抗体使用的术语“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个片段，其保留与抗原(例如Siglec-15)特异性结合的能力。已表明抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。术语抗体的“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，一种在铰链区处包含通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；(vi)经分离的互补决定区(CDR)；和(viii)纳米抗体，一种含有单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但这些结构域可以使用重组方法通过合成接头来接合，使这些结构域能够制成单个蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人,(1988)Science 242:423-426；和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体也旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。使用本领域中技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选片段以供使用。
术语抗体的“Fc区”是抗体的尾区，其与Fc受体和补体系统的一些蛋白质相互作用以活化免疫系统。IgG、IgA和IgD Fc区由衍生自抗体重链的第二恒定结构域和第三恒定结构域(CH2和CH3)的两个相同片段构成，而IgM和IgE Fc区含有三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。Fc区可与补体组分C1q结合以活化经典补体级联反应；可与吞噬细胞(即巨噬细胞、粒细胞和树突状细胞)上的Fc受体结合以诱导抗体所结合的细胞的吞噬作用；可与免疫效应细胞(主要是自然杀伤细胞)的Fc受体结合以诱导从免疫效应细胞释放细胞毒性颗粒，此导致抗体包被的细胞的死亡；并且可与比如树突状细胞的抗原呈递细胞的Fc受体结合以诱导体液和细胞抗病毒免疫应答。
如本文所用的术语“结合亲和力”通常是指本披露的抗体或其抗原结合部分与靶点分子(比如Siglec-15)之间的非共价相互作用的总强度。抗体或其抗原结合部分与靶点分子的结合是可逆的，并且结合亲和力通常报告为平衡解离常数(KD)。KD是解离速率(koff或k d )与缔合速率(kon或ka)的比率。结合对的KD越低，亲和力越高。测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，这些方法中的任一种均可用于本披露的目的。特定的说明性实施例包括以下内容。在一个实施例中，“KD”或“KD值”可通过本领域已知的测定(例如通过结合测定)测量。KD可以在放射性标记的抗原结合测定(RIA)中测量(Chen等人,(1999)J.Mol Biol 293:865-881)。KD或KD值也可以通过Biacore，使用例如BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)通过使用表面等离子共振测定，或通过生物层干涉测量法使用例如OctetQK384系统(ForteBio,Menlo Park,CA)来测量。当含有多个表位的靶点分子与含有结合靶点分子的多个结合位点的抗体或抗原结合部分接触时，结合分子与靶点分子在一个位点处的相互作用可能会增加在第二个位点处的反应的可能性。多价抗体与抗原之间的此类多重相互作用的强度称为亲合力。例如，高亲合力可以补偿低亲和力，正如有时针对五聚体IgM抗体所发现，其可具有低于IgG的亲和力，但IgM的高亲合力(由于其多价性)使其能够有效结合抗原。
如本文所用的术语“特异性结合”意指抗体或其抗原结合部分与抗原或表位的相互作用比替代物质(包括相关和不相关的蛋白质)更频繁、更迅速、持续时间更长、亲和力更大或上述的一些组合。特异性结合靶点分子(例如Siglec-15)的抗体或其抗原结合部分可以例如通过免疫测定、ELISA、SPR(例如Biacore)或本领域中技术人员已知的其他技术来鉴别。通常，特定反应将为背景信号或噪声的至少两倍，并且可为背景的超过10倍。对于有关抗体特异性的讨论，请参见例如Paul编辑,1989,Fundamental Immunology第二版,RavenPress,New York，第332-336页。特异性结合靶点分子的抗体或其抗原结合部分可以比其针对不同分子的亲和力更高的亲和力结合靶点分子。在一些实施例中，特异性结合靶点分子的抗体或其抗原结合部分可以以比其针对不同分子的亲和力高至少20倍、高至少30倍、高至少40倍、高至少50倍、高至少60倍、高至少70倍、高至少80倍、高至少90倍或高至少100倍的亲和力结合靶点分子。在一些实施例中，特异性结合特定靶点分子的抗体或其抗原结合部分可以低亲和力结合不同的分子，该亲和力低至以致使用本文所描述或本领域中另外已知的测定无法检测到结合。在一些实施例中，“特异性结合”意指例如抗体或其抗原结合部分以约5.0E-08或更小的KD结合分子靶点。由于不同物种中同源蛋白之间的序列同一性，特异性识别靶点分子的抗体或其抗原结合部分可与其他物种中的靶点交叉反应。应当理解，特异性结合第一靶点的抗体或其抗原结合部分可以特异性结合或可以不特异性结合第二靶点。因此，“特异性结合”不一定需要(尽管其可以包括)排斥性结合，即与单靶点结合。因此，在一些实施例中，抗体或其抗原结合部分特异性结合超过一个靶点。例如，在某些情况下，抗体或其抗原结合部分可包含两个相同的抗原结合位点，每个抗原结合位点特异性结合两种或更多种蛋白质上的相同表位。
如本文所用，“经分离的抗体”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合Siglec-15的经分离抗体基本上不含特异性结合除Siglec-15之外的抗原的抗体)。然而，特异性结合Siglec-15的经分离的抗体可与其他抗原具有交叉反应性。另外，经分离的抗体可基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即包含该群体的各个抗体是相同的，除了可能少量存在的可能自然发生的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)。单克隆抗体具有针对单抗原位点的高度特异性。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除其特异性之外，单克隆抗体的优势在于其是通过杂交瘤培养物合成的，未被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体中获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括例如杂交瘤方法(例如Kohler和Milstein,Nature,256:495-97(1975)；Hongo等人,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow等人,Antibodies:ALaboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988)；Hammerling等人,于：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)，以及用于在具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中产生人或人样抗体的技术(参见例如WO1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等人,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Mark等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,NatureBiotechnol.14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
