CN116615191A

CN116615191A - 化合物、组合物、生物体组织脆化剂、生物体组织表面的剥离方法和生物体组织剥离试剂盒

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Publication number: CN116615191A
Application number: CN202180086614.4A
Authority: CN
Inventors: 村上雄太; 中井健一朗; 太田希; 元藤梓平; 中村哲也; 松本有加
Original assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd; Saitama Medical University
Current assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd; Saitama Medical University
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2021-12-21
Publication date: 2023-08-18
Also published as: JPWO2022138626A1; WO2022138626A1; EP4269467A1; US20240059644A1

Abstract

通式(1)或通式(2)所示的化合物(Z)。[通式(1)和通式(2)中，X各自独立地为羧基、羧酸酯基或通式(3)所示的1价基团；通式(1)和通式(2)中的多个X中的至少1个为羧基或羧酸酯基；通式(1)和通式(2)中的多个X中的至少1个为通式(3)所示的1价基团。]‑C(O)‑Y‑(AO)_n‑R(3)[通式(3)中，‑Y‑为‑O‑、‑NH‑或‑S‑；A为碳原子数2～4的亚烷基；R为氢原子或氢原子可以被碳原子数1～10的烷氧基取代的碳原子数1～15的1价烃基；n为4～1000的整数；n个存在的A中的至少1个为亚乙基；在通式(1)和通式(2)中具有多个通式(3)所示的1价基团的情况下，‑Y‑、A、R和n相同或不同。]

Description

化合物、组合物、生物体组织脆化剂、生物体组织表面的剥离方法和生物体组织剥离试剂盒

技术领域

本发明涉及化合物、组合物、生物体组织脆化剂、生物体组织表面的剥离方法和生物体组织剥离试剂盒。

背景技术

随着再生医疗技术的发展，生物体组织表面的加工、细胞的移植得到了实用化。这种技术对于异常组织的除去、顽固性炎症组织的修复是有用的。作为肠道中的顽固性疾病之一、因小肠的广泛切除而产生的短肠综合征是由于残留肠功能障碍而需要长期的全胃肠外营养(TPN)或小肠移植的顽固性疾病。有时也进行小肠移植治疗，但术后的排斥反应和供体不足是重要的课题，尚未确立实用的治疗法。

对于短肠综合征需要划时代的治疗，在再生医疗领域进行了大量研究。近年来，其中肠道类器官在小肠功能再生中的利用受到关注。例如报道了下述方法：通过螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)产生的生物体组织脆化作用和之后的机械刺激将小鼠大肠上皮剥离，向其中移植小肠类器官，能够在动物个体内长期维持(例如非专利文献1～3)。

需要说明的是，非专利文献3是在本国际专利申请的优先日后发行的文献。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Genes and Development 2014年28卷1752-1757页

非专利文献2：Cell Stem Cell 2018年22卷1-6页

非专利文献3：Nature,2021,Vol.592,1April,99-104

发明内容

发明所要解决的课题

但是，在上述非专利文献的方法中，在大肠上皮剥离时EDTA会漏到血液中而流入体循环，有可能引起低钙血症等严重的副作用。因此，在使EDTA等螯合剂作用于正常粘膜上皮而将粘膜上皮剥离时，抑制粘膜损伤、螯合剂的血中转移等使风险最小化成为课题。

本发明是鉴于再生医疗中的生物体组织的加工和修复而完成的，本发明的目的在于提供兼顾作为生物体组织脆化剂的效果和对生物体的安全性的材料，并且提供安全的生物体组织表面的剥离方法。

用于解决课题的手段

本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果完成了本发明。

即，本发明涉及通式(1)或通式(2)所示的化合物(Z)；含有上述化合物(Z)的组合物；含有上述化合物(Z)的生物体组织脆化剂；一种生物体组织表面的剥离方法，其包括：使上述化合物(Z)与生物体组织接触而使上述生物体组织的表面脆化的步骤；和从上述生物体组织的脆化的表面部分剥离细胞组织的步骤；以及一种生物体组织剥离试剂盒，其包含上述生物体组织脆化剂。

[化1]

[化2]

[通式(1)和通式(2)中，X各自独立地为羧基、羧酸酯基或通式(3)所示的1价基团；

通式(1)和通式(2)中的多个X中的至少1个为羧基或羧酸酯基；

通式(1)和通式(2)中的多个X中的至少1个为通式(3)所示的1价基团。]

-C(O)-Y-(AO)_n-R(3)

[通式(3)中，-Y-为-O-、-NH-或-S-；A为碳原子数2～4的亚烷基；R为氢原子或者氢原子可以被碳原子数1～10的烷氧基取代的碳原子数1～15的1价烃基；n为4～1000的整数；n个存在的A中的至少1个为亚乙基；在通式(1)和通式(2)中具有多个通式(3)所示的1价基团的情况下，-Y-、A、R和n相同或不同。]

发明的效果

根据本发明，可以提供兼顾作为生物体组织脆化剂的效果和对生物体的安全性的材料，并且提供安全的生物体组织表面的剥离方法。

另外，可以提供对再生医疗中的组织的加工、修复有用的生物体组织脆化剂，能够简便地利用安全性高的方法对想要剥离除去的组织进行加工、修饰。特别是，在剥离粘膜上皮、向剥离部位移植新的类器官等的情况下是有用的。

具体实施方式

本发明涉及一种化合物(Z)，其由通式(1)或通式(2)表示。

[化3]

[化4]

通式(1)和通式(2)中，X各自独立地为羧基、羧酸酯基或通式(3)所示的1价基团。

另外，通式(1)和通式(2)中的多个X中的至少1个为羧基或羧酸酯基。从生物体组织脆化作用的观点出发，优选至少2个为羧基或羧酸酯基，进一步优选至少3个为羧基或羧酸酯基。

另外，通式(1)和通式(2)中的多个X中的至少1个为通式(3)所示的1价基团。从对生物体的安全性的观点出发，优选至少2个为通式(3)所示的1价基团。

氨基多羧酸型化合物在工业用途中一直被用作螯合剂，“DTPA(对应于通式(2)的骨架)”与“EDTA(对应于通式(1)的骨架)”相比具有几乎同等的螯合物生成能力。关于对钙离子的稳定常数(logK)，EDTA为10.9，DTPA为10.7。另外，关于安全性，已知将Ca-EDTA和Ca-DTPA分别对比格犬静脉给药1个月时没有大幅差异。

因此认为，从螯合能力和安全性的观点出发，通式(1)或通式(2)所示的化合物显示出同样的效果。

通式(1)和通式(2)中的X为羧酸酯基的情况下，羧酸酯基的抗衡离子可以举出碱金属离子(钠离子和钾离子等)和碱土金属离子(钙离子等)等，优选为钠离子。

-C(O)-Y-(AO)_n-R(3)

