CN115612671A - 靶向cd30和cd19的工程化免疫细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可以同时靶向CD30和CD19的双靶点工程化免疫细胞，以降低肿瘤细胞的逃逸，降低复发率。具体地，本发明提供一种工程化免疫细胞，其包含靶向CD19和CD30的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含：(1)抗原结合区，包含靶向CD19的抗体和靶向CD30的抗体；(2)跨膜结构域；和(3)初级信号传导结构域。本发明还提供一种工程化免疫细胞，其包含：(1)靶向CD19的第一嵌合抗原受体，包含靶向CD19的抗体、跨膜结构域和初级信号传导结构域；和(2)靶向CD30的第二嵌合抗原受体，包含靶向CD30的抗体、跨膜结构域和初级信号传导结构域。

Description

靶向CD30和CD19的工程化免疫细胞
技术领域
本发明属于免疫治疗领域。更具体地，本发明涉及靶向CD30和CD19的嵌合抗原受体，及其在治疗疾病中的用途。
背景技术
近几年，癌症免疫治疗技术发展迅速，尤其是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)相关的免疫疗法，作为一种新型的过继性免疫治疗技术，已经在多种实体肿瘤和血液肿瘤的治疗中显示出非常显著的临床疗效。
CD30是一种I型跨膜蛋白，一般在活化的B细胞和T细胞中表达。已经观察到CD30在各种非恶性疾病，例如淋巴瘤样丘疹病以及病毒感染的B细胞和T细胞中表达。还观察到CD30在各种恶性肿瘤中表达，例如霍奇金淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、免疫母细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成人T细胞淋巴瘤、白血病、蕈样肉芽肿、生殖细胞恶性肿瘤和甲状腺癌。
CD19是一种由556个氨基酸组成的I型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员。CD19只在正常和恶性B细胞中表达，几乎不在其他组织中表达，并且CD19在B细胞恶性转化过程中不丢失，对于难治性/复发性病例仍有效，使得CD19成为诊断和治疗B细胞恶性肿瘤的有效靶标。
目前，已经有单独靶向CD30或CD19的CAR-T疗法。但是，单靶点治疗在肿瘤细胞下调抗原表达后很容易产生复发。因此，本发明旨在提供一种可以同时靶向CD30和CD19的双靶点工程化免疫细胞，以降低肿瘤细胞的逃逸，降低复发率。
发明内容
在一个方面，本发明提供一种工程化免疫细胞，其包含靶向CD19和CD30的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含：
(1)抗原结合区，包含靶向CD19的抗体和靶向CD30的抗体；
(2)跨膜结构域；和
(3)初级信号传导结构域。
在一个实施方案中，所述靶向CD19的抗体和靶向CD30的抗体通过接头连接。
在一个实施方案中，所述接头包含(G4S)n，其中n为1、2、3、4、5或6，或者所述接头包含氨基酸序列(EAAAK)n或由其组成，其中n为1、2、3、4、5或6。
本发明还提供一种工程化免疫细胞，其包含：
(1)靶向CD19的第一嵌合抗原受体，包含靶向CD19的抗体、跨膜结构域和初级信号传导结构域；和
(2)靶向CD30的第二嵌合抗原受体，包含靶向CD30的抗体、跨膜结构域和初级信号传导结构域。
在一个实施方案中，所述第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体位于相同或不同的载体。
本发明还提供一种组合物，其包含：
(1)表达第一嵌合抗原受体的第一工程化免疫细胞群，所述第一嵌合抗原受体包含靶向CD19的抗体、跨膜结构域和初级信号传导结构域；和
(2)表达第二嵌合抗原受体的第二工程化免疫细胞群，所述第二嵌合抗原受体包含靶向CD30的抗体、跨膜结构域和初级信号传导结构域。
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含的跨膜结构域选自以下蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含的初级信号传导结构域选自以下蛋白的胞内区：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体还包含一个或多个共刺激结构域，其选自以下蛋白质的胞内区：CD94、LTB、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD8、CD18、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD270(HVEM)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)、DAP10、DAP12、LAT、NKG2C、SLP76、PD-1、LIGHT、TRIM、ZAP70以及它们的组合。
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含的抗体选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fd′、Fv、scFv、sdFv、单域抗体和纳米抗体；优选选自scFv、单域抗体和纳米抗体。
在一个实施方案中，本发明的靶向CD30的抗体包含：(1)如SEQ ID NO：1所示的CDR1、如SEQ ID NO：2所示的CDR2和如SEQ ID NO：3或4所示的CDR3；(2)如SEQ ID NO：5所示的CDR1、如SEQ ID NO：6所示的CDR2和如SEQ ID NO：7所示的CDR3；(3)如SEQ ID NO：8所示的CDR1、如SEQ ID NO：9所示的CDR2和如SEQ ID NO：10所示的CDR3；(4)如SEQ ID NO：11所示的CDR1、如SEQ ID NO：12所示的CDR2和如SEQ ID NO：13所示的CDR3；(5)如SEQ ID NO：14所示的CDR1、如SEQ ID NO：12所示的CDR2和如SEQ ID NO：15所示的CDR3；(6)如SEQ ID NO：16所示的CDR1、如SEQ ID NO：17所示的CDR2和如SEQ ID NO：18所示的CDR3；(7)如SEQ IDNO：19所示的CDR1、如SEQ ID NO：20所示的CDR2和如SEQ ID NO：21所示的CDR3；(8)如SEQID NO：22所示的CDR1、如SEQ ID NO：12所示的CDR2和如SEQ ID NO：23所示的CDR3；或(9)如SEQ ID NO：24所示的CDR1、如SEQ ID NO：12所示的CDR2和如SEQ ID NO：25所示的CDR3。
在一个实施方案中，本发明的靶向CD30的抗体与选自SEQ ID NO：26-72的氨基酸序列具有至少90％同一性。更优选地，本发明的靶向CD30的抗体选自SEQ ID NO：26-72。
在一个实施方案中，本发明的靶向CD19的抗体包含：(1)如SEQ ID NO：73所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：78所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：83所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：88所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：92所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：96所示的H-CDR3；(2)如SEQ IDNO：74所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：79所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：84所示的L-CDR3、如SEQID NO：89所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：93所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：97所示的H-CDR3；(3)如SEQ ID NO：75所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：80所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：85所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：90所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：94所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：98所示的H-CDR3；(4)如SEQ ID NO：76所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：81所示的L-CDR2、如SEQID NO：86所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：88所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：92所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：99所示的H-CDR3；(5)如SEQ ID NO：77所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：82所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：87所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：91所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：95所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：100所示的H-CDR3；(6)如SEQ ID NO：101所示的L-CDR1、如SEQID NO：102所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：103所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：89所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：95所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：104所示的H-CDR3；(7)如SEQ ID NO：105所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：112所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：119或120所示的L-CDR3、如SEQID NO：127所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：134所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：141所示的H-CDR3；(8)如SEQ ID NO：106所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：113所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：121所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：128所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：135所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：142所示的H-CDR3；(9)如SEQ ID NO：107所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：114所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：122所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：129所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：136所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：143所示的H-CDR3；(10)如SEQ ID NO：108所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：115所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：123所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：130所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：137所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：144所示的H-CDR3；(11)如SEQ IDNO：109所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：116所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：124所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：131所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：138所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：145所示的H-CDR3；(12)如SEQ ID NO：110所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：117所示的L-CDR2、如SEQ IDNO：125所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：132所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：139所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：146所示的H-CDR3；(13)如SEQ ID NO：111所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：118所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：126所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：133所示的H-CDR1、如SEQ IDNO：140所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：147所示的H-CDR3；(14)如SEQ ID NO：148所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：150所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：152所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：154所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：156所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：158所示的H-CDR3；或(15)如SEQ ID NO：149所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：151所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：153所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：155所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：157所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：159所示的H-CDR3。
