CN116640221A - 一种抗胃蛋白酶原ii的单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种抗胃蛋白酶原ii的单克隆抗体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116640221A CN116640221A CN202310640918.1A CN202310640918A CN116640221A CN 116640221 A CN116640221 A CN 116640221A CN 202310640918 A CN202310640918 A CN 202310640918A CN 116640221 A CN116640221 A CN 116640221A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- monoclonal antibody
- seq
- pepsinogen
- antibodies
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090001072 Gastricsin Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 102000034255 Pepsinogen C Human genes 0.000 title claims abstract description 53
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 32
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 44
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 43
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 43
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 31
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 30
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 28
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 26
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 17
- 108010047320 Pepsinogen A Proteins 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 10
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 9
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 8
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 6
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 6
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 6
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 5
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 4
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 4
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 4
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 4
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 3
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 3
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 210000000091 mucous neck cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 206010054949 Metaplasia Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000027119 gastric acid secretion Effects 0.000 description 2
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000015689 metaplastic ossification Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000012409 standard PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 238000012449 Kunming mouse Methods 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010067994 Mucosal atrophy Diseases 0.000 description 1
- 101000763311 Mus musculus Thrombomodulin Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 244000061632 Prinsepia uniflora Species 0.000 description 1
- 235000008997 Prinsepia uniflora Nutrition 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 210000002318 cardia Anatomy 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 1
- 230000002183 duodenal effect Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hcl hcl Chemical compound Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000009854 mucosal lesion Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- -1 probody Proteins 0.000 description 1
- 230000007425 progressive decline Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000001187 pylorus Anatomy 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 208000018556 stomach disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96472—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- G01N2333/96475—Aspartic endopeptidases (3.4.23) with definite EC number
