CN116602790A - 一种神经导管及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制造技术领域，尤其是涉及一种神经导管及其制备方法。本发明中的神经导管包括内层导管和外层导管；所述内层导管和外层导管均具有连通的微孔结构；所述内层导管包括多组沿轴分布的第一纺丝；所述外层导管包括一组或多组沿轴向螺旋分布的第二纺丝；所述内层导管具有微沟槽图案；所述微沟槽图案由相邻的纺丝形成，或者设置于单个纺丝上，或者由三个以上的纺丝形成。本发明提供的神经导管结构具有良好的稳定性，外层导管选用力学性能优异的生物材料，使神经导管的外层导管拥有了可调节的机械性能，而内层导管材料中加入了导电材料，从而使得神经导管具有导电性，极大促进了周向神经细胞的再生长。

Description

一种神经导管及其制备方法

技术领域

本发明属于生物制造技术领域，尤其是涉及一种神经导管及其制备方法。

背景技术

周围神经损伤在外伤患者中发生率为2％-5％，周围神经损伤可导致中枢神经系统与周围器官之间感觉神经和运动神经的神经元通讯丧失，严重影响患者的日常活动。目前首选的治疗方法是通过显微外科手术进行神经外膜无张力缝合，在神经缺损的情况下，自体神经移植是金标准。然而，自体神经移植的供体神经源对于周围神经损伤的治疗效果有限、而且手术时间较长，易出现供体部位发病和功能丧失的情况。

因此，人工神经导管作为轴突引导通道，这些管状结构可以连接被切断的神经的间隙，以促进神经元的重新连接，还可以作为外部环境的物理屏障和再生轴突穿过间隙损伤的物理引导，同时还能够保留受损神经残端分泌的自然释放的神经生长因子，并减少瘢痕组织形成以及成纤维细胞对损伤部位的侵袭。

理想的神经导管需要有一定的机械强度，以确保在受损的神经末梢之间充当桥梁，同时高效引导神经细胞定向迁移。研究表明，生物材料导管的表面微图案结构(沟槽结构)可以诱导细胞定向迁移从而诱导组织快速生长，但是现有技术中的神经导管制备方法需要多次刻蚀、铸模、灌注、成型、再铸模以及再灌注等过程，而且每一个过程都要保证严格的准确性，大大增加了制备的复杂程度，因此，开发一种尺寸可调、具有内壁微沟槽图案，并具有一定的机械强度、功能性、、力学性能以及高生物相容性的一体化神经导管的方法迫在眉睫。

3D打印技术(又称“3D快速成型技术”)作为一种新型数字化成型技术，通过材料精确堆积的增材制造方式，能快速制造复杂立体结构。在医疗领域中，该技术因具备满足患者个性化定制及精准医疗等优势而展现出极大的应用前景。目前，现有技术公开了基于3D打印制备人工神经导管的方法和人工神经导管，此技术中使用了蚕丝蛋白制备丝素蛋白溶液，制备丝素蛋白微球悬浮液，在丝素蛋白微球中加载生长因子，采用三维生物打印制备的神经导管为神经细胞的附着生长提供基体，为神经轴突结合提供了引导，能促进神经再生，取代自体神经移植；现有技术还公开了一种3D打印的高导电促愈合型多通道神经导管及其制备方法和应用，所述的神经导管包括原料聚丙交酯-聚三亚甲基碳酸酯和二碳化三钛，还包括溶剂N,N-二甲基甲酰胺与二氯甲烷，制备得到的MXPLT导管具有相当强的延展性，足以应对神经修复过程中的人体肌肉运动带来的导管变形，适合作为神经修复材料来修复神经断端。通常3D打印技术是基于挤出头和平台在X/Y/Z三个方向的运动，在重力作用下材料堆砌来制造立体结构。由于神经导管有着薄壁多孔轴类结构的特殊要求，而3D打印堆砌成型原理使其需要使用支撑结构，导致难以使用挤出成型的3D打印方式直接制备管状支架。关于这个问题，虽然现有技术公开了一种4轴3D打印管状医用支架及其制备方法，引入了旋转轴协同打印，解决了挤出式特别是熔融沉积成型(FDM)3D打印难以直接构建多孔管状支架的问题，得到了具有多级孔隙结构的管状支架，其中，纳米纤维包覆在支架表面形成双层管状支架，用于管状组织修复、血管外支架和人工气管支架等，但是，此制备方法的导管各向力学性能差异和修复效率尚未见报道。此外，兼具导电与通过内壁微沟槽图案地形引导的神经导管的3D打印制造方法还不成熟，应用很少。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术不足之处而提供一种神经导管及其制备方法