在一个实施方案中，本发明的靶向CD19的抗体包含与选自SEQ ID NO：160-166、174-181、190-191和194-195的氨基酸序列具有至少90％同一性的轻链可变区，和与选自SEQ ID NO：167-173、182-189、192-193和196-197的氨基酸序列具有至少90％同一性的重链可变区。更优选地，本发明的靶向CD19的抗体包含选自SEQ ID NO：160-166、174-181、190-191和194-195的轻链可变区，和选自SEQ ID NO：167-173、182-189、192-193和196-197的重链可变区。在一个实施方案中，本发明的靶向CD30的抗体与选自SEQ ID NO：26-72的氨基酸序列具有至少90％同一性。更优选地，本发明的靶向CD30的抗体选自SEQ ID NO：26-72。
在一个实施方案中，本发明的工程化免疫细胞是B细胞、T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞或NKT细胞。
在一个实施方案中，本发明的工程化免疫细胞衍生自干细胞。
还在另一个方面，本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的工程化免疫细胞或组合物，和一种或多种药学上可接受的赋型剂。
发明详述
除非另有说明，否则本文中所使用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解的相同。
嵌合抗原受体
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指人工构建的杂合多肽，该杂合多肽一般包括抗原结合区(例如抗体或其抗原结合部分)、跨膜结构域、任选的共刺激结构域和初级信号传导结构域，各个结构域之间通过接头连接。CAR能够利用抗体的抗原结合特性以非MHC限制性的方式将T细胞和其它免疫细胞的特异性和反应性重定向至所选择的靶标。非MHC限制性的抗原识别给予表达CAR的免疫细胞与抗原处理无关的识别抗原的能力，因此绕过了肿瘤逃逸的主要机制。
在一个实施方案中，本发明提供表达以串联或并联方式连接的靶向CD30和CD19双靶点的嵌合抗原受体的工程化免疫细胞。在本文中，“串联”是指靶向CD30抗体和靶向CD19抗体位于同一个嵌合抗原受体结构中，构成其中的抗原结合区。换言之，在“串联”的情况下，工程化免疫细胞表达一个同时靶向CD19和CD30的嵌合抗原受体，其包含：(1)抗原结合区，包含靶向CD19的抗体和靶向CD30的抗体；(2)跨膜结构域；和(3)初级信号传导结构域。在本文中，“并联”是指靶向CD30的抗体和靶向CD19的抗体位于两个不同的嵌合抗原受体结构，其可以位于同一载体(例如，通过2A肽将两个嵌合抗原受体结构连接，使其分别表达)，或位于不同载体(例如，每个载体包含一个靶向CD30或CD19的嵌合抗原受体结构，然后将两个载体一起导入免疫细胞)。换言之，在“并联”的情况下，工程化免疫细胞表达两个嵌合抗原受体，其分别靶向CD19和CD30。即，该工程化免疫细胞包含：(1)靶向CD19的第一嵌合抗原受体，包含靶向CD19的抗体、跨膜结构域和初级信号传导结构域；和(2)靶向CD30的第二嵌合抗原受体，包含靶向CD30的抗体、跨膜结构域和初级信号传导结构域。任选地，所述第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体位于同一载体或不同载体。
如本文所用，术语“抗体”具有本领域技术人员所理解的最广泛的含义，并且包括单克隆抗体(包含完整抗体)、多克隆抗体、多价抗体、和能够表现期望的生物活性的携带一个或多个CDR序列的抗体片段或合成多肽。本发明所述抗体可为任何种类(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA等)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG2a、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等)。本发明的抗体也包含重组抗体、人抗体、人源化抗体、驼源抗体、鼠源抗体、嵌合抗体及其抗原结合部分。
如本文所用，“抗体片段”或“抗原结合部分”是指完整抗体的一部分，一般包含完整抗体的抗原结合位点并因此保留结合抗原的能力。本发明中的抗体片段的实例包括但不限于：Fab、Fab'、F(ab')2、Fd片段、Fd′、Fv片段、scFv、二硫键-连接的Fv(sdFv)、抗体的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)、线性抗体、具有两个抗原结合位点的“双体”、单域抗体、纳米抗体、所述抗原的天然配体或其功能性片段等。因此，本发明的“抗体”涵盖如上定义的抗体的抗体片段或抗原结合部分。
通常，完整抗体包括通过二硫键连接在一起的两条重链和两条轻链，每条轻链通过二硫键被连至各自的重链，呈“Y”形结构。每条重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区，其中重链可变区包含三个互补决定区(CDR)：H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，重链恒定区包含三个恒定结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区，其中轻链可变区包含三个CDR：L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，轻链恒定区包含一个恒定结构域CL。在重链/轻链可变区中，CDR被更保守的框架区(FR)隔开。重链/轻链的可变区负责与抗原的识别和结合，恒定区则可以介导抗体与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分。
可以使用许多本领域熟知的编号方案容易地确定给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界，这些方案包括：Kabat等人(1991),“Sequences ofProteins of ImmunologicalInterest,”第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,贝塞斯达,马里兰州(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigeninteractions:Contact analysis and binding sitetopography,”J.Mol.Biol.262,732-745”(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGTunique numbering forimmunoglobulin and T cell receptor variable domains andIg superfamily V-likedomains,”Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A和Plückthun A,“Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool,”JMol Biol,2001年6月8日；309(3):657-70(“Aho”编号方案)；和Martin等人,“Modelingantibody hypervariable loops:a combinedalgorithm,”PNAS,1989,86(23):9268-9272(“AbM”编号方案)。
给定CDR或FR的边界可能取决于用于鉴定的方案而不同。例如，Kabat方案是基于结构比对，而Chothia方案是基于结构信息。Kabat和Chothia方案的编号都是基于最常见的抗体区域序列长度，其中通过插入字母提供插入(例如“30a”)并且在一些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“插入缺失(indel)”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。Contact方案是基于对复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。AbM方案是介于Kabat与Chothia定义之间的折衷，其基于Oxford Molecular的AbM抗体建模软件所使用的方案。
因此，除非另有规定，否则应当理解，给定抗体或其区域(如其可变区)的“CDR”涵盖由任何上述方案或其他已知方案所定义的CDR。例如，在指定特定的CDR(例如CDR3)含有给定氨基酸序列的情况下，应理解，这样的CDR还可以具有由任何上述方案或其他已知方案所定义的相应CDR(例如CDR3)的序列。同样，除非另有规定，否则应当理解给定抗体或其区域(如其可变区)的FR涵盖由任何上述方案或其他已知方案所定义的FR。
因此，在一个实施方案中，本发明的抗体选自完整抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fd′、Fv、scFv、sdFv、单域抗体和纳米抗体，优选选自Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、单域抗体和纳米抗体，更优选选自scFv、单域抗体和纳米抗体。
“单链抗体”或“scFv”是由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过接头连接而成的抗体。可以选择接头的最佳长度和/或氨基酸组成。接头的长度会明显影响scFv的可变区折叠和相互作用情况。事实上，如果使用较短的接头(例如在5-10个氨基酸之间)，则可以防止链内折叠。关于接头的大小和组成的选择，参见例如，Hollinger等人,1993ProcNatl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448；美国专利申请公布号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794；以及PCT公布号WO2006/020258和WO2007/024715，其全文通过引用并入本文。
“单域抗体”或“sdAb”是指一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，也称为“重链抗体”。而单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位，也称为纳米抗体(Nanobody，Nb)。
在一个实施方案中，本发明的靶向CD19的抗体可以源自本领域已知的任何抗体，例如HB12a、HB12b、HD37、B43、FMC63、4G7(CN105535967A)；HI19a(CN1775808A)；21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1、46E8(CN101233156A)；Mab381、Mab396(WO2011147834)，以及源自这些抗体的嵌合抗体、人源化抗体等；其中上述文献的全部内容通过引用并入本文。