CN116643038A - 一种用于评价covid-19疫苗免疫状态标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于评价COVID‑19疫苗免疫状态标志物及其应用。所述标志物包括SARS‑CoV‑2病毒的M1肽、N16肽、N24肽、S15肽、S39肽、S44肽、S64肽、S82肽、S95肽、S104肽或S115肽中任意一种或至少两种的组合。本发明准确地识别了无症状患者和有症状患者之间肽特异性抗体应答的差异，通过聚类热图确定了接种疫苗者和感染者之间对M1、N24、S15、S64、S82、S104和S115等肽的应答差异，可有效区分感染患者与接种人群、无症状患者与有症状患者，为COVID‑19治疗和肽疫苗的开发提供参考。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于评价COVID-19疫苗免疫状态标志物及其应用。
背景技术
新型冠状病毒感染(COVID-19)是由SARS-CoV-2引起的一种新型呼吸道传染病。SARS-CoV-2是一种RNA病毒，单链正链不稳定，容易突变，出现了一系列新型冠状病毒变种，如Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)变种。随着SARS-CoV-2的变异引起了广泛关注，了解对SARS-CoV-2蛋白免疫的特异性对于理解抗体反应蛋白在人类中的变化以及对自然获得性和疫苗诱导免疫的影响越来越重要。
传统的抗体检测方法包括血清学检测和间接免疫荧光检测。近年来，蛋白质微阵列的使用有所增加，这种方法将小分子，如多肽和蛋白质固定在微制造的表面上，以进行高通量筛选研究。利用蛋白质芯片技术，根据与某种蛋白质的不同成分的亲和力特征，筛选某种抗原的未知抗体。这种新型冠状病毒快速蛋白质组芯片具有准确性高、样品消耗少、操作简单、快速等特点，是新型冠状病毒感染的有效诊断工具。
在过去十年中，由严重急性呼吸系统综合征(SARS)、埃博拉和冠状病毒变体引起的疫情不断增加，这也凸显了快速疾病诊断和疫苗开发的重要性。因此，鉴别用于诊断措施的生物标记物和开发疫苗的抗原靶点变得越来越重要。肽微阵列可以显示大量假定的目标蛋白，这些蛋白被快速翻译成重叠的线性(和循环)多肽，用于多路高通量抗体分析。
综上所述，鉴别和评价COVID-19疫苗免疫状态，对于疫苗的研制非常重要。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于评价COVID-19疫苗免疫状态标志物及其应用，本发明鉴定抗体-结合区肽表位，采用SARS-CoV-2特异性抗体谱有效分析、评价COVID-19疫苗免疫状态，具有广阔的应用前景，如区分COVID-19患者与接种疫苗和无症状的个体、评价疫苗效果等等。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于评价COVID-19疫苗免疫状态标志物，所述标志物包括SARS-CoV-2病毒的M1肽、N16肽、N24肽、S15肽、S39肽、S44肽、S64肽、S82肽、S95肽、S104肽或S115肽中任意一种或至少两种的组合。
本发明通过聚类热图确定了接种疫苗者和感染者之间对M1、N24、S15、S64、S82、S104和S115等肽的应答差异。接受者工作特征曲线分析表明，S15、S64和S104联合诊断可将感染患者与接种人群区分开来。无症状患者对S15、S64和S104肽的特异性抗体应答强于有症状患者，而对M1、N24、S82和S115肽的特异性抗体应答弱于有症状患者。此外，两个多肽(N24和S115)与中和抗体水平相关。
本发明中，使用S64、S15和S104三个标记对接种疫苗后的患者和感染患者进行ROC分析，发现S64、S15和S104在区分患者和疫苗接种者方面具有良好的敏感性和特异性，联合诊断的敏感性和特异性分别为91.3％和99.2％，对AP高表达的S64、S15和S104和低表达的M1、N24、S82和S115进行ROC分析。S64、S15和S104对AP与症状患者的区分敏感性分别为94.1％、86.3％和96.1％。M1、N24、S82和S115的特异性分别为94.1％、92.2％、86.3％和98％，而联合诊断的预测敏感性和特异性分别为94.1％和85.3％，表明可作为区分AP与有症状患者的生物标志物。