通式(3)中，-Y-为-O-、-NH-或-S-。-Y-优选为-O-。

即使-Y-为-NH-或-S-，由于具有未共享孤对电子的杂原子，它们也发挥出与Y为-O-时同样的螯合效果。另外，即使-Y-为-NH-或-S-，与-Y-为-O-时相比安全性也同等。

另外，通式(3)中，A为碳原子数2～4的亚烷基(亚乙基、1,2-亚丙基或1,3-亚丙基、1,2-亚丁基、1,3-亚丁基、1,4-亚丁基或2,3-亚丁基等)。

另外，通式(3)中，R为氢原子或者氢原子可以被碳原子数1～10的烷氧基取代的碳原子数1～15的1价烃基(甲基、乙基、异丙基、叔丁基、新戊基和十四烷基等)。

另外，通式(3)中，n为4～1000的整数。从对生物体的安全性的观点出发，n优选为10～500。另外，从生物体组织脆化作用的观点出发，n更优选为4～100、进一步优选为4～50。

需要说明的是，通式(3)中，n个存在的A中的至少1个为亚乙基。从制剂稳定性以及对生物体的安全性的观点出发，优选n个存在的A中的85％以上的个数为亚乙基。

需要说明的是，无论A的亚烷基的碳原子数为2～4中的哪一者，均同样地发挥出螯合效果。另外，无论A的亚烷基的碳原子数为2～4中的哪一者，安全性均同等。

需要说明的是，通式(1)和通式(2)中，在具有多个通式(3)所示的1价基团的情况下，Y、A、R和n相同或不同。

从生物体组织脆化作用的观点出发，以化合物(Z)的重量为基准，上述化合物(Z)所具有的羧基和羧酸酯基的合计摩尔数优选为0.04～14mmol/g、进一步优选为0.04～5mmol/g。

从对生物体的安全性的观点出发，上述化合物(Z)的重均分子量优选为500～20000、更优选为500～10000、进一步优选为2000～10000。

另外，在含有多种通式(1)或通式(2)所示的化合物(Z)的组合物的情况下，相当于化合物(Z)的所有化合物的重均分子量优选为上述范围。

本发明中，重均分子量可以通过下述方法测定。

装置主体：HLC-8320GPC(东曹株式会社制造)

柱：东曹株式会社制造TSK gel Super AW

检测器：RI(折射率)

洗脱液：0.01M LiBr·DMF

洗脱液流量：0.6ml/分钟

柱温：40℃

试样浓度：0.125重量％

注入量：20μl

标准物质：东曹株式会社制造TSK标准聚环氧乙烷

从对生物体的安全性的观点出发，上述化合物(Z)的数均分子量优选为500～20000、更优选为500～10000、进一步优选为2000～10000。

另外，在含有多种通式(1)或通式(2)所示的化合物(Z)的组合物的情况下，相当于化合物(Z)的所有化合物的数均分子量优选为上述范围。

本发明中，数均分子量可以通过下述方法测定。

数均分子量可以使用¹H-NMR进行测定。例如，化合物(Z)为通式(1)中具有1个通式(3)所示的1价基团的化合物与通式(1)中具有2个通式(3)所示的1价基团的化合物的混合物、且A为碳原子数2的亚烷基的情况下，可以通过以下的方法算出。

可以由通式(1)中具有1个通式(3)所示的1价基团的化合物与通式(1)中具有2个通式(3)所示的1价基团的化合物的摩尔比(α：β)和¹H-NMR中的来自A的亚甲基的信号的积分值(γ)如下算出。其中，在算出¹H-NMR的积分值的情况下，将来自通式(1)中夹在2个氮之间的2个亚甲基的信号的合计积分值设为4。

n_sum＝γ/{[4×α+8×β]/(α+β)}

(数均分子量)＝44×n_sum+292

<¹H-NMR的评价条件>

溶剂：氘代DMSO

装置：AVANCE III HD400(Bruker Japan株式会社制造)

频率：400MHz

上述的化合物(Z)可以通过以下的方法制造。

将EDTA二酐和水(优选相对于EDTA二酐为1摩尔当量)在有机溶剂(DMF等)中在70～80℃下混合(优选混合2～4小时)，由此得到EDTA单酐。

接着，添加碱性化合物(三乙胺和二异丙基乙胺等)、通式(4)所示的化合物，在25～70℃下混合(优选混合2～24小时)，由此可以制造化合物(Z)[此时，得到具有1个通式(3)所示的1价基团的化合物(Z)作为主产物。通式(3)中的-Y-为-O-。]。

HO-(AO)_n-R(4)

需要说明的是，通式(4)中的A、R和n与通式(3)中的A、R和n相同。

另外，也可以使用下述化合物来代替通式(4)所示的化合物。

H₂N-(AO)_n-R(5)

HS-(AO)_n-R(6)

在使用通式(5)所示的化合物的情况下，通式(3)中的-Y-为-NH-，在使用通式(6)所示的化合物的情况下，通式(3)中的-Y-为-S-。

需要说明的是，通式(5)和(6)中的A、R和n与通式(3)中的A、R和n相同。

另外，即使是上述以外的方法，也可以通过例如以下的方法来制造。

将EDTA二酐和通式(3)所示的基团与羟基键合而成的化合物在有机溶剂(DMF等)中、在上述碱性化合物的存在下、在25～70℃下混合(优选混合2～24小时)，由此可以制造化合物(Z)[此时，得到具有2个通式(3)所示的1价基团的化合物(Z)作为主产物]。

本发明的组合物含有上述化合物(Z)。

上述的化合物(Z)可以单独使用1种，也可以合用2种以上。

本发明的组合物可以为粉末、片剂、凝胶、溶胶和溶液中的任一种，在溶液的情况下，优选除了上述化合物(Z)以外还含有水。

另外，除了上述化合物(Z)和水以外，本发明的组合物还可以在不妨碍发明效果的范围内含有盐(氯化钠等)等。

在组合物为溶液的情况下，从生物体组织脆化作用的观点出发，以组合物的重量为基准，上述化合物(Z)的重量比例优选为1～500mM、进一步优选为2～250mM。

本发明的组合物能够作为后述的生物体组织脆化剂使用，是有用的。

本发明的生物体组织脆化剂含有上述化合物(Z)。本发明的生物体组织脆化剂的优选方式与本发明的组合物相同。

生物体组织脆化剂可以为粉末、片剂、凝胶、溶胶和溶液中的任一种，在溶液的情况下，优选除了上述化合物(Z)以外还含有水。

另外，除了上述化合物(Z)和水以外，本发明的生物体组织脆化剂也可以在不妨碍发明效果的范围内含有盐(氯化钠等)等。

在生物体组织脆化剂为溶液的情况下，从生物体组织脆化作用的观点出发，以生物体组织脆化剂的重量为基准，上述化合物(Z)的重量比例优选为1～500mM、进一步优选为2～250mM。

