CN116601495A

CN116601495A - 用于评估非肿瘤细胞代谢活性的方法

Info

Publication number: CN116601495A
Application number: CN202180048565.5A
Authority: CN
Inventors: 法比奥·德尔本; 马特奥·图雷塔
Original assignee: Universita degli Studi di Udine
Current assignee: Universita degli Studi di Udine
Priority date: 2020-07-07
Filing date: 2021-07-02
Publication date: 2023-08-15
Also published as: MX2023000315A; WO2022009242A1; KR20230035389A; US20230221341A1; EP4179335A1; CA3189058A1; AU2021303836A1; JP2023532780A; IT202000016429A1; IL299698A

Abstract

通过检测细胞外酸化率评估生物流体样本中的非肿瘤细胞代谢活性的方法。

Description

用于评估非肿瘤细胞代谢活性的方法

技术领域

本文所述的实施例涉及一种评估非肿瘤细胞代谢活性的方法，特别是用于临床和诊断目的。

背景技术

全血细胞计数和白细胞分类计数是全世界最常要求的临床实验室测试(1,2)。白细胞分类计数在诊断、监测和治疗感染性、自身免疫性、肿瘤性和退行性病症方面提供了临床有效参数。全自动血液分析仪使用单细胞测量来创建二维或三维散射图，以对循环白细胞的不同亚型进行计数和区分。

大多数流行技术基于核酸(希森美康)、酶活性(西门子)或形态/物理参数(贝克曼)进行测量。

最近研究表明，除了上述参数外，不同白细胞亚群的代谢也不同(3)。此外，代谢变化是驱动某些效应子功能所必需的(特别是在淋巴细胞中)，因此是“功能”活性的一个指标(4,5)。在分类计数和临床导向生物标志物的背景下，代谢似乎是白细胞生物学中一个相当未被探索的方面。

然而，目前测量循环白细胞代谢活性的方法需要分离和培养相关细胞，因此是相对耗时和消耗资源的程序，可能会改变循环白细胞的“原生状态”。

血液分析也广泛用于产前诊断，作为通过从母体血流中分离胎儿(fetal)细胞外游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)来检测可能影响胎儿的染色体异常的筛查测试。这种做法被认为是无创的，因为它只需抽取孕妇的血，不会对胎儿造成任何风险。

分离的胎儿cfDNA用于检测，特别是非整倍体或其它额外染色体疾病(如染色体的删除或复制部分)。

尽管具有无创优势，但cfDNA以碎片形式在血液中循环。此外，与含有大量母体cfDNA的分离cfDNA总量相比，胎儿cfDNA仅占很小的比例。因此，即使采用最新技术，胎儿cfDNA也难以进行分析。

由于这些原因，这种筛查测试可能会导致假阴性结果，从而需要通过有创测试来确认。因此，对新的可靠无创产前筛查和/或诊断方法的需求增加。

耗氧量和质子产生率(PPR)的测量分别与线粒体功能和糖酵解相关，反之又可能与细胞的代谢活性相关。

直接或间接测量增酸分子(acidity raising molecules)(例如，与细胞外pH值相关的乳酸、乳酸离子和质子)，被称为细胞外酸化率(ECAR)。ECAR值越高，产生的增酸分子越多并且pH值越低。

其局限性在于，PPR通过检测细胞培养孔的细胞外介质的pH值变化进行评估，从而测量培养细胞的平均活性，而不可能通过单细胞分析来描述细胞异质性。

EP-B-3.084.434中描述了一种检测血流中循环肿瘤细胞(CTC)的方法，以评估单细胞水平的细胞外pH值。然而，与检测非肿瘤细胞，特别是白细胞或胎儿细胞相比，循环肿瘤细胞的检测呈现出相当不同的方面和问题。特别是，循环肿瘤细胞被认为是罕见细胞。因此，一个重要的区别是受检循环肿瘤细胞的数量极少(minimal)，甚至是几个单位；特别是，与非肿瘤细胞相比，每毫升血液中大约有1到10个细胞，在非肿瘤细胞中分析的细胞为每毫升血液中大约10^⁴-10^⁶个细胞。

此外，US-A-2019/0086391文件描述了一种细胞培养和测量多个培养细胞的细胞外pH值和氧气的综合方法。然而，这种方法不具备足够的灵敏度测量单个细胞，更不能用于识别和分离细胞群中具有不同代谢功能的细胞。此外，该已知文件并不适用于检验医学和体液样本诊断。