- G01N2333/96477—Pepsin (3.4.23.1; 3.4.23.2; 3.4.23.3)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种抗胃蛋白酶原II的单克隆抗体及其制备方法和应用,其中,抗胃蛋白酶原II的单克隆抗体为抗体3G10;抗体3G10的氨基酸序列为:VH CDR1‑3分别如SEQ ID NO.10‑12所示;VL CDR1‑3如SEQ ID NO.13‑15所示。所示。本发明提供的抗体具有高亲和力和高特异性,可以应用于抗胃蛋白酶原II试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其是涉及抗体及体外检测领域。具体而言,本发明涉及一种抗胃蛋白酶原II的抗体及其制备方法和应用。
背景技术
胃蛋白酶原(pepsinogen)是由泌酸腺的主细胞合成,在胃腔内经盐酸(HCl)或已有活性的胃蛋白酶(pepsin)作用变成胃蛋白酶,将蛋白质分解成膘、胨及少量多肽。该酶作用的最适pH为2,进入小肠后,酶活性丧失。
胃蛋白酶原是胃蛋白酶的前体,根据其生化性质和免疫原性将其分成2个亚群,1-5组分的免疫原性相同,称为胃蛋白酶原I(PGI),主要由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌;组分6和7被称为胃蛋白酶原II(PGII),除由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌外,贲门腺和胃窦的幽门腺的黏液颈细胞以及十二指肠上段也能产生胃蛋白酶原II。
血清胃蛋白酶原水平反映了不同部位胃粘膜的形态和功能:PGI是检测胃泌酸腺细胞功能的指针,胃酸分泌增多PGI升高,分泌减少或胃粘膜腺体萎缩PGI降低;PGII与胃底粘膜病变的相关性较大(相对于胃窦粘膜),其升高与胃底腺管萎缩、胃上皮化生或假幽门腺化生、异型增值有关;PGI/II比值进行性降低与胃粘膜萎缩进展相关。因此,联合测定PGI和PGII比值可起到胃底腺粘膜“血清学活检”的作用。
PGI和PGII血清浓度在各胃部疾病中均有不同程度的改变,但是目前国内对于PGII抗体的研究中,单克隆抗体的数量较少,可用于检测人血清中PGII浓度的抗体适配性较差。
发明内容
本发明的目的是提供高亲和力和高特异性的抗人胃蛋白酶原II的单克隆抗体,为具有优良性质的鼠源抗体,其能够特异性识别和结合人血清中的胃蛋白酶原II。
一方面,本发明提供一种抗胃蛋白酶原II单克隆抗体,包括:抗体1A7和/或抗体3G10;
其中,抗体1A7的氨基酸序列为:VH CDR1如SEQ ID NO.2所示;VH CDR2如SEQ IDNO.3所示;VH CDR3如SEQ ID NO.4所示;VL CDR1如SEQ ID NO.5所示;VL CDR2如SEQ IDNO.6所示;VL CDR3如SEQ ID NO.7所示;
抗体3G10的氨基酸序列为:VH CDR1如SEQ ID NO.10所示;VH CDR2如SEQ IDNO.11所示;VH CDR3如SEQ ID NO.12所示;VL CDR1如SEQ ID NO.13所示;VL CDR2如SEQ IDNO.14所示;VL CDR3如SEQ ID NO.15所示。
进一步地,抗体1A7的可变区氨基酸序列为:重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示;轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
进一步地,抗体3G10的可变区氨基酸序列为:重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.16所示;轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
在优选的实施方案中,重链可变区中含有的3个CDR和/或轻链可变区中含有的3个CDR由Chothia编号系统定义。
进一步地,单克隆抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体;所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)或单域抗体(sdAb)。
进一步地,单克隆抗体还包括:哺乳动物免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体1,所述变体1与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加;以及,哺乳动物免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体2,所述变体2与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换。
在本发明中,单克隆抗体可以包括这样的变体3,变体3与其所源自的抗体相比差异仅在于一个或多个氨基酸残基的保守置换;例如,至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换;或者与其所源自的抗体具有至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性,且基本保留了其所源自的抗体的上述生物学功能。
进一步地,单克隆抗体的重链恒定区是IgG重链恒定区;单克隆抗体的轻链恒定区是κ轻链恒定区。
进一步地,单克隆抗体带有标记。
抗体标记的目的在于将标记物链接到抗体上,与待检测物特异性反应形成多元复合物,并借助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器对试验结果直接镜检观察或进行自动化测定。本方案中的标记并不特指某一种标记方式,具体的,可以是酶标记、生物素化标记、荧光标记、胶体金标记等;在此不做限定。
另一方面,本发明还提供一种所述抗胃蛋白酶原II的抗体的制备方法,包括:在允许单克隆抗体表达的条件下,培养宿主细胞;从培养的宿主细胞培养物中回收单克隆抗体。
本发明提供的单克隆抗体可以采用本领域已知的各种方法来制备,例如通过基因工程重组技术来获得。例如,通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内,然后转染宿主细胞。然后,在特定条件下培养转染后的宿主细胞,并表达本发明的抗体。
本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得。另外,这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生。比如,Fab’片段可以直接从宿主细胞中获得;可以将Fab’片段化学偶联形成F(ab’)2片段。另外,Fv、Fab或F(ab’)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。一般而言,本领域的普通技术人员知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。
另一方面,本发明还提供一种分离的核酸分子,分离的核酸分子用于编码单克隆抗体。
另一方面,本发明还提供一种载体,包括上述分离的核酸分子。
进一步地,载体为克隆载体或表达载体。在优选的实施方案中,本发明的载体是例如质粒,粘粒,噬菌体等。在优选的实施方案中,所述载体能够在受试者,例如哺乳动物,体内表达所述抗体。