作为成为生物体组织脆化剂的适用对象的生物体组织，可以举出消化道上皮、粘膜、皮肤、结缔组织等。生物体组织脆化主要用于在再生医疗中移植新细胞结构体时作为预处理从移植部位的上皮、粘膜中除去不要的组织，或除去损伤组织、坏死组织而促进组织再生的情况。该情况下，为了尽量不损伤基底组织，需要使侵袭度为最小限度，高效地去除要除去的目标组织。从该观点出发，本发明人以登记于日本药典、在医疗领域中也能够利用的EDTA为基础，为了在保持螯合能力的同时提高生物体作用的安全性，成功地创制了高功能复合体。

作为上述生物体组织，在以消化道为靶标的情况下，从生物体组织脆化的观点出发，优选为大肠上皮和小肠上皮。可以考虑将大肠上皮剥离除去，在该部位移植各种类器官(大肠类器官和小肠类器官等)。

本发明的生物体组织脆化剂将细胞粘附所需的钙等离子螯合，使细胞间粘附脆弱化，发挥细胞游离功能。因此，在应用于生物体组织的情况下，只要是使本剂接触的步骤，则固定、涂布、停留等手法不限。另外，组织脆化后的组织除去只要是剥离、摩擦、清洗等使细胞、结缔组织游离的方法，则可以是任意方法。此外，向利用本剂进行了组织脆化、除去的部位移植细胞、组织的类器官等的操作也没有特别限定。另外，所移植的细胞、组织的结构体可以应用片、块、类器官等任意形状。

例如，通过本发明的生物体组织表面的剥离方法，能够剥离大肠上皮、移植其他组织，能够对生物体组织赋予与移植的组织相应的特性。在将本技术应用于短肠综合征的再生医疗治疗法的情况下，优选小肠类器官(记载于非专利文献1～2等)。

另外，本发明的生物体组织脆化剂也能够用于除去达到溃疡、损伤、坏死等的皮肤组织的清创术，也能够应用于健康组织的再生。在褥疮部位的伤口的清洁、肛瘘或外科手术后的瘘管的清洁、炎症粘膜的剥离及清洗等中，此外，若为皮下组织或体腔内，也可以将本剂作为剥离辅助剂应用于脏器或组织存在不良情况的粘连部位，以促进粘连修复为目的而使用。在外科手术时，组织、脏器的粘连有时会使手术变得困难，在这种情况下，本发明的技术也提供有效的解决手段。

此外，在皮肤护理领域，将本剂用作除去旧角质层的化学剥离中的辅助剂，能够在将皮肤刺激调整为最小限度的同时有效地除去角质层。

另外，也能够广泛用于临床检查时的粘膜组织的剥离分离。即使在以往那样想要通过切除、刮擦、擦拭等操作取得组织片的情况下，本发明的生物体组织脆化剂也能够从目标组织表面以在细胞生物化学上保持一定结构的形式剥离取得组织片，因此能够有效用作适于临床检查中的组织病理诊断、细胞诊断中的三维观察的组织采集法。例如，在宫颈癌检查等中有用。

具体而言，通过后述的本发明的生物体组织表面的剥离方法进行说明，但只要能够与目标部位的生物体组织表面接触一定时间，应用本发明的生物体组织脆化剂的形态可以为粉末、片剂、凝胶、溶胶、霜剂、贴剂、贴片、溶液中的任一种。例如，使凝胶与粘膜上皮部位接触，经过一定时间后，通过清洗剥离或摩擦剥离将接触部位的组织除去是优选的方法之一。另外，作为使本剂与目标部位接触的方法，可以使用探针、导管、注射、喷雾、内窥镜、腹腔镜、胸腔镜、贴附材料、刷子等作为接触用器材，在接触一定时间后除去本发明的生物体组织脆化剂时，通过施加清洗、抽吸、剥离等操作，实现接触部位的除去。

本发明的生物体组织表面的剥离方法为包括下述步骤的方法：使上述化合物(Z)与生物体组织接触而使上述生物体组织的表面脆化的步骤(以下有时简称为“脆化步骤”)；和从上述生物体组织的脆化的表面部分剥离细胞组织的步骤(以下有时简称为“剥离步骤”)。

此处，本发明中，生物体组织的表面只要是细胞以表层状结合的状态即可，不限于上述的皮肤、消化道上皮、外部粘膜等，是还包括器官内部存在的表面的概念。

作为上述脆化步骤的具体方式，可以举出以下的内容。

作为与生物体组织脆化剂所含有的化合物(Z)接触的方法，可以举出下述方法等：通过外科方法使希望脆化的生物体组织(接触部位)露出(可以使用上述非专利文献1和非专利文献2等中记载的方法等)，利用探针、导管、注射、喷雾对生物体组织脆化剂进行给药。

例如，在希望脆化的生物体组织为大肠上皮的情况下，可以举出下述方法等：通过外科方法使大肠露出于腹腔外，利用导管向肠道内进行生物体组织脆化剂的给药。

生物体组织脆化剂优选在向希望脆化的生物体组织(接触部位)给药前加热至20～50℃。

作为上述剥离步骤的具体方式，可以举出以下内容。

作为从生物体组织的脆化的表面部分剥离细胞组织的方法，可以举出下述方法等：通过对接触部位实施清洗剥离(利用生理盐水等的清洗的压力进行剥离)和摩擦剥离[利用刷子(牙缝刷等)等的摩擦进行剥离]等，除去细胞组织。

剥离步骤优选在上述脆化步骤中使上述化合物(Z)与生物体组织接触后立即迅速地实施。

本发明的生物体组织表面的剥离方法可以在上述剥离步骤之后包括将生物体组织脆化剂从生物体除去的除去步骤。

作为除去生物体组织脆化剂的方法，可以举出通过实施清洗、抽吸等操作来除去生物体组织脆化剂的方法等。需要说明的是，上述除去步骤可以与剥离步骤中的清洗剥离和摩擦剥离同时实施。

本发明的生物体组织剥离试剂盒是包含本发明的生物体组织脆化剂作为必要构成的试剂盒。

上述生物体组织剥离试剂盒优选除了本发明的生物体组织脆化剂以外还包含用于注入生物体组织脆化剂的器具(探针、导管、注射、喷雾等)、剥离步骤中使用的材料(生理盐水和刷子等)。能够用于医疗用途或皮肤护理用途等。

实施例

以下，通过实施例具体说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。

需要说明的是，下文中的份表示重量份。

<制造例1：EDTA单酐的制造>

使EDTA二酐(东京化成工业株式会社制造)148.5份在90℃下溶解于DMF(富士胶片和光纯药株式会社制造)701份中，冷却至75℃后，用2小时滴加DMF 140.1份和水10.4份(相对于EDTA单酐为1摩尔当量)的混合物。滴加后在75℃混合2小时，抽滤由此析出的固体，从而以收率62％、纯度93重量％得到化合物(PX-1)(EDTA单酐)。

<制造例2：通式(4)所示的化合物的制造方法>

将甲氧基聚乙二醇[通式(4)所示的化合物(n＝12为主成分)、数均分子量550、日油株式会社制造“UNIOX M-550”]275份和氢氧化钾水溶液[东亚合成株式会社制造“SuperCali”]0.40份投入带搅拌和温度调节功能的不锈钢制高压釜中，用氩气置换后减压，升温至130℃。