在一个实施方案中，本发明的靶向CD19的抗体包含：(1)如SEQ ID NO：73所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：78所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：83所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：88所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：92所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：96所示的H-CDR3；(2)如SEQ ID NO：74所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：79所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：84所示的L-CDR3、如SEQ IDNO：89所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：93所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：97所示的H-CDR3；(3)如SEQ ID NO：75所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：80所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：85所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：90所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：94所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：98所示的H-CDR3；(4)如SEQ ID NO：76所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：81所示的L-CDR2、如SEQ IDNO：86所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：88所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：92所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：99所示的H-CDR3；(5)如SEQ ID NO：77所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：82所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：87所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：91所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：95所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：100所示的H-CDR3；(6)如SEQ ID NO：101所示的L-CDR1、如SEQ IDNO：102所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：103所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：89所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：95所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：104所示的H-CDR3；(7)如SEQ ID NO：105所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：112所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：119或120所示的L-CDR3、如SEQID NO：127所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：134所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：141所示的H-CDR3；(8)如SEQ ID NO：106所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：113所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：121所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：128所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：135所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：142所示的H-CDR3；(9)如SEQ ID NO：107所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：114所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：122所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：129所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：136所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：143所示的H-CDR3；(10)如SEQ ID NO：108所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：115所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：123所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：130所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：137所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：144所示的H-CDR3；(11)如SEQ IDNO：109所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：116所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：124所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：131所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：138所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：145所示的H-CDR3；(12)如SEQ ID NO：110所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：117所示的L-CDR2、如SEQ IDNO：125所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：132所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：139所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：146所示的H-CDR3；(13)如SEQ ID NO：111所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：118所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：126所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：133所示的H-CDR1、如SEQ IDNO：140所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：147所示的H-CDR3；(14)如SEQ ID NO：148所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：150所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：152所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：154所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：156所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：158所示的H-CDR3；或(15)如SEQ ID NO：149所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：151所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：153所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：155所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：157所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：159所示的H-CDR3。在一个实施方案中，本发明的靶向CD19的抗体包含与选自SEQ ID NO：160-166、174-181、190-191和194-195的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与选自SEQ ID NO：167-173、182-189、192-193和196-197的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区。更优选地，本发明的靶向CD19的抗体包含选自SEQ ID NO：160-166、174-181、190-191和194-195的轻链可变区，和选自SEQ IDNO：167-173、182-189、192-193和196-197的重链可变区。
在一个实施方案中，本发明的靶向CD30的抗体可以源自本领域已知的任何抗体，例如HRS-1、HRS-3和HRS-4(Pfreundschuh et al.,1988,Anticancer Res.8:217-244；Pohlet al.,1993,Int.J.Cancer 54:418-25)；5F11、2H9和17G1(美国专利7,387,776)；AC10(美国专利申请公开号2005/0123536)；XmAb2513(美国专利申请公开号2012/0014943)；HeFi-1(Hecht et al.,J.Immunol.(1985)4231-4236)；M44和M67(Smith et al.,Cell 73(1993)1349-1360)；C10(Bowen et al.,J.Immunol.151(1993)5896-5906)、cAC10(布妥昔单抗)；Ber-H2(Schwarting et al.,Blood 74(1988)1678-1689)；Ki-1、Ki-2、Ki-3、Ki-4、Ki-5、Ki-6和Ki-7(Schwaab et al.,1982,299:65-67；Horn-Lohrens et al.,1995,Int.J.cancer 60:539-544；U.S.Pat.No.6,033,876)；IRac(Hsu et al.,1987,J.Natl.Cancer inst.79:1091-1097；Engert et al.,1990,Cancer Res.50:2929-2935)；以及T6、T13、T14、T24和T25(Nagata,2002,Clin.Cancer Res.8:2345-2355)，其中上述文献的全部内容通过引用并入本文。
在一个优选的实施方案中，本发明的靶向CD30的抗体是纳米抗体或单域抗体。优选地，本发明的靶向CD30的抗体包含：(1)如SEQ ID NO：1所示的CDR1、如SEQ ID NO：2所示的CDR2和如SEQ ID NO：3或4所示的CDR3；(2)如SEQ ID NO：5所示的CDR1、如SEQ ID NO：6所示的CDR2和如SEQ ID NO：7所示的CDR3；(3)如SEQ ID NO：8所示的CDR1、如SEQ ID NO：9所示的CDR2和如SEQ ID NO：10所示的CDR3；(4)如SEQ ID NO：11所示的CDR1、如SEQ ID NO：12所示的CDR2和如SEQ ID NO：13所示的CDR3；(5)如SEQ ID NO：14所示的CDR1、如SEQ ID NO：12所示的CDR2和如SEQ ID NO：15所示的CDR3；(6)如SEQ ID NO：16所示的CDR1、如SEQ IDNO：17所示的CDR2和如SEQ ID NO：18所示的CDR3；(7)如SEQ ID NO：19所示的CDR1、如SEQID NO：20所示的CDR2和如SEQ ID NO：21所示的CDR3；(8)如SEQ ID NO：22所示的CDR1、如SEQ ID NO：12所示的CDR2和如SEQ ID NO：23所示的CDR3；或(9)如SEQ ID NO：24所示的CDR1、如SEQ ID NO：12所示的CDR2和如SEQ ID NO：25所示的CDR3。
在一个实施方案中，本发明的靶向CD30的抗体与选自SEQ ID NO：26-72的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。优选地，本发明的靶向CD30的抗体与SEQ ID NO：26-72相比，具有不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸的保守性修饰。更优选地，本发明的靶向CD30的抗体选自SEQ ID NO：26-72。
术语“功能性变体”或“功能性片段”是指基本上包含亲本的氨基酸序列但与该亲本氨基酸序列相比含有至少一个氨基酸修饰(即取代、缺失或插入)的变体，条件是所述变体保留亲本氨基酸序列的生物活性。在一个实施方案中，所述氨基酸修饰优选是保守型修饰。
如本文所用，术语“保守性修饰”是指不会明显影响或改变含有该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这些保守修饰包括氨基酸取代、添加及缺失。修饰可以通过本领域中已知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变而引入本发明的嵌合抗原受体中。保守氨基酸取代是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中有定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保守性修饰可以例如基于极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或所涉及残基的两亲性质的相似性来进行选择。
因此，“功能性变体”或“功能性片段”与亲本氨基酸序列具有至少75％，优选至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且保留亲本氨基酸的生物活性，例如结合活性。
如本文所用，术语“序列同一性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同一性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同一性。本领域技术人员将认识到，一些算法可以用于使用标准参数来确定序列同一性，例如Blast(Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)、Blast2(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)、Smith-Waterman(Smith等(1981)J.Mol.Biol.147：195-197)和ClustalW。
