CN116650671A - 一种抗血清膜融合纳米载体及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请属于药物载体技术领域，尤其涉及一种抗血清膜融合纳米载体及制备方法和应用，本申请所提供的一种抗血清膜融合纳米载体在含胎牛血清的细胞培养基等富含蛋白质的环境中具有优异的抗蛋白吸附能力，保持稳定的膜融合作用，绕过了经内吞途径摄取时会面临的被内涵体/溶酶体降解的风险，从而直接将货物有效地递送到细胞内。该抗血清膜融合纳米载体因其优越的抗蛋白吸附能力，可以在静脉给药后实现体内稳定的膜融合递送，进行高效的荧光素酶基因递送和抗HBV病毒的CRISPR/Cas9基因编辑系统递送，具有作为治疗性纳米药物的潜力，从而解决现有技术中膜融合纳米载体抗蛋白吸附能力弱而导致的在体内应用中细胞内递送效率低的技术问题。
Description
技术领域
本申请属于药物载体技术领域，尤其涉及一种抗血清膜融合纳米载体及制备方法和应用。
背景技术
近年开发出来的基于膜融合的递送策略具有良好的细胞内递送应用前景，这种类型的膜融合纳米载体可通过仿生的融合效应与细胞膜进行融合，直接绕过内吞导致的内涵体/溶酶体途径，避免药物被提前降解，与传统的通过内吞途径运输的载体相比具有良好的优势。在细胞内递送的应用中，膜融合纳米载体通过紧密邻近的膜接触，脂质层混合，可实现内部的内容物转移，以此来进行细胞内直接高效的药物运输。
然而，目前可以实现膜融合的纳米载体往往在体内经注射给药后，易受到富含蛋白的复杂生理环境的影响，导致在体内应用时的融合递送效率不佳。这是因为在体内进行运输时，膜融合纳米载体的表面易吸附体内环境的蛋白而形成蛋白冠，严重阻碍到这些纳米载体的膜融合途径，使它们转化为内吞－溶酶体的细胞内化途径而导致融合优势丧失，大大降低了这些载体的体内递送效率。
发明内容
有鉴于此，本申请提供了一种抗血清膜融合纳米载体及制备方法和应用，用于解决现有技术中膜融合纳米载体抗蛋白吸附能力弱而导致的在体内应用中细胞内递送效率低的技术问题。
本申请第一方面提供了一种抗血清膜融合纳米载体，所述抗血清膜融合纳米载体包括抗血清膜融合脂质体外壳和钙沉淀质粒内核；
所述抗血清膜融合脂质体外壳包裹所述钙沉淀质粒内核；
所述抗血清膜融合脂质体外壳包括二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇。
优选的，抗血清膜融合脂质体外壳中，所述二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇的摩尔比为90：5：5。
优选的，所述钙沉淀质粒内核的质粒可为EGFP荧光报告质粒，荧光素酶质粒或基因编辑质粒；
所述基因编辑质粒为靶向HBV病毒基因组的CRISPR/Cas9质粒。
优选的，所述钙沉淀为碳酸钙。
本申请第二方面提供了一种抗血清膜融合纳米载体的制备方法，制备方法包括步骤：
步骤S1：将可溶性钙盐、可溶性碳酸盐以及质粒溶液混合形成共沉淀，得到钙沉淀质粒内核溶液；
步骤S2：将二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇按照特定的摩尔比例90：5：5溶解在有机溶剂中，挥发有机溶剂后得到抗血清膜融合脂质体薄膜；
步骤S3：将钙沉淀质粒内核溶液与抗血清膜融合脂质体薄膜混合，然后，将混合物在室温条件下依次通过不同纳米梯度孔径的聚碳酸酯膜(每个孔径进行20次重复步骤)；
步骤S4：通过尺寸排除色谱法除去游离的试剂和脂质成分，最终制备得到抗血清膜融合纳米载体。
优选的，步骤S1中，所述可溶性钙盐、可溶性碳酸盐分别选自氯化钙和碳酸钠。
优选的，步骤S2中，所述有机溶剂选自氯仿。
优选的，步骤S3中，所述不同纳米梯度孔径的聚碳酸酯膜具体为800nm、600nm、400nm、200nm的聚碳酸酯膜。
本申请第三方面提供了两种抗血清膜融合纳米载体在纳米药物中的应用。
优选的，所述在纳米药物中的应用具体为在荧光素酶的体内发光标记或抗HBV乙型肝炎的CRISPR/Cas9基因编辑纳米药物中的应用。