在2.7kPa、130℃下进行2小时脱水后，升温至150℃，以高压釜内压不会达到0.4MPa以上的方式在145～155℃的范围内用时5小时缓慢滴加环氧乙烷725份。滴加结束后，在145～155℃熟化1小时直至高压釜的内压显示为与滴加开始时相同的压力，得到通式(4)所示的化合物(n＝45的化合物为主成分)甲氧基聚乙二醇1000份。

<制造例3：通式(4)所示的化合物的制造方法>

将甲氧基聚乙二醇[通式(4)所示的化合物(n＝12为主成分)、数均分子量550、日油株式会社制造“UNIOX M-550”]137份和氢氧化钾水溶液[东亚合成株式会社制造“SuperCali”0.4份投入带搅拌和温度调节功能的不锈钢制高压釜中，用氩气置换后减压，升温至130℃。

在2.7kPa、130℃下进行2小时脱水后，将温度调节至120℃，以高压釜内压不会达到0.4MPa以上的方式在115～125℃的范围用时10小时缓慢滴加环氧乙烷863份。滴加结束后，在115～125℃熟化1小时直至高压釜的内压显示为与滴加开始时相同的压力，得到通式(4)所示的化合物(n＝90的化合物为主成分)甲氧基聚乙二醇1000份。

<实施例1：化合物(Z-1)的制造>

将甲氧基聚乙二醇[通式(4)所示的化合物(n＝12的化合物为主成分)、数均分子量550、日油株式会社制造“UNIOX M-550”]22份溶解于DMF107份中，在60℃依次投入二异丙基乙胺(东京化成工业株式会社制造)5份、制造例1中制造的化合物(PX-1)11份，在60℃混合5小时，加入叔丁基甲基醚(Nacalai Tesque制造)855份，进行抽滤，由此得到化合物(Z-1)[通式(1)中具有1个通式(3)所示的1价基团的化合物(Z-1-1)(82重量％)、通式(1)中具有2个通式(3)所示的1价基团的化合物(Z-1-2)(15重量％)]和作为杂质的甲氧基聚乙二醇(3重量％)的混合物。上述混合物100重量％中包含的化合物(Z-1)的纯度为97重量％。另外，上述混合物的收率为45％。

化合物(Z-1)的主成分(Z-1-1)和副成分(Z-1-2)的数均分子量分别为850和1400，化合物(Z-1)的主成分(Z-1-1)所具有的羧基的合计摩尔数以主成分(Z-1-1)的重量为基准计为1.2mmol/g，副成分(Z-1-2)所具有的羧基的合计摩尔数以副成分(Z-1-2)的重量为基准计为1.4mmol/g。

另外，与化合物(Z)相当的成分[主成分(Z-1-1)和副成分(Z-1-2)]的数均分子量为935，与化合物(Z)相当的成分所具有的羧基和羧酸酯基的合计摩尔数为1.2mmol/g。

需要说明的是，化合物(Z-1)的¹H-NMR谱图如下所示。

¹H-NMR(D₂O,400MHz):δ3.25(t,2H,-NCH₂CH₂N-),3.36(s,3H,-OMe),3.44(t,2H,-NCH ₂CH₂N-),3.58-3.80(m,PEG),3.90(s,4H,-NCH₂COOH and-NCH₂COO-),3.93(s,4H,-NCH₂COOH×2),4.33(m,2H,-COOCH₂CH₂O-)

<实施例2：化合物(Z-2)的制造>

将甲氧基聚乙二醇[通式(4)所示的化合物(n＝12的化合物为主成分)、数均分子量550、日油株式会社制造“UNIOX M-550”]46份溶解于DMF104份中，在25℃依次投入二异丙基乙胺10.5份、EDTA二酐10.5份，在60℃混合5小时，加入叔丁基甲基醚829份，进行抽滤，由此得到化合物(Z-2)[通式(1)中具有1个通式(3)所示的1价基团的化合物(Z-2-2)(2重量％)、通式(1)中具有2个通式(3)所示的1价基团的化合物(Z-2-1)(95重量％)]和作为杂质的甲氧基聚乙二醇(3重量％)的混合物。上述混合物100重量％中包含的化合物(Z-2)的纯度为97重量％。另外，上述混合物的收率为86％。

化合物(Z-2)的主成分(Z-2-1)和副成分(Z-2-2)的数均分子量分别为1400和850，化合物(Z-2)的主成分(Z-2-1)所具有的羧基的合计摩尔数以(Z-2-1)的重量为基准计为1.4mmol/g，副成分(Z-2-2)所具有的羧基的合计摩尔数以副成分(Z-2-2)的重量为基准计为1.2mmol/g。

另外，与化合物(Z)相当的成分[主成分(Z-2-1)和副成分(Z-2-2)]的数均分子量为1390，与化合物(Z)相当的成分所具有的羧基和羧酸酯基的合计摩尔数为1.4mmol/g。

需要说明的是，化合物(Z-2)的¹H-NMR谱图如下所示。

¹H-NMR(D₂O,400MHz):δ3.30(s,4H,-NCH₂CH₂N-),3.31(s,6H,-OMe×2),3.50-3.86(m,PEG),4.02(m,4H,-NCH₂COOH×2),4.35(m,4H,-COOCH₂CH₂O-×2)

<实施例3：化合物(Z-3)的制造>

将制造例2中制造的甲氧基聚乙二醇23.5份溶解于DMF 110.5份中，在60℃依次投入二异丙基乙胺0.5份、制造例1中制造的化合物(PX-1)3.5份，在60℃混合5小时，加入叔丁基甲基醚862份，进行抽滤，由此得到化合物(Z-3)[通式(1)中具有1个通式(3)所示的1价基团的化合物(Z-3-1)(83重量％)、通式(1)中具有2个通式(3)所示的1价基团的化合物(Z-3-2)(11重量％)]和作为杂质的甲氧基聚乙二醇(6重量％)的混合物。上述混合物100重量％中包含的化合物(Z-3)的纯度为94重量％。另外，上述混合物的收率为64％。

化合物(Z-3)的主成分(Z-3-1)和副成分(Z-3-2)的数均分子量分别为2300和4300，化合物(Z-3)的主成分(Z-3-1)所具有的羧基的合计摩尔数以主成分(Z-3-1)的重量为基准计为0.4mmol/g，副成分(Z-3-2)所具有的羧基的合计摩尔数以副成分(Z-3-2)的重量为基准计为0.5mmol/g。

另外，与化合物(Z)相当的成分[主成分(Z-3-1)和副成分(Z-3-2)]的数均分子量为2530，与化合物(Z)相当的成分所具有的羧基和羧酸酯基的合计摩尔数为0.4mmol/g。

