CN116642968A - 一种羟苯磺酸钙杂质的hplc-ms/ms方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种羟苯磺酸钙杂质的HPLC‑MS/MS检测方法，所述方法包括：(1)取供试品羟苯磺酸钙，制备供试品溶液；(2)取对照品2,5‑二羟基苯磺酸甲酯、2,5‑二羟基苯磺酸乙酯和/或2,5‑二羟基苯磺酸异丙酯，制备对照品溶液；(3)利用HPLC‑MS/MS测定所述供试品溶液和对照品溶液，根据检测图谱判断所述羟苯磺酸钙是否含有杂质2,5‑二羟基苯磺酸甲酯、2,5‑二羟基苯磺酸乙酯和/或2,5‑二羟基苯磺酸异丙酯或定量所述杂质的含量。本发明所述方法能够快速、准确地定性或定量检测羟苯磺酸钙中的羟苯磺酸酯类杂质，具有准确性和特异性好、精密度高、重复性好和灵敏度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体而言，涉及一种羟苯磺酸钙杂质的HPLC-MS/MS方法。
背景技术
羟苯磺酸钙生产过程中有生成羟苯磺酸酯类杂质的风险，该类杂质含基因毒性杂质警示结构，经Q(SAR)评估为3类杂质，故应在药品中严格控制其残留量。现行羟苯磺酸钙有关物质分析方法包括中国药典2020年版、EP11.0和BP2023，都采用HPLC-UV法测定，质量标准中均未对羟苯磺酸酯类杂质单独控制，且检测方法灵敏度不够，从而使该产品存在安全隐患，不利于安全用药，也不利于企业产品质量控制。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种羟苯磺酸钙杂质的HPLC-MS/MS检测方法，所述方法能够快速、准确地定性或定量检测羟苯磺酸钙中的羟苯磺酸酯类杂质，具有准确性和特异性好、精密度高、重复性好和灵敏度高等优点。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种羟苯磺酸钙杂质的HPLC-MS/MS检测方法，所述方法包括：
(1)取供试品羟苯磺酸钙，制备供试品溶液；
(2)取对照品2,5-二羟基苯磺酸甲酯、2,5-二羟基苯磺酸乙酯和/或2,5-二羟基苯磺酸异丙酯，制备对照品溶液；
(3)利用HPLC-MS/MS测定所述供试品溶液和对照品溶液，根据检测图谱判断所述羟苯磺酸钙是否含有杂质2,5-二羟基苯磺酸甲酯、2,5-二羟基苯磺酸乙酯和/或2,5-二羟基苯磺酸异丙酯或定量所述杂质的含量。
在一些具体的实施方式中，所述HPLC的条件包括：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3；
流动相：流动相A：水或5mM乙酸铵水溶液；流动相B：甲醇或乙腈；
洗脱方式：梯度洗脱；
流速：0.1～0.5ml/min；
柱温：30～40℃；
进样量：1～3μl。。
在一些具体的实施方式中，所述HPLC的条件包括：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3，100mm×2.1mm，1.8μm；
流动相：流动相A：水；流动相B：甲醇；
洗脱方式：梯度洗脱；
流速：0.25ml/min；
柱温：35℃；
进样量：2μl。
在一些具体的实施方式中，所述色谱柱的尺寸为100mm×2.1mm，1.8μm。
在一些具体的实施方式中，所述梯度洗脱包括：
(1)第0～2分钟，流动相A体积分数为95％，流动相B体积分数为5％；
(2)第2～5分钟，流动相A体积分数由95％降至20％，流动相B体积分数由5％升至80％；
(3)第5～7分钟，流动相A体积分数为20％，流动相B体积分数为80％；
(4)第7～7.1分钟，流动相A体积分数由20％升至95％，流动相B体积分数由80％降至5％；
(5)第7.1～10分钟，流动相A体积分数为95％，流动相B体积分数为5％。
在一些具体的实施方式中，所述MS的条件包括：离子源：电喷雾电离源；负离子模式；喷雾电压：-2～-3kv；离子源温度：100～200℃，脱溶剂温度：400～500℃；脱溶剂气流速：850～950L·h-1；扫描方式：多反应监测模式。
在一些具体的实施方式中，所述MS的条件包括：离子源：电喷雾电离源；负离子模式；喷雾电压：-2.5kv；离子源温度：150℃，脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气流速：900L·h-1；扫描方式：多反应监测模式。
在一些具体的实施方式中，所述MS的条件包括：
所述2,5-二羟基苯磺酸甲酯的母离子为203.0m/z，子离子为95.0m/z和188.0m/z；
所述2,5-二羟基苯磺酸乙酯的母离子为217.0m/z，子离子为79.8m/z和189.0m/z；
所述2,5-二羟基苯磺酸异丙酯的母离子为231.0m/z，子离子为80.0m/z和188.0m/z。
在一些具体的实施方式中，所述杂质的监测离子对、锥孔电压和/或碰撞能如表2所示。
在一些具体的实施方式中，所述供试品溶液和对照品溶液的溶剂为甲醇-水，甲醇和水的体积比为(90～100)：5。
在一些具体的实施方式中，所述供试品溶液和对照品溶液的溶剂为甲醇-水，甲醇和水的体积比为95：5。