如本文所用的术语“小鼠抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中构架区和CDR区均衍生自小鼠种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，则该恒定区也衍生自小鼠种系免疫球蛋白序列。本披露的小鼠抗体可以包括不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用的术语“小鼠抗体”不旨在包括其中衍生自另一哺乳动物物种种系的CDR序列已移植到小鼠构架序列上的抗体。
术语“嵌合抗体”是指通过将来自非人(例如，小鼠)来源的遗传物质与来自人类的遗传物质合并而制备的抗体。或者更一般地，嵌合抗体是具有来自某一物种的遗传物质与来自另一物种的遗传物质的抗体。
如本文所用的术语“人源化抗体”是指来自非人(例如，小鼠)物种的抗体，其蛋白质序列已经修饰以增加与人中天然产生的抗体变体的相似性。
“人抗体”是这样一种抗体，其具有对应于由人类产生的抗体的氨基酸序列和/或已经使用如本文披露的任何用于制造人抗体的技术来产生。人抗体的此定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)产生人抗体。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。也可用于制备人单克隆抗体的是在Cole等人,MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)中描述的方法。另请参见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)。人抗体可以通过将抗原施用至已经修饰以响应抗原攻击而产生此类抗体但其内源基因座已失效的转基因动物(例如，已免疫的异种小鼠(xenomice))来制备(参见例如，有关XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584)。有关经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体，还参见例如Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
术语“IC50”，也称为半最大抑制浓度，是指本披露的抗体或其抗原结合部分相对于在不存在抗体的情况下抑制特定生物学或生化功能或过程(例如Siglec-15的免疫抑制活性)50％的浓度。
术语“EC50”，也称为半最大有效浓度，是指抗体或其抗原结合部分在特定暴露时间后在基线和最大值之间的中间诱导应答的浓度。
术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，比如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖动物和爬行动物，然而哺乳动物是优选的，比如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、牛和马。
术语“治疗有效量”意指本披露的抗体或其抗原结合部分足以预防或减少与疾病或病状(比如骨质疏松症或肿瘤)相关的症状和/或减轻该疾病或病状的严重程度的量。治疗有效量被理解为与所治疗的病状有关，其中实际有效量很容易被本领域中的技术人员辨别。
如本文所用的与疾病或病状或患有疾病或病状的受试者相关的术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指抑制、消除、减少和/或改善症状、症状严重程度和/或与正在治疗的疾病或病症(比如骨质疏松症或肿瘤)相关的症状的频率的行为。
如本文所用的术语“施用(administer)”、“施用(administering)”或“施用(administration)”是指通过本文所描述或本领域中另外已知的方法将治疗性或药物组合物递送或导致递送至受试者体内的行为。施用治疗性或药物组合物包括开处要递送到患者体内的治疗性或药物组合物的处方。示例性施用形式包括口服剂型，比如片剂、胶囊剂、糖浆剂、混悬剂；可注射剂型，比如静脉内(IV)、肌肉内(IM)或腹膜内(IP)剂型；透皮剂型，包括乳膏、凝胶剂、粉剂或贴剂；口腔剂型；吸入粉剂、喷雾剂、混悬剂和直肠栓剂。
如本文在两个或更多个核酸或蛋白质/肽的上下文中所用的术语“同一性”百分比是指两个或更多个序列或子序列在针对最大对应性进行比较和对准(如有必要，引入缺口)时具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，不考虑任何保守氨基酸取代作为序列同一性的一部分。同一性百分比可以使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量。可用于获得氨基酸或核苷酸序列比对的各种算法和软件是本领域众所周知的。这些包括但不限于BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin Package和其变体。
如本文所用，术语“保守序列修饰”旨在指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被具有相似化学特征的侧链的另一个氨基酸残基替换的一种取代。本领域已经总体上定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，这些侧链包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，苯丙氨酸取代酪氨酸是保守取代。通常，本披露的多肽、可溶性蛋白质和/或抗体的序列中的保守取代不会消除含有氨基酸序列的多肽、可溶性蛋白质或抗体与靶结合位点的结合。对不消除结合的氨基酸保守取代进行鉴定的方法是本领域熟知的。
如本文所用的术语“变体”是指不同的抗体或其抗原结合部分，其与参考抗体或其抗原结合部分相比包含一个或多个(比如例如，约1至约25个、约1至约20个、约1至约15个、约1至约10个或约1至约5个)氨基酸取代、缺失和/或添加，但保持与参考抗体或其抗原结合部分所具有的相同的抗原结合亲和力/能力。
术语“载体”是指用于携带或包括核酸序列的物质，包括例如为了将核酸序列引入宿主细胞。适用的载体包括例如，表达载体、质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体，其可以包括可操作用于稳定整合到宿主细胞染色体中的选择序列或标志物。另外，载体可以包括一个或多个可选择的标志基因和合适的表达控制序列。可包括的可选择标志基因，例如提供对抗生素或毒素的抗性，补充营养缺陷或供应培养基中不存在的关键营养素。表达控制序列可以包括本领域中众所周知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子和其类似物。当要共表达两个或更多个核酸分子时(例如抗体重链和轻链或抗体VH和VL)，可以将核酸分子插入例如单一表达载体或分开的表达载体中。对于单一载体表达，编码核酸可以可操作地连接至一种共同的表达控制序列或连接至不同的表达控制序列，比如一种诱导型启动子和一种组成型启动子。可以使用本领域中众所周知的方法确认将核酸分子引入宿主细胞中。本领域中的技术人员理解，核酸分子以足以产生所需产物(例如，如本文所述的抗体)的量表达，并且进一步理解，可以使用本领域中众所周知的方法优化表达水平以获得足够的表达。
下文更详细地描述本披露的各个方面。
本披露的抗体或其抗原结合部分与Siglec-15特异性结合并且抑制Siglec-15的免疫抑制活性。Siglec-15可抑制免疫细胞活性和增殖并且促进肿瘤生长。因此，在通过本披露的抗体或其抗原结合部分降低或消除Siglec-15活性的情况下，可以逆转或恢复免疫力。因此，本披露的抗体或其抗原结合部分可有助于操控Siglec-15信号传导以便增加免疫应答，减少或消除免疫抑制，减少骨吸收或增加骨形成和/或治疗或缓解比如骨质疏松症和肿瘤的疾病。
本披露的抗体或其抗原结合部分是小鼠、嵌合或人源化的。
本披露的抗体或其抗原结合部分的重链/轻链CDR和可变区的氨基酸序列和ID编号列于下表1和表3中。重链可变区CDR和轻链可变区CDR已由IMGT编号系统定义。然而，正如本领域中众所周知的，CDR区也可以基于重链/轻链可变区序列通过其他系统比如Chothia和Kabat、AbM或Contact编号系统/方法来确定。
本披露的抗体或其抗原结合部分可以含有优选地具有降低的或最小的FcR和/或补体系统蛋白结合亲和力的重链恒定区，比如具有例如SEQ ID NO:117所示的氨基酸序列的人IgG4重链恒定区；和/或轻链恒定区，比如具有例如SEQ ID NO:118所示的氨基酸序列的人κ恒定区。本披露的抗体或其抗原结合部分可以含有其他合适的重链恒定区和/或轻链恒定区。