需要说明的是，化合物(Z-3)的¹H-NMR谱图如下所示。

¹H-NMR(D₂O,400MHz):δ3.25(t,2H,-NCH₂CH₂N-),3.42(s,3H,-OMe),3.44(t,2H,-NCH ₂CH₂N-),3.59-3.79(m,PEG),3.90(s,4H,-NCH₂COOH and-NCH₂COO-),3.98(s,4H,-NCH₂COOH×2),4.35(m,2H,-COOCH₂CH₂O-)

<实施例4：化合物(Z-4)的制造>

将制造例2中制造的甲氧基聚乙二醇27份溶解于DMF 126份中，在25℃依次投入二异丙基乙胺2份、EDTA二酐2份，在60℃混合5小时，加入叔丁基甲基醚843份，进行抽滤，由此得到化合物(Z-4)[通式(1)中具有1个通式(3)所示的1价基团的化合物(Z-4-2)(1重量％)、通式(1)中具有2个通式(3)所示的1价基团的化合物(Z-4-1)(96重量％)]和作为杂质的甲氧基聚乙二醇(3重量％)的混合物。上述混合物100重量％中包含的化合物(Z-4)的纯度为97重量％。另外，上述混合物的收率为85％。

化合物(Z-4)的主成分(Z-4-1)和副成分(Z-4-2)的数均分子量分别为4300和2300，化合物(Z-4)的主成分(Z-4-1)所具有的羧基的合计摩尔数以主成分(Z-4-1)的重量为基准计为0.5mmol/g，副成分(Z-4-2)所具有的羧基的合计摩尔数以副成分(Z-4-2)的重量为基准计为0.4mmol/g。

另外，与化合物(Z)相当的成分[主成分(Z-4-1)和副成分(Z-4-2)]的数均分子量为4280，与化合物(Z)相当的成分所具有的羧基和羧酸酯基的合计摩尔数为0.5mmol/g。

需要说明的是，化合物(Z-4)的¹H-NMR谱图如下所示。

¹H-NMR(D₂O,400MHz):δ3.30(s,4H,-NCH₂CH₂N-),3.36(s,6H,-OMe×2),3.49-3.85(m,PEG),4.03(m,4H,-NCH₂COOH×2),4.36(m,4H,-COOCH₂CH₂O-×2)

<实施例5：化合物(Z-5)的制造>

将制造例3中制造的甲氧基聚乙二醇32.3份溶解于DMF 110.9份中，在60℃依次投入二异丙基乙胺1.4份、制造例1中制造的化合物(PX-1)3.4份，在60℃混合12小时，加入叔丁基甲基醚852份，进行抽滤，由此得到化合物(Z-5)[通式(1)中具有1个通式(3)所示的1价基团的化合物(Z-5-1)(82重量％)、通式(1)中具有2个通式(3)所示的1价基团的化合物(Z-5-2)(15重量％)]和作为杂质的甲氧基聚乙二醇(3重量％)的混合物。上述混合物100重量％中包含的化合物(Z-5)的纯度为97重量％。另外，上述混合物的收率为91％。

化合物(Z-5)的主成分(Z-5-1)和副成分(Z-5-2)的数均分子量分别为4300和8300，化合物(Z-5)的主成分(Z-5-1)所具有的羧基的合计摩尔数以主成分(Z-5-1)的重量为基准计为0.23mmol/g，副成分(Z-5-2)所具有的羧基的合计摩尔数以副成分(Z-5-2)的重量为基准计为0.24mmol/g。

另外，与化合物(Z)相当的成分[主成分(Z-5-1)和副成分(Z-5-2)]的数均分子量为4920，与化合物(Z)相当的成分所具有的羧基的合计摩尔数为0.2mmol/g。

需要说明的是，化合物(Z-5)的¹H-NMR谱图如下所示。

¹H-NMR(D₂O,400MHz):δ3.20(t,2H,-NCH₂CH₂N-),3.32(s,3H,-OMe),3.37(t,2H,-NCH ₂CH₂N-),3.55-3.75(m,PEG),3.88(s,4H,-NCH₂COOH and-NCH₂COO-),3.98(s,4H,-NCH₂COOH×2),4.30(m,2H,-COOCH₂CH₂O-)

对于实施例1～5中合成的化合物(Z-1)～(Z-5)，如下所述评价稳定性和螯合能力。

<化合物(Z)的稳定性评价(pH：7)>

将化合物(Z)以浓度为1重量％的方式溶解于重水中，得到试验用的溶液(溶液的pH为7)。

接着，在25℃、40℃或60℃的温度下静置3小时。

之后，使用¹H-NMR分析各溶液(条件如下所述)，计算出以下的α。

α＝100×[“4.3ppm附近的来自通式(3)的与酯键来源的氧原子相邻的亚甲基的信号的积分值”/2]/[“3.35ppm附近的来自通式(3)的R(甲基)的信号的积分值”/3]

接着，计算温度调节前后的α的保持率[100×(静置3小时后的α)/(静置3小时前的α)]]。将按照以下基准评价的结果示于表1。

来自通式(3)的酯键的保持率95％以上···◎

来自通式(3)的酯键的保持率90％以上且小于95％···○

来自通式(3)的酯键的保持率80％以上且小于90％···△

来自通式(3)的酯键的保持率小于80％···×

<¹H-NMR的评价条件>

溶剂：重水

装置：AVANCE III HD400(Bruker Japan株式会社制造)

频率：400MHz

<化合物(Z)的稳定性评价(pH：8)>

将化合物(Z)溶解于重水中，利用乙酸钠调整为pH8，最终将化合物(Z)的重量比例调整为1重量％，得到试验用的溶液。

在上述<化合物(Z)的稳定性评价(pH：7)>中，将试验用的溶液变更为上述得到的试验用的溶液，除此以外，与<化合物(Z)的稳定性评价(pH：7)>同样地进行试验，计算α的保持率。结果示于表1。

<化合物(Z)的稳定性评价(pH：4)>

将化合物(Z)溶解于重水中，利用乙酸调整为pH4，最终将化合物(Z)的重量比例调整为1重量％，得到试验用的溶液。

在上述<化合物(Z)的稳定性评价(pH：7)>中，作为试验用的溶液，将试验用的溶液变更为上述得到的试验用的溶液，除此以外，与<化合物(Z)的稳定性评价(pH：7)>同样地进行试验，计算α的保持率。结果示于表1。

α的保持率越高，表示化合物(Z)的稳定性越优异，越能够抑制由化合物(Z)生成引起低钙血症等严重副作用的EDTA。此处，如上所述，本发明的化合物(Z)即使在4～8之间改变pH，也能抑制EDTA的生成。因此，暗示本发明的化合物(Z)在生物体内的pH环境下也能够抑制EDTA的生成。

<PEG-EDTA的螯合能力评价>

将化合物(Z)与氯化钙以1：1的摩尔比混合，用离子交换水稀释成浓度为10ppm。对于该试样，利用LC/TOF-MS进行分子量测定(条件如下所述)，确认是否能够观测到来自化合物(Z)与钙离子的螯合物的信号。