如本文所用，术语“跨膜结构域”是指能够使嵌合抗原受体在免疫细胞(例如淋巴细胞、NK细胞或NKT细胞)表面上表达，并且引导免疫细胞针对靶细胞的细胞应答的多肽结构。跨膜结构域可以是天然或合成的，也可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。当嵌合抗原受体与靶抗原结合时，跨膜结构域能够进行信号传导。特别适用于本发明中的跨膜结构域可以源自例如TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154及其功能性片段。或者，跨膜结构域可以是合成的并且可以主要地包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。优选地，所述跨膜结构域源自CD8α链或CD28，其与SEQ ID NO:202或204所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:203或205所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体还可以包含位于抗原结合区和跨膜结构域之间的铰链区。如本文所用，术语“铰链区”一般是指作用为连接跨膜结构域至抗原结合区的任何寡肽或多肽。具体地，铰链区用来为抗原结合区提供更大的灵活性和可及性。铰链区可以包含最多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸并且最优选25至50个氨基酸。铰链区可以全部或部分源自天然分子，如全部或部分源自CD8、CD4或CD28的胞外区，或全部或部分源自抗体恒定区。或者，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或可以是完全合成的铰链序列。在优选的实施方式中，所述铰链区包含CD8α链、CD28、FcγRIIIα受体、IgG4或IgG1的铰链区部分，更优选来自CD8α、CD28或IgG4的铰链，其与SEQ ID NO:218、220或222所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或者其编码序列与SEQ ID NO:219、221或223所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
如本文所用，术语“初级信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞进行指定功能的蛋白质部分。初级信号传导结构域负责在抗原结合区结合抗原以后的细胞内初级信号传递，从而导致免疫细胞和免疫反应的活化。换言之，初级信号传导结构域负责活化其中表达CAR的免疫细胞的正常的效应子功能的至少一种。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含的初级信号传导结构域可以是T细胞受体和共受体的细胞质序列，其在抗原受体结合以后一同起作用以引发初级信号传导，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同或相似功能的任何合成序列。初级信号传导结构域可以包含许多免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor Tyrosine-basedActivation Motifs,ITAM)。本发明的初级信号传导结构域的非限制性施例包括但不限于FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的胞内区。在优选的实施方式中，本发明CAR的信号传导结构域可以包含CD3ζ胞内区，其与SEQ ID NO:210或212所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:211或213所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体还包含一个或多个共刺激结构域。共刺激结构域可以是来自共刺激分子的细胞内功能性信号传导结构域，其包含所述共刺激分子的整个细胞内部分，或其功能片段。“共刺激分子”是指在T细胞上与共刺激配体特异性结合，由此介导T细胞的共刺激反应(例如增殖)的同源结合配偶体。共刺激分子包括但不限于1类MHC分子、BTLA和Toll配体受体。本发明的共刺激结构域的非限制性施例包括但不限于以下蛋白质的胞内区：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD8、CD18、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD270(HVEM)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)、DAP10、DAP12、LAT、NKG2C、SLP76、PD-1、LIGHT、TRIM、CD94、LTB以及ZAP70以及它们的组合。
在一个优选的实施方案中，所述共刺激结构域包含一个或多个选自以下蛋白质的胞内区：DAP10、DAP12、CD27、CD28、CD134、4-1BB或CD278。例如，在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含4-1BB的胞内区。在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含CD28的胞内区。在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含4-1BB的胞内区和CD28的胞内区。
在一个实施方案中，4-1BB的胞内区与SEQ ID NO:208所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:209所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。在一个实施方案中，CD28的胞内区与SEQ ID NO:206所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:207所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
在一个实施方案中，本发明的CAR还可以包含信号肽，使得当其在细胞例如T细胞中表达时，新生蛋白质被引导至内质网并随后引导至细胞表面。信号肽的核心可以含有长的疏水性氨基酸区段，其具有形成单个α-螺旋的倾向。在信号肽的末端，通常有被信号肽酶识别和切割的氨基酸区段。信号肽酶可以在移位期间或完成后切割，以产生游离信号肽和成熟蛋白。然后，游离信号肽被特定蛋白酶消化。可用于本发明的信号肽是本领域技术人员熟知的，例如衍生自CD8α、IgG1、GM-CSFRα、B2M等的信号肽。在一个实施方案中，可用于本发明的信号肽来自B2M或CD8α，其与SEQ ID NO:214或216所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:215或217所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，本发明的CAR还包含接头，其用于隔开任何本文中所述的结构域/区。例如，接头可位于信号肽与抗原结合区之间、scFv抗体的VH与VL之间、抗原结合区与铰链区之间、铰链区与跨膜结构域之间、侧接共刺激结构域或在共刺激结构域的N-或C-区上、和/或在跨膜结构域与初级信号传导结构域之间。接头可以是长度为约6至约40个氨基酸、或长度为约6至约25个氨基酸的肽。
可容易地选择具有任何合适长度的接头，例如1个氨基酸(例如Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。
示例性的接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(G4S)n和(GGGS)n，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性接头。示例性的接头包括但不限于GGSG、GGSGG、GSGSG、GSGGG、GGGSG、GSSSG、(G4S)3等。
在另一些实施方案中，接头包含(EAAAK)n，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一个实施方案中，本发明的CAR还可以包含开关结构，以调控CAR的表达时间。例如，开关结构可以是二聚化结构域的形式，通过与其相应配体的结合引起构象变化，暴露胞外的抗原结合区，使其与被靶向抗原结合，从而激活信号传导通路。或者，也可以使用开关结构分别连接抗原结合区和信号传导结构域，仅当开关结构互相结合(例如在诱导化合物的存在下)时，抗原结合区和信号传导结构域才能通过二聚体连接在一起，从而激活信号通路。开关结构还可以是掩蔽肽的形式。掩蔽肽可以遮蔽胞外的抗原结合区，阻止其与被靶向抗原的结合，当通过例如蛋白酶切割掩蔽肽后，就可以暴露胞外的抗原结合区，使其成为一个“普通”的CAR结构。本领域技术人员知晓的各种开关结构均可用于本发明。
在一个实施方案中，本发明的CAR还可以包含自杀基因，即，使其表达一个可通过外源物质诱导的细胞死亡信号，以在需要时(例如产生严重的毒副作用时)清除CAR细胞。例如，自杀基因可以是插入的表位的形式，例如CD20表位、RQR8等，当需要时，可以通过加入靶向这些表位的抗体或试剂来消除CAR细胞。自杀基因也可以是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)，该基因可使细胞在接受更昔洛韦治疗诱导下死亡。自杀基因还可以是iCaspase-9，可以通过化学诱导药物如AP1903、AP20187等诱导iCaspase-9发生二聚化，从而激活下游的Caspase3分子，导致细胞凋亡。本领域技术人员知晓的各种自杀基因均可用于本发明。
载体和载体系统
本发明还提供一种载体，其包含编码靶向CD19和CD30的嵌合抗原受体的核酸序列，其中所述嵌合抗原受体的抗原结合区包含靶向CD19的抗体和靶向CD30的抗体。
本发明还提供一种载体系统，其包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含编码靶向CD19的嵌合抗原受体的第一核酸序列和编码靶向CD30的嵌合抗原受体的第二核酸序列，所述第一核酸序列和第二核酸序列位于同一载体或不同载体。
一个实施方案中，编码靶向CD19的第一嵌合抗原受体多肽的第一核酸序列和编码靶向CD30的第二嵌合抗原受体的第二核酸序列位于同一载体。例如，可以通过在两个核酸序列之间插入编码2A肽的核酸，使得两个嵌合抗原受体结构可以独立表达而互不影响。如本文所用，术语“2A肽”是一种cis-水解酶作用元件(CHYSEls)，最初在口蹄疫病毒(FMDV)中发现。2A肽的平均长度为18～22氨基酸。在蛋白翻译时，2A肽可以通过核糖体跳跃从自身最后2个氨基酸C末端断裂。具体地，甘氨酸和脯氨酸之间的肽链结合群在2A位点是受损的，能引发核糖体跳跃而从第2个密码子开始翻译，从而使1个转录单元里的2个蛋白独立表达。这种2A肽介导的剪切广泛存在于真核动物细胞中。利用2A肽较高的剪切效率及促使上下游基因平衡表达的能力，可以改进异源多聚蛋白(如细胞表面受体、细胞因子、免疫球蛋白等)的表达效率。常规2A肽包含：P2A、T2A、E2A、F2A等。在另一个实施方案中，编码靶向CD19的第一嵌合抗原受体多肽的第一核酸序列和编码靶向CD30的第二嵌合抗原受体的第二核酸序列位于不同载体。
如本文所用，术语“载体”是用作将(外源)遗传材料转移到宿主细胞中的媒介核酸分子，在该宿主细胞中所述核酸分子可以例如复制和/或表达。
载体一般包括靶向载体和表达载体。“靶向载体”是通过例如同源重组或使用特异性靶向位点处序列的杂合重组酶将分离的核酸递送至细胞内部的介质。“表达载体”是用于异源核酸序列(例如编码本发明的Fc融合多肽或嵌合受体多肽的那些序列)在合适的宿主细胞中的转录以及它们的mRNA的翻译的载体。可用于本发明的合适载体是本领域已知的，并且许多可商购获得。在一个实施方案中，本发明的载体包括但不限于线性核酸分子(例如DNA或RNA)、质粒、病毒(例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、牛痘病毒、劳氏肉瘤病毒(RSV、多瘤病毒和腺相关病毒(AAV)等)、噬菌体、噬菌粒、粘粒和人工染色体(包括BAC和YAC)。载体本身通常是核苷酸序列，通常是包含插入物(转基因)的DNA序列和作为载体“骨架”的较大序列。工程化载体通常还包含在宿主细胞中自主复制的起点(如果需要多核苷酸的稳定表达)、选择标记和限制酶切割位点(如多克隆位点，MCS)。载体可另外包含启动子、多聚腺苷酸尾(polyA)、3’UTR、增强子、终止子、绝缘子、操纵子、选择标记、报告基因、靶向序列和/或蛋白质纯化标签等元件。在一个具体的实施方案中，所述载体是体外转录的载体。
工程化免疫细胞
本发明还提供一种工程化免疫细胞，其包含如上所述的载体或载体系统，或如上所述的嵌合抗原受体。
本发明还提供一种组合物，其包含：(1)表达第一嵌合抗原受体的第一工程化免疫细胞群，所述第一嵌合抗原受体包含靶向CD19的抗体、跨膜结构域和初级信号传导结构域；和(2)表达第二嵌合抗原受体的第二工程化免疫细胞群，所述第二嵌合抗原受体包含靶向CD30的抗体、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在该实施方案中，第一工程化免疫细胞群和第二工程化免疫细胞群可以同时或顺次向受试者施用。
如本文所用，术语“免疫细胞”是指免疫系统的具有一种或多种效应子功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、分泌细胞因子、诱导ADCC和/或CDC)的任何细胞。例如，免疫细胞可以是B细胞、T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞和/或NKT细胞，或者是衍生自干细胞，例如成体干细胞、胚胎干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞等的免疫细胞。优选地，免疫细胞是T细胞。T细胞可以是任何T细胞，如体外培养的T细胞，例如原代T细胞，或者来自体外培养的T细胞系例如Jurkat、SupT1等的T细胞，或获得自受试者的T细胞。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织及肿瘤。T细胞也可以被浓缩或纯化。T细胞可以处于任何发育阶段，包括但不限于，CD4+/CD8+T细胞、CD4+辅助T细胞(例如Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、γδ-T细胞、αβ-T细胞等。在一个优选的实施方案中，免疫细胞是人T细胞。可以使用本领域技术人员已知的多种技术，如Ficoll分离受试者的血液获得T细胞。采用本领域已知的常规方法(如通过转导、转染、转化等)可以将编码嵌合抗原受体多肽的核酸序列引入免疫细胞。
将核酸或载体引入免疫细胞后，本领域技术人员可以通过常规技术对所得免疫细胞进行扩增和活化。
药物组合物
本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明所述的工程化免疫细胞作为活性剂，和一种或多种药学上可接受的赋型剂。