S15：LGVYYHKNNKSWMESEFRVY。
S39：GVSPTKLNDLCFTNVYADSF。
S44：GCVIAWNSNNLDSKVGGNYN。
S64：PTWRVYSTGSNVFQTRAGCL。
S82：KPSKRSFIEDLLFNKVTLAD。
S95：TASALGKLQDVVNQNAQALN。
S104：ECVLGQSKRVDFCGKGYHLM。
S115：LQPELDSFKEELDKYFKNHT。
M1：MADSNGTITVEELKKLLEQW。
N16：PANNAAIVLQLPQGTTLPKG。
N24：ESKMSGKGQQQQGQTVTKKS。
第二方面，本发明提供第一方面所述的用于评价COVID-19疫苗免疫状态标志物在制备评价COVID-19疫苗免疫状态的产品中的应用。
第三方面，本发明提供一种评价COVID-19疫苗免疫状态的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于评价COVID-19疫苗免疫状态标志物。
优选地，所述试剂盒还包括肽芯片。
优选地，所述用于评价COVID-19疫苗免疫状态标志物连接于所述肽芯片上。
第四方面，本发明提供第一方面所述的用于评价COVID-19疫苗免疫状态标志物在以非疾病诊断为目的的评价COVID-19疫苗免疫状态中的应用。
本发明中，通过筛选SARS-COV-2抗原的抗体结合活性，可探索现有的潜在表位和感染机制的特征，为COVID-19治疗和肽疫苗的开发提供参考。
第五方面，本发明提供一种以非疾病诊断为目的的评价COVID-19疫苗免疫状态的方法，所述方法包括：
以第一方面所述的用于评价COVID-19疫苗免疫状态标志物为探针，检测受试者的样本中抗体水平，分析受试者对所述标志物的特异性抗体应答水平。
优选地，所述样本包括血清、血浆、鼻拭子或咽拭子中任意一种。
优选地，所述标志物包括N24肽和S115肽。
第六方面，本发明提供一种评价COVID-19疫苗免疫状态的装置，所述装置包括检测单元和分析单元；
所述检测单元用于执行包括：
以第一方面所述的用于评价COVID-19疫苗免疫状态标志物为探针，检测受试者的样本中抗体水平；
所述分析单元用于执行包括：
分析受试者对所述标志物的特异性抗体应答水平。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明准确地识别了无症状患者和有症状患者之间肽特异性抗体应答的差异，通过聚类热图确定了接种疫苗者和感染者之间对M1、N24、S15、S64、S82、S104和S115等肽的应答差异，接受者工作特征曲线分析表明，S15、S64和S104联合诊断可将感染患者与接种人群区分开来。无症状患者对S15、S64和S104肽的特异性抗体应答强于有症状患者，而对M1、N24、S82和S115肽的特异性抗体应答弱于有症状患者。此外，两个多肽(N24和S115)与中和抗体水平相关。
附图说明
图1为患者随访时间点图；
图2为低免疫反应和高免疫反应接种的肽特异性反应的热图；
图3A为感染者和接种者之间肽特异性反应的分布热图；
图3B为健康人群、接种疫苗者和病人对S15特定肽的特殊反应图；
图3C为健康人群、接种疫苗者和病人对S64特定肽的特殊反应图；
图3D为健康人群、接种疫苗者和病人对S104特定肽的特殊反应图；
图4A为感染者和健康人之间肽特异性反应的热图；
图4B为无症状、轻度和重度患者对S15特定肽的特异性IgG反应图；
图4C为无症状、轻度和重度患者对S64特定肽的特异性IgG反应图；
图4D为无症状、轻度和重度患者对S104特定肽的特异性IgG反应图；
图5A为肽和感染者的中和抗体之间的相关性分析图；