为实现上述目的，本发明提供了一种神经导管,包括内层导管和外层导管；

所述内层导管和外层导管均具有连通的微孔结构；

所述内层导管包括多组沿轴分布的第一纺丝；

所述外层导管包括一组或多组沿轴向螺旋分布的第二纺丝；

所述内层导管具有微沟槽图案；

所述微沟槽图案由相邻的纺丝形成，或者设置于单个纺丝上，或者由三个以上的纺丝形成。

优选的，所述内层导管材料包括第一生物材料和导电材料。

优选的，所述第一生物材料包括聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚丙烯酰胺、聚酯亚胺或聚乙烯醇中的一种或多种。

优选的，所述导电材料包括石墨烯、碳纳米管、金属纳米颗粒、MXene、聚吡咯或聚(3,4-乙烯二氧噻吩)中的一种或多种。

优选的，所述MXene为二维Ti₃C₂T_x MXene材料。

优选的，所述外层导管材料包括第二生物材料，所述第二生物材料包括聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚丙烯酰胺、聚酯亚胺或聚乙烯醇中的一种或多种。

优选的，所述微沟槽图案中槽的截面形状包括弧形或三角形。

优选的，所述微沟槽图案中槽的数目为16～30个，槽的宽度为0.2～0.5mm，槽的深度为0.1～0.25mm。

进一步的，本发明还提供了一种神经导管的制备方法，包括：

在基底上打印多组沿轴分布的第一纺丝，在所述第一纺丝上打印一组或多组沿轴向螺旋分布的第二纺丝，脱模，即得。

优选的，所述基底为不锈钢棒，所述不锈钢棒的截面直径为0.75-2.0mm。

优选的，所述不锈钢棒表面具有沿轴分布的连续的凸起结构，所述连续的凸起结构为沿不锈钢棒表面分布的金属丝。

进一步的，所述第一纺丝通过如下方式获得：

将第一生物材料和导电材料溶于二甲基亚砜中，得到聚合物溶液；

所述聚合物溶液通过第一挤出头挤出后，均匀分布在所述不锈钢棒上；

通过相分离获得具有连通的微孔结构的第一纺丝。

优选的，所述第一生物材料的含量为8-15wt％。

进一步的，所述第二纺丝通过如下方式获得：

获得第二生物材料与二甲基亚砜的混合溶液，所述混合溶液通过第二挤出头挤出后，均匀分布在所述第一纺丝上，通过相分离获得具有连通的微孔结构的第二纺丝。

优选的，所述第二生物材料的含量为15-25wt％。

本发明具有如下的有益效果：

1.本发明创新设计了“平移轴向+旋转径向”的组合打印策略，通过编程控制构建了各向同性的双层管状结构，使得神经导管具有复合功能。其中，外层导管选用力学性能优异的生物材料，使神经导管的外层导管拥有了可调节的机械性能，而内层导管材料中加入了导电材料，从而使得神经导管具有导电性，极大促进了周向神经的再生长。此外，采用沿不锈钢棒表面的轴方向紧密粘黏金属丝的简易方法预制微沟槽图案，使神经导管具有良好生物相容性的同时还具备了电刺激和地形引导等性能，大大促进了外周神经的再生速度和功能恢复效果。