US-B-8,728,758描述了一种监测和分析细胞的代谢活性特征(metabolicactivity profiles)的方法以及相应的诊断和治疗用途。所述技术对癌症患者的10^³到10^¹⁰个细胞的PBMC细胞进行测量。特别是，分析是在单个细胞样本上进行的，而非在单细胞上进行的。该分析可依次使用分光光度法的多个波长在该单个细胞样本上进行多次测量。

因此，需要改进一种评估非肿瘤细胞代谢活性的方法，以至少克服本领域的一个缺点。

申请人已经设计、测试并体现了本发明，以克服本技术领域的缺点，并获得这些和其它目的和优点。

参考文献

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3.克雷默PA(Kramer PA)、拉维S(Ravi S)、查科B(Chacko B)、约翰逊MS(JohnsonMS)、达利-乌斯马尔-VM(Darley-Usmar VM).人血小板和白细胞中的线粒体和糖酵解代谢的研究进展：它们作为生物能量生物标记物的意义.《氧化还原生物学》.2014年1月10日；2:206-10(Kramer PA,Ravi S,Chacko B,Johnson MS,Darley-Usmar VM.A review of themitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes:Implications for their use as bioenergetic biomarkers.Redox Biol.2014Jan 10；2:206–10).

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5.古伯斯尔PM(Gubser PM)、班图格GR(Bantug GR)、拉齐克L(Razik L)、费舍尔M(Fischer M)、迪梅罗S(Dimeloe S)、霍恩格G(Hoenger G)等人.记忆型CD8+T细胞的快速效应功能需要即刻早期糖酵解开关.《自然-免疫学》.2013年10月；14(10):1064–72(GubserPM,Bantug GR,Razik L,Fischer M,Dimeloe S,Hoenger G,et al.Rapid effectorfunction of memory CD8+T cells requires an immediate-early glycolyticswitch.Nat Immunol.2013Oct；14(10):1064–72).

发明内容

本发明在独立权利要求中予以阐述和描述，而从属权利要求则描述了本发明的其它特征或主要发明思想的变型。

本发明提供了一种评估生物流体样本中非肿瘤细胞代谢活性的方法，包括：

将每个单一非肿瘤细胞封装在体积约为10pL至10nL的所述流体中；

在4℃至37℃的温度下培养所述体积至少1分钟；

检测培养体积内的pH值和/或至少一种酸分子(例如乳酸、乳酸根离子和质子)的浓度，浓度与细胞的细胞外酸化率相关。

根据本发明的一个方面，相对于培养前为相同体积确定的参考pH值和/或浓度而言，pH值的降低和/或至少一种酸分子浓度的增加，表明存在于所述生物流体样本中的非肿瘤细胞的代谢活性增加，或总体上发生变化。

根据本发明的一个方面，参考pH值和/或浓度通过测量不含非肿瘤细胞的封装体积的所述流体的pH值和/或浓度来确定。

根据本发明的一个方面，生物流体样本为血液或其衍生品。

根据本发明的一个方面，该方法的生物流体样本对象中存在的非肿瘤细胞来自于为10^⁴至10^⁶个细胞每毫升的样本。

根据本发明的一个方面，所述非肿瘤细胞为白细胞，代谢活性的所述评估用于白细胞的功能分类。

根据本发明的一个方面，所述方法包括通过配置成允许区分不同白细胞群的至少一种标记物来获得细胞类型的信息。

根据本发明的一个方面，代谢活性可反映细胞的某些生物过程或途径的激活、甚至改变，从而反映执行其功能的能力。

例如，在白细胞需要免疫反应时，在存在感染或癌细胞或一般炎症等时，将它们的状态从非常状态转为与其代谢改变有关的激活状态。

同样，胎儿细胞显示出与成人细胞不同的代谢。

众所周知，与非转化或非肿瘤细胞相比，肿瘤细胞具有产生酸分子的能力极高。因此，在单细胞水平上利用细胞外pH值的测量来识别血流中的循环肿瘤细胞(CTC)是可能的。

发明人惊奇地发现，尽管与CTC相比，非肿瘤细胞的细胞外酸化率较低，但用本发明的方法可进行测量，并可与受试者的健康状况相关，和/或可用于分离非肿瘤细胞的特定亚群进行进一步分析。