图5B为疫苗接种后不同时间段的肽特异性IgG反应图，选择与PRNT50相关系数最高的四种肽(M1、N24，S82，S115)；
图6A为感染者与接种者的ROC曲线图，不同短肽S15、S64和S104曲线显示使用预测模型的预测结果；
图6B为使用不同单肽的ROC曲线为无症状患者和高免疫反应的预测结果图；
图6C为使用不同单肽的ROC曲线为无症状患者患者和低免疫反应的预测结果图；
图6D为使用预测模型预测的无症状和有症状患者的ROC曲线图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
本发明具体实施例中研究方法如下。
1.研究对象资料：
接受三剂灭活COVID-19疫苗BBIBP-CorV的健康成年志愿者(n＝44)在免疫前(第一剂，即健康受试者V1)、第一剂注射后一个月(V2+30)、第二剂注射后一个月(V1+30)和强化注射后一个月(V3+30)随机抽取随访。在44名志愿者中，22名出现了低免疫反应，这表明在第二次注射后的1个月没有产生有效的中和抗体，定义为NAb≤61.77AU/mL或VNT<8，其余22名志愿者出现了高免疫反应(VNT≥16)。本研究是按照赫尔辛基宣言的伦理原则进行的。本研究由广州医科大学第一附属医院医学伦理委员会批准(伦理批准号:gyfy-2021-31)和广州市第八人民医院(202002135)。获得所有参与者的书面知情同意。
2.样品采集与制备
受试者禁食一夜后，用10mlEDTA和5ml血清凝胶管中从肘前静脉采集外周血样本。血浆和血清分别于4℃、3000RPM离心10min。所有样品均置于0.5mL管中，并在-80℃保存，直到进一步处理。血浆用于活病毒中和试验，血清用于抗体和肽芯片检测。
3.基于RT-PCR的检测和SARS-CoV-2感染的检测
主要从鼻咽组织标本中提取核酸，根据商用病毒RNA提取试剂盒(中山大学达安基因有限公司)说明书进行RNA提取。针对SARS-CoV-2开放阅读框架1ab(ORFlab)和核衣壳(N)基因区的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测试剂盒购自广州大安基因有限公司。
4.多肽段
对SARS-CoV-2菌株(MN908947)的氨基酸序列进行分析，用GenScript(江苏，中国)化学合成了20-mer肽段，其中10个aa残基重叠，部分覆盖了SARS-CoV-2:刺突(S)、包膜(E)、膜(M)和N的4个结构蛋白，共合成131个肽段。其中，肽芯片的每孔均为4×4的矩形微阵列，在4个角上有3个人IgG阳性对照和1个阴性对照；中心纳入的探针分别为M1肽、N16肽、N24肽、S15肽、S39肽、S44肽、S64肽、S82肽、S95肽、S104肽和S115肽(序列如表1所示)。
表1
5.微阵列法检测血清中肽结合抗体
筛选过程与前面的描述基本相同，但进行了轻微的修改，血清筛选遵循间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)的原则。
首先，使用含有1％牛血清白蛋白、1％酪蛋白、0.5％蔗糖、0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.5％吐温20的0.01M磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)制备稀释的血清(100倍)。然后在每个微阵列孔中加入100μL稀释的血清样品，并在摇床(500rpm，37℃)上与肽微阵列孵育30分钟。用血清稀释缓冲液孵育的微阵列孔作为阴性对照。然后，用0.01M PBS-Tween(PBST，pH7.4)清洗芯片三次，再用100μL辣根过氧化物酶(HRP)结合的抗人IgG(ZSGB-BIO，中国北京)在摇床(500rpm，37℃)上培养30分钟。之后，用PBST洗去任何未结合的HRP结合的抗人IgG，并使用100μL的1-step Ultra TMB-Blotting Solution(Thermo Scientific)，用微阵列成像仪(中国苏州Epitope)检测IgG对肽探针的信号。最后，用UVC仪器V1.0软件(版本Epitope公司，中国苏州)处理数据。每个点的信号是通过从读出信号中减去背景信号进行计算。信号点＝读出信号-信号背景。每个探针的截止值被设定为10。