2.本发明创新结合非溶剂相分离与3D打印快速成型方法，可以实现多孔模式和复杂结构材料的快速固化，更有利于周围神经的高效修复。

3.本发明在传统3D打印基础上引入了第四旋转轴，使挤出头挤出的神经导管内外层导管材料原液，分别平移轴向以及旋转径向方向制备，得到一个双层管状支架形状的神经导管，这种第四旋转轴辅助成型的打印成型策略，能够方便得到壁厚均匀、性能稳定以及孔隙可调的神经导管，也很好地避免了采用平面收集可能出现因支架高度过高而发生支架坍塌的问题。

4.本发明神经导管的制备过程简便，易操作，材料的选择灵活。通过本发明提供的制备方法所制备得到的神经导管结构具有良好的稳定性，内、外层导管材料之间的结合交联良好，不易脱落，而且通过在第四旋转轴不锈钢棒上预制微沟槽图案可以对加工过程中的神经导管起到很好的支撑作用，使神经导管的内外层导管材料原液可以缓慢发生相分离固化，不易塌陷，而且神经导管的尺寸具有灵活可调性。

附图说明

图1为制备神经导管的装置示意图；

图2-a为实例1制得的神经导管实物外貌图；

图2-b为实例1制得的神经导管螺纹状外表面局部放大图；

图2-c为实例1制得的神经导管长度测量图；

图2-d为实例1制得的神经导管经折弯后的机械柔韧性展示图；

图3-a为实例1制得的神经导管截面图；

图3-b为实例1制得的神经导管内层导管表面微沟槽图案图；

图4为使用内层导管光滑无沟槽的神经导管培养PC12细胞5天后的活性检测图；

图5为使用内层导管具有微沟槽图案的神经导管培养PC12细胞5天后的活性检测图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明提供了一种神经导管的制备方法，包括以下步骤：

(1)四轴3D打印装置的搭建

如图1所示，打印装置包括四轴3D运动模块、挤出模块、相分离固化模块和电气控制模块。

其中，四轴3D运动模块引导挤出头在三维空间中定位和轨迹运动，其中XYZ三轴运动控制挤出头打印，打印空间为200×200×100mm³，XYZ三轴均采用步进电机，X轴采用第一步进电机、Y轴采用第二步进电机以及Z轴采用第三步进电机，而与驱动电机连接的不锈钢棒采用导轨配合滚珠丝杆和螺母的传动方式，既可确保运动精度，又可提供较大的驱动力。打印机机架部分采用6060铝合金型材，型材之间由相应角件连接固定，同时设置第四旋转轴作为接收平台，接收平台包括不锈钢棒，还包括带动不锈钢棒旋转的驱进电机、驱动器、支撑板及轴承等附属组件，其中，两个支撑板与不锈钢棒连接，不锈钢棒的截面直径为0.75-2mm，并沿不锈钢棒表面的周向方向紧密粘黏一层金属丝，相邻金属丝表面形成弧形或三角形，而且金属丝长度与不锈钢棒有效接收长度保持一致，该运动模块协同工作构成X/Y/Z/R的四轴成型系统，最终得到内层导管具有微沟槽图案的管状多孔神经导管；

挤出模块主要包含针筒、控压设备(即点胶机)以及高压氮气瓶等。工作时，首先将高压氮气通入点胶机，然后通过点胶机调节打印压力大小，调压后氮气进入针筒挤出材料原液，挤出头尺寸为0.20-0.35mm(规格为24G-27G)，并设置挤出速率与所述四轴3D运动模块的参数匹配；

相分离固化模块主要是指自行设计的凝固浴装置，其液体成分为去离子水，使得第四旋转轴中的不锈钢棒浸没于凝固浴装置中，浸没高度为不锈钢棒截面直径的一半，随着挤出并粘附在不锈钢棒上的材料原液进入凝固浴装置，不锈钢棒上的材料原液发生相分离作用，从而实现对挤出的材料原液的固化；