综上所述，本申请提供了一种抗血清膜融合纳米载体及制备方法和应用；抗血清膜融合纳米载体的组成包括抗血清膜融合脂质体外壳及其包覆的钙沉淀质粒内核，抗血清膜融合脂质体外壳的组成成分和特定摩尔比例为二油酰基卵磷脂：溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵：二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇＝90：5：5，其中，抗血清膜融合脂质体外壳在含胎牛血清的细胞培养基等富含蛋白质的环境中具有优异的抗蛋白吸附能力，保持稳定的膜融合作用，绕过了经内吞途径会面临的被内涵体/溶酶体降解的风险，从而直接将货物有效地递送到细胞内。该抗血清膜融合纳米载体因其优越的抗蛋白吸附能力，可以在静脉给药后实现体内稳定的膜融合递送，进行高效的药物运输(荧光素酶基因递送和抗HBV病毒的CRISPR/Cas9基因编辑系统递送)，具有作为治疗性纳米药物的潜力，从而解决现有技术中膜融合纳米载体抗蛋白吸附能力弱而导致的在体内应用中细胞内递送效率低的技术问题。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请提供的抗血清膜融合纳米载体在体内富含蛋白的情况下仍保持稳定膜融合递送的示意图；在血清蛋白浓度的影响下，传统膜融合纳米载体由膜融合途径转变内内吞途径，而抗血清膜融合纳米载体由于其优异的抗蛋白吸附能力，仍保持稳定的膜融合作用，绕过了经内吞途径会面临的被内涵体/溶酶体降解的风险，从而直接将货物有效地递送到细胞内；
图2为本申请提供的不同脂质摩尔比例膜融合脂质体外壳制备的纳米载体在无胎牛血清和10％胎牛血清培养条件下的细胞摄取荧光追踪；其中，载体用红色荧光信号显示，细胞核用蓝色荧光信号显示。根据结果筛选优化出抗血清膜融合载体的脂质体外壳由二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇按照特定的摩尔比例90：5：5组成，该抗血清膜融合载体可以在无胎牛血清和10％胎牛血清培养条件下均保持膜融合的效应；
图3为本申请提供的优化筛选出的抗血清膜融合纳米载体的物理化学性质表征；其中，图a为抗血清膜融合纳米载体的水合粒径分布，图b为抗血清膜融合纳米载体的Zeta电位分布。
图4为本申请提供的抗血清膜融合纳米载体的抗蛋白吸附能力验证；其中，图a为抗血清膜融合纳米载体(AFMFlip)和两种传统膜融合纳米载体(MFlip-a和MFlip-b)的脂质成分和比例构成图，图b为三种纳米载体在无胎牛血清和10％胎牛血清于37℃的培养条件下孵育1小时后的粒径变化统计，图c为三种纳米载体在无胎牛血清和10％胎牛血清于37℃的培养条件下孵育1小时后的Zeta电位变化统计，图d为三种纳米载体在10％胎牛血清和10％小鼠血清于37℃的培养条件下孵育1小时后进行的SDS-PAGE凝胶电泳图，图e为三种纳米载体在不同浓度胎牛血清于37℃的培养条件下孵育1小时后进行的BCA蛋白定量分析，图f为BCA测定数据图的曲线下面积(AUC)的统计结果。
图5为本申请提供的抗血清膜融合纳米载体在体外模拟生理环境条件下反应后，基于蛋白质谱对载体的抗蛋白吸附能力进行分析。其中，图a为对蛋白质谱分析数据进行质量评估的质量偏差分布图，图b、c、d分别为抗血清膜融合纳米载体(AFMFlip)和两种传统膜融合纳米载体(MFlip-a和MFlip-b)在体外模拟生理环境条件下(10％胎牛血清和37℃的培养条件)反应后表面吸附的蛋白成分中含量位于top 20的种类名称和对应的蛋白相对丰度分布图，图e、f、g、h分别为根据不同的蛋白参数(等电点、分子量、Gravy index、Instability index)进行分类的主成分分析数据图；
图6为本申请提供的抗血清膜融合纳米载体的抗血清融合递送效应验证。其中，图a为抗血清膜融合纳米载体(AFMFlip)和两种传统膜融合纳米载体(MFlip-a和MFlip-b)在无胎牛血清和10％胎牛血清培养条件下的细胞内递送荧光追踪和对应的荧光共定位分析，图b为使用内吞抑制剂或膜融合抑制剂预处理后，抗血清膜融合纳米载体(AFMFlip)和两种传统膜融合纳米载体(MFlip-a和MFlip-b)在无胎牛血清和10％胎牛血清培养条件下的细胞摄取情况；