6.焦点缩小中和试验(FRNT)
FRNT是在一个经过认证的生物安全实验室进行活病毒中和试验。
7.受试者数据
图1为所有患者的回访时间点，横坐标为患者的登记号，纵坐标为发病日期。AP，无症状患者；MP，轻度患者；SP，重症患者。
健康志愿者(n＝44)被随机纳入研究，他们全部完成了三次BBIBP-CorV疫苗接种，并在每一次接种后随访约一个月(如表2所示)。在这些患者中，22例出现高免疫应答，22例出现低免疫应答，平均年龄分别为36.14±9.14岁和41.32±5.96岁。
表2
实施例1
本实施例进行高免疫应答和低免疫应答之间的肽特异性应答差异分析。
首先用聚类热图分析了22个高免疫反应和22个低免疫反应测试者中的肽特异性抗体反应的分布(图2)，患者分为低免疫和超免疫两组。对于第1组，浅至暗(紫色)代表免疫前、第一次注射后30天、第二次注射后30天、第三次注射后30天的时间点，结果表明这11个肽的分布在两组之间是一致的，无统计学差异(p≤0.05)，因此，推测健康人接种灭活疫苗后产生相似的特异性抗体反应谱，在进一步的研究中，将这两组患者合并，进行后续分析。
实施例2
本实施例分析疫苗接种者和感染者之间肽特异性反应的差异。
44名疫苗接种者(V1,V1+30,V2+30和V3+30)和61名患者(AP,MP和SP)的肽特异性反应分布在聚类热图如图3A所示。所有接种人群对抗原表位的特异性IgG应答明显弱于所有类型的患者进一步分析显示，在健康人、感染者和疫苗接种者中，S64、S15和S104肽特异性IgG应答的分布有统计学差异(如图3B-图3D所示，*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001)。
实施例3
本实施例分析AP、MP和SP之间肽特异性反应的差异。
肽特异性反应不仅在接种疫苗者和患者之间不同，而且在不同疾病等级的患者之间也有很大差异。本实施例纳入18例AP患者、33例MP患者和10例SP患者，并对不同患者类型的结果进行聚类分析。如图4A所示，AP中S64、S15和S104肽的比活性显著高于MP和SP(p≤0.001)，但MP和SP之间无统计学差异(图4B-图4D)。同时，还发现M1、N24、S82和S115在AP中的表达显著低于MP和SP(P≤0.05)，而MP和SP之间无显著差异，健康，免疫接种前；AP，无症状患者；MP，轻度患者；SP，重症患者。*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.001；****p≤0.0001。
实施例4
本实施例分析SARS-CoV-2肽与对病毒的中和活性的相关性。
通过筛选SARS-COV-2抗原的抗体结合活性，可探索现有的潜在表位和感染机制的特征，为COVID-19治疗和肽疫苗的开发提供参考。因此，用斯皮尔曼(Spearman)相关性分析了感染过程中SARS-COV-2肽特异性IgG反应与PRNT50之间的相关性。根据相关热图，M1、N24、S82和S115的肽特异性IgG与PRNT50的相关性分别为0.55、0.58、0.58和0.73(p≤0.05，图5A)，多元线性187回归分析显示F＝47.758，p≤0.001，R＝0.649。模型中N24和S115肽对PRNT50结果的影响有统计学意义(p≤0.05)。
接种疫苗者的抗体水平通常在接种后一个月达到峰值；因此，在第一、第二和第三次注射后一个月，抗体水平增加了。进一步分析了这四种肽在接种疫苗后的变化趋势，发现N24和S115与抗体水平的变化趋势最一致(图5B)，即N24和S115与中和抗体水平相关。
实施例5
本实施例鉴定可以区分受感染者和接种者的多肽组合。