电气控制模块主要分为硬件和上位机软件两部分，其作用是实现对所述四轴3D运动模块的运动控制。

(2)内、外层导管材料原液的制备

外层导管材料原液通过如下方式获得：将适量的聚乳酸-羟基乙酸共聚物粉末溶于二甲基亚砜中，其中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的含量为15-25wt％，室温下连续搅拌24h，直至形成均匀的混合溶液，然后将溶液静置4小时，去除其中的气泡，备用。根据聚乳酸-羟基乙酸共聚物材料的加入量的不同可调节外层导管结构的机械力学性能；

内层导管材料原液通过如下的方式获得：将具有良好生物相容性的聚己内酯材料溶解于二甲基亚砜溶剂中，其中，聚己内酯的含量为10wt％，然后添加导电材料，混合均匀后，静置除泡，备用，所述导电填料包括聚(3,4-乙烯二氧噻吩)或聚吡咯中的一种或多种。

(3)神经导管的制备

对四轴3D打印装置进行调试，确定相关工艺参数，包括设置XYZ三轴所对应的第一步进电机、第二步进电机以及第三步进电机的速度为0.1-20mm/s，挤出头与不锈钢棒间距不大于2mm，针筒挤料速度为0.005-0.1mm/s，其中，控制不锈钢棒旋转时的转速为1-120r/min；

将四轴3D打印设备放置于无菌环境中，且使得不锈钢棒浸没在凝固浴装置中，浸没高度为不锈钢棒截面直径的一半；

首先控制不锈钢棒不发生旋转，将备用的内层导管材料原液通过挤出头挤出，通过第一步进电机，控制第一挤出头沿X轴方向移动，经过与不锈钢棒上表面中心接触，材料原液沿不锈钢棒轴方向成型，得到一组第一纺丝，当到达预定长度后，控制不锈钢棒发生小角度旋转，同时挤出头相反方向做往复移动，当挤出头回到初始位置时，控制挤出模块停止挤出材料原液，得到多组沿轴分布的第一纺丝，形成内层导管。此过程中，当材料原液在旋转过程中与凝固浴装置中的液体接触后发生相分离固化反应，使内层导管材料原液固化，使得得到的内层导管具有沿轴均匀分布的多孔结构；

内层导管制备结束后，控制不锈钢棒匀速旋转，将备用的外层导管材料原液通过挤出头挤出，通过第一步进电机，控制第二挤出头沿X轴缓慢移动，经过与不锈钢棒上表面已固化的内层导管的多孔结构接触，得到排列紧密的沿轴向螺旋分布的外层导管结构。此过程中，材料原液在旋转过程中与凝固浴装置中的液体接触后发生相分离固化反应，可得到螺旋分布的管状多孔的外层导管；

将固化后得到的神经导管沿粘黏金属丝的不锈钢棒轴向脱模，最终得到内层导管表面具有微沟槽图案的双层多孔神经导管；

若需多个神经导管，重复上述步骤即可。

在本发明的一个实施例内，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与二甲基亚砜溶剂按照一定比例混合，并进行磁力搅拌，利用水浴加热促进聚乳酸-羟基乙酸共聚物材料的溶解。

在本发明的一个实施例内，由于挤出的材料原液粘附/缠绕在不锈钢棒上，并在运动过程中与凝固浴装置中的液体充分接触，混合溶液产生相分离固化反应，使内、外层导管材料原液分别固化并形成密集的微孔结构，而且在固化的过程中，两层材料间发生良好的交联，不需要外加粘接剂。当神经导管长度达到预定长度时，停止挤出材料原液，控制不锈钢棒仍继续旋转一定时间，可使相分离反应充分反应。