根据本发明公开的方法可提供特别是非肿瘤细胞的糖酵解活性信息。

根据本发明的一个方面，检测的pH值和/或浓度用于识别和/或分类封装的非肿瘤细胞。

方法可用作诊断工具，对受试者的血样进行检测，以获得其中所含的白细胞信息，其中这种信息可用于若干临床领域，例如：

-传染病监测，或对传染病的无可评估怀疑(例如，败血症、创伤后发烧或手术后发烧)；

-自身免疫性疾病监测(无可评估的慢性炎症性疾病)；

-退化性病变监测或检测；

-肿瘤血液学病理(流体或固体肿瘤)。

该方法也可用于可能检测孕妇血样中的循环胎儿细胞。有利地，方法可提供胎儿细胞的分离，以获得可用于进行产前诊断测试的富集胎儿细胞样本。

富集胎儿细胞样本提供了可用于产前/遗传分析的纯正胎儿DNA来源，而到目前为止还不能以无创方式获得纯正胎儿DNA来源。

根据一个方面，方法包括从所述生物流体中分离细胞。

由于本发明特别注重检测非肿瘤细胞，特别至少是白细胞，因此可以检测和分析大量细胞，例如10^⁴-10^⁶个细胞每毫升的血液，而非循环肿瘤细胞反而很少，大约1-10个细胞每毫升的血液中只有几个单位。在这种非肿瘤细胞数量的情况下，有可能对检测的细胞群进行剖析。例如，存在白细胞的情况下，具有表现出不同代谢和与其生物学相关的代谢变化的不同白细胞群。例如，淋巴细胞采取类似于癌细胞的特征来激活，而中性粒细胞由于酸化活性很高，如果受损，就会失去这种活性。本发明的方法允许对临床相关细胞亚群进行功能分类，这可与确定疾病或可疑疾病或管理患者的临床决策相关联。

因此，根据本发明的方法进行的检测和分析不仅旨在识别存在的不同细胞，而且基于代谢方面利用pH值对它们进行剖析。因此，可区分不同的白细胞群，或识别具有相同代谢特征的新型未知类别的白细胞，这在单纯的免疫表型方法中是不可能的。

特别是，这种区分可能通过标记物的帮助来进行。这些标记有助于区分各种白细胞群，并且可使用物理量、特别是光学量(例如，不同角度的光散射，电量或比色量)或其它测量值，或抗体标记物。因此，本文描述的方法输出是一系列数以千计的“单细胞”测量值，用这些测量值可以创建不同白细胞群的特征。

例如，如果标记物与可测量物理量有关，它可为与电位、电导、电容、安培、伏安或光学测量结合使用的类型(例如基于荧光、基于化学发光或电化学发光的类型)。

因此，本文描述的方法的一个输出也可用一系列散点图来表示。在散点图中，pH值和各个标记物之间的关系是可视的，分析员能够识别由图形分割给出的与患者结果相关的“典型”模式或量化，其方式与当前流式细胞仪的做法类似。与本说明书的非肿瘤细胞对象不同，如存在肿瘤细胞，通常只有少数细胞存在，例如1到10个细胞，其并不足以创建可重复模式。

此外，本文描述的方法的另一个输出可为关系数据库，其中每一行均为细胞，每一列均为选自pH值、标记物1、标记物2、......标记物n的细胞特征。数据库具有10^⁴-10^⁶的行和1-10或以上的列。这种数据库结构为统计分析和数据科学技术提供了良好基础，将人工智能程序用于机器学习，即以机器学习为基础。

通过这种先进的数据分析，可根据分析员肉眼看不到的微妙模式，或分析员无法注意到的复杂变量之间的关系，有可能获得患者的结果预测。如存在循环肿瘤细胞，则典型输出为1-10个细胞每毫升的血液。对于这个数字，使用人工智能程序，特别是机器学习方法无法获得有效性能，也无法对人群进行令人满意的统计分析。

有利地，此外，通过本文描述的方法，还可将捕捉到的同一细胞通过光学检测阈值时的图像与每个封装细胞结合。该图像可作为上述关系数据库的另一个元素，每张图像均与数据库的行相关联，以对应于一个细胞。对于每个细胞，该图像可为人工智能模型和程序提供信息(特别是使用机器学习)，以进行上述高级统计分析。

此外，根据其它实施例，本文描述的方法提供了进一步研究在特定药物的影响下确定的代谢图谱(metabolic profiles)如何变化的可能性。这一方案可通过在每次使用不同药物和比较曲线的情况下对样本进行并行分析，或通过微流控技术将药物直接注入由单个封装细胞的体积所限定的微滴中并进行连续测量来实现。