如本文所用，术语“药学上可接受的赋型剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容(即，能够引发所需的治疗效果而不会引起任何不希望的局部或全身作用)的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)。药学上可接受的赋型剂的实例包括但不限于填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、抗粘附剂、助流剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、稀释剂、润湿剂、防腐剂、乳化剂、包覆剂、等渗剂、吸收延迟剂、稳定剂和张力调节剂。本领域技术人员已知选择合适的赋型剂以制备本发明期望的药物组合物。用于本发明的药物组合物中的示例性赋型剂包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。通常，合适的赋形剂的选择尤其取决于所使用的活性剂、待治疗的疾病和药物组合物的期望剂型。
根据本发明的药物组合物可适用于多种途径施用。通常，通过胃肠外完成施用。胃肠外递送方法包括局部、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、子宫内、阴道内、舌下或鼻内施用。
根据本发明的药物组合物也可以制备成各种形式，如固态、液态、气态或冻干形式，特别可以是软膏、乳膏、透皮贴剂、凝胶、粉末、片剂、溶液、气雾剂、颗粒、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊、糖浆、酏剂、浸膏剂、酊剂或流浸膏提取物的形式，或者是特别适用于所需施用方法的形式。本发明已知的用于生产药物的过程可包括例如常规混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或冻干过程。包含例如本文所述的免疫细胞的药物组合物通常以溶液形式提供，并且优选包含药学上可接受的缓冲剂。
根据本发明的药物组合物还可以与一种或多种适用于治疗和/或预防待治疗疾病的其它药剂组合施用。适用于组合的药剂的优选实例包括已知的抗癌药物，比如顺铂、美登素衍生物、雷查霉素(rachelmycin)、卡里奇霉素(calicheamicin)、多西紫杉醇、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、sorfimer卟啉钠II(sorfimersodiumphotofrin II)、替莫唑胺、拓扑替康、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreateglucuronate)、奥利斯他汀E(auristatin E)、长春新碱和阿霉素；肽细胞毒素，比如蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；放射性核素，比如碘131、铼186、铟111、铱90、铋210和213、锕225和砹213；前药，比如抗体定向的酶前药；免疫刺激剂，比如血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等；抗体或其片段，比如抗CD3抗体或其片段，补体活化剂，异种蛋白结构域，同种蛋白结构域，病毒/细菌蛋白结构域和病毒/细菌肽。此外，本发明的药物组合物也可以与其他一种或多种治疗方法，例如化疗、放疗组合使用。
治疗应用
本发明还提供一种治疗患有与CD30和/或CD19表达相关的疾病的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据本发明所述的免疫细胞或药物组合物。因此，本发明还涵盖所述工程化免疫细胞以及药物组合物在制备治疗与CD30和/或CD19表达相关的疾病的药物中的用途。
在一个实施方案中，所述免疫细胞是自体或同种异体的细胞，优选B细胞、T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞和/或NKT细胞，更优选T细胞、NK细胞或NKT细胞。
在一个实施方案中，与CD19表达相关的疾病是选自以下的B细胞淋巴瘤：急性淋巴母细胞白血病(ALL)、AIDS相关淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、经典霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、HHV8相关多中心Castleman病引起的大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)和瓦氏巨球蛋白血症或其组合。在一个优选的实施方案中，B细胞淋巴瘤是急性淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)和非霍奇金淋巴瘤。
在一个实施方案中，与CD30表达相关的疾病包括但不限于霍奇金淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、成人T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴结病(AILD)样T细胞淋巴瘤、HIV相关体腔淋巴瘤、胚胎癌、鼻咽部未分化癌(如Schmincke瘤)、Castleman病、Kaposi肉瘤和其他T细胞或B细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，与CD30表达相关的疾病是自身免疫性疾病，例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、系统性硬化、特应性皮炎、格雷夫斯病(Grave’s disease)、韦格纳氏肉芽肿病、桥本甲状腺炎、网膜综合征、慢性肾功能衰竭、急性传染性单核细胞增多症、HIV和疱疹病毒相关疾病。
下面将参考附图并结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
附图说明
图1：示出了CAR-T细胞对靶细胞Jurkat(A)和Nalm6(B)的杀伤效果。
图2：示出了肿瘤模型小鼠的活体成像结果。
图3：示出了经CAR-T细胞处理的Raji-Luci肿瘤模型小鼠的存活曲线。
图4：示出了经CAR-T细胞处理的Jurkat-Luci肿瘤模型小鼠的存活曲线。
具体实施方式
实施例1.制备CAR T细胞
合成编码以下蛋白的序列，并将其依次克隆至pLVX载体(Public Protein/Plasmid Library(PPL)，货号:PPL00157-4a)：CD8α信号肽(SEQ ID NO：216)、抗CD30抗体(SEQ ID NO：54)、CD8α铰链区(SEQ ID NO：218)、CD8α跨膜区(SEQ ID NO：202)、4-1BB胞内区(SEQ ID NO：208)、CD3ζ初级信号传导结构域(SEQ ID NO：210)，并通过测序确认目标序列的正确插入，获得表达CD30-CAR的质粒，将其命名为CAR30。
将CAR30质粒中的抗CD30抗体替换为抗CD19抗体(包含SEQ ID NO：163和SEQ IDNO：170)，获得表达CD19-CAR的质粒，将其命名为CAR19。
合成编码以下蛋白的序列，并将其依次克隆至pLVX载体(Public Protein/Plasmid Library(PPL)，货号:PPL00157-4a)：CD8α信号肽(SEQ ID NO：216)、抗CD19抗体(包含SEQ ID NO：163和SEQ ID NO：170)、接头(SEQ ID NO：200)、抗CD30抗体(SEQ ID NO：54)、CD8α铰链区(SEQ ID NO：218)、CD8α跨膜区(SEQ ID NO：202)、4-1BB胞内区(SEQ IDNO：208)、CD3ζ初级信号传导结构域(SEQ ID NO：210)，并通过测序确认目标序列的正确插入，获得串联的靶向CD30和CD19的CAR质粒，将其命名为Tan30-19。
合成编码以下蛋白的序列，并将其依次克隆至pLVX载体(Public Protein/Plasmid Library(PPL)，货号:PPL00157-4a)：CD8α信号肽(SEQ ID NO：216)、抗CD30抗体(SEQ ID NO：54)、CD8α铰链区(SEQ ID NO：218)、CD8α跨膜区(SEQ ID NO：202)、4-1BB胞内区(SEQ ID NO：208)、CD3ζ初级信号传导结构域(SEQ ID NO：210)、T2A(SEQ ID NO：198)、CD8α信号肽(SEQ ID NO：216)、抗CD19抗体(包含SEQ ID NO：163和SEQ ID NO：170)、CD8α铰链区(SEQ ID NO：218)、CD8α跨膜区(SEQ ID NO：202)、4-1BB胞内区(SEQ ID NO：208)、CD3ζ初级信号传导结构域(SEQ ID NO：210)，并通过测序确认目标序列的正确插入，获得并联的靶向CD30和CD19的CAR质粒，将其命名为Dual30-19。
在无菌管中加入3ml Opti-MEM(Gibco，货号31985-070)稀释上述质粒后，再根据质粒:病毒包装载体：病毒包膜载体＝4:2:1的比例加入包装载体psPAX2(Addgene，货号12260)和包膜载体pMD2.G(Addgene，货号12259)。然后，加入120ul X-treme GENE HP DNA转染试剂(Roche，货号06366236001)，立即混匀，于室温下孵育15min，然后将质粒/载体/转染试剂混合物逐滴加入到293T细胞的培养瓶中。在24小时和48小时收集病毒，将其合并后，超速离心(25000g，4℃，2.5小时)获得浓缩的慢病毒。
用DynaBeads CD3/CD28 CTSTM(Gibco,货号40203D)激活野生型T细胞，并在37℃和5％CO2下继续培养1天。加入浓缩的慢病毒，持续扩增培养，获得CAR T细胞。
实施例2：CAR T细胞对靶细胞的杀伤效果
为了检测CAR-T细胞对表达CD3或CD19的靶细胞的杀伤能力，首先以1x104/孔将Jurkat-Luci细胞或Nalm6-Luci细胞铺入96孔板中，然后以各种效靶比将CAR T细胞和未转染T细胞(UnT，阴性对照)铺入到96孔板进行共培养，16-18小时后利用酶标仪测定荧光值。根据计算公式：(靶细胞荧光均值-样品荧光均值)/靶细胞荧光均值×100％，计算得到杀伤效率，结果如图1所示。
可以看出，在针对Jurkat靶细胞的杀伤实验中，与UnT和CAR19细胞相比，CAR30、Dual30-19和Tan30-19 CAR-T细胞均对靶细胞产生了显著的杀伤效果，且效果相当(图1A)。在针对Nalm6靶细胞的杀伤实验中，与Unt和CAR30细胞相比，CAR19、Dual30-19和Tan30-19CAR-T细胞均对靶细胞产生了显著的杀伤效果，且效果相当(图1B)。
实施例3.CAR T细胞对肿瘤的体内抑制效果
3.1 对Raji-Luci细胞诱发肿瘤的体内抑制效果
将20只6-8周龄的健康雌性NPI小鼠分成4组，每组5只小鼠：PBS组(阴性对照)、CAR19组、Dual30-19组和Tan30-19组。在第0天向每只小鼠尾静脉注射8×106个Raji-luci细胞。14天后，根据分组情况向每只小鼠尾静脉注射PBS溶液或2x106个相应CAR-T细胞。每周评估小鼠状态和存活率。
在细胞治疗后7天、14天、21天、28天、35天、46天检测小鼠肿瘤负荷并以Photons/s表示，结果如图2所示。图3示出了小鼠的存活曲线。结果表明，在PBS组中，小鼠体内的肿瘤负荷进展迅速，小鼠快速死亡。接受CAR-T细胞治疗的小鼠则肿瘤负荷进展较慢，其中CAR19组与Dual30-19组对肿瘤的抑制效果相当，Tan30-19组效果最佳。可见，对于CD19阳性肿瘤而言，双靶点CAR-T细胞可以提供与单靶点CAR-T细胞基本相当或甚至更优的抑制效果。
3.2 对Jurkat-Luci细胞诱发肿瘤的体内抑制效果
将25只6-8周龄的健康雌性NPI小鼠分成5组，每组5只小鼠：PBS组、NT组、CAR30组、Dual30-19组和Tan30-19组。在第0天向每只小鼠尾静脉注射2×106个Jurkat-luci细胞。6天后，根据分组情况向每只小鼠尾静脉注射PBS溶液、2x106个NT细胞或2x106个相应CAR-T细胞。每周评估小鼠状态和肿瘤负荷的变化。
小鼠存活曲线如图4所示。结果表明，在PBS组中，小鼠体内的肿瘤负荷进展迅速，小鼠快速死亡。接受CAR-T细胞治疗的小鼠则肿瘤负荷进展较慢，其中CAR30组与Tan30-19组对肿瘤的抑制效果相当，Dual30-19组效果最佳。可见，对于CD30阳性肿瘤而言，双靶点CAR-T细胞可以提供与单靶点CAR-T细胞基本相当或甚至更优的抑制效果。
需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京北恒生物科技有限公司
<120> 靶向CD30和CD19的工程化免疫细胞
<130> BHCN43
<160> 223
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Val Ser Thr Val Tyr Leu
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Ala Met Gly Trp Tyr Arg Lys Gly Pro Gly Asn Val Cys Asp Leu Val
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<220>
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Asp Met Ala Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Asn Glu Cys Glu Leu Val
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Ser Ile Ile Ser Ala Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Phe Leu
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<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD30-10
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
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Thr Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Gly Pro
20 25 30
Asp Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Cys Glu Leu Val
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Ser Ile Ile Ser Ala Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ala Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu
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100 105 110
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
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<223> CD30-1-1
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Gly Asp Ser
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Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Cys Glu Leu Val
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Gly Asp Ser
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Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Cys Glu Leu Val
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Ser Ile Ile Ser Ser Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
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<223> CD30-1-3
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Gly Asp Ser
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<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
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<223> CD30-2-1
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD30-2-2
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<223> CD30-9-4
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Pro Asp Pro Arg Arg Asn Cys Arg Gly Gly Asp Cys Cys Gly Asn Trp
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Gly Pro
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Asp Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Cys Glu Leu Val
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Ser Ile Ile Ser Ala Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ala Ser Gln Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Pro Arg Arg Asn Cys Arg Gly Asn Cys Cys Gly Asn Trp Gly
100 105 110
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Gly Pro
20 25 30
Asp Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Cys Glu Leu Val
35 40 45
Ser Ile Ile Ser Ala Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ala Ser Gln Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
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100 105 110
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Gly Pro
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Asp Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Cys Glu Leu Val
35 40 45
Ser Ile Ile Ser Ala Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ala Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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Gly Arg Phe Thr Ala Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
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Gly
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Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Pro Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
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Gly
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Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
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Gly
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Gly
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Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
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Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
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Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
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Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Asp Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu
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65 70 75 80
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Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser
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Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly
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Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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50 55 60
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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50 55 60
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65 70 75 80
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50 55 60
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<213> Homo sapiens(Homo sapiens)
<220>
<223> 21D4 VH
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Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Val Thr Met Ile Trp Gly Val Ile Ile Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 183
<211> 121
<212> PRT
<213> Homo sapiens(Homo sapiens)
<220>
<223> 21D4a VH
<400> 183
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Arg Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Val Thr Met Ile Trp Gly Val Ile Ile Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 184
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens(Homo sapiens)
<220>
<223> 47G4 VH
<400> 184
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Asp Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Gln Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Val Ala Ala Asp Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 185
<211> 124
<212> PRT
<213> Homo sapiens(Homo sapiens)
<220>
<223> 27F3 VH
<400> 185
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Asp Ser Tyr Tyr Gly Met Gly
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 186
<211> 123
<212> PRT
<213> Homo sapiens(Homo sapiens)
<220>
<223> 3C10 VH
<400> 186
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Pro Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Gly Gly Ser Ala Asp Tyr Ser Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 187
<211> 121
<212> PRT
<213> Homo sapiens(Homo sapiens)
<220>
<223> 5G7 VH
<400> 187
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Asn Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Ser Met Ile Trp Gly Val Ile Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 188
<211> 124
<212> PRT
<213> Homo sapiens(Homo sapiens)
<220>
<223> 13F1 VH
<400> 188
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Gln Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Arg Ser Tyr Tyr Gly Met Gly
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 189
<211> 124
<212> PRT
<213> Homo sapiens(Homo sapiens)
<220>
<223> 46E8 VH
<400> 189
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Gln Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Arg Ser Tyr Tyr Gly Met Gly
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 190
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> hFMC63-1 VL
<400> 190
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Gln
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105