另一方面,本发明还提供一种宿主细胞,包括分离的核酸分子或载体。所述宿主细胞包括但不限于:原核细胞例如大肠杆菌细胞,真核细胞例如酵母细胞,昆虫细胞,植物细胞,动物细胞例如哺乳动物细胞等。在优选的实施方案中,本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞,例如CHO,具体包括CHO-K1、CHO-S和CHO DG44。
另一方面,本发明还提供一种检测胃蛋白酶原II的试剂盒,包括上述单克隆抗体。
在一个实施方式中,试剂盒包含第一单抗和第二单抗;第一单抗和第二单抗配合检测样本。其中,第一单抗包含:SEQ ID NO.2所示的VH CDR1、SEQ ID NO.3所示的VH CDR2、SEQ ID NO.4所示的VH CDR3;和SEQ ID NO.5所示的VL CDR1、SEQ ID NO.6所示的VL CDR2、SEQ ID NO.7所示的VL CDR3。第二单抗包含:SEQ ID NO.10所示的VH CDR1、SEQ ID NO.11所示的VH CDR2、SEQ ID NO.12所示的VH CDR3;和SEQ ID NO.13所示的VL CDR1、SEQ IDNO.14所示的VL CDR2、SEQ ID NO.15所示的VL CDR3。
在一个实施方式中,试剂盒包含第一单抗或第二单抗。第一单抗和第二单抗也可以单独使用,检测胃蛋白酶原Ⅰ。
另一方面,本发明还提供一种所述试剂盒的使用方法,包括以下步骤:使用试剂R1稀释被测样品,并加入试剂R2反应;然后使用生化分析仪,测定570nm波长下吸光值;利用胃蛋白酶原I标准品制备标准曲线,根据标准曲线和吸光值计算被测样品中胃蛋白酶原I的含量。
其中,试剂R1为常见缓冲液,可以是pH7.4的0.05mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液,制备方法如下:取Tris 6.057g;先加入800mL去离子水,加入浓盐酸调节pH值至7.4;去离子水定容至1L。
试剂R2由第一单抗与胶乳颗粒偶联形成的致敏源1和第二单抗与胶乳颗粒偶联形成的致敏源2混合配制而成。
另一方面,本发明还提供一种所述试剂盒的使用方法,包括以下步骤:使用试剂R1稀释被测样品,并加入试剂R2反应;然后使用生化分析仪,测定570nm波长下吸光值;利用胃蛋白酶原II标准品制备标准曲线,根据所述标准曲线和所述吸光值计算被测样品中胃蛋白酶原II的含量。
本发明的试剂盒的可能原理包括:当样品中存在相应抗原时,第一单抗与胶乳颗粒偶联形成的致敏源1和第二单抗与胶乳颗粒偶联形成的致敏源2能够同时与抗原结合,发生聚集反应。单个致敏源在入射光波长之内,光线可通过。当两个致敏源聚集时,则使透射光减少,这种减少程度与致敏源聚集成正比,也与抗原量成正比。由此进行胃蛋白酶原II的定性和定量分析。
其中,用于构建本发明的试剂盒的第一单抗和第二单抗分别针对人胃蛋白酶原II的不同抗原表位并且具有配对检测效果。
本发明的抗体可进行衍生化,例如被连接至另一个分子。通常,抗体的衍生化不会不利影响其对胃蛋白酶原II的结合。因此,本发明的抗体还包括此类衍生化的形式。例如,可以将本发明的抗体功能性连接于一个或多个其它分子基团,例如另一个抗体,检测试剂,药用试剂,和/或能够介导抗体或抗原结合片段与另一个分子结合的蛋白或多肽。此外,本发明的抗体还可以用化学基团进行衍生,例如聚乙二醇(PEG),甲基或乙基,或者糖基。这些基团可用于改善抗体的生物学特性,例如增加血清半衰期。
因此,在优选的实施方案中,本发明的抗体与胶乳颗粒偶联。本发明的抗体可偶联可检测的标记,例如酶、放射性核素、荧光染料、发光物质或生物素。本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的,其实例包括但不限于,酶、放射性核素、荧光染料、发光物质、磁珠、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素的生物素。教导该标记物的使用的专利包括,但不限于,美国专利3,817,837;3,850,752;3,939,350;3,996,345;4,277,437;4,275,149;及4,366,241。如上所述的可检测的标记可通过本领域已知的方法检测。例如,放射性标记可使用摄影胶片或闪烁计算器检测,荧光标记物可使用光检测器检测,以检测发射的光。酶标记物一般通过给酶提供底物及检测通过酶对底物的作用产生的反应产物来检测,及测热标记物通过简单可视化着色标记物来检测。在某些实施方案中,此类标记能够适用于免疫学检测,例如,酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等。在某些实施方案中,可通过不同长度的接头将如上所述的可检测的标记连接至本发明的抗体,以降低潜在的位阻。
术语定义
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的细胞培养、生物化学、核酸化学、免疫学实验室等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的,术语“抗体”是指,通常由两对多肽链组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε,并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内,可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接,重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合,但展现出多种效应子功能,如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子,包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR)),其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循Kabat,Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and1991)),或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989)Nature342:878-883的定义。
如本文中所使用的,术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个CDR,命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义,例如可按照Kabat编号系统、Chothia编号系统或IMGT编号系统中的定义。对于给定的抗体,本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且,不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的。
在本发明中,本发明的抗体含有的CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中,本发明的抗体含有的CDR优选地通过Kabat、Chothia或IMGT编号系统确定。在某些实施方案中,本发明的抗体含有的CDR优选地通过Kabat编号系统确定。
