CN116640732A - 一种原发性耐三代tki的人非小细胞肺癌原代细胞株及其应用 - Google Patents
一种原发性耐三代tki的人非小细胞肺癌原代细胞株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种原发性三代TKI耐药的人非小细胞肺癌细胞株及其应用。该细胞株是从携带EGFR 21号外显子L858R突变并且三代TKI原发性耐药的患者术后肿瘤组织样本中提取所得。该细胞株除了携带EGFR 21号外显子L858R突变外，还同时携带ERBB2 17号外显子I655V、20号外显子I625V以及21号外显子I640V突变。药敏性测试结果显示，该细胞株对于AZD9291具有较高的耐药性，其IC50值为携带同样突变的H1975细胞株IC50值的11.85倍。该细胞株可用于研究L858R第三代EGFR‑TKI原发性耐药机制，探究相关信号通路，筛选和开发肿瘤耐药逆转药物，研究更有效的肿瘤治疗方法等。因此，该细胞株具有较高的科研和生产应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤生物技术领域，尤其涉及一种原发性耐三代TKI的人非小细胞肺癌原代细胞株及其应用。
背景技术
肺癌是肺部最常见的恶性肿瘤，也是导致癌症死亡的主要原因之一。其中，非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌总数的80%-85%。虽然手术是治疗肺癌最有效的方法，但约75%的肺癌患者在诊断时已经处于晚期，失去了手术的治疗机会。因此，肺癌5年生存率仅约为19.5%。近年来，以铂类为基础的化疗药物对NSCLC的疗效虽有提高，但无法满足进展期NSCLC的治疗需要。肿瘤分子靶向治疗不仅提高了无进展生存期，且副作用更小，迅速成为全球研究的热点之一。目前已知的肺癌相关驱动基因包括EGFR（Epidermal Growth FactorReceptor，表皮生长因子受体）、ALK、KRAS、HER2、BRAF等，其中EGFR突变在亚洲人中高达60%。近年来，吉非替尼和厄洛替尼为代表的第一代EGFR-TKI（tyrosine kinaseinhibitor，酪氨酸激酶抑制剂），是携带EGFR相关突变NSCLC患者的治疗一线选择。而在临床中，有些患者对EGFR-TKIs的治疗并不敏感，或开始对该类药物高度敏感但经过约10-14个月的中位无疾病进展生存期后最终产生耐药。奥希替尼是第三代EGFR-TKI药物，2017年在我国批准上市，现已作为针对EGFR突变、靶向药物治疗进展后检测出T790M突变的NSCLC标准治疗，在晚期肺腺癌患者治疗中显得尤为重要，但仍不可避免地在半年到一年的时间内获得耐药，并表现出恶化的特征。这些更多是获得性耐药，而针对奥希替尼原发耐药性的机理研究，目前缺少合适的原代细胞株。
因此，现有技术还有待于进一步的提升和改进。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种原发耐三代TKI人非小细胞肺癌原代细胞株及其应用。
一种原发性耐三代TKI人非小细胞肺癌原代细胞株，其中，将其命名为人肺癌细胞系NSCLC-007T，保藏编号为GDMCC NO:63207。
可选地，所述的原发性耐三代TKI人非小细胞肺癌原代细胞株，其中，所述细胞株NSCLC-007T携带EGFR 21号外显子L858R突变，本应对三代TKI药物敏感，但它表现出原发性耐药，原代肿瘤细胞007T对三代TKI药物的IC50是H1975细胞株IC50的11.85倍；此外，此细胞株同时携带ERBB2 17号外显子I655V、20号外显子I625V号以及21号外显子I640V突变。
可选地，所述的原发性耐三代TKI的人非小细胞肺癌原代细胞株，其中，所述细胞株NSCLC-007T在构建人非小细胞肺癌体内外奥希替尼耐药的肿瘤模型中的应用。
可选地，所述的原发性三代TKI耐药的人非小细胞肺癌原代细胞株，其中，所述细胞株NSCLC-007T在筛选逆转肿瘤耐药性的药物中的应用。
可选地，所述的原发性三代TKI耐药的人非小细胞肺癌原代细胞株，其中，所述细胞株NSCLC-007T在制备抗肿瘤药物的应用。
可选地，所述的原发性三代TKI耐药的人非小细胞肺癌原代细胞株，其中，所述细胞株NSCLC-007T在筛选抗肿瘤药物的应用。
有益效果：本发明提供了一种携带EGFR 21号外显子L858R突变且原发性耐三代TKI的人非小细胞肺癌原代细胞株NSCLC-007T，同时携带ERBB2 17号外显子I655V、20号外显子I625V号以及21号外显子I640V突变。该细胞株可以用于研究原发性三代TKI耐药人非小细胞肺癌细胞形态学及生物学特点、筛选和评估抗肿瘤药物、开发肿瘤耐药逆转药物、研究更有效的肿瘤治疗方法等。此外，该细胞株还可用于探讨原发性三代TKI耐药的机制和挖掘临床靶点。因为是原发性三代TKI耐药细胞株，相较于现有的获得性耐药细胞株具有较高的科研和生产应用价值，预期能产生良好的科研、经济和社会效益。