本披露的抗体或其抗原结合部分可以是全长抗体、重链抗体(HCAb)、Fab、F(ab’)2、Fv、scFv或(scFv)2。本披露的抗体或其抗原结合部分可具有IgA、IgD、IgE、IgG或IgM同种型，比如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
与Siglec-15结合的其他抗体的VH和VL序列(或CDR序列)可以与本披露的抗体的VH和VL序列(或CDR序列)“混合和匹配”。优选地，当VH和VL链(或此类链内的CDR)混合和匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列经结构相似的VH序列替换。同样，优选地，来自特定VH/VL配对的VL序列经结构相似的VL序列替换。
可以通过本领域中已知的标准技术，比如定点诱变和PCR介导的诱变，将修饰引入本披露的抗体或其抗原结合部分。本披露的抗体或其抗原结合部分的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以经来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换(即，保守序列修饰)，并且改变的抗体可以使用本文所述的功能测定来测试其保留功能(即，上述功能)。
可以使用具有本披露的抗体或其抗原结合部分的一个或多个VH/VL序列的抗体作为起始材料来制备本披露的抗体，以对修饰的抗体进行工程化。可以通过修饰一个或两个可变区(即，VH和/或VL)内，例如在一个或多个CDR区内和/或在一个或多个构架区内的一个或多个残基来对抗体进行工程化。另外地或可替代地，可以通过修饰恒定区内的残基来对抗体进行工程化，例如以改变抗体的效应子功能。
在某些实施例中，CDR移植可用于对抗体的可变区进行工程化。抗体主要经由位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶点抗原相互作用。出于此原因，CDR内的氨基酸序列在个别抗体之间比CDR外的序列更为多样。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，因此可以通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体的特性的重组抗体，这些表达载体包括来自特定天然存在的抗体的CDR序列，这些CDR序列移植到来自具有不同特性的不同抗体的框架序列上。参见例如Riechmann等人(1998)Nature 332:323-327；Jones等人(1986)Nature321:522-525；Queen等人(1989)Proc.Natl.Acad。另参见U.S.A.86:10029-10033；美国专利号5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370。
因此，本披露的另一实施例涉及经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其可包含重链可变区，该重链可变区可包含可含有本披露的序列的CDR1、CDR2和CDR3序列，如上文所描述；和/或轻链可变区，该轻链可变区可包含可含有本披露的序列的CDR1、CDR2和CDR3序列，如上文所描述。虽然这些抗体含有本披露的单克隆抗体的VH和VL CDR序列，但其可以含有不同的构架序列。
框架修饰可用于去除T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。这种方法也称为“去免疫化”，并且进一步详细地描述于美国专利公开号20030153043中。
另一种类型的可变区修饰是突变VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基，从而改善目标抗体的一个或多个结合特性(例如，亲和力)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入突变，并且可以在如本领域中已知的体外或体内测定中评估对抗体结合或其他目标功能特性的影响。优选引入保守修饰(如本领域中已知的)。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失，但优选是取代。此外，CDR区内通常不超过一个、两个、三个、四个或五个残基经改变。
此外或者作为框架区或CDR区内进行的修饰的替代方案，本披露的抗体可经工程化以包括Fc区内的修饰，通常以改变抗体的一种或多种功能特性，比如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本披露的抗体可以经化学修饰(例如，一个或多个化学部分可以附接至抗体)或经修饰以改变其糖基化，以再次改变抗体的一种或多种功能特性。
在一个实施例中，CH1的铰链区经修饰以使得铰链区中的半胱氨酸残基的数量被改变，例如，增加或减少。这种方法进一步描述于美国专利号5,677,425中。改变CH1铰链区中的半胱氨酸残基的数量以例如促进轻链和重链的组装或提高或降低抗体的稳定性。
在另一实施例中，抗体的Fc铰链区经突变以减少抗体的生物半衰期。更具体地说，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区，使得相对于天然Fc铰链结构域SpA结合，该抗体具有削弱的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。这种方法进一步详细地描述于美国专利号6,165,745中。
在其他实施例中，抗体或其抗原结合部分的糖基化经修饰。例如，可以制备经糖基化的抗体(即抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点处的糖基化。此类糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。参见例如美国专利号5,714,350和6,350,861。
另外地或可替代地，可以制备具有改变类型的糖基化的抗体，比如具有减少的岩藻糖基残基量的低岩藻糖基化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。此类改变的糖基化模式已经证明可以增加抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化机制的细胞已在本领域中描述并且可以用作宿主细胞，在其中表达本披露的重组抗体从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1,6)-岩藻糖基转移酶)，使得在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其碳水化合物上缺乏岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系是通过使用两种替代载体靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因而创建的(参见美国专利公开号20040110704和Yamane-Ohnuki等人(2004)Biotechnol Bioeng 87:614-22)。作为另一实例，EP 1,176,195描述了一种具有功能性破坏的FUT8基因的细胞系，该基因编码岩藻糖基转移酶，使得在此类细胞系中表达的抗体通过减少或消除α-1,6键相关酶来表现出低岩藻糖基化。EP 1,176,195还描述了细胞系，这些细胞系具有低酶活性以用于将岩藻糖添加到与抗体Fc区结合的N-乙酰葡糖胺，或者不具有酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。PCT公开WO 03/035835描述了一种变体CHO细胞系Lec13细胞，其使岩藻糖附接到Asn(297)连接的碳水化合物的能力降低，此也导致该宿主细胞中所表达的抗体的低岩藻糖基化(另参见Shields等人(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。如PCT公开WO 06/089231中所描述，还可以在鸡蛋中生产具有修饰的糖基化概况的抗体。可替代地，可以在比如浮萍的植物细胞中生产具有修饰的糖基化概况的抗体。PCT公开WO 99/54342描述了经工程化以表达糖蛋白修饰糖基转移酶(例如，β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得经工程化细胞系中所表达的抗体表现出增加的二等分GlcNac结构，其导致抗体的ADCC活性增加(另参见Umana等人(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。可替代地，抗体的岩藻糖残基可以使用岩藻糖苷酶切割掉；例如，将岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体中去除岩藻糖基残基(Tarentino等人(1975)Biochem.14:5516-23)。
