CN116590190A - 嗜碱盐单胞菌lh-b.0040及其微生物菌剂与用途 - Google Patents

嗜碱盐单胞菌lh-b.0040及其微生物菌剂与用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及嗜碱盐单胞菌（Halomonas alkaliphila）LH‑B.0040，属于生物技术领域。其保藏编号为CGMCC No.16324。该菌株可以在高盐无碳或低碳条件下彻底将硝酸盐转化为氮气，且不产生亚硝酸盐积累。本发明还公开了该菌株的菌剂，以及其处理高盐含氮废水的应用，该菌株最高可脱氮盐度为15%，在高盐含氮废水处理中很好的应用前景。同时能够在高盐环境下降解有机物，可用于高盐废水生物脱氮，能低成本解决高盐环境下生物脱氮难题。

Description

嗜碱盐单胞菌LH-B.0040及其微生物菌剂与用途
技术领域
本发明涉及环保生物技术领域，特别是一种嗜碱盐单胞菌(Halomonasalkaliphila)LH-B.0040，本发明还涉及前述菌株的微生物菌剂，及其在高盐含氮废水处理中的应用。
背景技术
高盐含氮废水是指总溶解固体(Total dissolved inorganic salt,TDS)质量分数高于1％的含氮废水称为，具有来源广泛、离子浓度高、污染物成分复杂等特点。如果未经处理直接排放，会导致江河湖泊的水质矿化度提高、水体富营养化、毒害水生生物并对土壤造成严重污染。全球高盐废水的处理需求已达到废水处理总需求的5％，而且还以年均2％的速率增长。
而硝酸盐引起的总氮污染问题是世界性的环保难题。各地立法组织纷纷出台相应法律规定，对水体中硝酸盐含量进行严格限定。我国也不断提高城镇污水和工业废水处理的总氮排放标准。大多C/N较低的污水处理厂仍主要靠投加大量的碳源实现TN的脱除，既不符合绿色环保发展理念，又导致一系列的负面作用，如产生大量污泥处置成本和二次污染风险，尾水碳超标、盐过高导致微生物死亡等。同时污水处理厂普遍存在尾水总氮不达标的问题。因此研究开发低碳甚至无碳的自养反硝化深度脱氮技术，是针对上述问题研究的热点。而微生物脱氮是一种低成本高效可行的方法。
生物处理技术是利用微生物的催化、同化等作用脱除废水中污染物的一种方法，具有应用广、适应性强、经济性好、处理效率高等特点。目前，低碳物探自养反硝化微生物处理技术的难点在于筛选耐盐反硝化深度脱氮菌种。利用某些细菌的硝化和反硝化的能力，将污水中的氮转化为无害的氮气，可以廉价无害的解决污水排放问题，尤其是自养反硝化细菌在不利用有机碳源的情况下，能够实现硝态氮的去除，是一种绿色环保的生物技术。但目前自养反硝化菌株的筛选及应用是技术难题，尤其是在高盐环境下实现自养脱氮的菌株更是鲜有报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的嗜碱盐单胞菌LH-B.0040菌株，该菌株具有能够在高盐条件下进行自养反硝化脱总氮及碱度作用。
本发明所要解决的另一个问题是提供了含有嗜碱盐单胞菌LH-B.0040发酵液的微生物菌剂。
本发明的再一个问题是提供上述嗜碱盐单胞菌LH-B.0040的应用及含嗜碱盐单胞菌LH-B.0040菌剂的应用，主要是为解决高盐条件下的无碳生物脱氮问题，尤其是盐度≥10％条件下的无碳生物脱氮问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现：
本发明公开的嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphila)LH-B.0040，根据其形态特征和生理生化特征及16SrRNA基因序列在Genbank中的检索结果，分类命名为(Halomonasalkaliphila)LH-B.0040。该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16324，保藏日期2018年8月20日。该菌株于2018年8月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16324。本发明的嗜碱盐单胞菌(Halomonasalkaliphila)LH-B.0040的16SrRNA序列长度为1400bp。