图7为本申请提供的抗血清膜融合纳米载体用于抗血清膜融合介导的基因传递；其中，图7a为抗血清膜融合纳米载体(AFMFlip)在不同胎牛血清浓度(0、10％、20％、30％、40％和50％)培养条件下的细胞摄取情况，图7b为抗血清膜融合纳米载体(AFMFlip)在不同胎牛血清浓度(0、10％、20％、30％、40％和50％)培养条件下的细胞内递送荧光追踪图像，图7c为抗血清膜融合纳米载体(AFMFlip)和商业化转染试剂Lipo2K在不同胎牛血清浓度(0、10％、20％、30％、40％和50％)培养条件下的EGFP质粒转染效率比较，图7d为抗血清膜融合纳米载体(AFMFlip)在不同胎牛血清浓度(0、10％、20％、30％、40％和50％)培养条件下的EGFP质粒转染的荧光图像。
图8为本申请提供的抗血清膜融合纳米载体的体内抗蛋白吸附能力的探究；其中，图a为抗血清膜融合纳米载体(AFMFlip)和两种传统膜融合纳米载体(MFlip-a和MFlip-b)在小鼠体内注射后进行回收和表征的实验设计方案，图b为在体外模拟生理环境和在小鼠体内注射1小时和3小时后回收的抗血清膜融合纳米载体(AFMFlip)和两种传统膜融合纳米载体(MFlip-a和MFlip-b)的BCA蛋白定量分析，图c为在小鼠体内注射1小时和3小时后回收的抗血清膜融合纳米载体(AFMFlip)和两种传统膜融合纳米载体(MFlip-a和MFlip-b)进行的SDS-PAGE电泳图，图d为在小鼠体内注射1小时和3小时后回收的抗血清膜融合纳米载体(AFMFlip)和两种传统膜融合纳米载体(MFlip-a和MFlip-b)的TEM图像。
图9为本申请提供的抗血清膜融合纳米载体的体内细胞内转运共聚焦观察图像和荧光共定位分析；其中，载体经DiR染色后以红色荧光信号显示，质粒经YOYO-1染色后以绿色荧光信号显示，细胞膜经phalloidin染色后以青色荧光信号显示，细胞核经DAPI染色后以蓝色荧光信号显示。
图10为本申请提供的抗血清膜融合纳米载体应用于体内荧光素酶转染；其中，图a为抗血清膜融合纳米载体(AFMFlip)和两种传统膜融合纳米载体(MFlip-a和MFlip-b)运载荧光素酶表达质粒在体外无胎牛血清和10％胎牛血清培养条件下细胞转染24小时，48小时和72小时后的荧光表达数据，图b和c分别为抗血清膜融合纳米载体(AFMFlip)和两种传统膜融合纳米载体(MFlip-a和MFlip-b)运载荧光素酶表达质粒在小鼠体内通过尾静脉注射48小时后的活体荧光成像和主要器官(心肝脾肺肾)成像。
图11为本申请提供的抗血清膜融合纳米载体应用于CRISPR/Cas9基因编辑治疗小鼠乙型肝炎病毒(HBV)感染；其中，图a为治疗示意图，图b为治疗过程中小鼠的体重变化曲线，图c为小鼠的肝组织DNA中HBV靶点点位置的T7核酸内切酶I(T7E1)的测定，红色箭头表示预期尺寸的具体带(394bp+293bp)，图d为通过TIDE分析小鼠肝组织DNA中靶向HBV基因组的测序结果，其编辑效率是根据在线网站计算的(https://tide.nki.nl/)，图e、f、g分别为通过小鼠血清检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)和HBV DNA水平的结果，图h、i、j分别为通过小鼠肝脏组织检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)和HBV DNA水平的结果，图k为小鼠肝脏的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)免疫荧光切片图像。
图12为本申请提供的抗血清膜融合纳米载体的体内基于血生化指标安全性评价；其中血生化指标包括血清白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、肌酸激酶(CK)、肌酐(CREA)和乳酸脱氢酶(LDH)。
图13为本申请提供的抗血清膜融合纳米载体的体内基于组织学指标安全性评价，包括主要器官(心肝脾肺肾)的H&E染色。
具体实施方式
本申请提供了一种抗血清膜融合纳米载体及制备方法和应用，用于解决现有技术中膜融合纳米载体抗蛋白吸附能力弱而导致的在体内应用中细胞内递送效率低的技术问题。
下面将结合附图对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1