本披露考虑的本文中的抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。抗体可以经聚乙二醇化以例如增加抗体的生物学(例如，血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，抗体或其片段在其中一个或多个PEG基团变得附接至抗体或抗体片段的条件下通常与聚乙二醇(PEG)反应，比如PEG的反应性酯或醛衍生物。优选地，聚乙二醇化经由与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生其他蛋白质的任何形式的PEG，比如单(C1-C10)烷氧基-聚乙二醇或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施例中，待聚乙二醇化的抗体是非糖基化抗体。用于对蛋白质进行聚乙二醇化的方法是本领域已知的并且可以应用于本披露的抗体。参见例如EP0 154 316和EP 0 401 384。
本披露的抗体可以通过其各种物理特性来表征，以检测和/或区分其不同类别。
例如，抗体可在轻链或重链可变区中含有一个或多个糖基化位点。此类糖基化位点可能导致抗体的免疫原性增加或由于改变的抗原结合而引起的抗体pK的改变(Marshall等人(1972)Annu Rev Biochem 41:673-702；Gala和Morrison(2004)JImmunol 172:5489-94；Wallick等人(1988)J Exp Med 168:1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12:43R-56R；Parekh等人(1985)Nature 316:452-7；Mimura等人(2000)Mol Immunol 37:697-706)。已知糖基化发生在含有N-X-S/T序列的基序处。在一些情况下，优选具有不含可变区糖基化的抗体。这可以通过选择在可变区中不含糖基化基序的抗体或通过突变糖基化区内的残基来实现。
在优选的实施例中，抗体不含有天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺作用可发生在N-G或D-G序列上并且导致异天冬氨酸残基的产生，该残基将扭结引入多肽链并降低其稳定性(异天冬氨酸效应)。
每种抗体将具有独特的等电点(pI)，该等电点通常落在6与9.5之间的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7-9.5的pH范围内，而IgG4抗体的pI通常落在6-8的pH范围内。据推测，pI超出正常范围的抗体在体内条件下可能会出现一些展开和不稳定性。因此，优选具有含有落在正常范围内的pI值的抗体。这可以通过选择pI在正常范围内的抗体或通过对带电荷的表面残基进行突变来实现。
在另一方面，本披露提供了编码本披露的抗体的重链和/或轻链可变区或CDR的核酸分子。核酸可以存在于全细胞、细胞裂解物或部分纯化或基本纯的形式中。本披露的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或可以不含有内含子序列。
可以使用标准分子生物学技术获得本披露的核酸。对于由杂交瘤表达的抗体，编码由杂交瘤制造的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，可以从基因文库中回收编码此类抗体的核酸。
本披露的优选核酸分子包括编码抗体或CDR的VH和VL序列的核酸分子。一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，这些DNA片段可以通过标准重组DNA技术进一步操控，例如以将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段可操作地连接至编码另一蛋白质的另一DNA片段，比如抗体恒定区或柔性接头。如在本上下文中使用的术语“可操作地连接”旨在意指，两个DNA片段经接合以使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内。
编码VH区的经分离的DNA可以通过将编码VH的DNA可操作地连接至编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子来转化为全长重链基因。小鼠/人重链恒定区基因的序列是本领域中已知的，并且涵盖这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增来获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但在本披露中最优选地可以是IgG1恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可以可操作地连接至仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。
通过将编码VL的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子，可以将编码VL区的经分离的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。小鼠/人轻链恒定区基因的序列是本领域中已知的，并且涵盖这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增来获得。在优选的实施例中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为了创建scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段可操作地连接至编码柔性接头的另一片段，使得VH和VL序列可以表达为连续的单链蛋白质，其中VL和VH区通过柔性接头接合(参见例如，Bird等人(1988)Science 242:423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty等人,(1990)Nature348:552-554)。
还可以使用本领域中的技术人员已知的杂交瘤方法制备本披露的单克隆抗体。例如，使用杂交瘤方法，如上文所描述免疫接种小鼠、大鼠、兔、仓鼠或其他合适的宿主动物。在一些实施例中，在体外免疫接种淋巴细胞。在一些实施例中，免疫抗原是人Siglec-15蛋白或其片段。在免疫接种后，可以分离淋巴细胞并且使用例如聚乙二醇与合适的骨髓瘤细胞系融合。可以使用如本领域中已知的专用培养基来选择杂交瘤细胞，并且未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞不能在选择过程中存活。产生针对所选抗原的单克隆抗体的杂交瘤可以通过多种方法来鉴别，这些方法包括但不限于免疫沉淀、免疫印迹和体外结合测定(例如，流式细胞术、FACS、ELISA、SPR(例如，Biacore)和放射免疫测定)。一旦鉴别出产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，克隆可通过有限稀释或其他技术进行亚克隆。杂交瘤可以使用标准方法在体外培养物中，或在体内在动物中作为腹水瘤来繁殖。单克隆抗体可以根据本领域中的标准方法从培养基或腹水中纯化，这些方法包括但不限于亲和色谱、离子交换色谱、凝胶电泳和透析。
本披露的单克隆抗体也可以从表达所需物种的可变结构域或CDR的噬菌体展示文库中分离。噬菌体文库的筛选可以通过本领域中已知的各种技术来完成。例如，可以通过在几轮越来越严格的选择中用涂布有Siglec-15的比色板进行溶液淘选，来筛选scFv格式的小鼠或人B细胞抗体文库或小鼠或人天然Fab文库中与Siglec-15蛋白结合的抗体。分离物可以首先表达为scFv或Fab并通过ELISA筛选与受体结合结构域的结合，并且可以随后将所选分离物克隆并表达为IgG4，通过ELISA和/或SPR重新分析与Siglec-15蛋白的结合以及功能活性，并在CHO哺乳动物细胞系中进行转染以表达完整的IgG4抗体。