此外，由于本文描述的方法，在提供细胞分离的情况下，可使大量非肿瘤细胞可用，每个细胞均被单独封装并根据代谢参数进行分离。它的优点是能够用分子生物学技术研究具有限定的代谢特征的单细胞或从代谢角度看是同质的细胞群，这在具体代谢方面(细胞外酸化能力)是不可能的。

附图说明

附图与本发明的实施例有关，并在下文中进行了描述。

图1A至图1C是封装白细胞的二维图，示出了时间与葡萄糖施用对ECAR的影响。特别地，图1A是指白细胞培养30分钟后进行的ECAR检测；图1B是指用5mM葡萄糖处理的白细胞培养三种不同时间后进行的ECAR检测比较；图1C是指经葡萄糖处理和未经葡萄糖处理的白细胞在两种不同孵育时间后进行的ECAR检测比较。

图2A和图2B是封装白细胞的二维图，示出了药物处理对ECAR的影响。特别地，图2A是指采用或不采用影响糖酵解的药物培养白细胞120分钟后的ECAR检测；图2B是指采用或不采用刺激白细胞活性的药物培养白细胞120分钟后的ECAR检测。

图3是一系列封装白细胞的二维图，示出了血液学或非血液学条件对白细胞ECAR以及健康对照组的影响。

具体实施方式

现在将详细参考本发明的各实施例。各实例均以阐述本发明的方式来提供，而并非意在对本发明进行限制。例如，所示出或描述的作为一个实施例的部分的特征可用在其它实施例或可与其它实施例结合使用，以产生另一个实施例。本发明旨在包括这些修改和变动。

还应澄清的是，本文使用的短语和术语仅用于描述目的，不应被认为是限制性的。

除非另有限定，否则本文使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意义相同的意义。尽管在本发明的实践或测试中也可使用任何与本文中所述的方法和材料类似或相当的方法和材料，但现在对代表性说明性方法和材料加以描述。

本文描述的实施例涉及一种通过检测细胞外酸化率(ECAR)来评估存在于10^³至10^⁵个细胞的生物流体样本中的非肿瘤细胞的代谢活性的方法，包括：

在4℃至37℃的温度下培养所述体积至少1分钟；

检测所述培养体积内的pH值和/或至少一种酸分子的浓度，该浓度与所述细胞的细胞外酸化率相关。

在本发明的范围内，术语“细胞”是指生物体最小的结构和功能单位(通常是微观的)，并且由细胞膜包裹的细胞质和细胞核组成。

在本说明书中，术语“非肿瘤细胞”是指不具有或不受任何肿瘤特征或特征影响的细胞，特别是不被已知的肿瘤识别技术(例如基于免疫细胞化学方法、形态学标准、细胞行为或DNA/RNA-异常的识别技术)识别为肿瘤细胞。

此外，在本说明书中，术语“非肿瘤细胞”和“细胞”可以互换，在任何情况下都表示为“非肿瘤细胞”，除非另有说明。

此外，在本说明书中，所述生物流体样本的封装体积可简单称为“微滴”。因此，封装非肿瘤细胞可称为含有非肿瘤细胞的微滴。另一方面，不含非肿瘤细胞的所述生物流体样本的封装体积可能被称为不含非肿瘤细胞的微滴。

可使用微流控器件来封装所述体积的生物流体样本。

EP-B-3.084.434中所述的微流控器件(在此通过参考纳入)通常可用于封装所述体积的生物流体样本。因此，此类微流控器件可用于封装所述体积中的一个非肿瘤细胞，即获得每个含有一个非肿瘤细胞的微滴，并进一步获得不含非肿瘤细胞的所述生物流体样本的封装体积。

在实施例中，上述参考pH值和/或浓度通过测量不含非肿瘤细胞的所述流体的封装体积(即不含非肿瘤细胞的微滴的pH值和/或浓度)来确定。

在实施例中，上述体积是基于微滴的微流控器件内的微滴形式。

在实施例中，这种微流控器件可用于使用基于荧光的技术，或电学系统(例如电容测量、电化学传感器、电位纳米传感器)，或通过直接分子检测(例如质谱或酶学检测)来筛选各个微滴。

