CN116617210A - 一种小分子化合物在抗病毒感染中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于生物医药技术领域，提供了一种小分子化合物在抗病毒感染中的应用，所述小分子化合物选自化合物Etoposid及其类似物和/或衍生物，其应用包括制备抗病毒产品、制备抑制病毒产品和制备预防病毒感染产品中的一种或多种组合；所述化合物Etoposid的化学结构式如下式所示：。本发明通过揭示人CUL4B‑DDB1‑RBX1‑PRPF19 E3泛素连接酶复合体降解新型冠状病毒ORF6蛋白的作用，进而明确了CUL4B激活剂Etoposid具有抑制新型冠状病毒的作用，将对于新冠病毒感染的临床治疗与预防具有巨大意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种小分子化合物在抗病毒感染中的应用。
背景技术
新型冠状病毒ORF6蛋白是新型冠状病毒的附属蛋白之一，在病毒感染阶段，具有强烈抑制宿主抗病毒免疫，保证病毒稳定复制的重要作用，是一个理想的药物设计靶点。本发明在前期研究中发现人体内CUL4B-DDB1-RB
X1-PRPF19 E3泛素连接酶复合体，可以通过对ORF6蛋白进行多聚泛素化，进而诱导ORF6蛋白降解，最终抑制病毒的免疫逃逸，恢复宿主免疫系统功能，抵抗病毒复制。基于此研究，上调CUL4B的泛素化活性进而促进ORF6的降解可成为抑制新型冠状病毒的有效治疗手段。为此我们提出一种小分子化合物在抗病毒感染中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小分子化合物在抗病毒感染中的应用，旨在解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种小分子化合物在抗病毒感染中的应用，所述小分子化合物选自化合物Etoposid及其类似物和/或衍生物，其应用包括制备抗病毒产品、制备抑制病毒产品和制备预防病毒感染产品中的一种或多种组合；
所述化合物Etoposid的化学结构式如下式所示：
。
进一步的，所述病毒为新型冠状病毒。
进一步的，所述抑制病毒产品用于抑制新型冠状病毒复制。
进一步的，所述产品为试剂盒、食品、保健品和药品中的一种或多种组合，所述产品中Etoposid的含量不低于2 mg/kg。
进一步的，所述试剂盒为包含Etoposid及其类似物和/或衍生物成分的试剂，以及含有Etoposid及其类似物和/或衍生物成分并配合其他试剂组成整套的试剂盒。
进一步的，所述食品为包含Etoposid及其类似物和/或衍生物成分的可食用物品。
进一步的，所述保健品为包含Etoposid及其类似物和/或衍生物成分的具有预防或保健作用的食品。
进一步的，所述药品为包含Etoposid及其类似物和/或衍生物成分的药物制剂。
进一步的，所述药物制剂的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、分散剂、注射剂和喷雾剂中的一种或多种组合。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
该小分子化合物在抗病毒感染中的应用，通过揭示人CUL4B-DDB1-RBX
1-PRPF19 E3泛素连接酶复合体降解新型冠状病毒ORF6蛋白的作用，进而明确了CUL4B激活剂Etoposid具有抑制新型冠状病毒的作用；Etoposid能够降低病毒在小鼠体内的复制，减轻小鼠肺组织病变，增加小鼠体重，全面改善小鼠面对新冠病毒感染所带来的病理改变，将对于新冠病毒（SARS-CoV-2）感染的临床治疗与预防具有巨大意义和应用价值。
附图说明
图1为Etoposid促进新型冠状病毒ORF6蛋白降解的示意图。
图2为Etoposid抑制新型冠状病毒在细胞水平复制的示意图。
图3为Etoposid抑制新型冠状病毒在小鼠体内复制的示意图。
图4为Etoposid减轻小鼠肺部由病毒感染造成损伤的示意图。
图5为Etoposid恢复小鼠由病毒感染造成的体重减轻的示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
本发明一个实施例提供的一种小分子化合物在抗病毒感染中的应用，所述小分子化合物选自化合物Etoposid及其类似物和/或衍生物，其应用包括制备抗病毒产品、制备抑制病毒产品和制备预防病毒感染产品中的一种或多种组合；
所述化合物Etoposid的化学结构式如下式所示：
。