鉴于现有膜融合纳米载体在富含蛋白的环境下，特别是体内复杂生理环境下容易吸附蛋白而形成蛋白冠覆盖在载体表面，从而造成膜融合纳米载体递送效率低下的技术问题，本申请实施例1提供了一种抗血清膜融合纳米载体，抗血清膜融合纳米载体包括钙沉淀质粒内核和抗血清膜融合脂质体外壳，抗血清膜融合脂质体外壳由二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇按照特定的摩尔比例90：5：5组成，如图2的实验结果显示，在该特定的脂质成分和组成比例下，由二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇构成的膜融合脂质体外壳具有优异的抗蛋白吸附能力，能够实现体内稳定的膜融合递送，达到高效的递送效率。
作为优选，将膜融合脂质体外壳中二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇的摩尔比设为65～95：0～30：5来探究并筛选能实现抗蛋白膜融合能力的优化比例。如图2所示，当二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇的摩尔比为90：5：5时，在无胎牛血清和含10％胎牛血清的培养基中，均保持以膜融合的方式与细胞相互作用，抗蛋白吸附能力优于其他摩尔比例。
实施例2
本申请实施例2提供了抗血清膜融合纳米载体的一种制备方法，制备方法包括钙沉淀质粒内核的制备步骤、抗血清膜融合脂质体薄膜的制备步骤以及抗血清膜融合纳米载体的制备步骤。
其中，钙沉淀质粒内核的制备步骤包括将32μL CaCl2(0.5M)溶液，2μg EGFP质粒与ddH2O混合形成100μL a液，B液则由32μL Na2CO3(0.01M)溶液与ddH2O稀释形成(100μL)；将b液在震荡中快速逐滴加入a液，所得c混合液(200μL)在室温静置15min，记为钙沉淀质粒内核溶液。
抗血清膜融合脂质体薄膜的制备步骤包括：采用薄膜水化法制备膜融合脂质体薄膜：将溶解于氯仿的DOPC(二油酰基卵磷脂)、DOTAP(溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵)和DSPE-PEG(二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇)按照不同的比例混合于圆底烧瓶中，将氯仿挥发使之在瓶底形成脂质薄膜；其中，二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇的摩尔比例为90：5：5。
抗血清膜融合纳米载体的制备步骤包括：将所得钙沉淀质粒内核溶液通过薄膜水化法加入形成脂质薄膜的圆底烧瓶中，并依次通过800nm、600nm、400nm、200nm孔径的聚碳酸酯膜，通过尺寸排除色谱法除去游离的试剂和脂质成分，最终制备得到抗血清膜融合纳米载体，记为AFMFlippEGFP；其中，控制抗血清膜融合脂质体的总质量与负载的EGFP质粒的质量比为25：1。
实施例3
本申请实施例3提供了载有荧光素酶表达基因质粒的抗血清膜融合纳米载体的一种制备方法。
制备方法与实施例2的区别在于钙沉淀质粒内核的制备步骤中，质粒为2μg荧光素酶质粒，抗血清膜融合脂质体薄膜的制备步骤中二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇的摩尔比例为90：5：5。
实施例4
本申请实施例4提供了载有靶向HBV病毒基因组的CRISPR/Cas9质粒的抗血清膜融合纳米载体的一种制备方法。
制备方法与实施例2的区别在于钙沉淀质粒内核的制备步骤中，质粒为靶向HBV病毒基因组的CRISPR/Cas9质粒，抗血清膜融合脂质体薄膜的制备步骤中二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇的摩尔比例为90：5：5。
实验例1
本申请实验例1对实施例1提供的含有5种不同摩尔比例组成的膜融合脂质体外壳的抗血清膜融合纳米载体(AFMFlippEGFP)进行性能测试，测试结果如附图2所示，从图2可以看出，只有当二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇的摩尔比为90：5：5时，可以在无胎牛血清和10％胎牛血清情况下均存在膜融合情况，显示该比例构建的载体具有抗血清蛋白吸附的影响，并保持融合的递送能力，这说明通过控制脂质成分组成的摩尔比例，可以优化筛选出具有优异抗蛋白能力的抗血清膜融合纳米载体，作为AFMFlip用于后续实验。