本发明的嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphila)LH-B.0040为革兰氏阴性菌；通过电子显微镜观察其形态结构呈棒、杆状，单个、无交叉，菌落表面光滑。
本发明的嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphila)LH-B.0040能够在盐浓度1％-15％、pH7-11、温度15-45℃范围内生长。最适生长温度是20℃，最适生长pH是9，最适生长盐度是1-10％。
本发明所述的嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphila)LH-B.0040于2017年3月25日从江苏省某海滩中采集样品中分离获得，其生长以硫铁矿、硫代硫酸钠等为电子供体，以NO3 -或NO2 -为电子受体生长。
本发明所述的微生物菌剂，包含以上技术方案所述的嗜碱盐单胞菌(Halomonasalkaliphila)LH-B.0040或者其发酵液的微生物菌剂。菌剂的制备方法可以采用现有技术中公开的常规菌剂的制备方法。
所述的微生物菌剂中嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphila)LH-B.0040含量不低于10％。微生物菌剂可以按需要添加适量的菌剂助剂，相互间不排斥的同功能菌株发酵液等。也可以全部是嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphila)LH-B.0040菌株或者菌种发酵液。
本发明所述的微生物菌剂在高盐废水处理中的应用。
本发明所述的微生物菌剂在盐度1-15％的高盐废水的生物脱氮处理中的应用。
本发明所述的微生物菌剂进一步优选对于盐度大于10％的高盐废水进行自养反硝化。
利用本发明菌株LH-B.0040制备的微生物菌剂，当以生物脱氮为主要目标进行应用时，该菌剂的最适耐盐浓度范围是1％-15％。
当废水盐浓度为1％-15％，该菌剂可以NO3-N、NO2-N为电子受体，以硫铁矿、硫代硫酸钠等为电子供体，在无碳的情况下，经过6h，NO3-N、NO2-N的去除率可以达到99.5％以上，无亚硝酸盐积累，且对碱度有一定的去除效果。
本发明与现有技术相比，有益效果如下：
本发明的嗜碱盐单胞菌LH-B.0040耐受高渗透压及高盐环境，其耐盐范围是1％-15％，可在该盐度范围内以NO3-N、NO2-N为电子受体、以硫铁矿、硫代硫酸钠等为电子供体进行反硝化脱氮，硝化反硝化效率均大于99.5％，不产生亚硝酸盐积累，且对碱度有一定的去除效果。
利用LH-B.0040制备的微生物菌剂，耐受高渗透压及高盐环境，在高盐废水处理、RO浓水处理、尾水净化、高碱度废水脱氮、污染海水治理，盐碱地修复，消耗氮素营养，抑制藻类过度繁殖，净化水体，改良底质等方面有较好的应用效果。
附图说明
图1为菌株系统进化树分析图；
图2为菌株革兰氏染色后光学显微镜形态图；
图3为菌株电子显微镜形态图；
图4菌株在不同盐度下的生长曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下列实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1，嗜碱盐单胞菌LH-B.0040的筛选
1、菌群富集：将采集的样品经1％盐水反复清洗5次，去除残留COD，经测定上清液COD＜10mg/L。
配置自养反硝化培养液：每升含KNO3 0.4g/L，硫铁矿粉末1.5g/L、硫代硫酸钠0.2g/L、多硫化钙0.2g/L、菱铁矿石粉末1g/L、铁粉末0.5g/L、硫酸亚铁0.3g/L、Na2CO3 0.5/L、NaCl 1％、微量元素液10mL，pH8-9。微量元素液(1000mL)：MnCl2·7H2O 0.05g/L，H3BO30.05g/L，CoCl2·6H2O 0.2g/L，CuCl2·6H2O 0.05g/L，NiCl2·6H2O 0.05g/L，Na2Mo4·2H2O0.05g/L，水1L。