还可以使用例如如本领域中众所周知的重组DNA技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生本披露的抗体(例如，Morrison,S.(1985)Science229:1202)。在一个实施例中，将通过标准分子生物学技术获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入一个或多个表达载体中，使得基因可操作地连接至转录和翻译调节序列。在本上下文中，术语“可操作地连接”旨在意指抗体基因连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节抗体基因的转录和翻译的预期功能。
术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和控制抗体链基因的转录或翻译的其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。此类调节序列描述于例如Goeddel(GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990))中。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导哺乳动物细胞中高水平的蛋白质表达的病毒元件，比如衍生自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。可替代地，可以使用非病毒调节序列，比如泛素启动子或β-球蛋白启动子。更进一步，调节元件由来自不同来源的序列构成，这些不同来源比如SRα启动子系统，其含有来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病病毒1型的长末端重复序列(Takebe等人(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472)。选择表达载体和表达控制序列以与所使用的表达宿主细胞相容。
抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到相同或不同的表达载体中。在优选的实施例中，通过将可变区插入已编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，来使用这些可变区以产生任何抗体同种型的全长抗体基因，使得VH区段可操作地连接至载体内的CH区段并且VL区段可操作地连接至载体内的CL区段。另外地或可替代地，重组表达载体可以编码信号肽，其促进抗体链从宿主细胞中分泌。可以将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽框内连接至抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除了抗体链基因和调节序列之外，本披露的重组表达载体可以携带额外的序列，比如调节宿主细胞中载体的复制(例如，复制起点)和可选择标志基因的序列。可选择标志基因有助于选择已引入载体的宿主细胞(参见例如美国专利号4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常可选择标志基因赋予已引入载体的宿主细胞对药物(比如G418、潮霉素或甲氨蝶呤)的抗性。优选的可选择标志基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr宿主细胞中的甲氨蝶呤选择/扩增)和新霉素抗性基因(用于G418选择)。
对于轻链和重链的表达，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的广泛多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染和类似技术。尽管理论上可能在原核或真核宿主细胞中表达本披露的抗体，但在真核细胞且最优选地哺乳动物宿主细胞中表达抗体是最优选的，因为此类真核细胞且特别是哺乳动物细胞，是比原核细胞更可能组装和分泌经正确折叠且具有免疫活性的抗体。
用于表达本披露的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220，其与DHFR可选择标志物一起使用，例如，如描述于R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159:601-621)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别是与NSO骨髓瘤细胞一起使用时，另一种优选的表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中披露的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足够长的时间段以允许抗体在宿主细胞中表达，或更优选地允许抗体分泌到生长宿主细胞的培养基中来生产抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
在另一方面，本披露的特征在于双特异性分子，其可包含本披露的一种或多种抗体，该一种或多种抗体连接至至少一种其他功能分子，例如另一种肽或蛋白质(例如另一种抗体或受体的配体)，以产生与至少两个不同结合位点或靶点分子结合的双特异性分子。例如，本披露的双特异性抗体可经设计成结合Siglec-15中的两个表位，或结合Siglec-15中的一个表位和破骨细胞标志物或肿瘤相关抗原。本文中的术语“双特异性分子”包括具有三种或更多种特异性的分子。
双特异性分子可以许多不同的格式和大小出现。在尺寸光谱的一端处，双特异性分子保留了传统的抗体格式，除了其不具有两个具有相同特异性的结合臂，而是具有两个各自具有不同特异性的结合臂。在另一末端处，是由肽链连接的两个单链抗体片段(scFv)组成的双特异性分子，即所谓的Bs(scFv)2构建体。中等大小的双特异性分子包括由肽基接头连接的两个不同的F(ab)片段。这些和其他格式的双特异性分子可以通过基因工程化、体细胞杂交或化学方法制备。参见例如，Kufer等人,同上文所引用；Cao和Suresh,Bioconjugate Chemistry,9(6),635-644(1998)；和van Spriel等人,Immunology Today,21(8),391-397(2000)，以及其中所引用的参考文献。
本披露还提供了一种溶瘤病毒，其配备有本披露的抗体或其抗原结合部分。溶瘤病毒优先感染和裂解癌细胞而非正常细胞。经溶瘤病毒感染的癌细胞在裂解后释放新的感染性病毒颗粒或病毒粒子来破坏其他癌细胞。溶瘤病毒可为能够复制的。
溶瘤病毒可以配备有肿瘤靶向抗体，比如免疫调节抗体。例如，溶瘤病毒可以经工程化以表达本披露的抗体或其抗原结合部分。
在另一方面，本披露提供了一种药物组合物，其可以包含与药学上可接受的载剂一起配制的本披露的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、溶瘤病毒、核酸分子、表达载体或宿主细胞。该组合物可以任选地含有一种或多种额外的药物活性成分，比如抗骨质疏松剂或抗肿瘤剂。本披露的药物组合物还可以与例如抗骨质疏松剂、抗肿瘤剂或用于调节Siglec-15信号传导的另一种药剂以联合疗法形式施用。抗肿瘤剂可以是抗PD-1/抗PD-L1抗体。
药物组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载剂、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、包衣剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂和其组合。合适赋形剂的选择和使用教示于Gennaro编辑,Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版(Lippincott Williams&Wilkins 2003)，其披露内容通过援引并入本文。
优选地，药物组合物适用于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。如本文所用的短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用以外的施用模式，其通常通过注射进行，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。可替代地，本披露的抗体可以经由非肠胃外途径施用，比如局部、表皮或粘膜施用途径，例如经鼻内、经口、经阴道、经直肠、经舌下或局部施用。
药物组合物可以呈无菌水溶液或分散剂的形式。其也可以配制成微乳剂、脂质体或适合高药物浓度的其他有序结构。