实验例2
本申请实验例2对实施例2所示的由二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇(摩尔比为90：5：5)并载有荧光报告EGFP质粒的抗血清膜融合纳米载体(AFMFlippEGFP)进行表征和抗蛋白吸附能力测试。从图3可以看出，AFMFlippEGFP粒径较为均匀，大约为200nm，Zeta电位呈现微正电。如图4a所示，将AFMFlip与两种传统膜融合纳米载体(MFlip-a和MFlip-b)一同进行后续的抗蛋白吸附能力测试，包括：在无胎牛血清和10％胎牛血清培养条件下的粒径和Zeta电位变化、在10％胎牛血清和10％小鼠血清的培养条件孵育后进行SDS-PAGE电泳、在不同浓度胎牛血清的培养条件孵育后进行BCA蛋白定量和在体外模拟生理环境条件下(10％胎牛血清)反应后进行蛋白质谱分析，测试结果如附图4-5所示。
其中，载体的性质变化测试如图4b和c所示，使用纳米粒度仪和Zeta电位仪检测富含蛋白环境对纳米载体物化性质的影响，结果显示，抗血清膜融合纳米载体(AFMFlippEGFP)在无胎牛血清和10％胎牛血清于37℃的培养条件下孵育1小时后，其粒径大小和电位几乎没有变化，而两种传统膜融合纳米载体(MFlip-a和MFlip-b)则在10％胎牛血清的影响下粒径变大，电位变负。
在体外模拟生理环境条件下进行载体表面吸附形成蛋白冠测试如图4c和d所示，通过SDS-PAGE和BCA法对蛋白冠进行定量和半定量检测。结果显示，和传统膜融合脂质体MFlip-a和MFlip-b相比，抗血清膜融合纳米载体(AFMFlippEGFP)具有更少的蛋白冠，在体外模拟生理环境的条件下表现出很好的抗蛋白吸附能力。
在不同胎牛血清蛋白浓度条件下进行载体表面吸附形成蛋白冠测试如图4e和f所示，抗血清膜融合纳米载体(AFMFlippEGFP)在0到100％的胎牛血清浓度影响下，始终保持比传统膜融合脂质体MFlip-a和MFlip-b更低的蛋白吸附量，证实了抗血清膜融合纳米载体(AFMFlippEGFP)优异的抗蛋白吸附能力。
在体外模拟生理环境条件下对载体表面吸附形成的蛋白冠进行蛋白质谱的分析测试如图5所示，将AFMFlippEGFP、MFlip-a和MFlip-b与10％胎牛血清于37℃的培养条件下孵育1小时后，对其表面吸附的蛋白成分进行蛋白质谱分析。如图5a所示，对蛋白质谱分析数据进行质量评估，显示出良好的质控结果。图5b-c描述了抗血清膜融合纳米载体(AFMFlip)和两种传统膜融合纳米载体(MFlip-a和MFlip-b)在体外模拟生理环境(10％胎牛血清和37℃的培养条件)下孵育1小时后表面吸附的蛋白成分中含量在top 20的种类名称和对应的蛋白相对丰度。为了进一步表征蛋白冠组成物的整体蛋白质性质，根据不同参数(等电点、分子量、Gravy index、Instability index)对抗血清膜融合纳米载体(AFMFlip)和两种传统膜融合纳米载体(MFlip-a和MFlip-b)在体外模拟生理环境条件下(10％胎牛血清和37℃的培养条件)反应后表面吸附的蛋白进行了分类分析(图5e-h)。结果显示，低等电点(pI值小于7)的蛋白质是富集在抗血清膜融合纳米载体(AFMFlip)和两种传统膜融合纳米载体(MFlip-a和MFlip-b)表面的主要成分，与之前的研究报道一致；中等分子量(MW＝30-90kDa)的蛋白所占比例最大；抗血清膜融合纳米载体(AFMFlip)和两种传统膜融合纳米载体(MFlip-a和MFlip-b)在体外模拟生理环境条件下(10％胎牛血清和37℃的培养条件)反应后表面吸附的蛋白的总平均亲水性和脂溶指数都趋向于较小的范围值，说明三种载体在体外模拟生理环境条件下(10％胎牛血清和37℃的培养条件)反应后表面吸附的蛋白组成有一大部分是亲水稳定的蛋白质。
实验例3
本申请实验例3对实施例2所示的由二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇(摩尔比为90：5：5)并载有EGFP质粒的抗血清膜融合纳米载体(AFMFlippEGFP)进行细胞内递送效应的验证，实验结果如图6所示。