如本文中所使用的,术语“构架区”或“FR”残基是指,抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如,其包括,重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体,例如,IgG,IgA1,IgA2,IgD,IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的,术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽,其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力,和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合,其也被称为“抗原结合部分”。通常参见,Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版,Raven Press,N.Y.(1989),其以其全文通过引用合并入本文,用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、互补决定区(CDR)片段、scFv、双抗体、单域抗体、嵌合抗体、线性抗体、纳米抗体、probody和这样的多肽,其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005;Nat Biotechnol,23:1126-1136中。
如本文中所使用的,术语“全长抗体”意指,由两条“全长重链”和两条“全长轻链”组成的抗体。其中,“全长重链”是指这样的多肽链,其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成;并且,当所述全长抗体为IgE同种型时,任选地还包括重链恒定区CH4结构域。优选地,“全长重链”是在N端到C端方向上由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽链。“全长轻链”是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。两对全长抗体链通过在CL和CH1之间的二硫键和两条全长重链的HR之间的二硫键连接在一起。本发明的全长抗体可以来自单一物种,例如人;也可以是嵌合抗体或人源化抗体。本发明的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合部位,这两个抗原结合部位特异性识别/结合相同的抗原。
如本文中所使用的,术语“Fd”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段;术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段;术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段;术语“F(ab’)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段;术语“Fab’片段”意指还原连接F(ab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段,由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成。
如本文中所使用的,术语“Fv”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是,能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为,六个CDR赋予抗体的抗原结合特异性。然而,即便是一个可变区(例如Fd片段,其仅仅含有三个对抗原特异的CDR)也能够识别并结合抗原,尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。
如本文中所使用的,术语“Fc”意指,由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的Fc片段具有多种不同的功能,但不参与抗原的结合。
如本文中所使用的,术语“scFv”是指,包含VL和VH结构域的单个多肽链,其中所述VL和VH通过接头相连。此类scFv分子可具有一般结构:NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如,可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头,但也可使用其变体,可用于本发明的其他接头。在一些情况下,scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。
如本文中所使用的,术语“双抗体”意指,其VH和VL结构域在单个多肽链上表达,但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对,从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位。
如本文中所使用的,术语“单域抗体”具有本领域技术人员通常理解的含义,其是指由单个单体可变抗体结构域所组成的抗体片段,其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力。单域抗体也称为纳米抗体。
上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力,和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。
可使用本领域技术人员已知的常规技术从给定的抗体获得抗体的抗原结合片段,并且以与用于完整抗体的方式相同的方式特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本文中,除非上下文明确指出,否则当提及术语“抗体”时,其不仅包括完整抗体,而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的,术语“单克隆抗体”、“单抗”、“mAb”具有相同的含义且可互换使用,其是指,来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段,也即,除可能自发出现的自然突变外,一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的,其通常包含至少2种或更多种的不同抗体,这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。此外,修饰语“单克隆”仅表明该抗体的特征为从高度同源的抗体群中获得,不能理解为需要通过任何特定方法来制备所述抗体。
本发明的单克隆抗体可以通过多种技术进行制备,例如杂交瘤技术,重组DNA技术,或噬菌体抗体库技术。
抗体可通过公知的技术,例如使用蛋白A或蛋白G的亲和层析进行纯化。随后或作为替代,可将特异性抗原或其抗原表位固定在柱上,并通过免疫亲合层析法来纯化免疫特异性抗体。
如本文中所使用的,术语“嵌合抗体”是指,这样的抗体,其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体,且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体,但无论如何,其仍保留对目标抗原的结合活性。例如,术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体(例如人鼠嵌合抗体),其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体,而抗体的重链和轻链可变区来自第二抗体。
如本文中所使用的,术语“人源化抗体”是指,经基因工程改造的非人源抗体,其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言,人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体,全部或部分的非CDR区来自于人源免疫球蛋白。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质,包括但不限于,抗原特异性、亲和性、反应性等。供体抗体可以是有预期性质的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物抗体。