可以与载剂材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将视所治疗的受试者和特定施用模式而变化，并且将通常为产生治疗效果的组合物的量。通常，在100％之外，该量将占活性成分的约0.01％至约99％范围内，优选约0.1％至约70％，最优选占活性成分与药学上可接受的载剂的组合的约1％至约30％。
调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用单一剂量，可以随时间施用几个分次剂量，或者可以如治疗情况的紧急状态所指示按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物是特别有利的，以方便施用和剂量均匀度。如本文所用的剂量单位形式是指物理上离散的单位，其适合作为用于待治疗受试者的单位剂量；每个单位都含有预定量的活性成分，该活性成分经计算可与所需的药物载剂缔合以产生所需的治疗效果。可替代地，抗体可以作为持续释放制剂施用，在这种情况下需要较低频率的施用。
在某些实施例中，可以配制本披露的组合物以确保适当的体内分布。例如，为了确保本披露的治疗性抗体穿过血脑屏障，这些组合物可以配制在脂质体中，脂质体可以另外包含靶向部分以增强向特定细胞或器官的选择性转运。参见例如美国专利号4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685；Umezawa等人,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038；Bloeman等人(1995)FEBSLett.357:140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180；Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233:134；Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269:9090；Keinanen和Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；以及Killion和Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
本披露的组合物具有多种体外和体内效用，涉及例如体外或体内检测Siglect-15和调节Siglect-15信号传导。
例如，本申请的组合物可用于体外或体内检测Siglec-15，包括使抗体或其抗原结合部分与可能含有Siglec-15的待测试样品接触。
本申请的组合物可用于体外或体内调节Siglec-15信号传导，包括使本披露的组合物与表达Siglec-15的细胞接触。在某些实施例中，Siglec-15信号传导经改变，例如减少。
本披露的组合物可用于在有需要的受试者中操控Siglec-15信号传导，包括向受试者施用治疗有效量的本披露的组合物。在某些实施例中，Siglec-15信号传导经改变，例如减少。
本披露的组合物可用于在有需要的受试者中增加免疫应答或逆转免疫抑制，包括向受试者施用治疗有效量的本披露的组合物。在某些实施例中，免疫应答经增加，或免疫抑制经减少或消除。
本披露的组合物可用于在有需要的受试者中调节破骨细胞分化，包括向受试者施用本披露的组合物。在某些实施例中，本披露的组合物可用于减少或消除骨吸收。在某些实施例中，本披露的组合物可促进骨形成。
本披露的组合物可用于在有需要的受试者中治疗或缓解与Siglec-15信号传导相关的疾病，包括向受试者施用治疗有效量的本披露的组合物。在某些实施例中，该疾病是骨质疏松症。可以向受试者进一步施用抗骨质疏松剂。在某些实施例中，该疾病是肿瘤。该肿瘤可以是实体瘤，包括但不限于子宫内膜样癌、甲状腺癌、膀胱癌、肾癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC))、肝癌、卵巢癌、黑色素瘤、结直肠癌和乳腺癌。可以向受试者进一步施用抗肿瘤剂。受试者可对PD-L1疗法具抗性。
本文所讨论的治疗剂的组合可以作为在药学上可接受的载剂中的单一组合物同时施用，或作为单独的组合物与在药学上可接受的载剂中的每种药剂一起同时施用。在另一实施例中，治疗剂的组合可以依序施用。
此外，如果依序施用超过一个剂量的联合疗法，则依序施用的顺序可以在每个施用时间点颠倒或保持相同的顺序；依序施用可以与同时施用组合；或它们的任何组合。
尽管已经详细描述了本发明和其优点，但是应当理解，在不脱离所附权利要求书中所限定的本发明的精神和范围的情况下，可以在本文中进行各种改变、替换和变更。
本发明将在以下实例中进一步说明，这些实例仅出于说明目的提供而不旨在以任何方式限制本发明。
实例
实例1.靶向Siglec-15的抗体的生成和生产
靶向Siglec-15的抗体的生成
1.1免疫接种
根据当前的动物福利法规，用融合有6×His标签(目录号：C9294FC260-1，GenScript)的重组人Siglec-15胞外结构域(ECD)免疫三只BALB/c(AD1344-AD1346)和3只SJL(AD1347-AD1349))小鼠。简而言之，在免疫接种前给予动物7天来适应设施。随后在小鼠背部皮下注射100μg的乳化于CFA中的抗原以用于初级免疫接种和50μg的乳化于IFA中的抗原以用于加强免疫接种。根据抗体滴度，每只动物接受2次初级剂量和2至3次加强剂量。通过收集血清样品并通过ELISA测试样品与人Siglec-15的结合活性来确定抗体滴度。6只小鼠在4轮免疫接种后血清中的抗体滴度水平如图1中所示。
1.2杂交瘤生成和筛选
在最后一次免疫接种后三天，在无菌环境中按照标准杂交瘤生成方案收集来自所选小鼠的脾细胞并与sp2/0细胞融合。将经融合的细胞在含有1×HAT(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷)的DMEM培养基(补充有10％FBS)中培养7天。通过ELISA分析细胞培养物上清液与Siglec-15结合的能力。将阳性克隆通过有限稀释进行亚克隆(每孔1-3个细胞)，并在补充有1×HT(次黄嘌呤-胸苷)和10％FBS的DMEM培养基中培养。将细胞培养1周并进行新一轮的筛选，直到获得阳性单克隆。再次通过ELISA分析阳性单克隆的细胞培养物上清液与Siglec-15结合的能力，使用CHO-hSiglec-15细胞(目录号：C9506EA220_3，GenScript)经由荧光活化细胞分选(FACS)对其进行验证。CHO-hSiglec-15细胞是通过用编码插入主链质粒pLVX(目录号：125839，Addgen)中的cDNA的人Siglec-15进行慢病毒转染来产生。
共进行9轮筛选，最终选出57个独特的克隆。将每个独特的克隆所产生的抗体用蛋白-A磁珠纯化，通过0.5M柠檬酸钠溶液(pH3.5)洗脱，并用0.5MTris-HCl(pH9.0)中和。随后，在PBS中制备抗体，以通过分光光度计(NanoDrop，Thermo Fisher Scientific)测定浓度。
实例2.小鼠抗Siglec-15抗体的表征
2.1与表达人Siglec-15的CHO-K1细胞的结合能力
将如实例1中使用的CHO-hSiglec-15细胞用补充有10％FBS(目录号：16140，LifeTechnologies)和8μg/mg嘌呤霉素(目录号：A1113803，Thermo Fisher)的1×F12K(目录号：21127022，GIBCO)培养，并且将具有10％FBS的200μl 1×DMEM中的2×104个此类细胞接种到圆底96孔板的每个孔中。加入板并且分别与如实例1中获得的纯化抗体、NC318类似物(目录号：NC318IVP0120191225NJJ01，GenScript)和IgG同种型对照一起在50μl 4℃FACS缓冲液中在4℃温育1h。随后加入板并且与用FACS缓冲液以1:200稀释的经荧光团标记的抗Fc二级抗体温育，以测量与细胞表面huSiglec-15结合的抗体。一些抗体的FACS数据显示于图2(A至D)中。
九种抗体，即T2C6A6、T12A7C2、T16G8B9、T2D5A7、T9D6E8、T13C1A12、T13D5E6、T15D11A7和T12F8A11，显示出如与NC318相比的对人Siglec-15更强或相当的结合能力。
2.2与表达食蟹猴Siglec-15的CHO-K1细胞的结合能力
使用CHO-K1-食蟹猴Siglec-15细胞(目录号：C9506EA220_9，GenScript)测试本申请的抗体与细胞表面食蟹猴Siglec-15的结合能力，其中使用如实例1中用于制备CHO-hSiglec-15细胞所描述的相同方法生成CHO-K1-食蟹猴Siglec-15细胞。