采用缺氧反应器中加入一半体积的反硝化培养液，将清洗好备用的耐盐反硝化浓缩污泥接入反应器中，补清水至系统MLSS3000-5000mg/L浓度，开启设备搅拌，控制溶氧＜0.5mg/L，15-37℃培养8-48h，测定硝态氮和亚硝态氮含量均＜1mg/L时，说明反硝化完全，停止搅拌，沉降2h，弃去上清液一半，继续补加反硝化培养液一半后，开启搅拌反应，如此不额外补加任何碳源的条件下重复10次以上，反应时间逐渐缩短至8h内，出水硝态氮和亚硝态氮含量均1mg/L，表明反硝化菌群富集成功。
2、菌种分离鉴定
将实富集的自养反硝化菌液，进行梯度稀释后划线或涂布分离；
自养反硝化固体分离培养基：每升含KNO3 0.4g/L，硫铁矿粉末2g/L、硫代硫酸钠0.3g/L、多硫化钙0.2g/L，菱铁矿石粉末0.5g/L、铁粉末0.5g/L、硫酸亚铁0.5g/L，Na2CO30.5g/L，NaCl 10g/L、微量元素液10mL，pH8-9，琼脂粉20g。微量元素液(1000mL)：MnCl2·7H2O 0.05g/L，H3BO3 0.05g/L，CoCl2·6H2O 0.2g/L，CuCl2·6H2O 0.05g/L，NiCl2·6H2O0.05g/L，Na2Mo4·2H2O 0.05g/L，煮沸充分溶解琼脂，倒制平板培养基备用。
将梯度稀释后的自养反硝化菌液在生物安全柜中涂布至固体平板上，放置于培养箱37℃下培养2-5d，待长出菌落后，挑取单菌落划线分离纯化，直至平板中的菌呈单一菌种。
将分离获得的单菌株送至中国农业微生物菌种保藏中心进行菌种鉴定，单菌株鉴定为嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphila)，命名为嗜碱盐单胞菌LH-B.0040。菌株系统进化树分析图参见图1。
实施例2，嗜碱盐单胞菌LH-B.0040的形态特征及生理生化
将筛选出的菌进行革兰氏染色后(如图2)，光学显微镜观察为革兰氏阴性菌，呈短杆状。经电子显微镜观察(如图3)呈棒、杆状，单个、无交叉，菌落表面光滑。
在无菌条件下，用移液枪吸取50μL菌液，接种到15种生理生化试剂反应管(葡萄糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、氧化酶、淀粉、苯丙氨酸脱氨酶、甘露醇、七叶苷、硝酸盐还原(还原)、亚硝酸盐(产气)、明胶、DNA、尿素)，将其在试剂架上摆放整齐，放至30℃培养箱中培养24h观察并记录结果，如表1所示:
表1嗜碱盐单胞菌LH-B0040的生理生化特征
注：+：阳性；-：阴性。
实施例3，嗜碱盐单胞菌LH-B.0040的耐盐生长特性
将LH-B.0040接入不同盐度的自养反硝化培养液中，放入35℃，160rpm摇床中培养，每4h测定一次OD600，待连续两次以上测量值没有明显变化后停止测量。结果表明(见图4)，菌株LH-B.0040接接种于不同盐度的液体培养基中，在3-15％盐度培养基中，接种后直接进入对数期，没有延迟期，25h进入稳定期；说明该菌株耐盐性能良好。
实施例4，嗜碱盐单胞菌LH-B.0040的脱氮性能测定
将筛选的菌株接入盐浓度为5％的自养反硝化培养液中培养24h后，一级种子液以10％接种量接种于盐浓度为5％自养反硝化培养液，培养12h后以20％接种量接种于自养反硝化培养基中(初始氮浓度为55mg/L)，每2h取样测定、硝态氮和亚硝态氮浓度。结果表明，菌株LH-B.0040可以有效转化硝态氮，可在2h内将其全部转化，在反应液中几乎检测不到亚硝态氮。说明该菌株有良好的反硝化脱氮能力，且反硝化速率快。
实施例5，嗜碱盐单胞菌LH-B.0040的发酵液制备
(1)培养基：KNO3 0.4g/L，硫铁矿粉末1g/L、硫代硫酸钠0.3/L、硫酸亚铁0.5/L，Na2CO3 1.5g/L，NaCl 10g/L；微量元素10ml/L，pH为8.5～9.0。液体培养基进行灭菌，同时控制好水分蒸发。
(2)上述培养基装入1L的三角瓶中，接种菌株LH-B.0040后在35℃条件下培养，培养过程中补充水分的散失，防止盐浓度的变化。培养48h后测定反硝化降解率，硝态氮降解率达到90％以上。培养物进行两次转接培养，每次转接后均培养48h，两次培养完成后硝态氮降解率达到90％以上。
(3)将1L三角瓶中的培养液接种到20L的厌氧发酵罐中，反复进行发酵培养，培养基不变。培养时间48h，培养温度为35℃、搅拌速度为100rpm，菌液硝态氮降解率达到90％以上即为发酵成功。
(4)检验：培养过程中使用显微镜每日取样观察，检查是否有杂菌混入生长；同时观察LH-B.0040的生长及形态变化情况。
(5)结果：试验结果表明，菌株LH-B.0040可以快速的进行发酵培养和放大，这表明LH-B.0040具有规模应用的潜力。
实施例6，含菌株LH-B.0040的微生物菌剂的制备
利用实施例5所述方法制备的菌株LH-B.0010的发酵液作LH-B.0040的微生物菌剂。
实施例7，含菌株LH-B.0040的微生物菌剂在高盐含氮废水处理中的应用
利用实施例6制得的微生物菌剂，处理COD100mg/L，NO3-N 100mg/L，pH7.0-8.5，盐度分别为1％、3％、5％、8％、10％、15％的废水，过程中不补加碳源，30℃、2h后各物质如下表2所示(单位％)：
表2
盐度 1％ 3％ 5％ 8％ 10％ 12％ 15％
硝态氮 0.09 0.23 0.34 0.35 0.48 0.72 1.10
亚硝态氮 0.012 0.01 0.02 0.01 0.01 0 0.02
由上表2可知，复合微生物菌剂能够在1％-15％盐度下高效降解有机物及硝态氮，且废水中几乎没有亚硝酸盐氮的积累，几乎完全实现了完全反硝化，15％盐度条件下，硝酸盐氮有少量的积累，延长培养时间后硝酸盐氮完全脱除，说明在高盐度的条件下，需要延长处理时间。
实施例8，含LH-B.0040菌株的微生物菌剂在实际高盐含氮废水处理中的应用实验：将实施例6制得的微生物菌剂用于处理COD100mg/L，总氮150mg/L(主要为硝态氮)，盐度3％的焦化废水RO浓水，过程中不补加碳源，稳定运行后，总氮去除率95％以上。证明该菌剂对于高含盐废水具有很好的处理效果。

Claims (9)

1.一种嗜碱盐单胞菌（Halomonas alkaliphila）LH-B.0040，其特征在于，该菌株的保藏编号为CGMCC No.16324。
2.根据权利要求1所述的嗜碱盐单胞菌LH-B.0040的用途，其特征在于，该菌株能够在低有机碳源或无有机碳环境下降硝酸盐还原为氮气，实现自养或自养/异养协同脱氮。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，嗜碱盐单胞菌LH-B.0040在碱度＞400mg/L的废水中脱氮并降低碱度。
4.根据权利要求1-3中任何一项所述的用途，其特征在于，嗜碱盐单胞菌LH-B.0040在盐度1%-15%的环境下进行硝态氮及碱度的脱除。
5.一种微生物菌剂，其特征在于：该微生物菌剂含有权利要求1所述的菌株嗜碱盐单胞菌LH-B.0040的菌种发酵液。
6.根据权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，所述的微生物菌剂中嗜碱盐单胞菌LH-B.0040的菌种发酵液的质量含量不低于10%。
7.权利要求5或6所述的微生物菌剂的用途，其特征在于，所述的用途为将该菌剂应用于盐度1%-15%的高盐废水反硝化脱总氮的处理。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的反硝化为缺氧反硝化。
9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的用途为将该菌剂应用于盐度10%-15%的高盐废水反硝化脱总氮的处理。
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