本发明的嵌合抗体或人源化抗体可以根据上述制备的鼠单克隆抗体的序列进行制备。编码重链和轻链的DNA可以从目标鼠杂交瘤中获得,并且使用标准分子生物学技术进行工程改造以包含非鼠免疫球蛋白序列。
为制备嵌合抗体,可使用本领域已知的方法将鼠免疫球蛋白可变区连接至人免疫球蛋白恒定区。例如,将编码VH的DNA可操作的连接至编码重链恒定区的另一DNA分子以获得全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的,包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区,但是通常优选为IgG1或IgG4恒定区。例如,将编码VL的DNA可操作的连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子以获得全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的,包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区,但通常优选为κ恒定区。
为制备人源化抗体,可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人源框架序列。或者,还可以利用转基因动物,其能够在免疫后不产生内源性免疫球蛋白、并且能够产生完整人抗体库。例如,已有报道在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失可以完全抑制了内源性抗体产生,然后将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到所述种系突变小鼠中将导致该小鼠在遇到抗原刺激时产生人抗体。上述转基因动物的非限制性实例包括,HuMAb小鼠,其含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微型基因座,加之使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变;或携带人重链转基因和人轻链转染色体的“KM小鼠TM”。其他抗体人源化改造的方法还包括噬菌体展示技术。
如本文中所使用的,术语“特异性结合”是指,两分子间的非随机的结合反应,如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以由该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本发明中,术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数,其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小,抗体-抗原结合越紧密,抗体与抗原之间的亲和力越高。在某些实施方式中,特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指,抗体以小于约10-9M,例如小于约10-9M、10-10M、10-11M或10-12M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定,例如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定。
如本文中所使用的,术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时,那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如,如果两个序列的10个位置中有6个匹配,那么这两个序列具有60%的同一性。例如,DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常,在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用,例如,可通过计算机程序例如Align程序方便地进行Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl Biosci.,4:11-17(1988))的算法,使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外,可使用已整合入GCG软件包的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法,使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的,术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如,可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换,例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链、酸性侧链、不带电荷的极性侧链、非极性侧链、β分支侧链和芳香族侧链的氨基酸。因此,优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。在本发明中,术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中,氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如,丙氨酸可用A或Ala表示。
采用本发明提供的技术方案,能达到的有益效果为:本发明提供的单克隆抗体能够与PGII蛋白特异性结合;通过双抗体夹心免疫比浊检测方法,能有效地检测人血清中PGII蛋白的含量,灵敏度高,最低限达2μg/L,检测线性宽,为2.0-70μg/L,能够满足临床检测的需要。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例2的PGII的线性范围测定图;
图2是本发明实施例2的PGII检测方法与某品牌比对试剂/检测方法相关性图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本实施例的主要试剂和仪器分别见表1和表2:
表1:主要试剂
表2:主要仪器:
名称 | 厂家 | 型号 |
移液器 | Eppendorf | / |
恒温培养箱 | 普和希PHC | MCO-170AICL-PC |
生物安全柜 | 济南鑫贝西生物技术有限公司 | BSC-1100IIA2-X |
生物显微镜 | 宁波永新光学 | N-117M |
倒置生物显微镜 | 宁波永新光学 | XD-202 |
台式离心机 | 卢湘仪 | TD4 |
洗板机 | 山东博科 | ST-96W |
酶标仪 | 美国伯腾 | ELX800 |
生化仪 | HITACHI | 7180 |
抗原:
重组PGII蛋白,来自HEK293细胞表达,氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;
人源PGII蛋白,来自人胃粘膜,购自Lee Biosolutions公司,货号440-50。
实验动物:
Balb/C小鼠:SPF(Specific Pathogen Free)级别的Balb/C小鼠购自上海灵畅生物科技有限公司。
缓冲液的配制:
磷酸盐缓冲液(PBS)配方为:NaCl,8g;KCl,0.2g;Na2HPO4·12H2O,2.9g;KH2PO4,0.2g;H2O定容至1L
10×PBST洗液配方为:NaCl,80g;KCl,2g;Na2HPO4·12H2O,29g;KH2PO4,2g;TWEEN-20,5ml;H2O定容至1L