将能够确认到来自化合物(Z)与钙离子的螯合物的信号的情况评价为○，将不能确认到来自螯合物的信号的情况评价为×。结果示于表1。

<利用LC/TOF-MS的评价条件>

装置主体：Waters公司制造

LC：Aquity UFLC,半微量型超高速LC

MS：SYNAPT HDMS,Q-TOF型混合MS

试样浓度：10ppm

注入量：0.2μl或1.0μl

[表1]

<实施例6～11：含有化合物(Z)的组合物的制造>

对于化合物(Z-1)一点一点地少量添加室温的水，利用涡旋混合器(KENIS株式会社制造Vortex-Genie 2)搅拌振荡，添加水直至全部溶解。用5分钟左右使其溶解，之后利用1M NaOH调整至pH8。之后，利用汉克斯平衡盐溶液(不含Ca、Mg，含有酚红)(Nacalai TesqueCat#17460-15)稀释成表2的摩尔浓度，得到组合物(C-1)～(C-6)。

<比较例1～7：含有比较用的化合物(Z’)的比较用的组合物的制造>

作为比较用的化合物(Z’-1)，利用下述方法制造含有Na₂EDTA(乙二胺四乙酸二钠)的组合物。

利用汉克斯平衡盐溶液(不含Ca、Mg，含有酚红)(Nacalai Tesque Cat#17460-15)将Na₂EDTA(0.5mol/l EDTA溶液pH 8.0Nacalai Tesque Cat#14347-21)稀释成表2的摩尔浓度，得到比较用的组合物(C’-1)～(C’-7)。

使用实施例中得到的组合物(C-1)～(C-6)和比较用的组合物(C’-1)～(C’-7)，利用下述方法评价性能。

<体外(in vitro)的隐窝分离效果的评价1>

将小鼠(C57B6/j 8周雄性日本CLEA)通过颈椎脱臼处死后，取出全长的大肠，利用汉克斯平衡盐溶液(不含Ca、Mg，含有酚红)(Nacalai Tesque Cat#17460-15)进行清洗。将肠道沿长轴方向展开，制成长度5mm的组织小片，逐个放入装有1ml汉克斯平衡盐溶液的1.5ml微管中。利用微管混合器(TOMY SEIKO CO.,LTD.制造MT-400)搅拌10分钟，清洗组织小片。清洗后，将组织小片移至加入有1ml新的汉克斯平衡盐溶液的1.5ml微管中，进行同样的清洗操作。将组织小片移至装有1ml组合物(C-1)～(C-6)或比较用组合物(C’-1)～(C’-7)的1.5ml微管中，在37℃静置30分钟。

经过30分钟后，将组织小片移至装有1ml汉克斯平衡盐溶液的1.5ml微管中，利用微管混合器搅拌5分钟，使隐窝游离。经过5分钟后，向装有组织的微管中添加0.5ml 4％多聚甲醛·磷酸缓冲液(Nacalai Tesque Cat#09154-85)，将组织固定。从其中采集50μl滴加到皿中，利用光学显微镜测量所包含的隐窝数。关于隐窝数的测量，对于一个浓度重复3次，计算平均值。结果示于表2。

需要说明的是，只要能够确认隐窝数为1以上，即可视为得到了充分的脆化效果。

<实施例12～19：含有化合物(Z)的组合物的制造>

对于表3中记载的种类的化合物(Z)一点一点地少量添加室温的水，利用涡旋混合器(KENIS株式会社制造Vortex-Genie 2)搅拌振荡，添加水直至全部溶解。用5分钟左右使其溶解，之后利用1M NaOH调整至pH8。之后，利用汉克斯平衡盐溶液(不含Ca、Mg，含有酚红)(Nacalai Tesque Cat#17460-15)稀释成表3的摩尔浓度，得到组合物(C-7)～(C-14)。

<比较例8～9：含有比较用的化合物(Z’)的比较用的组合物的制造>

利用汉克斯平衡盐溶液(不含Ca、Mg，含有酚红)(Nacalai Tesque Cat#17460-15)将Na₂EDTA(0.5mol/l EDTA溶液pH 8.0Nacalai Tesque Cat#14347-21)稀释成表3的摩尔浓度，得到比较用的组合物(C’-8)～(C’-9)。

使用实施例中得到的组合物(C-7)～(C-14)和比较用的组合物(C’-8)～(C’-9)，利用下述方法评价性能。

<体外(in vitro)的隐窝分离效果的评价2>

将小鼠(C57B6/j 8周雄性日本CLEA)通过颈椎脱臼处死后，取出远端大肠4cm，利用汉克斯平衡盐溶液(不含Ca、Mg，含有酚红)(Nacalai Tesque Cat#17460-15)进行清洗。将肠道沿长轴方向展开，使用剃刀(Feather Cat#FAS-10)制成肉末。将40ml的肉末组织悬浮于汉克斯平衡盐溶液中，将各4ml等分到15ml管中。以1500rpm离心1分钟，使肉末组织沉淀，弃去上清。添加1ml汉克斯平衡盐溶液，使肉末组织悬浮，将肉末组织连同溶液一起转移到1.5ml微管中。利用微管混合器(TOMY SEIKOCO.,LTD.制造MT-400)搅拌10分钟，清洗肉末组织。将管以15000rpm离心1分钟，使肉末组织沉淀，弃去上清。添加1ml汉克斯平衡盐溶液，进行同样的清洗操作。将管以15000rpm离心1分钟，使肉末组织沉淀，弃去上清，添加1ml组合物(C-7)～(C-14)或比较用的组合物(C’-8)～(C’-9)，在37℃静置30分钟。

经过30分钟后，将管以15000rpm离心1分钟，使肉末组织沉淀，弃去上清。添加1ml汉克斯平衡盐溶液，利用微管混合器搅拌5分钟，使隐窝游离。经过5分钟后，向装有组织的微管中添加0.5ml 4％多聚甲醛·磷酸缓冲液(Nacalai Tesque Cat#09154-85)，将组织固定。从其中采集50μl滴加到皿中，利用光学显微镜测量所包含的隐窝数。关于隐窝数的测量，对于一个浓度重复3次，计算平均值。将该实验各进行6次，计算其平均值。结果示于表3。

<实施例20～24：生物体组织脆化剂的制造>

在表4中记载的化合物(Z)中一点一点地少量添加室温的水，利用涡旋混合器(KENIS株式会社制造Vortex-Genie 2)搅拌振荡，添加水直至全部溶解。用5分钟左右使其溶解，之后利用1M NaOH调整至pH8，由此得到生物体组织脆化剂(M-1)～(M-5)。生物体组织脆化剂(M)中的化合物(Z)的浓度如表4中所记载。

<比较例10～12：比较用的生物体组织脆化剂的制造>

作为比较用的化合物(Z’-1)，制造含有Na₂EDTA(乙二胺四乙酸二钠)的生物体组织脆化剂。

用水将Na₂EDTA(0.5mol/l EDTA溶液pH 8.0Nacalai Tesque Cat#14347-21)稀释成表4的摩尔浓度，得到比较用的生物体组织脆化剂(M’-1)～(M’-3)。