使用共聚焦荧光显微镜观察在无胎牛血清和含有10％胎牛血清的培养条件下，抗血清膜融合纳米载体(AFMFlip)和两种传统膜融合纳米载体(MFlip-a和MFlip-b)向HeLa细胞递送EGFP质粒的过程。其中EGFP质粒用YOYO-1染色(绿色)，脂质体层用DiD染色(红色)，细胞核用DAPI染色(蓝色)，结果如图6a所示，所有膜融合纳米载体在无胎牛血清的培养条件下均表现出明显的膜融合作用，表现为标记的脂质体层(红色)的荧光信号主要分布在细胞膜上，而YOYO-1标记的质粒(绿色)则分布在细胞质内。然而，当使用含有10％FBS的培养基时，只有AFMFlip仍以膜融合的方式与细胞进行相互作用和递送质粒，而用传统膜融合纳米载体处理的组则观察到有一些红色和绿色信号重叠进入细胞质，提示MFlip-a和MFlip-b在含胎牛血清的培养条件下，其细胞内递送途径参与了内吞作用。
使用流式细胞仪分析在用内吞抑制剂或膜融合抑制剂预处理后，抗血清膜融合纳米载体(AFMFlip)和两种传统膜融合纳米载体(MFlip-a和MFlip-b)在无胎牛血清和10％胎牛血清培养条件下的细胞摄取情况。结果如图6b所示，在无胎牛血清的培养条件下，所有膜融合纳米载体的细胞摄取均表现出只受膜融合抑制剂影响的结果。然而，在10％胎牛血清培养条件下，只有AFMFlip的摄取结果仍保持只被膜融合抑制剂所影响的趋势，而传统膜融合纳米载体(MFlip-a和MFlip-b)的摄取不但受到膜融合抑制剂影响，其效率还会受到内吞抑制剂氯丙嗪(Chlorpromazine)的阻碍。
实验例4
本申请实验例4对实施例2所示的由二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇(摩尔比为90：5：5)并载有EGFP质粒的抗血清膜融合纳米载体(AFMFlippEGFP)进行用于抗血清膜融合介导的基因传递实验，实验结果如图7所示。
实验过程包括细胞摄取实验、细胞内运输过程追踪实验、细胞内质粒转染验证实验。
其中，细胞摄取实验包括使用流式细胞仪分析抗血清膜融合纳米载体(AFMFlippEGFP)在不同胎牛血清浓度(0、10％、20％、30％、40％和50％)培养条件中的细胞摄取情况。如图7a所示，EGFP质粒用YOYO-1染色，结果显示AFMFlippEGFP递送的质粒一直保持高水平的细胞摄取，直至培养条件中胎牛血清的浓度上升至40％时，其摄取效率开始出现降低。
细胞内运输过程追踪实验包括使用共聚焦荧光显微镜观察抗血清膜融合纳米载体(AFMFlippEGFP)在在不同胎牛血清浓度(0、10％、20％、30％、40％和50％)培养条件下与HeLa细胞共孵育处理后的细胞内运输情况。结果如图7b所示，YOYO-1标记的质粒(绿色)遍布整个细胞甚至部分进入了细胞核(蓝色)，但YOYO-1显示的绿色荧光并不任何标记溶酶体成分的荧光(洋红色)重叠，提示细胞内递送途径并不涉及内吞-溶酶体过程；直到培养条件的胎牛血清浓度增加到40％或更多时，部分绿色荧光信号才开始与洋红色荧光信号共定位。这些结果说明了AFMFlippEGFP比传统的MFlip表现出更高的抗蛋白吸附能力(融合效应能维持并抵抗到高达40％左右的胎牛血清浓度培养条件)，通过膜融合介导的独立于内吞－溶酶体的递送方式将货物运送到细胞中。
细胞内质粒转染验证实验包括使用流式分析和荧光显微镜观察AFMFlippEGFP运载EGFP质粒的转染效率。图7c的流式结果显示，由于具有优异的抗血清膜融合介导的转运，AFMFlippEGFP可以实现约40％的EGFP粒转染效率，直到FBS浓度上升到30％，此时商业转染试剂Lipofectamine 2000(Lipo2K)的转染能力显著降低至17.9％。图7d中的荧光图像也显示，即使在含有30％胎牛血清的培养基中，装载有EGFP质粒的AFMFlippEGFP处理的细胞也表现出相对较高的EGFP表达，验证了抗蛋白吸附膜融合载体介导的高效基因传递。
实验例5
本申请实验例5对实施例2所示的由二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇(摩尔比为90：5：5)并载有EGFP质粒的抗血清膜融合纳米载体(AFMFlippEGFP)进行体内注射后，对回收的纳米载体进行抗蛋白吸附能力评估，实验结果如图7所示。