在微流控器件中流动的微滴可分类、储存、重新注入其它微流控器件，与其它微滴融合，并且细胞可在微滴内培养。

微滴体积可适用于让微滴在类似流式细胞仪结构的流体系统中流动，例如，作为血细胞仪或流式细胞仪的传统诊断血液学仪器。

微滴在类似流式细胞仪结构的流体系统中的流动可能需要改变流动条件，例如，从水溶液切换到油片流体或将油滴封装在水溶液中。

在实施例中，可在血细胞仪或流式细胞仪中检测所述pH值和/或浓度。

在实施例中，细胞可封装在微流控器件中，并注入上述器件中的一种装置，该装置具有适用于激发微滴中的pH指示剂并读取其发射信号以检测pH值变化的光学装置或设备。因此，方法可在常规诊断中实施，因为血细胞仪或流式细胞仪构成了临床实验室的标准设备。

根据实施例，将每个非肿瘤细胞封装在可为微流控器件中水乳剂的一部分的微滴中。

在一个实施例中，微滴为油包水乳液，但也可以采用双乳液。氟油(例如HFE 7500或FC-77或3M^TM的FC-40)由于其储存溶解氧的能力，可能成为首选。乳液可在芯片上形成或单独形成。

在一个实施例中，生物流体可能是体液，并可能选自包括血液、血清、淋巴、胸膜液、腹膜液、脑脊液、尿液、唾液的组。

如有血液，则根据本发明的方法可包括去除红细胞以增加产量的初始步骤。

培养步骤可在室温下进行，或一般在4℃和37℃之间进行。培养时间可至少为1分钟到48小时。培养步骤(即时间和温度培养)可根据要检测的亚群而变化。

pH值可通过pH指示剂、基于荧光的技术、电子系统或通过上述直接分子检测来确定。

pH指示剂可为对pH值敏感的染料或在pH值变化时改变其吸收/发射光谱的指示剂。这些指示剂的实例有pHrodo^TM Green(赛默飞世尔科技)，其在酸性pH值下发出绿色荧光；5-(和-6)羧酸(赛默飞世尔科技)，其580nm和640nm的荧光之间的比例在酸性pH值下增加；以及对pH值敏感的无机盐，其聚集形成微晶体。

根据本发明的方法还可包括用光激光照射封装的非肿瘤细胞，所述检测的pH值是所述照射的封装非肿瘤细胞的发射信号函数。

根据本发明内容，pH值评估也可通过使用技术人员已知的任何技术来测量乳酸或乳酸盐离子或质子的浓度。

根据本发明的各个方面，检测的pH值和/或测量的浓度用于识别和/或分类所述封装的非肿瘤细胞。

因此，根据本发明的方法可在每个单一封装细胞的水平上检测处于特定功能状态的细胞，已知特定功能状态与改变的ECAR活性相关联。由于ECAR活性可能主要由糖酵解途径的激活及其激活程度引起，本方法允许研究与糖酵解活性有关的葡萄糖代谢。

在实施例中，根据本发明的方法可包括用影响糖酵解途径的药物处理细胞的处理步骤，允许出现负责改变可能具有临床意义的pH值和/或浓度的其它生物过程。

在可能的实施例中，方法还可以包括，特别是，分析在特定药物影响下确定的代谢图谱的变化。特别是，对在特定药物影响下确定的代谢图谱变化的评估规定(provides)在每次使用不同药物并比较代谢图谱的情况下对样本进行并行分析，或采用微流控技术将药物直接注入由单个封装细胞的体积限定的微滴中并进行连续测量。

有利地，根据本发明的方法可应用于诊断程序，以分析生物流体(特别是血液)，以检测临床相关的特定细胞亚群等。特定细胞亚群可能与某种疾病或疾病疑似物相关，或用于患者管理的临床决策。

在实施例中，可根据至少一个pH参考阈值或范围进行识别和/或分类，该阈值或范围对应于作为参考的特定细胞群或亚群的实验测量的正常细胞外酸化率。

在实施例中，方法可包括从生物流体样本中分类包括非肿瘤细胞的体积或直接分类非肿瘤细胞的分离步骤。

分离步骤对于获得均匀细胞群非常有用，至少具有可对其进行进一步分析的相同ECAR活性。

此外，由于分离获得多个非肿瘤细胞，每个细胞均被单独封装并根据代谢参数进行分离。这可利用分子生物学技术进行研究，特别是研究限定的代谢特征的单细胞或从代谢角度来看同质细胞群。