本发明所述方法的有益效果：本发明所述方法对羟苯磺酸钙中潜在基因毒性杂质羟苯磺酸酯类化合物残留水平进行质控，建立了定性定量分析方法，并进行了方法学验证，完善了羟苯磺酸钙中基因毒性杂质的控制策略，提高了该药品质量标准并降低其用药安全风险。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1～图2为对照品溶液图谱(杂质D/D-1,5.556min)，峰标识中“D”表示“定量离子对”，D-1表示“定性离子对”；
图3～图4为对照品溶液图谱(杂质E/E-1,5.980min)，峰标识中“E”表示“定量离子对”，E-1表示“定性离子对”；
图5～图6为对照品溶液图谱(杂质F/F-1,5.839min)，峰标识中“F”表示“定量离子对”，F-1表示“定性离子对”；
图7～图8为灵敏度溶液图谱(杂质D/D-1)，峰标识中“D”表示“定量离子对”，D-1表示“定性离子对”；
图9～图10为灵敏度溶液图谱(杂质E/E-1)，峰标识中“E”表示“定量离子对”，E-1表示“定性离子对”；
图11～图12为灵敏度溶液图谱(杂质F/F-1)，峰标识中“F”表示“定量离子对”，F-1表示“定性离子对”；
图13～图18为空白溶剂图谱；
图19～图24为供试品溶液图谱；
图25为杂质D的标准曲线；
图26为杂质E的标准曲线；
图27为杂质F的标准曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1HPLC-MS/MS检测羟苯磺酸酯类杂质
1.溶液的制备(避光操作)
1.1供试品溶液：取本品，精密称取适量，加甲醇-水(95：5)溶解并稀释制成每1ml中约含羟苯磺酸钙10mg的溶液，摇匀滤过。
1.2对照品溶液：精密称取2,5-二羟基苯磺酸甲酯、2,5-二羟基苯磺酸乙酯和2,5-二羟基苯磺酸异丙酯工作对照品各适量，用甲醇-水(95：5)定量稀释制成每1ml中各约含10ng的混合溶液。
1.3空白溶液：取甲醇-水(95：5)适量。
1.4灵敏度溶液：精密量取对照品溶液适量，用甲醇稀释制成每1ml中约含1ng的溶液。
2.HPLC-MS/MS的检测条件
2.1色谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100mm×2.1mm，1.8μm)。
流动相：流动相A为水，流动相B为甲醇。另外，经验证，流动相A还可以为5mM乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈。与流动相水-甲醇的差异在于保留时间和响应信号强度有所不同。
洗脱：参照表1进行线性洗脱。
表1色谱的洗脱条件
| 时间(time) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 95 | 5 |
| 2 | 95 | 5 |
| 5 | 20 | 80 |
| 7 | 20 | 80 |
| 7.1 | 95 | 5 |
| 10 | 95 | 5 |
流速：0.25ml/min。
柱温：35℃。
进样量：2μl。
2.2质谱条件
离子源：电喷雾电离源(ESI)；负离子模式；喷雾电压：-2.5kv；离子源温度：150℃，脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气流速：900L·h-1；扫描方式：多反应监测模式(MRM)，监测离子对及相关参数如表2所示。
表2杂质的监测离子对及相关参数
注：“*”为定量离子
实施例2方法学验证HPLC-MS/MS检测方法
1.系统适用性考察
取对照品溶液和灵敏度溶液，按照实施例1所述HPLC-MS/MS方法进行检测。对照品溶液连续进样6次，各主峰峰面积RSD均小于10％，具体检测图谱详见图1～图6。灵敏度溶液中各主峰信噪比(S/N)均大于10，具体检测图谱详见图7～图12。
2.专属性试验
空白溶液和供试品溶液，按照实施例1所述HPLC-MS/MS方法进行检测。空白溶液图谱参见图13～18，供试品溶液图谱参见图19～24。根据图谱所示结果可知，空白溶液对测定无干扰，主成分羟苯磺酸钙对测定无干扰。
3.线性关系考察
取2,5-二羟基苯磺酸甲酯、2,5-二羟基苯磺酸乙酯和2,5-二羟基苯磺酸异丙酯工作对照品各适量，用甲醇溶解制成每1ml中分别约含1.0、2.5、5.0、8.0、10.0、15.0、20.0ng的溶液，按照实施例1所述HPLC-MS/MS方法进行检测，以浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标进行线性回归，杂质D、E、F回归方程分别为：
A＝8.66×103C+2.44×103(r＝0.9988)，参见图25；
A＝1.04×104C+4.17×102(r＝0.9993)，参见图26；
A＝4.42×103C-2.99×101(r＝0.9991)，参见图27。
4.精密度考察
取对照品溶液连续进样6针，按照实施例1所述HPLC-MS/MS方法进行检测，杂质D、E、F峰面积的RSD分为3.2％、5.7％、4.6％。
5.加样回收率试验
按实施例1所述HPLC-MS/MS方法进行加样回收率试验：杂质D平均回收率(n＝9)为98.9％，RSD＝5.6％，详见表3；杂质E平均回收率(n＝9)为102.8％，RSD＝6.3％，详见表4；杂质F平均回收率(n＝9)为106.6％，RSD＝4.6％，详见表5。