将CHO-K1-食蟹猴Siglec-15细胞用补充有10％FBS和8μg/mg嘌呤霉素的1×F12K(目录号：21127022，GIBCO)培养，并且将具有10％FBS的200μl 1×DMEM中的2×104个此类细胞添加到圆底96孔板的每个孔中。加入板并且分别与实例1中获得的纯化抗体、NC318类似物和同种型对照一起在50μl 4℃ FACS缓冲液中在4℃温育1h。随后加入板并且与用FACS缓冲液以1:200稀释的经荧光团标记的抗Fc二级抗体一起温育。一些抗体的FACS数据显示于图3(A至D)中。
十七种单克隆抗体，即T2C6A6、T17C2D10、T2H5F9、T12F8A11、T12E3A4、T16C4F6、T1D12A4、T14E3H2、T13C1A12、T9D6E8、T13D5E6、T145A9E4、T13F4A5、T15D11A7、T12A7C2、T19C11F9和T10H8D11，显示出如与NC318相比对食蟹猴Siglec-15的更强或相当的结合能力。
2.3与表达小鼠Siglec-15的CHO-K1细胞的结合能力
使用CHO-K1-mSiglec-15细胞(目录号：C9506EA220_6，GenScript)测试本申请的抗体与细胞表面小鼠Siglec-15的结合能力，这些CHO-K1-mSiglec-15细胞使用如实例1中用于制备CHO-hSiglec-15细胞所描述的相同方法来生成。
简而言之，将CHO-K1-mSiglec-15细胞用补充有10％FBS和8μg/mg嘌呤霉素的1×F12K培养基培养，并且将具有10％FBS的200μl 1×DMEM中的2×104个此类细胞添加到圆底96孔板的每个孔中。加入板并且分别与实例1中获得的抗体、NC318类似物和同种型对照一起在50μl 4℃ FACS缓冲液中在4℃温育1h。随后加入板并且与用FACS缓冲液以1:200稀释的经荧光团标记的抗Fc二级抗体一起温育。一些抗体的FACS数据显示于图4(A至C)中。
相比于NC318，本申请的大多数抗体具有较低的结合活性，但少数显示出更高的Bmax。NC318最初是在Siglec-15敲除小鼠中生成的，并且缺乏天然Siglec-15蛋白使该小鼠对人和小鼠Siglec-15上的表位敏感并从而产生对这些表位的强烈免疫应答。而本申请的抗体是在天然表达Siglec-15的小鼠中产生的，并且因此主要结合在结构上与人Siglec-15上的表位相似或共有的小鼠Siglec-15表位。
2.4对Siglec-15免疫抑制活性的抑制作用
进一步测试本申请的抗体对Siglec-15免疫抑制活性的抑制作用。
简而言之，从Allcells购得外周血单个核细胞(PBMC)(目录号：PB003F-C)，并且将其在补充有10％热灭活胎牛血清、10mM HEPES缓冲液、2mM l-谷氨酰胺、50μg/ml庆大霉素、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和0.25μg/ml两性霉素的RPMI 1640中培养。用50μl 1μg/ml抗CD3抗体(OKT3，目录号：16-0037-81，eBioscience)涂布96孔板，用RPMI 1640培养基洗涤两次，并且接种1×105个PBMC。将100μl培养基中的PBMC与5μg/ml Siglec-15和50μg/ml的本申请抗体一起温育48小时，并且以210×g离心5分钟。收集细胞培养物上清液并且使用市售套件(kit)(目录号：62IFNPEC，Cisbio；和目录号：62HIL02PEH，Cisbio)按照供应商的手册测量IFN-γ和IL-2水平。数据显示于图5(A和B)中。
如图5(A)中所示，本申请的多于20种抗体，包括T2C6A6、T7G6A1、T12A7C2、T13C1A12、T13D5E6、T15A4A2、T15D11A7、T16G8B9和T152E8A10，显著促进PBMC表达IFN-γ，与NC318相比具有更高或相当的活性。而根据图5(B)，本申请的5种抗体，包括T2C6A6、T13C1A12和T152E8A10，在促进PBMC释放IL-2方面表现出比NC318更高的活性。
挑选了十种抗体并进行测序。这些抗体的CDR区和重链/轻链可变区的氨基酸序列和SEQ ID编号列于下表1中。
表1.靶向Siglec-15的单克隆抗体的氨基酸序列抗体序列
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2.5对Siglec-15免疫抑制活性的抑制作用
使用Jurkat细胞(一种CD4阳性T细胞系(GS-J2B，目录号：RD20170721/RD2GG038，GenScript)，其荧光素酶表达受NFAT启动子调节)，进一步测试本申请的抗体(包括十种经挑选以用于测序的抗体)对Siglec-15免疫抑制活性的抑制作用。
简而言之，使用50μl的0.5μg/ml抗CD3 OKT3抗体(目录号：16-0037-81，eBioscience)在37℃涂布96孔板持续2小时。通过PBS洗涤板，加入1×106/ml GS-J2B细胞并在200μl 1×RPMI 1640中温育24小时，该培养基补充有10％FBS、400μg/ml潮霉素B、5μg/ml Siglec-15(目录号：SG5-H52H3，ACRO)和15μg/ml的本申请抗体。随后收集细胞并送去进行发光测量。抗体对经OKT3刺激的报告基因活性的影响可以表示为发光强度。
结果显示于图6中，8种抗体，即T11D2A8、T7D1C7、T15A5A1、T15C2G4、T2C6A6、T15D11A7、T10H8D11和T13C1A12，抑制Siglec-15的免疫抑制活性并增加GS-J2B细胞系中的NFAT-荧光素酶表达。
2.6对Siglec-15免疫抑制活性的抑制作用
使用来自5个供体的PBMC，进一步测试本申请的抗体对Siglec-15免疫抑制活性的抑制作用。
简而言之，在补充有10％热灭活胎牛血清、10mM HEPES缓冲液、2mM l-谷氨酰胺、50μg/ml庆大霉素、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和0.25μg/ml两性霉素B的RPMI 1640中培养PBMC。用50μl的1μg/ml抗CD3 OKT3抗体(目录号：16-0037-81，eBioscience)涂布96孔板，用RPMI 1640培养基洗涤两次并接种1×105个PBMC。将100μl培养基中的PBMC与5μg/mlSiglec-15(目录号：SG5-H52H3，ACRO)和10μg/ml或50μg/ml(最终浓度)的本申请抗体温育48小时，并且以210×g离心5分钟。收集上清液并且使用市售套件(目录号：62IFNPEC，Cisbio；目录号：62HIL02PEH，Cisbio)按照供应商的手册测量IFN-γ和IL-2水平。数据显示于图7(A至J)中。
这些抗体，包括T2C6A6、T2D5A7、T12A7C2、T13C1A12、T13D5E6和T15D11A7，在某些抗体浓度下以高于NC318的活性促进PBMC释放IFN-γ。
这些抗体，包括T2C6A6、T2D5A7、T12A7C2、T13C1A12、T13D5E6和T15D11A7，在某些抗体浓度下以高于NC318的活性促进PBMC释放IL-2。
2.7基于ELISA的表位鉴定
对本申请的抗体进行基于ELISA的表位鉴定。
简而言之，用100μl的0.5μg/ml Siglec-15蛋白(目录号：SG5-H52H3，ACRO)在4℃涂布96孔板过夜，并且随后分别加入2.5μg/ml的本申请抗体并温育1小时。随后，加入板并在4℃与本申请的不同抗体温育30分钟以用于表位竞争，该不同抗体用生物素标记并以较低浓度(7.5-125ng/ml)存在。用1×PBS洗涤板并送去进行生物素检测。如表2中所示，这些抗体被分类为具有完全不同结合表位的两组。
表2.基于结合表位的抗体分类
实例3.人源化抗Siglec-15抗体的生成和生产
3.1抗Siglec-15抗体的人源化
抗体T2C6A6和T13C1A12是人源化的。人源化重链/轻链可变区的氨基酸序列和SEQID编号列于下表3中，并且编码人源化重链/轻链可变区的核酸序列和SEQ ID编号列于表4中。
表3.人源化抗Siglec-15抗体的氨基酸序列
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表4.编码人源化抗Siglec-15抗体的核酸序列
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3.2人源化抗Siglec-15抗体的生产