pH 2.7的甘氨酸洗脱液配方为:甘氨酸1.9g,H2O定容至500mL,pH值2.68~2.72。
pH 1.9的甘氨酸洗脱液配方为:甘氨酸1.9g,H2O定容至500mL,pH值1.88~1.92。
实施例1:PGII单克隆抗体的制备和筛选
将重组PGII蛋白(1mg/ml)与佐剂CFA和IFA混合,制备免疫原。即,重组蛋白先与CFA按体积比1:1混合,作为免疫原A,重组蛋白再与IFA按体积比1:1混合作为免疫原B。免疫原A是初次免疫,免疫原B是第二次、第三次和第四次加强免疫。皮下免疫小鼠2只,第四次加强免疫后在第14天抽取小鼠尾血,使用间接ELISA方法进行尾血抗体效价的评价。
使用PGII重组蛋白包被酶标板(2μg/mL),每孔加入100μL,4℃过夜反应;使用PBST溶液洗板3次,使用5%BSA在37℃封闭2h;然后使用PBST溶液洗板3次后,加入使用5%BSA溶液梯度稀释的小鼠尾血,37℃反应2h;然后使用PBST溶液洗板3次,加入1:20000倍稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗,37℃反应1h;用PBST溶液洗板5次后,拍干,加入100μL TMB显色液,37℃避光反应15min;然后加入50μL终止液(2M H2SO4),混匀后在酶标仪上读取OD450值。免疫后第14天小鼠尾血间接ELISA评价结果见表3。
表3:PGII四次免疫后第14天小鼠尾血抗体效价评价
1号小鼠 | 2号小鼠 | |
1/10000 | 2.023 | 1.954 |
1/20000 | 1.707 | 1.614 |
1/40000 | 1.388 | 1.323 |
1/80000 | 1.104 | 1.018 |
1/160000 | 0.739 | 0.66 |
1/320000 | 0.494 | 0.437 |
1/640000 | 0.298 | 0.268 |
1/1280000 | 0.22 | 0.182 |
NC | 0.074 | 0.078 |
注:NC为阴性对照,PBS。
从结果中看出,四次免疫后两只小鼠尾血识别PGII重组蛋白的抗体滴度均超过1:640000,使用PGII重组蛋白冲击免疫小鼠,冲击免疫后第3天取小鼠脾脏,分离脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14进行细胞融合。融合后有3000个以上杂交瘤细胞群落在96孔板中生长,通过之前所描述的间接ELISA方法对96孔板中的细胞培养上清进行评价,筛选能够分泌识别蛋白的单克隆抗体的单克隆细胞株,从筛选结果中,挑选了48个阳性克隆进行筛选的确认实验,实验过程如下:使用人源PGII蛋白包被酶标板(2μg/mL),每孔加入100μL,4℃过夜反应;使用PBST溶液洗板3次,使用5%BSA在37℃封闭2h;然后使用PBST溶液洗板3次后,加入使用PBS溶液50倍稀释的细胞培养上清,37℃反应2h;然后使用PBST溶液洗板3次,加入1:20000倍稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗,37℃反应1h;用PBST溶液洗板5次后,拍干,加入100μL TMB显色液,37℃避光反应15min;然后加入50μL终止液(2M H2SO4),混匀后在酶标仪上读取OD450值,结果见表4。
表4:阳性克隆的确认结果
克隆号 | 1A7 | 1H8 | 2B9 | 3C8 | 3G10 | 4D11 | 5C2 | 5D8 | 5F10 | 6E6 |
OD450 | 1.699 | 1.223 | 1.656 | 1.335 | 1.722 | 1.364 | 1.542 | 1.638 | 0.965 | 1.128 |
克隆号 | 7H11 | 9A5 | 9F10 | 10B4 | 10D3 | 10H1 | 11C5 | 11E7 | 11F6 | 12D9 |
OD450 | 1.356 | 1.112 | 1.369 | 1.568 | 1.193 | 1.452 | 0.996 | 1.612 | 1.865 | 1.036 |
克隆号 | 13E11 | 14B7 | 14D2 | 15G9 | 16H4 | 17A7 | 17D6 | 18C3 | 18F9 | 19C2 |
OD450 | 1.551 | 1.007 | 1.834 | 1.683 | 0.956 | 1.529 | 1.658 | 1.622 | 1.267 | 0.989 |
克隆号 | 19F10 | 19H5 | 20A6 | 20C9 | 20F11 | 21C6 | 21G5 | 22B7 | 22G1 | 23C1 |
OD450 | 1.869 | 0.996 | 1.566 | 1.339 | 1.569 | 1.883 | 1.681 | 1.226 | 1.153 | 1.598 |
克隆号 | 24D9 | 24H10 | 26C9 | 27D3 | 27G9 | 29B7 | 29F9 | 30E10 | NC | PC |
OD450 | 1.739 | 1.653 | 1.381 | 1.722 | 0.994 | 1.146 | 1.693 | 1.787 | 0.064 | 1.866 |
注:NC为阴性对照,PBS;PC为阳性对照,1号小鼠血清1/10000稀释。
根据表4阳性克隆复筛结果,挑选出25个阳性克隆继续进行灵敏度检测实验,使用人源PGII蛋白包被酶标板(2μg/mL),每孔加入100μL,4℃过夜反应;使用PBST溶液洗板3次,使用5%BSA在37℃封闭2h;然后使用PBST溶液洗板3次后,加入使用PBS溶液梯度稀释的细胞培养上清,37℃反应2h;然后使用PBST溶液洗板3次,加入1:20000倍稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗,37℃反应1h;用PBST溶液洗板5次后,拍干,加入100μL TMB显色液,37℃避光反应15min;然后加入50μL终止液(2M H2SO4),混匀后在酶标仪上读取OD450值,结果见表5。
表5:灵敏度测试结果
注:NC为阴性对照,PBS;PC为阳性对照,1号小鼠血清1/10000稀释。
根据表5结果,选取1A7,3G10,5D8,11E7,11F6,14D2,15G9,17D6,18C3,19F10,21C6,21G5,24D9,24H10,30E10共计15株进行纯化抗体制备和筛选。
实施例2:纯化抗体的制备
1)腹水制备
将1A7,3G10,5D8,11E7,11F6,14D2,15G9,17D6,18C3,19F10,21C6,21G5,24D9,24H10,30E10抗体进行腹水制备,分别将约1×106个细胞注射入3只预先注射了IFA佐剂的Balb/C小鼠的腹腔,然后约10天后,分别抽取每个阳性克隆产生的腹水,然后4℃、12000rpm离心15min,收取上清进行下一步的G蛋白纯化。
2)小鼠单克隆抗体的纯化
取1mL的偶联有G蛋白的柱料加入一根空柱子中,使用PBS溶液清洗后,将2mL腹水用8mL的PBS稀释后上柱,然后将流过液重新上柱一次;然后使用pH2.7的甘氨酸洗脱液进行洗脱,每1mL洗脱液收集一管(预先加入100μL中和液,中和液成分为1MTris-HCl、10mMEDTA、1.5M NaCl,pH8.0-8.38),共收集5管;紧接着使用pH1.9的甘氨酸洗脱液进行洗脱,每1mL洗脱液收集一管(预先加入300μL中和液),共收集3管;然后分别对每一管洗脱液进行OD280读数,将OD280大于0.5的洗脱液进行混合,混合后再重新测定混合液的OD280,按照1.4的系数计算抗体浓度:抗体浓度=OD280/1.4。
实施例3:纯化抗体的筛选