在实施例中，根据本发明的方法可包括通过配置为允许在不同白细胞群之间进行区分的至少一种标记物来获取关于细胞类型的信息。

根据可能的实施例，获得细胞类型的信息包括：将生物流体样本与一个或多个探针接触，探针作为适用于与非肿瘤细胞表达的抗原结合以获得细胞类型信息的抗体标记物。

根据实施例，所述一个或多个探针可为或包括已知血液学CD标记物，以获得免疫表型信息。标记物可选自包括以下标记物的组：CD3(T淋巴细胞)、CD4(Th淋巴细胞)、CD8(Tc淋巴细胞)、CD14(单核细胞)、CD15(粒细胞)、CD19(B淋巴细胞)、CD45(白细胞)或其它已知标记物。探针可与选自Alexa-Fluor染料、绿色荧光蛋白(GFP)、荧光素衍生物(例如，硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基罗丹明(TRITC)、别藻蓝素(APC))或诸如此类的荧光分子相关联。

或者，获得细胞类型的信息包括：使用检测的物理量，特别是光学量(例如不同角度的光散射，电量或比色量)作为标记物。

根据本发明内容，非肿瘤细胞是白细胞，所述代谢活性的评估用于白细胞的功能分类。

根据本发明内容，方法可识别代谢改变的白细胞，即就其ECAR而言，激活的或无活动力的白细胞或其它临床相关的未限定的白细胞群。

就通常在生理条件下发现的静止白细胞而言，无活动力的白细胞在功能上是失活的，即使在充分共刺激的情况下遇到抗原，也无法启动生产性反应。

相反地，激活的白细胞能够引发呼吸爆发和脱颗粒。

在实施例中，一个或多个探针可用于区分不同的白细胞亚群(中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞或其它)，提供特定亚群的功能分类或将其排除在分析之外。

在进一步的实施例中，可使用其它标记物用于非血液学来源的细胞染色。

该方法的一个实施例可提供将白细胞分组到不同ECAR活性组的步骤。ECAR活性组可由一个或多个低于或超过参考值或参考区间的阈值来限定，参考值或参考区间在从健康受试者分离的白细胞上通过实验测量。

阈值可在不同的白细胞亚群之间变化。

在实施例中，可将确定为具有改变代谢的白细胞分离，以进行进一步分析或体外培养。

在实施例中，方法包括建立关系数据库，其中每行均为通过上述白细胞功能分类确定的细胞，每列均为选自pH值和一个或多个标记物的细胞特征，并使用人工智能程序(特别是机器学习)对所述数据库进行统计分析，以基于确定模式或所述数据库元素之间复杂关系获得患者结果预测。可采用用于自动自学的人工智能程序的实例是无监督学习技术或监督学习技术(例如，人工神经网络或支持向量机(SVM))，可能与基于规则的专家系统和/或与数据挖掘技术相结合。

通过本发明的方法，还可将捕捉的同一细胞通过光学检测阈值时的图像与每个封装细胞结合。该图像可作为上述关系数据库中的另一个元素，每张图像均与数据库的一行相关联，以对应于一个细胞。对于每个细胞，该图像可为人工智能模型和程序提供信息(特别是使用机器学习)，以进行上述高级统计分析。

根据本发明，非肿瘤细胞也可能是胎儿细胞，如上所述的代谢活性评估可用于胎儿细胞识别，从而用于产前筛查或诊断的用途。

在实施例中，根据本发明的方法可用于评估代谢活性，以识别提供用于产前筛查或诊断的丰富胎儿细胞来源的胎儿细胞。

简而言之，微流控器件包括用于将细胞封装在体积约为10pL至10nL的生物流体的微滴中的器件，以及用于检测pH值和/或选自乳酸、乳酸根离子和质子等的至少一种酸分子浓度的器件。

实验实例

器件制造

由PDMS(聚二甲基硅氧烷)制成的器件粘合在玻璃表面，并进行硅烷化处理以使其具有疏水性(如EP-B-3.084.434中所述)，特此通过参考纳入本文。在微细加工中使用标准光刻程序。

光学装置

测量微滴荧光的光学装置包括倒置显微镜(尼康)。405nm激光束穿过柱面透镜，形成正交穿过微流通道的直线，在微流通道中激发微滴，发出的荧光信号由40倍物镜(奥林巴斯LUCPlanFLN，40x/0.60)捕获，用双色向滤光镜分割，通过带通滤波器(579/34；630/38和450/65)的光电倍增器管(PMT)(H957-15，滨松)检测。信号由1V/uA的增益放大，并由采集系统(美国国家仪器公司的cRIO-9024，模拟输入模块NI9223)以10μsec的扫描速率进行检测。