将编码人源化重链和轻链可变区的cDNA以人IgG4重链恒定区和人κ轻链恒定区为框架克隆于具有pCDNA3.4 CMV启动子(目录号：A14697，ThermoFisher)的表达质粒中。
人IgG4重链恒定区：
人κ轻链恒定区：
将CHO细胞在含有6mM L-谷氨酰胺和250mg/LG418的Excell无血清培养基中悬浮培养。为了在600ml tubespin烧瓶中生产抗体，在转染前24小时接种6×108个CHO-3E7细胞。对于转染，将8×108个细胞以210×g离心5min，去除上清液，并且向细胞中添加20ml预热的CD CHO培养基。同时，将上述制备的表达质粒分别混合于20ml CD CHO培养基中，终量为400μg DNA，向其进一步添加1080μg PEI溶液(2.7μg/ml)。将DNA/PEI混合物涡旋15秒，并且随后在室温下温育10min。其后，将CHO细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到600ml tubespin瓶中，并且在具有5％CO2的温育箱中在37℃温育3小时。在温育后，将细胞加入360mlExcell培养基，其含有6mM L-谷氨酰胺、5g/L Pepsoy和1.25mM VPA，并且再培养24小时。在7天后，在BIAcore T200和8K仪器上对培养上清液进行表面等离子共振(SPR)分析。简而言之，以约50RU的密度将5μg/ml Siglec-15(目录号：SG5-H52H3，ACRO)胺偶联到S系列传感器芯片上。含有抗Siglec-15人源化mAb的培养上清液以10nM(T2C6A6)或50nM(T13C1A12)来注射。流速设置为30μl/min，并且缔合相和解离相分别持续2min和6min。使用甘氨酸/HCl pH1.5对芯片进行再生。T2C6A6的动力学参数ka、kd和KD显示于表5中，而T13C1A12人源化mAb的这些动力学参数显示于表6中。
表5.Siglec-15与培养上清液的结合动力学
表6.Siglec-15与培养上清液的结合动力学
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结果显示，大多数人源化抗体与其亲本抗体保持相当的结合亲和力。
随后通过以2500×g离心60min收集培养上清液，无菌过滤(用0.22μg过滤器)，加入最终浓度为0.01％w/v的叠氮化钠并且在4℃保存。
将培养上清液中经分泌的人源化抗体通过蛋白A来纯化。人源化抗Siglec-15分子的产量、浓度和纯度列于表7中。
表7.人源化抗Siglec-15抗体的产量、浓度和纯度
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3.3人源化抗Siglec-15抗体的SPR分析
通过表面等离子共振(SPR)在BIAcore T200和8K仪器上测定每个人源化mAb的亲和常数(KD)。
简而言之，以约50RU的密度将5μg/ml Siglec-15(目录号：SG5-H52H3，ACRO)胺偶联到S系列传感器芯片上。本披露的抗Siglec-15人源化mAb以0.9375nM与30nM(T2C6A6)或1.5625nM与50nM(T13C1A12)之间的6种不同浓度来注射。流速设置为30μl/min，并且缔合相和解离相分别持续3min和6min(T2C6A6)，或2min和6min(T13C1A12)。使用甘氨酸/HCl pH1.5对芯片进行再生。不同mAb浓度处的结合曲线用于计算动力学参数ka、kd和KD(关于T2C6A6和T13C1A12人源化mAb亲和力数据，请参见表8)。
表8.人源化抗Siglec-15抗体的结合亲和力
***
已经如此详细描述了本发明的优选实施例，应当理解，由上述段落定义的本发明不限于上述描述中阐述的特定细节，因为在不脱离本发明的精神或范围的情况下，其许多显而易见的变化形式为可能的。
Claims (20)
1.一种特异性结合Siglec-15的经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述单克隆抗体或其抗原结合部分包含
(a)重链可变区，所述重链可变区包含分别含有以下氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3：SEQ ID NO:7、8和9，和
(b)轻链可变区，所述轻链可变区包含分别含有以下氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3：SEQ ID NO:10、11和12。
2.如权利要求1所述的经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:93、94、95或96具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:97、98、99或100具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区和所述轻链可变区包含分别与以下具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:95和97。
5.如权利要求1-4任一项所述的经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链恒定区和/或轻链恒定区。
6.如权利要求5所述的经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链恒定区是IgG4恒定区。
7.如权利要求6所述的经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链恒定区是包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的人IgG4恒定区。
8.如权利要求5所述的经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链恒定区是κ恒定区。
9.如权利要求8所述的经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链恒定区是包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的人κ恒定区。
10.如权利要求1-9任一项所述的经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述单克隆抗体或其抗原结合部分是小鼠、嵌合或人源化抗体或其抗原结合部分。
11.如权利要求1所述的经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述单克隆抗体或其抗原结合部分是全长IgG抗体或Fab片段。
12.如权利要求1所述的经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述单克隆抗体或其抗原结合部分(a)与人Siglec-15结合，(b)与猴Siglec-15结合，(c)与小鼠Siglec-15结合和/或(d)逆转Siglec-15介导的免疫抑制。
13.一种双特异性分子，其包含如权利要求1至12中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
14.一种溶瘤病毒，其表达如权利要求1至12中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
15.一种核酸分子，其编码如权利要求1至12中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
16.一种表达载体，其含有如权利要求15所述的核酸分子。
17.一种宿主细胞，其包含如权利要求16所述的表达载体或将如权利要求15所述的核酸分子整合至其基因组中。
18.一种组合物，其包含如权利要求1至12中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、如权利要求13所述的双特异性分子、如权利要求14所述的溶瘤病毒、如权利要求15所述的核酸分子、如权利要求16所述的表达载体和/或如权利要求17所述的宿主细胞。
19.如权利要求18所述的组合物，其进一步包含抗骨质疏松剂或抗肿瘤剂。
20.如权利要求18或19所述的组合物在治疗或缓解与Siglec-15信号传导相关的疾病中的用途。
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