<210> 191
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> hFMC63-1 VH
<400> 191
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 192
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> hFMC63-2 VL
<400> 192
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile
100 105
<210> 193
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> hFMC63-2 VH
<400> 193
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 194
<211> 108
<212> PRT
<213> Mus musculus(Mus musculus)
<220>
<223> Mab381 VL
<400> 194
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Val
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 195
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> Mab396 VL
<400> 195
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Val
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 196
<211> 121
<212> PRT
<213> Mus musculus(Mus musculus)
<220>
<223> Mab381 VH
<400> 196
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ile Asn Tyr Ser Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Ile Thr Thr Val Val Gly Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 197
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> Mab396 VH
<400> 197
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ile Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Ile Thr Thr Val Val Gly Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 198
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> T2A
<400> 198
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 199
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> F2A
<400> 199
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 200
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头
<400> 200
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 201
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头
<400> 201
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 202
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD8α跨膜结构域
<400> 202
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
20 25
<210> 203
<211> 0
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD8α跨膜结构域
<400> 203
<210> 204
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD28跨膜结构域
<400> 204
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 205
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD28跨膜结构域
<400> 205
ttttgggtcc tcgtcgtagt tggaggggta cttgcctgtt atagcctcct ggttaccgta 60
gcatttatta tattctgggt g 81
<210> 206
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD28共刺激结构域
<400> 206
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 207
<211> 123
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD28共刺激结构域
<400> 207
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 208
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> 4-1BB共刺激结构域
<400> 208
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
1 5 10 15
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
35 40
<210> 209
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> 4-1BB共刺激结构域
<400> 209
cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 60
actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 120
<210> 210
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD3ζ信号传导结构域
<400> 210
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
1 5 10 15
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
20 25 30
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
35 40 45
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 211
<211> 339
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD3ζ信号传导结构域
<400> 211
ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 120
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339
<210> 212
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD3ζ信号传导结构域突变体
<400> 212
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
1 5 10 15
Gly Gln Asn Gln Leu Phe Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
20 25 30
Phe Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
35 40 45
Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
50 55 60
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
65 70 75 80
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser
85 90 95
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
100 105 110
Pro Arg
<210> 213
<211> 342
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD3ζ信号传导结构域突变体
<400> 213
ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60
ctctttaacg agctcaatct aggacgaaga gaggagttcg atgttttgga caagagacgt 120
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg cagagaagga agaaccctca ggaaggcctg 180
tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 240
gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc cttttccagg gtctcagtac agccaccaag 300
gacacctttg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc 342
<210> 214
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> B2M信号肽
<400> 214
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala
20
<210> 215
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> B2M信号肽
<400> 215
atgtcccgct ctgttgcttt ggctgtgctg gcccttttgt cccttagcgg actggaggcc 60
<210> 216
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD8α信号肽
<400> 216
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 217
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD8α信号肽
<400> 217
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 218
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD8α铰链区
<400> 218
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 219
<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD8α铰链区
<400> 219
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 220
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD28铰链区
<400> 220
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35
<210> 221
<211> 117
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD28铰链区
<400> 221
attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60
catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117
<210> 222
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG4铰链区
<400> 222
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 223
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG4铰链区
<400> 223
gaaagcaaat acgggccgcc gtgtccaccc tgtccg 36

Claims (18)

1.一种工程化免疫细胞，其包含：(i)靶向CD19和CD30的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含：
(1)抗原结合区，包含靶向CD19的抗体和靶向CD30的抗体；
(2)跨膜结构域；和
(3)初级信号传导结构域。
2.一种工程化免疫细胞，其包含：
(1)靶向CD19的第一嵌合抗原受体，包含靶向CD19的抗体、跨膜结构域和初级信号传导结构域；和
(2)靶向CD30的第二嵌合抗原受体，包含靶向CD30的抗体、跨膜结构域和初级信号传导结构域。
3.权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述靶向CD19的抗体和靶向CD30的抗体通过接头连接。
4.权利要求3所述的工程化免疫细胞，其中所述接头包含(G4S)n，其中n为1、2、3、4、5或6，或者所述接头包含氨基酸序列(EAAAK)n或由其组成，其中n为1、2、3、4、5或6。
5.权利要求2所述的工程化免疫细胞，其中编码所述靶向CD19的第一嵌合抗原受体的第一核酸序列和编码所述靶向CD30的第二嵌合抗原受体的第二核酸序列位于相同或不同的载体。