微滴的产生和细胞的封装

在20μm宽的T型结的芯片中产生单分散微滴。连续相：HFE-7500(3M)中的2％(w/w)表面活性剂(Krytox-Jeffamin-Krytox A-B-A三嵌体共聚物)。

分散相：在含有15％ Optiprep和4μM SNARF-5F的Joklik改性EMEM中的细胞悬浮液(1-2百万细胞/mL)。连续相的流速设定为600μL/h，分散相为300μL/h。

用于细胞外酸化率测量的pH测定法

对pH值敏感的荧光染料SNARF-5F(Invitrogen)用于测量每个微滴的pH值。SNARF-5F响应pH值变化，在发射光谱中发生波长漂移。对于每个微滴，计算SNARF-5F在580nm和630nm处发射的荧光强度的比率(580/630比)。当pH值更具酸性时，SNARF-5F荧光在580nm处增大，在630nm处减小。微滴的pH值以580/630的比值表示。

样本

从日常工作中选出的剩余样本收集在K3-EDTA管中(Kima,Padova)。根据制造商的方案，用裂解液(BD Bioscences)溶解全血后，分析白细胞(WBC)，以300g x 5分钟的速度离心，并重新悬浮在工作液(Joklik's modified EMEM，optiprep 15％和4uM SNARF-5F)中，以获得1-2百万细胞/毫升的浓度。根据血细胞测定结果(Beckman Coulter DxH 900)和患者病史选择病理样本。

结果

结果显示在图1至图3中。

特别是，如表1所示，580/630比越高，pH值越低。

表1

580/630比	pH值
		0.76	8
1.05	7.4
		1.44	7.0
2.03	6.5
		3.21	6
3.72	5.5
		3.85	5

基础条件

为了研究健康捐赠者外周血的循环白细胞，在其基础原生状态下，用抗CD45抗体标记它们，并用微滴微流控器件进行分析。图1A示出了白细胞在37℃下培养30分钟后获得的代表性图谱。

微滴在图谱上沿顺时针方向一致分布在四个细胞群中。

-既没有CD45信号，也没有对应于空微滴的ECAR活性的最丰富细胞群。

-CD45低/ECAR高表型的主要细胞群

-CD45中/ECAR非常高表型的较小细胞群

-CD45高/ECAR低表型的主要细胞群

如图1A所示，中性粒细胞构成了具有CD45低/ECAR高表型的主要亚群，而通常只占一小部分的单核细胞可通过略微增加的CD45表达和酸化潜能来识别。

另一方面，淋巴细胞被证实是具有最高CD45表达和最低ECAR的细胞群。

值得注意的是，在不裂解红细胞的情况下也得到了类似图谱，这表明在不进行任何进一步操作的情况下分析全血也是可能的。

通过直接控制糖酵解调节ECAR

为了确定观察到的效应可归因于葡萄糖依赖性的细胞外酸化，并且该方法能够测量这种现象的扰动，对细胞进行长期观察，并将其暴露在已知影响糖酵解级联的不同条件下。

现在参考图1B，对细胞进行长期观察，直到完成120分钟的培养，细胞群之间的ECAR值差异增加。原因在于，对于CD45水平较低的细胞，ECAR活性显示出时间依赖性增加更明显。

通过比较在补充或不补充葡萄糖的培养基中培养的细胞，如图1C所示，在不添加葡萄糖的情况下，白细胞的ECAR活性明显降低。相应地，当细胞在PBS中培养时，我们还可在同一细胞群中观察到显著的ECAR活性。

参照图2A，将细胞放在添加或不添加寡霉素的培养基中，寡霉素通过抑制线粒体ATP的产生来刺激糖酵解，或者添加糖酵解竞争性抑制剂2-脱氧葡萄糖(2-DG)来抑制糖酵解。发明者发现，寡霉素导致所有细胞群的ECAR值增加，而2-DG反而能够显著降低ECAR，其程度与我们在没有葡萄糖的情况下可以观察到的相似。

通过免疫刺激细胞调节ECAR

最后，如图2B所示，还利用PMA(Phorbol Myristate Acetate)，一种众所周知的蛋白激酶C(PKC)的激活剂来处理细胞，以刺激白细胞活性和氧化爆发启动，并发现PMA能够增加ECAR。

单细胞ECAR分析的临床作用试验探索

循环白细胞的代谢图谱有可能成为研究人类疾病的临床相关生物标志物。

参照图3，在血液学或非血液学、病理学和准生理学条件下，对白细胞的细胞外酸化活性进行初步筛选。图3示出了正常的健康对照图，以及不同淋巴细胞异常患者的对照图。根据上述数据来解释这些图。

-EBV感染图示出了ECAR高的淋巴细胞较多，

-败血症图示出了存在大量中性粒细胞，但集群的形状有所改变(ECAR的方差降低，CD45的方差增加)。淋巴细胞群的形状也有改变。

-毛细胞白血病图示出了“双”淋巴细胞群，一个CD45低的ECAR相对较高，另一个CD45高的ECAR相对较低。

-急性白血病图示出了中性粒细胞群的形状有所改变，但ECAR有升高趋势。

显然，在不背离本发明的领域和范围的情况下，可修改前述方法和/或增加步骤。

Claims

1.一种通过检测细胞外酸化率评估生物流体样本中存在的，特别是10^{^4}至10^{^5}个细胞每毫升的样本中存在的血液或血液衍生物中的非肿瘤细胞代谢活性的方法，所述方法包括：

在4℃至37℃的温度下培养所述体积至少1分钟；

检测所述培养体积内pH值和/或至少一种酸分子的浓度，所述浓度与所述细胞的所述细胞外酸化率相关，其中相对于培养前相同体积确定的参考pH值和/或浓度而言，所述pH值的降低和/或所述至少一种酸分子的浓度增加表明所述生物流体样本中存在的所述非肿瘤细胞代谢活性的变化；

其中，所述非肿瘤细胞为白细胞，所述代谢活性的评估用于白细胞的功能分类；

其中，此外所述方法包括通过配置成允许区分不同白细胞群的至少一种标记物来获得细胞类型的信息。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述参考pH值和/或浓度通过测量不含非肿瘤细胞的封装体积的所述流体的pH值和/或浓度来确定。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述检测的pH值和/或浓度用于识别和/或分类所述封装的非肿瘤细胞。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述识别和/或所述分类依据至少一个pH值和/或浓度的阈值或范围进行，所述阈值和所述范围对应于作为参考的特定细胞群或亚群的实验测量的正常细胞外酸化率。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述方法包括分离步骤，所述分离步骤用于从所述生物流体样本中分类包括所述非肿瘤细胞的所述体积。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，获得所述细胞类型信息包括：将所述生物流体样本与一个或多个探针接触，所述探针作为适用于与所述非肿瘤细胞表达的抗原结合以获得细胞类型信息的抗体标记物。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，获得所述细胞类型的信息包括：使用检测的物理量，特别是光学量，诸如不同角度的光散射，电量或比色量，作为标记物。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述pH值通过使用pH指示剂，特别是pH值敏感染料或在pH值变化时改变其吸收/发射光谱的指示剂来检测。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述方法包括：用光激光器照射所述封装的非肿瘤细胞，所述检测的pH值是所述照射的封装非肿瘤细胞的发射信号的函数。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，检测所述pH值和/或浓度在血细胞仪或流式细胞仪类似结构中进行。

11.根据前述任何一项权利要求所述的方法，其中，所述至少一种酸分子选自乳酸、乳酸离子和质子。

12.根据前述任何一项权利要求所述的方法，其中，所述方法包括：建立关系数据库，在所述关系数据库中，每一行均为通过所述白细胞功能分类识别的细胞，每一列均为选自所述pH值和一个或多个所述标记物的所述细胞的特征；使用人工智能程序，特别是机器学习，以对所述数据库进行统计分析，以便根据所述数据库的元素之间的识别模式或复杂关系来获得患者结果预测。

13.根据权利要求12所述的方法，所述方法包括：在每个封装的细胞通过光学检测阈值时捕获其图像，所述图像用作所述关系数据库中的额外元素，每张图像与所述数据库的行相关联，以便通过人工智能程序进行所述统计分析。

14.根据前述任何一项权利要求所述的方法，所述方法包括：分析在特定药物的影响下确定的代谢图谱变化。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，对在特定药物影响下确定的代谢图谱变化的评估规定在每次使用不同药物并比较代谢图谱的情况下对样本进行并行分析，或采用微流控技术将药物直接注入由单个封装细胞的体积限定的微滴中并进行连续测量。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，所述非肿瘤细胞也可能是胎儿细胞，所述代谢活性的评估可用于胎儿细胞识别，从而用于产前筛查或诊断的用途。