将G蛋白纯化后的鼠单抗一部分进行生物素标记,标记后的抗体后缀加-Bio表示,如生物素标记后1A7抗体用1A7-Bio表示,使用夹心ELSIA方法进行抗体配对筛选,使用未标记的抗体包被酶标板(2μg/mL),每孔加入100μL,4℃过夜反应;使用PBST溶液洗板3次,使用5%BSA在37℃封闭1.5h;使用PBST溶液洗板3次后,加入人源PGII蛋白(2μg/mL)37℃孵育1.5h;使用PBST溶液洗板3次后,加入5%BSA溶液梯度稀释的生物素标记抗体,37℃反应1.5h;使用PBST溶液洗板3次,加入1:500稀释的HRP标记的链霉亲和素,37℃反应1h;用PBST溶液洗板5次后,拍干,加入100μLTMB显色液,37℃避光反应15min;然后加入50μL终止液(2MH2SO4),混匀后在酶标仪上读取OD450值。纯化抗体的评价部分结果见表6。
表6:夹心ELISA法配对抗体筛选部分结果
注:NC为阴性对照,PBS。
根据表6的结果,选取抗体1A7,3G10,19F10进行胶乳增强免疫比浊法配对筛选,将抗体1A7,3G10,19F10按照不同的组合方式两两配对偶联胶乳颗粒;将偶联后的胶乳颗粒配制成检测试剂R2用于后续校准品检测,检测结果见表7;
检测方法为:
检测仪器为:全自动生化分析仪7180
分析方法为:两点终点法
反应方向为:上升反应
校准方式为:Spline
测定波长:570nm
测定温度:37℃
校准品:试剂R1:试剂R2=2μL:120μL:120μL
表7:不同抗体组合方式制备PGII检测试剂检测校准品OD570nm读数
根据表7结果,选取抗体1A7和3G10作为PGII含量双抗体夹心法免疫比浊检测试剂原料。
经测序分析,鼠单克隆抗体1A7的可变区氨基酸序列为:
重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示;轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示。
进一步,使用Immunolobin BLAST(IG Blast)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/giblast/)在线分析,确定了该抗体的CDR序列,其氨基酸序列分别为:VH CDR1如SEQ IDNO.2所示;VH CDR2如SEQ ID NO.3所示;VH CDR3如SEQ ID NO.4所示;VL CDR1如SEQ IDNO.5所示;VL CDR2如SEQ ID NO.6所示;VL CDR3如SEQ ID NO.7所示。
经测序分析,鼠单克隆抗体3G10的可变区氨基酸序列为:
重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示;轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.17所示。
进一步,使用Immunolobin BLAST(IGBlast)在线分析,确定了该抗体的CDR序列,其氨基酸序列分别为:VH CDR1如SEQ ID NO.10所示;VH CDR2如SEQ ID NO.11所示;VHCDR3如SEQ ID NO.12所示;VL CDR1如SEQ ID NO.13所示;VL CDR2如SEQ ID NO.14所示;VLCDR3如SEQ ID NO.15所示。
实施例4:双抗体夹心免疫比浊法检测样本PGII蛋白
检测胃蛋白酶原II(PGII)含量的方法,利用胃蛋白酶原II检测试剂R1、R2及校准品,进行胃蛋白酶原II检测。
其中,检测试剂主要组成成分如下:
试剂R1:三羟甲基氨基甲烷缓冲液
试剂R2:一定比例的1A7与胶乳颗粒偶联形成的致敏源1和3G10与胶乳颗粒偶联形成的致敏源2混合配制而成。
校准品:人胃蛋白酶原II。
检测方法如下:
所用检测仪器为:全自动生化分析仪7180
分析方法:两点终点法。
反应方向为:上升反应;
校准方式为:Spline;
测定波长:570nm;
测定温度:37℃;
样本:试剂R1:试剂R2=2μL:120μL:120μL;
方法步骤:
步骤一,取2μL样本和120μL试剂R1加入反应杯,混匀并孵育3min;
步骤二,取120μL试剂R2加入上述混合溶液中,并混合均匀;
步骤三,通过全自动生化分析仪7180在570nm处分别读取第一读数点透射吸光度A1和第二读数点透射吸光度A2;
步骤五,通过软件计算出△A=A2-A1并根据校准曲线计算出被测样本中胃蛋白酶原II的浓度。
对胃蛋白酶原II试剂线性范围测定:用PGII校准品配制成高浓度样本,用生理盐水按常规比例分别进行倍比稀释,使用实施例2中PGII试剂R1、R2重复测定每个样本3次,计算均值,求出回归方程,并通过回归方程计算出理论值,所得结果详见图1。从结果可以得出,胃蛋白酶原II试剂线性范围为2.0-70μg/L,检测灵敏度高且线性宽,满足临床高灵敏度、宽线性的检测需求。
将本发明PGII检测方法与国内某知名品牌比对试剂检测方法进行相关性试验,对80例血清样本进行测定,对测定值进行相关性分析,结果如图2,本发明PGII检测方法与国内某知名品牌比对试剂检测方法相关系数R2=0.9959,表明本发明检测方法与国内某知名品牌比对试剂检测方法具有良好的相关性。
最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种抗胃蛋白酶原II单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体为抗体3G10;
所述抗体3G10的氨基酸序列为:VH CDR1如SEQ ID NO.10所示;VH CDR2如SEQ IDNO.11所示;VH CDR3如SEQ ID NO.12所示;VL CDR1如SEQ ID NO.13所示;VL CDR2如SEQ IDNO.14所示;VL CDR3如SEQ ID NO.15所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体,其特征在于,所述抗体3G10的可变区氨基酸序列为:重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示;轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体的重链恒定区是IgG重链恒定区;所述单克隆抗体的轻链恒定区是κ轻链恒定区。
4.根据权利要求1所述的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体带有标记。
5.一种如权利要求1至4任一项所述的抗胃蛋白酶原II的单克隆抗体的制备方法,其特征在于,包括:
在允许所述单克隆抗体表达的条件下,培养宿主细胞;
从培养的宿主细胞培养物中回收所述单克隆抗体。
6.一种分离的核酸分子,其特征在于,所述分离的核酸分子用于编码制备如权利要求1至4任一项所述的单克隆抗体。
7.一种载体,其特征在于,包括如权利要求6所述的分离的核酸分子。
8.根据权利要求8所述的载体,其特征在于,所述载体为克隆载体或表达载体。
9.一种检测胃蛋白酶原II的试剂盒,其特征在于,包括如权利要求1至4任一项所述的单克隆抗体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310640918.1A CN116640221A (zh) | 2022-06-07 | 2022-06-07 | 一种抗胃蛋白酶原ii的单克隆抗体及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210636189.8A CN114835814B (zh) | 2022-06-07 | 2022-06-07 | 一种抗胃蛋白酶原ii的单克隆抗体及其制备方法和应用 |
CN202310640918.1A CN116640221A (zh) | 2022-06-07 | 2022-06-07 | 一种抗胃蛋白酶原ii的单克隆抗体及其制备方法和应用 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210636189.8A Division CN114835814B (zh) | 2022-06-07 | 2022-06-07 | 一种抗胃蛋白酶原ii的单克隆抗体及其制备方法和应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116640221A true CN116640221A (zh) | 2023-08-25 |