6.权利要求1或2所述的工程化免疫细胞，其中所述跨膜结构域选自以下蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。
7.权利要求1或2所述的工程化免疫细胞，其中所述初级信号传导结构域选自以下蛋白的胞内区：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。
8.权利要求1或2所述的工程化免疫细胞，其中所述嵌合抗原受体还包含一个或多个共刺激结构域，其选自以下蛋白质的胞内区：CD94、LTB、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD8、CD18、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD270(HVEM)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)、DAP10、DAP12、LAT、NKG2C、SLP76、PD-1、LIGHT、TRIM、ZAP70以及它们的组合。
9.权利要求1或2所述的工程化免疫细胞，其中所述抗体选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fd′、Fv、scFv、sdFv、单域抗体和纳米抗体。
10.权利要求1或2所述的工程化免疫细胞，其中：
(i)所述靶向CD19的抗体包含：(1)如SEQ ID NO：73所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：78所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：83所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：88所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：92所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：96所示的H-CDR3；(2)如SEQ ID NO：74所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：79所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：84所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：89所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：93所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：97所示的H-CDR3；(3)如SEQ ID NO：75所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：80所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：85所示的L-CDR3、如SEQ IDNO：90所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：94所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：98所示的H-CDR3；(4)如SEQ ID NO：76所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：81所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：86所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：88所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：92所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：99所示的H-CDR3；(5)如SEQ ID NO：77所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：82所示的L-CDR2、如SEQ IDNO：87所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：91所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：95所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：100所示的H-CDR3；(6)如SEQ ID NO：101所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：102所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：103所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：89所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：95所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：104所示的H-CDR3；(7)如SEQ ID NO：105所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：112所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：119或120所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：127所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：134所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：141所示的H-CDR3；(8)如SEQID NO：106所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：113所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：121所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：128所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：135所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：142所示的H-CDR3；(9)如SEQ ID NO：107所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：114所示的L-CDR2、如SEQID NO：122所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：129所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：136所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：143所示的H-CDR3；(10)如SEQ ID NO：108所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：115所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：123所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：130所示的H-CDR1、如SEQ IDNO：137所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：144所示的H-CDR3；(11)如SEQ ID NO：109所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：116所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：124所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：131所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：138所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：145所示的H-CDR3；(12)如SEQ ID NO：110所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：117所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：125所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：132所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：139所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：146所示的H-CDR3；(13)如SEQ ID NO：111所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：118所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：126所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：133所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：140所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：147所示的H-CDR3；(14)如SEQ ID NO：148所示的L-CDR1、如SEQ IDNO：150所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：152所示的L-CDR3、如SEQ ID NO：154所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：156所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：158所示的H-CDR3；或(15)如SEQ ID NO：149所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：151所示的L-CDR2、如SEQ ID NO：153所示的L-CDR3、如SEQ IDNO：155所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：157所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：159所示的H-CDR3。
(ii)所述靶向CD30的抗体包含(1)如SEQ ID NO：1所示的CDR1、如SEQ ID NO：2所示的CDR2和如SEQ ID NO：3或4所示的CDR3；(2)如SEQ ID NO：5所示的CDR1、如SEQ ID NO：6所示的CDR2和如SEQ ID NO：7所示的CDR3；(3)如SEQ ID NO：8所示的CDR1、如SEQ ID NO：9所示的CDR2和如SEQ ID NO：10所示的CDR3；(4)如SEQ ID NO：11所示的CDR1、如SEQ ID NO：12所示的CDR2和如SEQ ID NO：13所示的CDR3；(5)如SEQ ID NO：14所示的CDR1、如SEQ ID NO：12所示的CDR2和如SEQ ID NO：15所示的CDR3；(6)如SEQ ID NO：16所示的CDR1、如SEQ ID NO：17所示的CDR2和如SEQ ID NO：18所示的CDR3；(7)如SEQ ID NO：19所示的CDR1、如SEQ IDNO：20所示的CDR2和如SEQ ID NO：21所示的CDR3；(8)如SEQ ID NO：22所示的CDR1、如SEQID NO：12所示的CDR2和如SEQ ID NO：23所示的CDR3；或(9)如SEQ ID NO：24所示的CDR1、如SEQ ID NO：12所示的CDR2和如SEQ ID NO：25所示的CDR3。
11.权利要求1或2所述的工程化免疫细胞，其中所述靶向CD19的抗体包含与选自SEQID NO：160-166、174-181、190-191和194-195的氨基酸序列具有至少90％同一性的轻链可变区，和与选自SEQ ID NO：167-173、182-189、192-193和196-197的氨基酸序列具有至少90％同一性的重链可变区；所述靶向CD30的抗体与选自SEQ ID NO：26-72的氨基酸序列具有至少90％同一性。
12.权利要求1或2所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞是B细胞、T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞或NKT细胞。
13.权利要求1或2所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞衍生自干细胞。
14.一种组合物，其包含：
(1)表达第一嵌合抗原受体的第一工程化免疫细胞群，所述第一嵌合抗原受体包含靶向CD19的抗体、跨膜结构域和初级信号传导结构域；和
(2)表达第二嵌合抗原受体的第二工程化免疫细胞群，所述第二嵌合抗原受体包含靶向CD30的抗体、跨膜结构域和初级信号传导结构域。
15.一种药物组合物，其包含权利要求1-13任一项所述的工程化免疫细胞或权利要求14所述的组合物，和一种或多种药学上可接受的赋型剂。
16.一种载体，其包含编码靶向CD19和CD30的嵌合抗原受体的核酸序列，其中所述嵌合抗原受体的抗原结合区包含靶向CD19的抗体和靶向CD30的抗体。
17.一种载体系统，其包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含编码靶向CD19的嵌合抗原受体的第一核酸序列和编码靶向CD30的嵌合抗原受体的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列位于相同或不同的载体。
18.权利要求16所述的载体或权利要求17所述的载体系统，其中所述载体选自：线性核酸分子、质粒、病毒、噬菌体、噬菌粒、粘粒和人工染色体。
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