使用实施例中得到的生物体组织脆化剂(M-1)～(M-5)和比较用的生物体组织脆化剂(M’-1)～(M’-3)，通过下述方法评价性能。

<体内(in vivo)的上皮剥离效果的评价1>

将小鼠(C57B6/j 8周雄性日本CLEA)在异氟烷(FUJIFILM Cat#099-06571)麻醉下以仰卧位固定后，在腹部正中纵向切开1cm，使近端大肠露出到腹腔外。在近端大肠的距离盲肠1cm肛门侧切开小切口，朝向肛门侧插入导管。利用杜氏磷酸缓冲生理盐水(不含Ca、Mg)(Nacalai Tesque Cat#14249-24)清洗内腔。在距离导管插入部1cm肛门侧切开小切口，朝向口侧插入导管。由此，能够通过2根导管对1cm长的肠道进行灌流。用线将导管从肠道外捆绑固定，由此阻断被2根导管夹住的1cm长的肠道的血流，在该状态下用时2分钟从导管注入8ml加热至50℃的生物体组织脆化剂(M-1)或比较用的生物体组织脆化剂(M’-1)～(M’-3)。

刚注入生物体组织脆化剂后，用时45秒连续注入3次25ml的杜氏磷酸缓冲生理盐水(不含Ca、Mg)，使隐窝脱落。注入高葡萄糖杜氏改良伊格尔培养基(Sigma-Aldrich Cat#D5796)20ml，进行生物体组织脆化剂的拮抗。切出进行了操作的近端大肠部，利用4％多聚甲醛·磷酸缓冲液固定组织。将大肠沿长轴切开并展开为平面，利用立体荧光显微镜(Leica M165FC)和一体化系统(All-in-One)荧光显微镜(KEYENCE BZ-X800)进行拍摄。利用ImageJ分析图像，测量剥离面积。结果示于表4。

<体内(in vivo)的上皮剥离效果的评价2>

为了评价能否通过延长PEG-EDTA给药时间带来剥离效果的扩大，在<体内(invivo)的上皮剥离效果的评价1>中，对于用时2分钟从导管注入8ml加热至50℃的生物体组织脆化剂(M-1)～(M-5)的操作，不是进行1次而是重复4次，除此以外与<体内(in vivo)的上皮剥离效果的评价1>同样地操作，测量剥离面积。结果示于表4。

需要说明的是，只要能够确认到上皮的剥离，即可视为得到了充分的脆化效果(本评价的情况下，优选能够确认到1mm²以上的上皮剥离)。

<评价例和比较评价例：通过经口给药进行的毒性评价>

使小鼠(C57B6/j 8周雄性日本CLEA)从给药前一天20点开始禁食(可饮水)。从12小时后的检查日8点开始给药。关于给药的溶液，在即将给药前测定体重，计算Na₂EDTA的LD50相当量(参照：化学物质的初期风险评价书暂定版No.14.化学物质排出把握管理促进法政令号编号：1-47CAS登记号：60-00-4)、其一半量(LD50的0.5倍量)、以及其1.5倍量(LD50的1.5倍量)。

制备含有Na₂EDTA(0.5mol/l EDTA溶液pH 8.0Nacalai Tesque Cat#14347-21)的LD50相当量或其一半量(LD50的0.5倍量)的1ml的水溶液，将其作为毒性评价用试剂(P’-1)～(P’-2)。

另外，制备含有与毒性评价用试剂(P’-1)所含有的Na₂EDTA物质量相同的物质量的化合物(Z-1)的1ml的水溶液，将其作为毒性评价用试剂(P-1)。另外，将使用(Z-3)、(Z-5)或(Z-4)代替(Z-1)的试剂分别作为毒性评价用试剂(P-3)、(P-4)、(P-5)。

制备含有与毒性评价用试剂(P’-2)所含有的Na₂EDTA的物质量相同的物质量的化合物(Z-1)的1ml的水溶液，将其作为毒性评价用试剂(P-2)。

制备含有毒性评价用试剂(P’-1)所含有的Na₂EDTA物质量的1.5倍的物质量(LD50的1.5倍量)的化合物(Z-3)的1ml的水溶液，将其作为毒性评价用试剂(P-6)。

接着，将毒性评价用试剂(P-1)～(P-6)或毒性评价用试剂(P’-1)或(P’-2)给药至上述小鼠。

给药时，毒性评价用试剂使用一次性经口探针(FUCHIGAMI Cat#4200)在异氟烷麻醉下进行强制经口给药。对于各溶液，LD50量使用各3只、LD50的0.5倍量使用各5只、LD50的1.5倍量使用各5只进行验证，按照下述基准进行评价。结果示于表5～表7。

◎：全部量给药后经过1周以上确认仍存活

〇：全部量给药后经过15分钟以上确认仍存活

×：全部量给药后在小于15分钟的时间内确认死亡

[表5]

[表6]

[表7]

<评价例7～25和比较评价例3～5：通过腹腔内给药进行的毒性评价>

如下对小鼠(C57B6/j 8周雄性日本CLEA)进行给药。关于给药的溶液，在即将给药前测定体重，计算Na₂EDTA的LD50相当量(参照：化学物质的初期风险评价书暂定版No.14.化学物质排出把握管理促进法政令号编号：1-47CAS登记号：60-00-4)、其一半量(LD50的0.5倍量)、其1.5倍量(LD50的1.5倍量)、其2.0倍量(LD50的2.0倍量)、其3.0倍量(LD50的3.0倍量)、其4.0倍量(LD50的4.0倍量)、以及其8.0倍量(LD50的8.0倍量)。

制备含有Na₂EDTA(0.5mol/l EDTA溶液pH 8.0Nacalai Tesque Cat#14347-21)的LD50相当量、其一半量(LD50的0.5倍量)或其1.5倍量(LD50的1.5倍量)的0.5ml的水溶液，将其作为毒性评价用试剂(P’-3)～(P’-5)。

另外，制备含有与毒性评价用试剂(P’-3)～(P’-5)分别含有的Na₂EDTA物质量相同的物质量的化合物(Z-1)的0.5ml的水溶液，将其作为毒性评价用试剂(P-7)～(P-9)。

制备含有毒性评价用试剂(P’-3)所含有的Na₂EDTA物质量的1.5倍物质量(LD50的1.5倍量)的化合物(Z-3)的0.5ml的水溶液，将其作为毒性评价用试剂(P-10)。另外，将使用(Z-5)或(Z-4)代替(Z-3)的试剂分别作为毒性评价用试剂(P-11)、(P-12)。

制备含有毒性评价用试剂(P’-3)所含有的Na₂EDTA物质量的2.0倍物质量(LD50的2.0倍量)的化合物(Z-1)的0.5ml的水溶液，将其作为毒性评价用试剂(P-13)。另外，将使用(Z-3)、(Z-5)或(Z-4)代替(Z-1)的试剂分别作为毒性评价用试剂(P-14)、(P-15)、(P-16)。