Family
ID=82574444
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210636189.8A Active CN114835814B (zh) | 2022-06-07 | 2022-06-07 | 一种抗胃蛋白酶原ii的单克隆抗体及其制备方法和应用 |
CN202310640918.1A Pending CN116640221A (zh) | 2022-06-07 | 2022-06-07 | 一种抗胃蛋白酶原ii的单克隆抗体及其制备方法和应用 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210636189.8A Active CN114835814B (zh) | 2022-06-07 | 2022-06-07 | 一种抗胃蛋白酶原ii的单克隆抗体及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (2) | CN114835814B (zh) |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07304800A (ja) * | 1994-05-06 | 1995-11-21 | Nippon Igaku Rinshiyou Kensa Kenkyusho:Kk | ヒトペプシノゲンに対するモノクローナル抗体 |
CN111217911B (zh) * | 2018-11-26 | 2021-10-12 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | 一种抗人胃蛋白酶原ii的重组抗体 |
CN111217912B (zh) * | 2018-11-26 | 2022-11-08 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | 一种抗pgⅱ的抗体及其应用 |
CN109991409B (zh) * | 2018-12-03 | 2022-03-04 | 浙江聚康生物工程有限公司 | 胃蛋白酶原i/胃蛋白酶原ii检测试剂盒 |
CN113045666B (zh) * | 2021-03-23 | 2021-12-07 | 中元汇吉生物技术股份有限公司 | 胃蛋白酶原ii单克隆抗体及其应用 |
CN113004412B (zh) * | 2021-03-23 | 2021-12-03 | 中元汇吉生物技术股份有限公司 | 胃蛋白酶原i单克隆抗体及其应用 |
CN113046324A (zh) * | 2021-04-12 | 2021-06-29 | 黎榕萍 | 一种胃蛋白酶原ⅱ重组蛋白及其单克隆抗体和制备方法及应用 |
-
2022
- 2022-06-07 CN CN202210636189.8A patent/CN114835814B/zh active Active
- 2022-06-07 CN CN202310640918.1A patent/CN116640221A/zh active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114835814B (zh) | 2023-08-25 |
CN114835814A (zh) | 2022-08-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220056112A1 (en) | MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST SARS-CoV-2 NUCLEOCAPSID PROTEIN AND USES THEREOF | |
JP7200375B2 (ja) | ヒト抗ミュラー管ホルモンに対する特異抗体およびその使用 | |
CN109336973B (zh) | 抗转铁蛋白抗体及其用途 | |
Hinz et al. | A generic procedure for the isolation of pH-and magnesium-responsive chicken scFvs for downstream purification of human antibodies | |
US11884743B2 (en) | Preparation and application of an intact recombinant antibody specific to clothianidin based on the identified variable region sequence | |
CN112409487B (zh) | 抗可溶性转铁蛋白受体抗体及其应用 | |
CN114835814B (zh) | 一种抗胃蛋白酶原ii的单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
CN114835815B (zh) | 一种抗胃蛋白酶原i的单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
CN113234156B (zh) | 一种抗肌红蛋白的抗体及其制备方法和应用 | |
US20210380719A1 (en) | Rabbit antibodies to human immunoglobulins g | |
CN117106091A (zh) | 抗人免疫球蛋白g4单克隆抗体及制备方法、载体、试剂盒 | |
CN116813787A (zh) | 抗人免疫球蛋白g4单克隆抗体及制备方法、载体、试剂盒 | |
CN115109155A (zh) | 一种抗人pla2r抗体标准品的制备方法 | |
Lütkecosmann et al. | A cross-reactive monoclonal antibody as universal detection antibody in autoantibody diagnostic assays | |
WO2019189882A1 (ja) | Ncc-st-439抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体およびその製造方法。 | |
CN117264072B (zh) | 一种抗sn38单抗及其应用 | |
Ma et al. | Generation and optimisation of antibodies for biosensor applications | |
CN112646029B (zh) | 成熟脑源性神经营养因子的抗体及其应用和诊断试剂盒 | |
CN112574305B (zh) | 针对前体脑源性神经营养因子的抗体及其应用 | |
CN117304327B (zh) | 一种抗山羊IgG的兔单克隆抗体及其应用 | |
WO2023109785A1 (zh) | 一种用于检测血清中sTNFR2的抗体及试剂盒 | |
CN108727493B (zh) | 抗Stathmin单克隆抗体及其用途 | |
CN115925924A (zh) | 用于检测tsp-1特异性肽段的抗体及其用途 | |
CN118440194A (zh) | 用于检测鼠白介素-2的抗体、抗体对及检测试剂或试剂盒 | |
CN118684779A (zh) | 一种抗Trop2单克隆抗体药物或其衍生物的特异性结合剂及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |