CN116650634A - 一种免疫佐剂和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种免疫佐剂，取皂树皂苷溶解于TBS缓冲液中，得皂树皂苷溶液，称取羟丙基‑β‑环糊精加入PBS缓冲液，置于恒温磁力搅拌器上搅拌至完全溶解，得羟丙基‑β‑环糊精水溶液，置于超声设备中，将皂树皂苷溶液逐滴加入到羟丙基‑β‑环糊精水溶液中，得混合物体系，即为免疫佐剂，置于4℃保存。本发明免疫佐剂是将递送ISCOMs中用于递送QuilA的磷脂和胆固醇替换为价格低廉的羟丙基‑β‑环糊精。羟丙基‑β‑环糊精与Ouil‑A按摩尔比混合后，形成均质、透明的混合溶液，该混合液具有与ISCOMs相同的免疫佐剂效果，并且显著降低成本，减少制备时间。
Description
技术领域
本发明属于免疫学、医学技术领域，尤其是一种免疫佐剂和应用。
背景技术
免疫佐剂是一种非特异性免疫增强剂，具有增强免疫应答的作用。免疫佐剂作为疫苗中的重要成分之一，市场需求大，有效且成本低的免疫佐剂少。
ISCOMs(免疫刺激复合物)是由抗原、胆固醇、磷脂和皂树皂苷(Quil-A)组成的颗粒性抗原传递系统，ISCOMs已被证明能诱导多种动物(包括非人灵长类和人)对病毒、细菌、寄生虫或肿瘤抗原的强抗原能增强特异性细胞或体液免疫反应。本发明是将羟丙基-β-环糊精作为Quil-A的包载物质，将两种溶液按摩尔比混合后，形成均质、透明的混合液，该混合液具有与ISCOMs相同的免疫佐剂效果。
ISCOMs由胆固醇、磷脂和皂树皂苷组成，于1984年发现与病毒可形成一种有效的颗粒疫苗，是一种十分有效的刺激免疫活性的抗原递送系统，能够有效地刺激机体产生高水平抗体。ISCOMs的配方能够保留Quil-A的佐剂活性，同时增加其稳定性，降低其溶血活性，并产生更少的毒素。与简单的游离抗原和Quil-A混合疫苗相比，能够大大降低有道宿主体内免疫所需的抗原量。许多研究表明，ISCOMs能够在许多动物模型中诱导针对多种抗原的强抗原特异性细胞或体液免疫反应。因此，ISCOMs已被批准用于兽用疫苗，并通过不同层面的优化，进行人用疫苗的临床试验。
疫苗佐剂的关键要素是安全、有效、成本低廉，因此ISCOMs相关的技术优化均围绕提高Ouil-A稳定性、提高机体抗体水平以及降低成本三方面。
目前，主要通过以下方法制得ISCOMs：
1、离心法：首先使用Triton X-100等表面活性剂溶解抗原蛋白质、胆固醇和磷脂，获得胶束溶液，然后将Ouil-A通过蔗糖梯度密度离心融入胶束溶液中，形成ISCOMs。
缺点：使用磷脂和胆固醇作为ISCOMs的成分导致成本昂贵；步骤繁琐，每次制备的ISCOMs量有限，难以量产；纯化后仍有表面活性剂的残留。
2、透析法：脂质成分和Ouil-A首先在表面活性剂系统中溶解，如辛基葡萄糖苷或MEGA 10，随后通过透析去除。
缺点：使用磷脂和胆固醇作为ISCOMs的成分导致成本昂贵；纯化后仍有表面活性剂的残留；透析过程耗时长。
3、脂膜水化法：使用QuilA水溶液与干燥的磷脂/胆固醇薄膜的水合。
缺点：使用磷脂和胆固醇作为ISCOMs的成分导致成本昂贵；获得的非均质样品较多；样品平衡时间长。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种免疫佐剂和应用。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种免疫佐剂，取皂树皂苷溶解于TBS缓冲液中，得皂树皂苷溶液；称取羟丙基-β-环糊精加入PBS缓冲液，置于恒温磁力搅拌器上搅拌至完全溶解，得羟丙基-β-环糊精水溶液，置于超声设备中；按照皂树皂苷：羟丙基-β-环糊精的摩尔比为1:1-1:10的比例，在25-37℃，超声频率30-40KHz，输入功率150-200W的条件下将皂树皂苷溶液缓慢逐滴加入到羟丙基-β-环糊精水溶液中，得混合物体系，即为免疫佐剂，置于4℃保存。