制备含有毒性评价用试剂(P’-3)所含有的Na₂EDTA物质量的3.0倍物质量(LD50的3.0倍量)的化合物(Z-3)的0.5ml的水溶液，将其作为毒性评价用试剂(P-17)。另外，将使用(Z-5)或(Z-4)代替(Z-3)的试剂分别作为毒性评价用试剂(P-18)、(P-19)。

制备含有毒性评价用试剂(P’-3)所含有的Na₂EDTA物质量的4.0倍物质量(LD50的4.0倍量)的化合物(Z-3)的0.5ml的水溶液，将其作为毒性评价用试剂(P-20)。另外，将使用(Z-5)或(Z-4)代替(Z-3)的试剂分别作为毒性评价用试剂(P-21)、(P-22)。

制备含有毒性评价用试剂(P’-3)所含有的Na₂EDTA物质量的8.0倍物质量(LD50的8.0倍量)的化合物(Z-3)的1.5ml的水溶液，将其作为毒性评价用试剂(P-23)。另外，将使用(Z-5)或(Z-4)代替(Z-3)的试剂分别作为毒性评价用试剂(P-24)、(P-25)。

接着，将毒性评价用试剂(P-7)～(P-25)或毒性评价用试剂(P’-3)或(P’-5)给药至上述小鼠。

给药时，毒性评价用试剂使用安装有针的注射器[含有Na₂EDTA物质量的0.5倍～4.0倍物质量的化合物的0.5ml水溶液使用带有29G针的1ml注射器(Terumo Cat#SS-10M2913A)。另外，含有Na₂EDTA物质量的0.5倍～4.0倍物质量的化合物的1.5ml水溶液使用带有27G针(Terumo Cat#NN-2719S)的2.5ml注射器(Terumo Cat#SS-02SZ)]在异氟烷麻醉下进行腹腔内给药。对于各溶液，LD50量、LD50的0.5倍量、LD50的1.5倍量、LD50的2.0倍量、LD50的3.0倍量使用各3只、LD50的4.0倍量、LD50的8.0倍量使用各2只进行验证，按照下述基准进行评价。结果示于表8～表14。

◎：全部量给药后经过1周以上确认仍存活

〇：全部量给药后经过60分钟以上确认仍存活

△：全部量给药后经过15分钟以上确认仍存活

×：全部量给药后在小于15分钟的时间内确认死亡

[表8]

[表9]

[表10]

[表11]

[表12]

[表13]

[表14]

<评价例26～29和比较评价例6～7：腹腔内给药后的Ca浓度评价>

与“通过腹腔内给药进行的毒性评价”同样地，制备含有Na₂EDTA(0.5mol/l EDTA溶液pH 8.0Nacalai Tesque Cat#14347-21)的LD50相当量的2.0倍量(LD50的2.0倍量)的0.5ml的水溶液，将其作为毒性评价用试剂(P’-6)。

制备含有与毒性评价用试剂(P’-6)所含有的Na₂EDTA物质量相同的物质量的化合物(Z-1)的0.5ml的水溶液，将其作为毒性评价用试剂(P-26)。

另外，将使用(Z-3)、(Z-5)或(Z-4)代替(Z-1)的试剂分别作为毒性评价用试剂(P-27)、(P-28)、(P-29)。

利用与“通过腹腔内给药进行的毒性评价”同样的方法，将上述水溶液腹腔内给药至上述小鼠，2分钟后采血。对于由采集的血液得到的血清，基于下式求出校正Ca浓度(mg/dl)[血中存在的Ca中除外与血中白蛋白结合的Ca的Ca浓度]。

校正Ca浓度(mg/dL)＝实测Ca浓度(mg/dL)+4-Alb(g/dL)

需要说明的是，上式中，“实测Ca浓度(mg/dL)”和“Alb(g/dL)”是通过以下的测定得到的值。

实测Ca浓度(mg/dL)：对于由采集的血液得到的血清，使用偶氮砷(Arsenazo)III法(委托于株式会社BML)，测定Ca浓度(mg/dl)[实测Ca浓度]。

Alb(g/dL)：对于由采集的血液得到的血清，使用白蛋白IIHA-Testwako(富士胶片和光纯药株式会社制造)，测定白蛋白浓度(g/dL)(测定委托于富士胶片和光纯药株式会社)。

另外，代替上述毒性评价用试剂而进行水的给药，利用与上述同样的方法测定校正Ca浓度(mg/dl)。将使用水的毒性评价用试剂作为(P’-7)。

每个毒性评价用试剂使用3只小鼠来实施，求出校正Ca浓度(mg/dl)的平均值。结果示于表15。

需要说明的是，从生物体安全性的观点出发，校正Ca浓度优选为7.0mg/dl以上。若校正Ca浓度小于7.0mg/dl，则有可能发生手足搐搦和全身痉挛等神经症状、以及QT延长和心动过缓等严重的心率不齐等症状。

[表15]

工业实用性

将含有本发明的化合物的组合物用作生物体组织脆化剂的情况下，可得到与以往的EDTA同样的组织脆化作用，另一方面，发挥出对生物体的毒性少的效果，因此上述组合物作为生物体组织脆化剂是有用的。

Claims

1.一种化合物(Z)，其由通式(1)或通式(2)表示，

[化1]

[化2]

通式(1)和通式(2)中，X各自独立地为羧基、羧酸酯基或通式(3)所示的1价基团；

通式(1)和通式(2)中的多个X中的至少1个为羧基或羧酸酯基；

通式(1)和通式(2)中的多个X中的至少1个为通式(3)所示的1价基团，

-C(O)-Y-(AO)_n-R(3)

通式(3)中，-Y-为-O-、-NH-或-S-；A为碳原子数2～4的亚烷基；R为氢原子或氢原子可以被碳原子数1～10的烷氧基取代的碳原子数1～15的1价烃基；n为4～1000的整数；n个存在的A中的至少1个为亚乙基；在通式(1)和通式(2)中具有多个通式(3)所示的1价基团的情况下，-Y-、A、R和n相同或不同。

2.一种组合物，其含有权利要求1所述的化合物(Z)。

3.一种生物体组织脆化剂，其含有权利要求1所述的化合物(Z)。

4.如权利要求3所述的生物体组织脆化剂，其中，所述生物体组织为消化道上皮、粘膜、皮肤或结缔组织。

5.一种生物体组织表面的剥离方法，其包括：

使权利要求1所述的化合物(Z)与生物体组织接触而使所述生物体组织的表面脆化的步骤；和

从所述生物体组织的脆化的表面部分剥离细胞组织的步骤。

6.如权利要求5所述的生物体组织表面的剥离方法，其中，所述生物体组织为消化道上皮、粘膜、皮肤或结缔组织。

7.一种生物体组织剥离试剂盒，其包含权利要求3所述的生物体组织脆化剂。