在症状出现的1-2周内，病毒载量可达到无法检测的水平，诊断AP是疫情控制的关键。抗原检测目前受敏感性和特异性的困扰；因此，识别疫苗接种者、AP和有症状患者(MP和SP)之间肽特异性IgG抗体应答的差异对疾病的发现、诊断和治疗至关重要。基于以上讨论和分析，本实施例使用S64、S15和S104三个标记对接种疫苗后的患者和感染患者进行ROC分析，结果如图6A所示，发现S64、S15和S104在区分患者和疫苗接种者方面具有良好的敏感性和特异性，联合诊断的敏感性和特异性分别为91.3％和99.2％(表3)。
表3
相比之下，为了区分AP与有症状患者，对AP高表达的S64、S15和S104和低表达的M1、N24、S82和S115进行ROC分析(图6C)。S64、S15和S104对AP与症状患者的区分敏感性分别为94.1％、86.3％和96.1％。M1、N24、S82和S115的特异性分别为94.1％、92.2％、86.3％和98％(表4)，而联合诊断的预测敏感性和特异性分别为94.1％和85.3％(图6D和表4)，表明可作为区分AP与有症状患者的生物标志物。
表4
综上所述，本发明使用含有11个肽的SARS-CoV-2肽微阵列来鉴定肽表位。将44名接种BBIBP-CorV灭活病毒疫苗的志愿者与61名感染SARS-CoV-2的患者进行了区分，并准确地识别了无症状患者和有症状患者之间肽特异性抗体应答的差异。通过聚类热图确定了接种疫苗者和感染者之间对M1、N24、S15、S64、S82、S104和S115等肽的应答差异。接受者工作特征曲线分析表明，S15、S64和S104联合诊断可将感染患者与接种人群区分开来。无症状患者对S15、S64和S104肽的特异性抗体应答强于有症状患者，而对M1、N24、S82和S115肽的特异性抗体应答弱于有症状患者。此外，两个多肽(N24和S115)与中和抗体水平相关。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种用于评价COVID-19疫苗免疫状态标志物，其特征在于，所述标志物包括SARS-CoV-2病毒的M1肽、N16肽、N24肽、S15肽、S39肽、S44肽、S64肽、S82肽、S95肽、S104肽或S115肽中任意一种或至少两种的组合。
2.权利要求1所述的用于评价COVID-19疫苗免疫状态标志物在制备评价COVID-19疫苗免疫状态的产品中的应用。
3.一种评价COVID-19疫苗免疫状态的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于评价COVID-19疫苗免疫状态标志物。
4.根据权利要求3所述的评价COVID-19疫苗免疫状态的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括肽芯片。
5.根据权利要求4所述的评价COVID-19疫苗免疫状态的试剂盒，其特征在于，所述用于评价COVID-19疫苗免疫状态标志物连接于所述肽芯片上。
6.权利要求1所述的用于评价COVID-19疫苗免疫状态标志物在以非疾病诊断为目的的评价COVID-19疫苗免疫状态中的应用。
7.一种以非疾病诊断为目的的评价COVID-19疫苗免疫状态的方法，其特征在于，所述方法包括：
以权利要求1所述的用于评价COVID-19疫苗免疫状态标志物为探针，检测受试者的样本中抗体水平，分析受试者对所述标志物的特异性抗体应答水平。
8.根据权利要求7所述的以非疾病诊断为目的的评价COVID-19疫苗免疫状态的方法，其特征在于，所述样本包括血清、血浆、鼻拭子或咽拭子中任意一种。
9.根据权利要求7所述的以非疾病诊断为目的的评价COVID-19疫苗免疫状态的方法，其特征在于，所述标志物包括N24肽和S115肽。
10.一种评价COVID-19疫苗免疫状态的装置，其特征在于，所述装置包括检测单元和分析单元；
所述检测单元用于执行包括：
以权利要求1所述的用于评价COVID-19疫苗免疫状态标志物为探针，检测受试者的样本中抗体水平；
所述分析单元用于执行包括：
分析受试者对所述标志物的特异性抗体应答水平。
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