实例1

设备采用的是自主搭建的四轴3D打印机，在原有的3D打印机的基础上，加入了新的第四旋转轴。第四旋转轴包括不锈钢棒，还包括带动不锈钢棒旋转的驱进电机、驱动器、支撑板及轴承等附属组件，不锈钢棒通过联轴器与电机相连，其中，不锈钢棒位于挤出头的正下方，轴方向平行于底座平面，不锈钢棒上带有微沟槽图案。挤出头可进行相对于不锈钢棒轴方向以及轴向方向的移动。将不锈钢棒浸没在凝固浴装置中，浸没高度为不锈钢棒截面直径的一半，以便控制不锈钢棒发生旋转时材料原液和凝固浴装置中的液体充分接触，从而进行相分离固化反应。

内、外层导管材料原液的制备：

外层导管材料原液：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物材料与二甲基亚砜溶剂按照质量比为1：4进行搅拌混合，并利用水浴加热促进聚乳酸-羟基乙酸共聚物材料的溶解，即得；

内层导管材料原液：将聚己内酯材料与二甲基亚砜溶剂根据质量比为1：9进行混合，得到聚合物溶液，然后将导电材料添加于聚合物溶液中，搅拌，加快溶解效率，即得。此过程中，添加导电材料可以使神经导管具有导电性，从而促进周围神经的修复效率。

神经导管具体制备步骤如下：

步骤1，对设备进行调试，选取合适的速度区间，使其具有良好的成型效果。

步骤2，启动设备，内层导管材料原液通过第一挤出头挤出，沿着不锈钢棒，以其轴为方向进行挤出，通过旋转进行相分离固化成型。当挤出的内层导管材料原液长度足够长时，停止挤出，让不锈钢棒继续旋转一段时间，使相分离反应充分反应。

步骤3，更换新的针筒，外层导管材料原液通过第二挤出头进行挤出，通过旋转轴匀速旋转，使得外层导管材料原液紧密覆盖在内层导管上，同时使得外层导管材料原液发生相分离反应，并使内、外两层导管材料之间发生良好的物理交联，不需要外加粘接剂。

步骤4，当神经导管长度足够长时，停止挤出，控住不锈钢棒继续旋转一定时间，使相分离反应充分反应，然后将神经导管从不锈钢棒上脱模，得到呈现管状支架型的具有多功能性的多孔神经导管，其中，图2-a为制得的神经导管实物外貌图；图2-b为制得的神经导管螺纹状外表面局部放大图；图2-d为制得的神经导管经折弯后的机械柔韧性展示图；图3-a为制得的神经导管截面图；图3-b为制得的神经导管内层导管表面微沟槽图案图；经测量，如图2-c所示，制得的神经导管的长度为16.01mm。

在本发明的一个实施例内，外层导管的聚乳酸-羟基乙酸共聚物材料为神经导管的外层结构提供了足够的机械强度，且外层的机械强度可通过改变聚乳酸-羟基乙酸共聚物材料的加入比例进行调节；

在本发明的一个实施例内，内层导管材料中的导电材料具有一定的电活性，有利于促进成品神经导管对外周神经的修复效率；

在本发明的一个实施例内，神经导管通过内、外层导管材料发生相分离固化成型，相分离固化反应过程中，溶剂的去除使得神经导管具有密集的连通的微孔结构。对于两层导管材料间的结合，采用物理交联，利用内、外层导管材料在相分离固化反应的过程中所发生的固化进行自然粘接。

实例2

选择聚乳酸-羟基乙酸共聚物为纺丝原料，通过四轴3D打印方法构建了内层导管光滑无沟槽和内层导管具有微沟槽图案的两种神经导管结构进行对比实验，选用PC12细胞在两种神经导管内表面进行培养，观察并记录细胞分化生长情况。

(1)将块状聚乳酸-羟基乙酸共聚物原材料于室温下干燥12小时后溶解于DMSO溶剂中搅拌12h，得到混合溶液，其中聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度为16wt％；