作为本发明的一种优选实施例，所述病毒为新型冠状病毒。
作为本发明的一种优选实施例，所述抑制病毒产品用于抑制新型冠状病毒复制。
作为本发明的一种优选实施例，所述产品为试剂盒、食品、保健品和药品中的一种或多种组合，所述产品中Etoposid的含量不低于2 mg/kg。
作为本发明的一种优选实施例，所述试剂盒为包含Etoposid及其类似物和/或衍生物成分的试剂，以及含有Etoposid及其类似物和/或衍生物成分并配合其他试剂组成整套的试剂盒。
作为本发明的一种优选实施例，所述食品为包含Etoposid及其类似物和/或衍生物成分的可食用物品。
作为本发明的一种优选实施例，所述保健品为包含Etoposid及其类似物和/或衍生物成分的具有预防或保健作用的食品。
作为本发明的一种优选实施例，所述药品为包含Etoposid及其类似物和/或衍生物成分的药物制剂。
作为本发明的一种优选实施例，所述药物制剂的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、分散剂、注射剂和喷雾剂中的一种或多种组合。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施材料：本发明实施例中所列的材料和耗材如无特殊指明均可从市售渠道获得，细胞与病毒来自于ATCC或其他相关机构的细胞与微生物资源库，质粒载体来自于Addgene、独立构建或学术材料交流。
下述实验方法为标准的分子生物学、细胞生物学或病毒学等操作程序，领域内的研究人员可以方便的理解和操作。
实施例1：化合物Etoposid抑制新型冠状病毒在CACO2细胞中感染作用的检测：以往研究显示，CACO2细胞表面表达新型冠状病毒受体（ACE2），是新冠病毒的天然靶细胞系。因此，本发明在此细胞中鉴定了Etoposid化合物对新型冠状病毒的抑制作用。
具体操作如下：
步骤一、正常的CACO2细胞（来自于ATCC，HTB-37）被计数，并种于12孔板中（4*105个/孔），与此同时，在细胞培养基中分别加入化合物Etoposid 10μM；
步骤二、次日，进行MOI为0.1的新型冠状病毒的感染，感染2小时后，对细胞进行换液处理（更换为含有10%胎牛血清的DMEM培养基）；
步骤三、感染48小时后收取细胞上清液，利用Trizol（Absin，货号：abs60154）提取RNA，并利用反转录试剂盒（Roche，货号：4896866001）进行反转录操作，得到新型冠状病毒的cDNA。
上述感染病毒实验均在P3实验室操作。
接下来，以cDNA为模板，利用SYBR Green（Roche，货号：491314001）和特异性引物（F：5’-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3’和R:5’-CAGACAT
TTTGCTCTCAAGCTG-3’）以及Roche 480实时定量PCR仪进行了新型冠状病毒的含量检测。
实验结果如图2 所示，10μM的化合物Etoposid即可抑制病毒至未加药组的1/6左右。
上述实验结果显示，Etoposid在细胞水平具有抑制病毒复制的作用。
实施例2：化合物Etoposid抑制新型冠状病毒在小鼠模型中感染作用的检测：为了进一步鉴定化合物Etoposid在体内抑制新型冠状病毒的作用，我们选择了BALB/C小鼠模型进行测试。
具体操作如下：
步骤一、购买6周龄BALB/C雌性小鼠48只（维通利华），随机分成三组，每组16只小鼠；
步骤二、对小鼠进行腹腔注射给药（药物溶剂为含有8%DMSO的生理盐水，药物为化合物Etoposid），给药剂量分别为0mg/kg，1mg/kg和3mg/kg；隔一天给药一次，共计给药4次；
步骤三、将上述每组小鼠都平均分成两组，一组进行新型冠状病毒的攻毒（攻毒剂量：病毒滴度为1*105.5TCID50/ml，30μl），对照组采用培养基进行对照；攻毒期间，每日测量小鼠体重，观察小鼠症状，并记录。
步骤四、攻毒7天后，取小鼠的肺组织和脾组织，并分别利用病毒RNA提取试剂盒（Qiagen，货号：52904）提取组织中病毒RNA，利用RT-qPCR方法分析组织中病毒载量；制备病理样本（将组织浸泡于4%多聚甲醛24小时）、RNA提取样本（将组织匀浆后，加入Trizol）和免疫印迹样本（将组织匀浆后加入5*上样缓冲液，并用沸水浴煮样20分钟）。
上述攻毒实验及样本采集工作均在P3实验中操作。