如图8a示意图所示，实验过程包括在小鼠体内注射1小时和3小时后，对回收的纳米载体表面吸附蛋白质形成蛋白冠的分析，以及回收的纳米载体表面性质变化的探究。
将纳米载体注射到小鼠体内1小时和3小时后，对回收的纳米载体表面吸附形成的蛋白冠进行分析。具体而言，通过BCA检测和SDS-PAGE对纳米载体表面的蛋白冠进行定量和半定量分析。如图8b和c的结果显示，和传统膜融合脂质体MFlip-a和MFlip-b相比，体内运输时，AFMFlip形成更少的蛋白冠，在体内具有更好的抗蛋白吸附能力。
将纳米载体注射到小鼠体内1小时和3小时后，对回收的纳米载体进行TEM电镜观察。如图8d显示，AFMFlip表面吸附形成的蛋白冠厚度要远远低于传统膜融合纳米载体，一致证实了AFMFlip在体内具有较强的抗蛋白吸附能力。
实验例6
本申请实验例6对实施例2所示的由二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇(摩尔比为90：5：5)并载有EGFP质粒的抗血清膜融合纳米载体(AFMFlippEGFP)进行体内注射后，在肝脏内细胞运输过程的评估，实验结果如图9所示。
实验结果显示，体内注射1小时和3小时后，注射了AFMFlip的小鼠肝细胞中由DiR标记的脂质层(红色)和phalloidin标记的细胞膜(青色)之间显示出明显的荧光重叠，而YOYO-1标记的质粒(绿色)在细胞质中扩散。相比之下，其他两种传统膜融合脂质体处理的组中，一些DiR荧光在细胞内与YOYO-1荧光共定位，这意味着膜融合和典型的内吞过程共存。因此，AFMFlip具有良好的抗蛋白吸附效果，可以保证在体内循环后仍通过膜融合介导转运，实现高效的细胞内传递。
实验例7
本申请实验例7对实施例3所示的由二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇(摩尔比为90：5：5)并载有荧光素酶表达质粒的抗血清膜融合纳米载体(AFMFlippEGFP)进行抗血清膜融合介导的荧光素酶转染，实验结果如图10所示。
实验包括体外荧光素酶转染和体内荧光素酶转染。
其中，用体外荧光素酶转染初步评估了AFMFlip在体外无胎牛血清和10％胎牛血清培养条件下于HeLa细胞中递送编码荧光素酶报告基因质粒(pluci)的能力。结果如图10a显示，结果为AFMFlip和两种传统膜融合脂质体均在无胎牛血清培养基中诱导等效生物荧光表达，且随时间增加；当暴露于含10％胎牛血清的培养基中时，只有AFMFlip转染的细胞仍保持高荧光表达水平。
其中，体内荧光素酶转染通过静脉注射研究了在C57BL/6小鼠体内的递送转染效率，在注射48小时后通过活体和体外器官成像评估生物发光情况。结果如图10b和c显示，AFMFlip处理的小鼠肝脏区域荧光素酶表达量最高，表明AFMFlip可以在复杂的体内环境中成功实现高效的膜融合介导的传递，具有作为治疗性纳米药物的应用潜力。
实验例8
本申请实验例8对实施例4所示的由二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇(摩尔比为90：5：5)并载有基因编辑质粒的抗血清膜融合纳米载体(AFMFlippEGFP)进行抗血清膜融合介导的CRISPR/Cas9基因编辑治疗HBV感染，治疗过程如图11a所示。
实验包括体内CRISPR/Cas9基因编辑效果评估和体内抗HBV治疗效果评估。
在治疗过程中监测了小鼠的体重变化，如图11b所示，所有处理组的小时体重均无明显变化。体内CRISPR/Cas9基因编辑效果评估如图11c和d所示，用T7E1和TIDE分析验证了AFMFlip递送CRISPR/Cas9靶向HBV的质粒在HBV复制小鼠模型中治疗的基因编辑效果。结果为基因编辑的效率高达19％，证明AFMFlip可以在体内成功递送pCas9-gHBV质粒，对HBV靶向位点进行有效的基因编辑。
体内抗HBV治疗效果评估如图11e-j所示，通过检测小鼠血清和肝脏组织中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)和HBV DNA的水平，可以发现HBV复制小鼠模型经AFMFlip治疗后血清和肝组织中的HBV相关病毒载量均被下调。图11k的肝脏组织切片HBsAg免疫荧光分析也证实了上述结果，AFMFlip治疗后肝脏组织中HBsAg的免疫荧光信号最弱，证明AFMFlip可以实现体内有效的疾病治疗。