表3杂质D(2,5-二羟基苯磺酸甲酯)回收率汇总表
表4杂质E(2,5-二羟基苯磺酸乙酯)回收率汇总表
表5杂质F(2,5-二羟基苯磺酸异丙酯)回收率汇总表
6.检出限与定量限考察
考察实施例1所述HPLC-MS/MS检测方法的检测限：杂质D、E、F的检出限分别为0.02ppm、0.01ppm和0.03ppm；定量限分别为0.07ppm、0.03ppm和0.1ppm。
7.溶液的稳定性
取供试品溶液和对照品溶液，进行溶液的稳定性考察：在2～8℃避光保存条件下，供试品溶液24小时内均未检出杂质D、E、F；对照品溶液在8小时内稳定，详见表6。检测方法详见实施例1。
表6对照品溶液中杂质D、E、F稳定性汇总表
| 进样时间 | 杂质I峰面积 | 杂质II峰面积 | 杂质Ⅲ峰面积 |
| 0hr | 102111 | 116424 | 48896 |
| 2hr | 99094 | 108975 | 44872 |
| 4hr | 98621 | 115315 | 44643 |
| 8hr | 98471 | 106224 | 47041 |
测试例
按实施例1所述方法，对某制药生产企业的3批羟苯磺酸钙进行了羟苯磺酸酯类杂质检查，结果均未检出杂质D、E、F。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种羟苯磺酸钙杂质的HPLC-MS/MS检测方法，其特征在于，包括：
(1)取供试品羟苯磺酸钙，制备供试品溶液；
(2)取对照品2,5-二羟基苯磺酸甲酯、2,5-二羟基苯磺酸乙酯和/或2,5-二羟基苯磺酸异丙酯，制备对照品溶液；
(3)利用HPLC-MS/MS测定所述供试品溶液和对照品溶液，根据检测图谱判断所述羟苯磺酸钙是否含有杂质2,5-二羟基苯磺酸甲酯、2,5-二羟基苯磺酸乙酯和/或2,5-二羟基苯磺酸异丙酯，或定量所述杂质的含量。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述HPLC的条件包括：
色谱柱：WatersACQUITYUPLCHSST3；
流动相：流动相A：水或5mM乙酸铵水溶液；流动相B：甲醇或乙腈；
洗脱方式：梯度洗脱；
流速：0.1～0.5ml/min；
柱温：30～40℃；
进样量：1～3μl。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述HPLC的条件包括：
色谱柱：WatersACQUITYUPLCHSST3；
流动相：流动相A：水；流动相B：甲醇；
洗脱方式：梯度洗脱；
流速：0.25ml/min；
柱温：35℃；
进样量：2μl。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述色谱柱的尺寸为100mm×2.1mm，1.8μm。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱包括：
(1)第0～2分钟，流动相A体积分数为95％，流动相B体积分数为5％；
(2)第2～5分钟，流动相A体积分数由95％降至20％，流动相B体积分
数由5％升至80％；
(3)第5～7分钟，流动相A体积分数为20％，流动相B体积分数为80％；
(4)第7～7.1分钟，流动相A体积分数由20％升至95％，流动相B体积分数由80％降至5％；
(5)第7.1～10分钟，流动相A体积分数为95％，流动相B体积分数为5％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MS的条件包括：
离子源：电喷雾电离源；负离子模式；喷雾电压：-2～-3kv；离子源温度：100～200℃，脱溶剂温度：400～500℃；脱溶剂气流速：850～950L·h-1；扫描方式：多反应监测模式。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述MS的条件包括：
离子源：电喷雾电离源；负离子模式；喷雾电压：-2.5kv；离子源温度：150℃，脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气流速：900L·h-1；扫描方式：多反应监测模式。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述MS的条件包括：
所述2,5-二羟基苯磺酸甲酯的母离子为203.0m/z，子离子为95.0m/z和188.0m/z；
所述2,5-二羟基苯磺酸乙酯的母离子为217.0m/z，子离子为79.8m/z和189.0m/z；
所述2,5-二羟基苯磺酸异丙酯的母离子为231.0m/z，子离子为80.0m/z和188.0m/z。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液和对照品溶液的溶剂为甲醇-水，甲醇和水的体积比为(90～100)：5。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液和对照品溶液的溶剂为甲醇-水，甲醇和水的体积比为95：5。
Priority Applications (1)
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