(2)取10mL混合溶液置入针筒中，并沿不锈钢棒表面进行内层导管打印，其中，不锈钢棒表面具有沿轴分布的金属丝，此打印过程在由去离子水组成的凝固浴装置中实施。作为对照组，只需将不锈钢棒表面的金属丝去除即可，其余不变；

(3)将打印好的两组神经导管在凝固浴装置中浸泡1h。神经导管从不锈钢棒上脱模后，将其在室温下条件下自然风干，然后在干燥环境中保存防止降解，以备进一步测量或分析；

(4)在上述两组神经导管内表面培养PC12细胞，采用Calcein-AM/PI细胞活/死染色实验检测培养5天后的PC12细胞的活性；

如图4-5所示，随着培养时间的增加，两组神经导管结构中包封的PC12细胞增殖情况存在显著差异，其中内层导管具有微沟槽图案的神经导管因具有地形引导功能，明显对细胞活性和诱导细胞定向迁移从而使得组织快速生长起到更为积极作用。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (14)

1.一种神经导管,其特征在于，包括内层导管和外层导管；

所述内层导管和外层导管均具有连通的微孔结构；

所述内层导管包括多组沿轴分布的第一纺丝；

所述外层导管包括一组或多组沿轴向螺旋分布的第二纺丝；

所述内层导管具有微沟槽图案；

所述微沟槽图案由相邻的纺丝形成，或者设置于单个纺丝上，或者由三个以上的纺丝形成。

2.根据权利要求1所述的神经导管，其特征在于，所述内层导管材料包括第一生物材料和导电材料。

3.根据权利要求2所述的神经导管，其特征在于，所述第一生物材料包括聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚丙烯酰胺、聚酯亚胺或聚乙烯醇中的一种或多种。

4.根据权利要求2所述的神经导管，其特征在于，所述导电材料包括石墨烯、碳纳米管、金属纳米颗粒、MXene、聚吡咯或聚(3,4-乙烯二氧噻吩)中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的神经导管，其特征在于，所述外层导管材料包括第二生物材料，所述第二生物材料包括聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚丙烯酰胺、聚酯亚胺或聚乙烯醇中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的神经导管，其特征在于，所述微沟槽图案中槽的截面形状包括弧形或三角形。

7.根据权利要求6所述的神经导管，其特征在于，所述微沟槽图案中槽的数目为16～30个，槽的宽度为0.2～0.5mm，槽的深度为0.1～0.25mm。

8.一种神经导管的制备方法，其特征在于，用于制备权利要求1-7任一所述的神经导管，所述制备方法包括：

在基底上打印多组沿轴分布的第一纺丝，在所述第一纺丝上打印一组或多组沿轴向螺旋分布的第二纺丝，脱模，即得。

9.根据权利要求8所述的一种神经导管的制备方法，其特征在于，所述基底为不锈钢棒，所述不锈钢棒的截面直径为0.75-2.0mm。

10.根据权利要求9所述的一种神经导管的制备方法，其特征在于，所述不锈钢棒表面具有沿轴分布的连续的凸起结构。

11.根据权利要求8所述的一种神经导管的制备方法，其特征在于，所述第一纺丝通过如下方式获得：

将第一生物材料和导电材料溶于二甲基亚砜中，得到聚合物溶液；

所述聚合物溶液通过第一挤出头挤出后，均匀分布在所述不锈钢棒上；

通过相分离获得具有连通的微孔结构的第一纺丝。

12.根据权利要求11所述的一种神经导管的制备方法，其特征在于，所述第一生物材料的含量为8-15wt％。

13.根据权利要求8所述的一种神经导管的制备方法，其特征在于，所述第二纺丝通过如下方式获得：

获得第二生物材料与二甲基亚砜的混合溶液，所述混合溶液通过第二挤出头挤出后，均匀分布在所述第一纺丝上，通过相分离获得具有连通的微孔结构的第二纺丝。

14.根据权利要求13所述的一种神经导管的制备方法，其特征在于，所述第二生物材料的含量为15-25wt％。