附图说明
图1 为原发性三代TKI耐药的人非小细胞肺癌原代细胞株NSCLC-007T外显子测序总体变异百分比图。
图2为原发性三代TKI耐药的人非小细胞肺癌原代细胞株NSCLC-007T细胞增殖曲线。
图3 为原发性三代TKI耐药的人非小细胞肺癌原代细胞株NSCLC-007T细胞迁移实验结果。
图4 为原发性三代TKI耐药的人非小细胞肺癌原代细胞株NSCLC-007T细胞药物敏感性检测实验。
图5 为原发性三代TKI耐药的人非小细胞肺癌原代细胞株NSCLC-007T细胞形态图。
具体实施方式
本发明提供一种原发性三代TKI耐药的人非小细胞肺癌原代细胞株及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
需要说明的是，本发明中涉及的实验测试方法均为本领域常用的方法，所用的到试剂、培养液、抗体等均为市购产品。
实施例
支持细胞的培养，准备好完全培养基DMEM+10%FBS+双抗（成分为DMEM,加入10%胎牛血清(FBS),100U/ml青霉素和100 ug/ml链霉素）；将3T3-J2细胞从液氮中取出来，马上放入37℃中水浴锅中尽快解冻；将3T3-J2细胞加入5ml 完全培养基中1200 rpm/min 3min RT离心；去上清，加入1ml 完全培养基轻柔吹打均匀；加入T25培养瓶中进行培养；细胞培传代培养到拟合度达80-90%丰度后加入含有丝裂霉素C（4ug/ml）3ml 1.5 h，使其成为非增殖细胞，可作为支持细胞；去除含有药物的培养基，加入DMEM完全培养基进行培养，为下一步的的原代细胞培养作为支持细胞用。
组织消化成为单个肿瘤细胞进行培养，收集非小细胞肺癌患者术后肿瘤组织0.3×0.3×0.3cm3肿瘤组织；用95～100％(v/v)的乙醇洗分离的组织样品，再用PBS(0 .01M，pH7 .4) 洗；在2.0 ml离心管中加入1.0ml配好的胶原消化酶；将冲洗好的组织加入胶原酶中用剪刀剪碎并置于37℃水浴锅中进行消化25分钟；往消化好的组织中加入含10%的PBS终止消化；将终止消化的组织过70目筛，用PBS冲洗细胞筛；1000rpm/min 5min RT离心去除上清，加入5ml红细胞裂解液裂解5-10min；加入10ml PBS终止红细胞裂解，1200rpm/min 3min RT离心，去除上清；使用PBS洗涤1-2此，离心，加入肿瘤完全培养基轻柔吹打细胞；将细胞吸入已加有支持细胞的T25瓶子置于37℃5% CO2培养箱中进行培养； 24 h内不移动细胞培养瓶，4天换一次支持细胞；7-14天左右观察是否形成原代肿瘤细胞克隆。
原代细胞传代，在装有原代肿瘤细胞的培养瓶中吸出培养基，加入3ml PBS洗涤细胞；吸去PBS，加入3 ml EDTA细胞消化液置于37℃5% CO2培养箱中消化5min； 5 min后吸取含10%FBS的PBS终止消化，去除支持细胞，用PBS洗涤完全去除支持细胞； 吸取1ml 0.05%(质量体积比)胰酶-EDTA消化加入培养瓶中置于37℃5% CO2培养箱中消化4min，消化期间注意观察细胞消化情况；至细胞掉下来80-90%加入3 ml 含有10%FBS的PBS终止胰酶消化反应；吸取细胞置于15 ml离心管中以2000rpm/min 3min RT进行离心，去除上清；细胞按照要求以1：2、1：3、1：4、1：5传代于细胞培养瓶中，或冻存或用于其他实验。
实施例2 细胞增殖实验，用胰酶将上述实施例1制备得到的原代肿瘤细胞消化成单细胞悬液并计数；将原代细胞按照每孔 1000 个细胞，铺入 96 孔板中，每组 6 孔；每隔24 小时加入 10ul CCK8 试剂，37℃孵育 2 小时后酶标仪检测吸光度，连续检测 4 天。增殖曲线如图2所示。
实施例3细胞形态学观察，及本发明的耐奥希替尼人非小细胞肺癌细胞株原代肿瘤细胞株种于25cm2培养瓶中，待生长至对数期，置倒置相差显微镜下观察活细胞形态并拍照，如图5所示，本发明所提供的耐奥希替尼的人非小细胞肺癌细胞呈立体形态。
实施例4细胞迁移实验， BD基质胶（Matrigel）提前一晚从-80℃取出放置于冰上并置于4℃冰箱中溶解；
提前在细胞培养小室（Transwell 小室，corning，8um）中铺入100μL浓度为50 μg/uL基质胶，放入37℃培养箱中，使其凝固（2小时以上）；
用含0.25%EDTA胰酶消化实施例1中的来源于人非小细胞肺癌的细胞株（原代肿瘤细胞）制成细胞悬液并计数，用无血清的细胞培养基重悬细胞，将1×105的细胞悬液（即含有1×105个细胞）加入小室上层，小室下层加入 800μL 肿瘤完全培养基，放入细胞培养箱中培养 24小时；