通过检测不同组小鼠肺组织中的病毒载量，本发明发现1mg/kg的化合物Etoposid便可将小鼠肺组织中病毒复制抑制到不加药组的1/50左右，而3mg/kg的化合物Etoposid则能够将小鼠肺组织中病毒复制抑制到不加药组的1/100左右（如图3所示）。
而病理检测中，我们也不难发现，无药物保护作用的小鼠肺泡已经出现坍塌，而有化合物Etoposid保护的小鼠肺泡组织依然完整（如图4所示）。
通过对小鼠体重的统计，我们也可以发现，给药组的小鼠体重下降情况明显优于未经化合物Etoposid保护的小鼠（如图5所示）。
上述实验结果均说明了化合物Etoposid在小鼠模型中能够抑制新型冠状病毒的复制，达到保护小鼠的作用，且没有对小鼠产生可观测的副作用影响。
本发明通过揭示人CUL4B-DDB1-RBX1-PRPF19 E3泛素连接酶复合体降解新型冠状病毒ORF6蛋白的作用，进而明确了CUL4B激活剂Etoposid具有抑制新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的作用。
进一步的体内攻毒实验表明，Etoposid能够降低病毒在小鼠体内的复制，减轻小鼠肺组织病变，改善小鼠体重减轻情况，改善小鼠面对新冠病毒感染所带来的病理改变。
本发明通过Etoposid提高人CUL4B泛素活性，进而增强人体对新型冠状病毒ORF6蛋白的降解作用，将对于新冠病毒（SARS-CoV-2）感染的临床治疗与预防具有巨大意义和应用价值。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些均不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
Claims (9)
1.一种小分子化合物在抗病毒感染中的应用，其特征在于：
所述小分子化合物选自化合物Etoposid及其类似物和/或衍生物，其应用包括制备抗病毒产品、制备抑制病毒产品和制备预防病毒感染产品中的一种或多种组合；
所述化合物Etoposid的化学结构式如下式所示：
。
2.根据权利要求1所述的小分子化合物在抗病毒感染中的应用，其特征在于，所述病毒为新型冠状病毒。
3.根据权利要求2所述的小分子化合物在抗病毒感染中的应用，其特征在于，所述抑制病毒产品用于抑制新型冠状病毒复制。
4.根据权利要求1所述的小分子化合物在抗病毒感染中的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒、食品、保健品和药品中的一种或多种组合，所述产品中Etoposid的含量不低于2mg/kg。
5.根据权利要求4所述的小分子化合物在抗病毒感染中的应用，其特征在于，所述试剂盒为包含Etoposid及其类似物和/或衍生物成分的试剂，以及含有Etoposid及其类似物和/或衍生物成分并配合其他试剂组成整套的试剂盒。
6.根据权利要求4所述的小分子化合物在抗病毒感染中的应用，其特征在于，所述食品为包含Etoposid及其类似物和/或衍生物成分的可食用物品。
7.根据权利要求4所述的小分子化合物在抗病毒感染中的应用，其特征在于，所述保健品为包含Etoposid及其类似物和/或衍生物成分的具有预防或保健作用的食品。
8.根据权利要求4所述的小分子化合物在抗病毒感染中的应用，其特征在于，所述药品为包含Etoposid及其类似物和/或衍生物成分的药物制剂。
9.根据权利要求8所述的小分子化合物在抗病毒感染中的应用，其特征在于，所述药物制剂的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、分散剂、注射剂和喷雾剂中的一种或多种组合。
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Non-Patent Citations (1)
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| H.U. RASHID, N. AHMAD, M. ABDALLA ET AL: "Molecular docking and dynamic simulations of Cefixime, Etoposide and Nebrodenside A against the pathogenic proteins of SARS-CoV-2", JOURNAL OF MOLECULAR STRUCTURE, vol. 1247, pages 1 - 14 * |
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