进一步地，所述皂树皂苷：TBS缓冲液的比例g：L为1:1-5:1；所述羟丙基-β-环糊精：PBS缓冲液的比例g：L为3:5-35:1。
进一步地，所述皂树皂苷：羟丙基-β-环糊精的摩尔比为1:1、1:2、1:4、1:8或1:10。
进一步地，所述皂树皂苷：羟丙基-β-环糊精的摩尔比为1:4。
进一步地，所述免疫佐剂较皂树皂苷与抗原免疫后，刺激机体产生的IgG为2倍，IgG1为2倍，IgG2a为1.3倍。
进一步地，所述免疫佐剂是将递送免疫刺激复合物ISCOMs中用于递送QuilA的磷脂和胆固醇替换为价格低廉的羟丙基-β-环糊精，羟丙基-β-环糊精与Ouil-A按摩尔比混合后，形成均质、透明的混合溶液。
进一步地，所述免疫佐剂具有与免疫刺激复合物ISCOMs相同的免疫佐剂效果，并且显著降低成本，减少制备时间。
如上所述的免疫佐剂在疫苗中的应用。
本发明取得的有益效果是：
1、本发明免疫佐剂是将递送ISCOMs中用于递送QuilA的磷脂和胆固醇替换为价格低廉的羟丙基-β-环糊精。羟丙基-β-环糊精与Ouil-A按摩尔比混合后，形成均质、透明的混合溶液，该混合液具有与ISCOMs相同的免疫佐剂效果，并且显著降低成本，减少制备时间。
2、本发明免疫佐剂将羟丙基-β-环糊精作为包载物质，能够降低生产成本，保证与ISCOMs无差别的免疫佐剂效果。
3、本发明免疫佐剂将羟丙基-β-环糊精作为包载物质混合QuilA方法简单，提高生产效率。
附图说明
图1为本发明中羟丙基-β-环糊精+Ouil-A第三次小鼠后血清中针对OVA的特异性IgG水平图；注：与OVA免疫组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001；
图2为本发明中羟丙基-β-环糊精+Ouil-A第三次小鼠后血清中针对OVA的特异性IgG1水平图；注：与OVA免疫组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001；
图3为本发明中羟丙基-β-环糊精+Ouil-A第三次小鼠后血清中针对OVA的特异性IgG2a水平图；注：与OVA免疫组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001；
图4为本发明中羟丙基-β-环糊精+Ouil-A第三次小鼠后脾淋巴细胞中CD4+T细胞的数量图；注：与OVA免疫组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001；
图5为本发明中羟丙基-β-环糊精+Ouil-A第三次小鼠后脾淋巴细胞中CD19+B细胞的数量图；注：与OVA免疫组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001；
图6为本发明中羟丙基-β-环糊精+Ouil-A第三次小鼠后对脾淋巴细胞的增殖作用图；注：与OVA免疫组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。
本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。
一种免疫佐剂，取皂树皂苷溶解于TBS缓冲液中，得皂树皂苷溶液；称取羟丙基-β-环糊精加入PBS缓冲液，置于恒温磁力搅拌器上搅拌至完全溶解，得羟丙基-β-环糊精水溶液，置于超声设备中；按照皂树皂苷：羟丙基-β-环糊精的摩尔比为1:1-1:10的比例，在25-37℃，超声频率30-40KHz，输入功率150-200W的条件下将皂树皂苷溶液缓慢逐滴加入到羟丙基-β-环糊精水溶液中，得混合物体系，即为免疫佐剂，置于4℃保存。
较优地，所述皂树皂苷：TBS缓冲液的比例g：L为1:1-5:1；所述羟丙基-β-环糊精：PBS缓冲液的比例g：L为3:5-35:1。
较优地，所述皂树皂苷：羟丙基-β-环糊精的摩尔比为1:1、1:2、1:4、1:8或1:10。
较优地，所述皂树皂苷：羟丙基-β-环糊精的摩尔比为1:4。
较优地，所述免疫佐剂较皂树皂苷与抗原免疫后，刺激机体产生的IgG为2倍，IgG1为2倍，IgG2a为1.3倍。
较优地，所述免疫佐剂是将递送免疫刺激复合物ISCOMs中用于递送QuilA的磷脂和胆固醇替换为价格低廉的羟丙基-β-环糊精，羟丙基-β-环糊精与Ouil-A按摩尔比混合后，形成均质、透明的混合溶液。
较优地，所述免疫佐剂具有与免疫刺激复合物ISCOMs相同的免疫佐剂效果，并且显著降低成本，减少制备时间。
如上所述的免疫佐剂在疫苗中的应用。
具体地，相关的制备及检测如下：
实施例1
称取1.33g Quil-A，溶解于1L的TBS缓冲液中，得皂树皂苷溶液，取3.99g(2-羟丙基)-β-环糊精，溶解于1L PBS缓冲液中，置于恒温磁力搅拌器上搅拌至完全溶解，得环糊精水溶液，置于超声设备中，在37℃，超声频率30KHz，输入功率200W的条件下将皂树皂苷溶液缓慢逐滴加入到水溶性环糊精水溶液中，得混合物体系，即为免疫佐剂，置于4℃保存。
实施例2
称取1.00g Quil-A，溶解于1L的TBS缓冲液中，得皂树皂苷溶液，取0.698g(2-羟丙基)-β-环糊精，溶解于1L PBS缓冲液中，置于恒温磁力搅拌器上搅拌至完全溶解，得环糊精水溶液，置于超声设备中，在25℃，超声频率35KHz，输入功率200W的条件下将皂树皂苷溶液缓慢逐滴加入到水溶性环糊精水溶液中，得混合物体系，即为免疫佐剂，置于4℃保存。
实施例3
称取5.00g Quil-A，溶解于1L的TBS缓冲液中，得皂树皂苷溶液，取34.9g(2-羟丙基)-β-环糊精，溶解于1L PBS缓冲液中，置于恒温磁力搅拌器上搅拌至完全溶解，得环糊精水溶液，置于超声设备中，在30℃，超声频率40KHz，输入功率150W的条件下将皂树皂苷溶液缓慢逐滴加入到水溶性环糊精水溶液中，得混合物体系，即为免疫佐剂，置于4℃保存。
本发明的相关检测如下：
1、将不同摩尔比例的羟丙基-β-环糊精Quil-A溶液作为佐剂与5μgOVA混合于PBS中，终体积为50μL，在第0天、第21天、第42天通过肌肉注射法免疫小鼠，设置ISCOMs与OVA和OVA单独免疫作为对照，PBS作为阴性对照。与第二次免疫和第三次免疫以后第7天取小鼠血，分离血清，检测血清中针对OVA的特异性抗体水平。
由图1可知，Ouil-A+羟丙基-β-环糊精在摩尔比为1：1至1：10作为免疫佐剂时，均能提高机体产生针对OVA的特异性IgG，摩尔比为1：4时，与阳性对照ISCOMs作为免疫佐剂免疫后产生的OVA特异性IgG水平相当，且明显优于QuilA或羟丙基-β-环糊精与OVA免疫后的IgG水平，较OVA单独免疫后机体产生的OVA特异性IgG水平差异性显著。
由图2可知，Ouil-A+羟丙基-β-环糊精在摩尔比为1：1至1：10作为免疫佐剂时，均能提高机体产生针对OVA的特异性IgG1，摩尔比为1：4时，机体产生的OVA特异性IgG1含量最高，约是阳性对照ISCOMs作为免疫佐剂免疫后产生的OVA特异性IgG1的1.5倍，且明显优于QuilA或羟丙基-β-环糊精与OVA免疫后的IgG1水平，较OVA单独免疫后OVA特异性IgG1水平差异性极显著。
由图3可知，Ouil-A+羟丙基-β-环糊精在摩尔比为1：1至1：10作为免疫佐剂时，均能提高机体产生针对OVA的特异性IgG2a，摩尔比为1:4时，机体产生的OVA特异性IgG2a含量最高，约是阳性对照ISCOMs作为免疫佐剂免疫后产生的OVA特异性IgG2a的1.33倍，且与QuilA与OVA免疫后的IgG水平相当，优于羟丙基-β-环糊精与OVA免疫后的IgG水平，较单独免疫后OVA特异性IgG2a水平差异性显著。
以上针对机体产生抗体水平的分析显示，Ouil-A+羟丙基-β-环糊精在摩尔比为1：4时作为免疫佐剂，具有与ISCOMs相当或者更优的免疫佐剂活性，且两者在合适的摩尔比例作为免疫佐剂具有协同作用，较单个成分具有更优的免疫佐剂活性。
由图4和图5可知，Ouil-A+羟丙基-β-环糊精在摩尔比为1：1至1：10作为免疫佐剂时，与OVA单独免疫后刺激机体产生的CD4+T细胞数量和CD19+B细胞差异性不显著，说明羟丙基-β-环糊精没有额外的抗原性；且羟丙基-β-环糊精作与OVA共同免疫后的细胞变化与OVA单独免疫后没有差异性，说明，羟丙基-β-环糊精没有额外的佐剂活性。
由图6可知，Ouil-A+羟丙基-β-环糊精在摩尔比除1：4以外作为免疫佐剂时，与OVA单独免疫后刺激脾细胞增殖数量差异性不显著；在摩尔比为1：4时较对照组具有显著差异，说明Ouil-A+羟丙基-β-环糊精在摩尔比除1：4时能够更好地促进淋巴细胞增殖。
综上所述，羟丙基-β-环糊精与Ouil-A共同作为疫苗佐剂，能够有效保证Ouil-A的佐剂活性，较单个组分作为免疫佐剂能够刺激机体产生更高水平的抗体。动物实验表明，Ouil-A：羟丙基-β-环糊精在摩尔比为1：4时作为免疫佐剂较QuilA与抗原免疫后，刺激机体产生的IgG约为2倍，IgG1约为2倍，IgG2a约为1.3倍，且羟丙基-β-环糊精本身没有抗原性及佐剂活性，无论在抗体水平或细胞水平上，均与抗原单独免疫后结果接近，说明羟丙基-β-环糊精与Ouil-A共同作为疫苗佐剂较其单个成分具有协同作用，尤其在Ouil-A：羟丙基-β-环糊精在摩尔比为1：4时，其免疫佐剂的协同作用最为明显。
2、成本核算:
以发明中所使用的原料进行成本核算，其中磷脂、胆固醇、(2-羟丙基)-β-环糊精均来自同一品牌，原料价格如下：
| 原料 | 单价(元)/mg |
| Quil-A | 1.1 |
| 磷脂 | 3.401 |
| 胆固醇 | 0.61631 |
| (2-羟丙基)-β-环糊精 | 0.369962 |
ISCOMs成本/ml＝1.33*1.1元+0.84*3.401元+0.2565*0.61631元＝4.477923元。
HP-β-CD+QuilA成本/ml＝1.33*1.1元+4*0.369962元＝2.942848元。
HP-β-CD+QuilA的成本下降35％。
由此可以看出，本发明免疫佐剂能够显著降低成本。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
Claims (8)
1.一种免疫佐剂，其特征在于：取皂树皂苷溶解于TBS缓冲液中，得皂树皂苷溶液；称取羟丙基-β-环糊精加入PBS缓冲液，置于恒温磁力搅拌器上搅拌至完全溶解，得羟丙基-β-环糊精水溶液，置于超声设备中；按照皂树皂苷：羟丙基-β-环糊精的摩尔比为1:1-1:10的比例，在25-37℃，超声频率30-40KHz，输入功率150-200W的条件下将皂树皂苷溶液逐滴加入到羟丙基-β-环糊精水溶液中，得混合物体系，即为免疫佐剂，置于4℃保存。
2.根据权利要求1所述的免疫佐剂，其特征在于：所述皂树皂苷：TBS缓冲液的比例g：L为1:1-5:1；所述羟丙基-β-环糊精：PBS缓冲液的比例g：L为3:5-35:1。
3.根据权利要求1所述的免疫佐剂，其特征在于：所述皂树皂苷：羟丙基-β-环糊精的摩尔比为1:1、1:2、1:4、1:8或1:10。
4.根据权利要求1所述的免疫佐剂，其特征在于：所述皂树皂苷：羟丙基-β-环糊精的摩尔比为1:4。
5.根据权利要求4所述的免疫佐剂，其特征在于：所述免疫佐剂较皂树皂苷与抗原免疫后，刺激机体产生的IgG为2倍，IgG1为2倍，IgG2a为1.3倍。
6.根据权利要求1所述的免疫佐剂，其特征在于：所述免疫佐剂是将递送免疫刺激复合物ISCOMs中用于递送QuilA的磷脂和胆固醇替换为价格低廉的羟丙基-β-环糊精，羟丙基-β-环糊精与Ouil-A按摩尔比混合后，形成均质、透明的混合溶液。
7.根据权利要求1至6任一项所述的免疫佐剂，其特征在于：所述免疫佐剂具有与免疫刺激复合物ISCOM相同的免疫佐剂效果，并且显著降低成本，减少制备时间。
8.如权利要求1至7任一项所述的免疫佐剂在疫苗中的应用。
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