将小室取出，弃掉培养基，用棉签将小室上部的基质胶及细胞擦净，小室上下各加入 500μL 4%多聚甲醛固定液，室温固定30分钟；
小室上下加入500μL结晶紫，染色15分钟，弃掉结晶紫，清水漂洗小室后垫支晾干；
使用刀片将小室的上室膜切下，使用盖玻片压片于载玻片上，显微镜下统计穿过基质胶的细胞数，得到细胞迁移率。同时，以正常的肺上皮细胞做对比，结果如图3所示，与正常的肺上皮细胞（N）对比，NSCLC-007T（原代肿瘤细胞）的迁移能力显著上调，说明NSCLC-007T具有高侵袭性实验结果如图3所示，与正常的肺上皮细胞（N）对比，NSCLC 007T原代细胞株的迁移能力显著上调。
实施例5外显子测序总体变异检测，采用Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit试剂盒对样本进行DNA提取。使用Covaris M220 Focused-ultrasonicator (Covaris)对DNA进行打断后构建测序文库。采用安捷伦SureSelect Human All Exon V6 Kit对每个样本进行捕获，结果如图1所示：其中indel为插入缺失，外显子（exonic）突变占插入缺失的8.33%（数目为733），内含子（intronic）突变占插入缺失的65.34%，其他突变占插入缺失的26.33%；SNP是单核苷酸多态性（指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性），其中外显子（exonic）突变占34.22%（数目为24037），内含子（intronic）突变占34.22%，同义单核苷酸突变（synonymous_SNV）占18.21%，其他突变占12.49%。
实施例6 细胞药物敏感性检测，将对数期生长的H1975细胞株和NSCLC 007T细胞株分别配置成每孔2000细胞；待细胞贴壁后吸去培养基，分别加入100ul含10uM、5uM、2.5uM、1uM、500nM、250nM、50nM、25nM、12.5nM、0nM AZD9291完全培养基，同一浓度3个复孔。加药后48小时，每孔加入10ul cck8，2小时后酶标仪检测处吸光值。其中，抑制率(％)＝(对照组OD值-试验组OD值)/对照组OD值×100％；耐药指数(RI)＝原代细胞IC50/对照细胞IC50。检测结果如图4所示，原代肿瘤细胞007T对第三代TKI药物的IC50是H1975细胞株IC50的11.85倍，大于10倍以上，所以NSCLC 007T是临床上获得的原发性三代TKI耐药的人非小细胞肺癌原代细胞株。
综上所述，本发明提供的一种原发性三代TKI耐药的人非小细胞肺癌原代细胞株，该细胞株NSCLC-007T携带EGFR 21号外显子L858R突变，本应对三代TKI药物敏感，但其原发性耐药，同时携带ERBB2 17号外显子I655V、20号外显子I625V号以及21号外显子I640V突变，具有较强的迁移能力，该细胞株可以用于研究三代TKI耐药人非小细胞肺癌细胞形态学及生物学特点、研究肿瘤耐药机制、分析抗肿瘤药物敏感性及筛选和评估抗肿瘤药物、开发肿瘤耐药逆转药物、研究更有效的肿瘤治疗方法等，因为是原发性耐药细胞株，未被其他因素影响，对耐药的机理研究更为直接，相较于现有的获得性耐药细胞株具有较高的科研和生产应用价值，预期能产生良好的科研、经济和社会效益。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (7)
1. 一种原发性三代TKI耐药的人非小细胞肺癌原代细胞株，其特征在于，将其命名为人肺癌细胞系NSCLC-007T，保藏编号为GDMCC NO:63207。
2.根据权利要求1所述的原发性三代TKI耐药的人非小细胞肺癌原代细胞株，其特征在于，所述细胞株NSCLC-007T携带EGFR 21号外显子L858R突变，三代TKI耐药。
3.根据权利要求1所述的原发性三代TKI耐药的人非小细胞肺癌原代细胞株，同时携带ERBB2 17号外显子I655V、20号外显子I625V号以及21号外显子I640V突变。
4.根据权利要求1所述的耐奥希替尼的人非小细胞肺癌细胞株，其特征在于，所述细胞株NSCLC-007T在构建人非小细胞肺癌体内外奥希替尼耐药的肿瘤模型中的应用。
5.根据权利要求1所述的耐三代TKI的人非小细胞肺癌细胞株，其特征在于，所述细胞株NSCLC-007T在筛选逆转肿瘤耐药性的药物中的应用。
6.根据权利要求1所述的耐三代TKI的人非小细胞肺癌细胞株，其特征在于，所述细胞株NSCLC-007T在制备抗肿瘤药物的应用。
7.根据权利要求1所述的耐三代TKI的人非小细胞肺癌细胞株，其特征在于，所述细胞株NSCLC-007T在筛选抗肿瘤药物的应用。
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