实验例8
本申请实验例8对实施例4所示抗血清膜融合纳米载体(AFMFlippEGFP)生物安全性评估，实验结果如图11b、图12和图13所示。
实验包括体重观察、血清样本血液生化检测和治疗后主要器官的组织病理学分析。
结果显示，在接受治疗后，小鼠体重变化小于5％，检测到小鼠中的血清白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、肌酸激酶(CK)、肌酐(CREA)和乳酸脱氢酶(LDH)水平变化可以忽略不计，且不同治疗组小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)组织的H&E染色与健康小鼠相比未见明显病理损伤，表明AFMFlip在体内应用的毒性很小。
以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种抗血清膜融合纳米载体，其特征在于，所述抗血清膜融合纳米载体包括抗血清膜融合脂质体外壳和钙沉淀质粒内核；
所述抗血清膜融合脂质体外壳包裹所述钙沉淀质粒内核；
所述抗血清膜融合脂质体外壳包括二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇。
2.根据权利要求1所述的一种抗血清膜融合纳米载体，其特征在于，抗血清膜融合脂质体外壳中，所述二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇的摩尔比为90：5：5。
3.根据权利要求1所述的一种抗血清膜融合纳米载体，其特征在于，所述钙沉淀质粒内核的质粒为EGFP荧光报告质粒，荧光素酶质粒或基因编辑质粒；
所述基因编辑质粒为靶向HBV病毒基因组的CRISPR/Cas9质粒。
4.根据权利要求1所述的一种抗血清膜融合纳米载体，其特征在于，所述钙沉淀为碳酸钙。
5.权利要求1-4任一项所述的一种抗血清膜融合纳米载体的制备方法，其特征在于，制备方法包括步骤：
步骤S1：将可溶性钙盐、可溶性碳酸盐以及质粒溶液混合形成共沉淀，得到钙沉淀质粒内核溶液；
步骤S2：将二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇按照特定的摩尔比例90：5：5溶解在有机溶剂中，挥发有机溶剂后得到抗血清膜融合脂质体薄膜；
步骤S3：将钙沉淀质粒内核溶液与抗血清膜融合脂质体薄膜混合后，将混合物在室温条件下依次通过不同纳米梯度孔径的聚碳酸酯膜；
步骤S4：通过尺寸排除色谱法除去游离的试剂和脂质成分，最终制备得到抗血清膜融合纳米载体；
步骤S3中，每个纳米梯度孔径的聚碳酸酯膜重复步骤20次。
6.根据权利要求5所述的一种抗血清膜融合纳米载体的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述不同纳米梯度孔径的聚碳酸酯膜具体为800nm、600nm、400nm、200nm的聚碳酸酯膜。
7.根据权利要求5所述的一种抗血清膜融合纳米载体的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述可溶性钙盐、可溶性碳酸盐分别选自氯化钙和碳酸钠。
8.根据权利要求5所述的一种抗血清膜融合纳米载体的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述溶解二油酰基卵磷脂、溴化三甲基-2,3－二油酰氧基丙基铵以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇－半乳糖的有机溶剂选自氯仿。
9.权利要求1-4任一项所述的一种抗血清膜融合纳米载体在纳米药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述在纳米药物中的应用具体为在荧光素酶的体内发光标记或抗HBV乙型肝炎的CRISPR/Cas9基因编辑纳米药物中的应用。
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