CN116590151A - 一种海洋土曲霉发酵培养基及利用海洋土曲霉发酵生产丁内酯-i的工艺 - Google Patents

一种海洋土曲霉发酵培养基及利用海洋土曲霉发酵生产丁内酯-i的工艺 Download PDF

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CN116590151A CN202310443413.6A CN202310443413A CN116590151A CN 116590151 A CN116590151 A CN 116590151A CN 202310443413 A CN202310443413 A CN 202310443413A CN 116590151 A CN116590151 A CN 116590151A
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杨献文
胡曼宜
徐琳
罗联忠
谢春兰
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Abstract

本申请公开了一种海洋土曲霉发酵培养基，包含蔗糖28～40g/L、可溶性淀粉5～15g/L、酵母提取物2～6g/L、花生饼粉8～18g/L、谷氨酸钠10～18g/L、苯丙氨酸5～10g/L、K2HPO4·3H2O 0.1～1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.1～1.0g/L。本申请还公开了利用海洋土曲霉发酵生产丁内酯‑I(BTL‑I)的工艺。本申请通过培养基成分、初始pH、发酵温度、发酵时间等条件进行了优化和调整，大幅提高了BTL‑I的产量，因此实现了BTL‑I的大规模生产。

Description

一种海洋土曲霉发酵培养基及利用海洋土曲霉发酵生产丁内 酯-I的工艺
技术领域
本申请涉及生物发酵工程技术领域，尤其涉及海洋土曲霉发酵培养基，利用海洋土曲霉发酵生产丁内酯-I(BTL-I)的工艺。
背景技术
丁内酯-I(butyrolactone I，BTL-I，式I)为丁烯酸内酯类化合物，广泛存在于真菌中。首次在1977年得到，BTL-I具有良好的生物活性，是激酶CDC2和CDK2的特异性抑制剂；并且可以通过与ATP相竞争显示出抗肿瘤作用。近年还发现BTL-1不仅可以减轻小鼠的非酒精性脂肪性肝炎；而且还可以通过抑制SARS-CoV-2蛋白酶，发挥抗新冠病毒的作用；此外，有科研工作者构建出BTL-I的体内抗神经性病变效应模型，并通过计算机模拟研究了BTL-I的吸收、分布、代谢、排泄和毒性(ADMET)和药物相似特性。值得一提的是，BTL-I具有很强的抗过敏活性，是一个非常有开发应用价值的抗过敏候选药物，因此急需解决其大规模制备的难题。
土曲霉(Aspergillus terreus)是广泛存在于海洋和陆地中的一种真菌。土曲霉的主要次级代谢物包括丁烯酸内酯类化合物、洛伐他汀、衣康酸等，是海洋药物开发的重要资源，具有重要的研发前景及工业化生产的潜力。目前，基于发酵工程技术和基因工程技术，土曲霉生产洛伐他汀和衣康酸已形成了相对较完善的工业体系，但对BTL-I的研究基本还停留在化合物分离以及活性的研究上。这是因为土曲霉的生产对菌丝完整性的要求较高，因此更适合采用固体静置培养的形式来进行发酵生产，有研究表明，使用大米培养基发酵20天的土曲霉BTL-I的产量能够达到20mg/g，但由于固体发酵周期长、易染菌，无法开展BTL-I的规模化制备。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本申请的目的在于提供一种海洋土曲霉发酵培养基，应用于海洋土曲霉发酵生产丁内酯-I(BTL-I)，通过对培养基的成分和配比，提高培养基对土曲霉的发酵效果，从而提高BTL-I产量。
为实现上述目的，本申请实施例提供以下方案：
一种海洋土曲霉发酵培养基，包含蔗糖28～40g/L、可溶性淀粉5～15g/L、酵母提取物2～6g/L、花生饼粉8～18g/L、谷氨酸钠10～18g/L、苯丙氨酸5～10g/L、K2HPO4·3H2O0.1～1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.1～1.0g/L。
作为进一步优选的方案，本申请实施例中所述的海洋土曲霉发酵培养基采用离子水作为溶剂。
作为进一步优选的方案，本申请实施例中，所述的海洋土曲霉发酵培养基包含蔗糖20～35g/L、可溶性淀粉10～15g/L、酵母提取物3～5g/L、花生饼粉10～15g/L、谷氨酸钠12～15g/L、苯丙氨酸5～8g/L、K2HPO4·3H2O 0.2～0.6g/L、MgSO4·7H2O 0.2～0.6g/L。
本申请所述的海洋土曲霉发酵培养基在利用海洋土曲霉发酵生产BTL-I中的应用。
本申请还提供了一种利用海洋土曲霉发酵生产BTL-I的工艺，在该工艺中，通过对发酵培养基的组成和配比进行优化设计，并调整培养条件以实现BTL-I产量的大幅提高，为BTL-I大规模生产提供条件。
所述工艺包括菌种培养：配制活化培养基，接入土曲霉以获得发酵菌种；
配置发酵液：按照权利要求1～3任一项所述的发酵培养基组成将蔗糖、可溶性淀粉、酵母提取物、花生饼粉、谷氨酸钠、苯丙氨酸、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O混合后加入去离子水，得到发酵培养基；
发酵：去上述培养基，调节pH为6.5～6.9，灭菌后接入二代菌种，摇床发酵；
发酵液处理：将发酵液经抽滤分离菌体和上清液，菌体干燥后经甲醇超声破碎，上清液经乙酸乙酯萃取，提取纯化后得到目标代谢产物。
作为进一步优选的方案，本申请实施例中，上述工艺所述的菌种培养过程中，所采用的土曲霉为土曲霉H768，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017121，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2017年3月15日。
作为进一步优选的方案，本申请实施例中，上述工艺所述的发酵过程中，二代菌种的接种量为0.2～0.8ml(1％，v/v)。
作为进一步优选的方案，本申请实施例中，上述工艺摇床发酵时。温度为27～28℃，摇床转速为100～300rpm，发酵时间为5～10天。
与现有技术相比，本申请的有益效果是：
1.本申请所述的海洋土曲霉发酵培养基通过对组成和配比进行调整和优化，应用于土曲霉的发酵，提高了培养基对土曲霉的发酵效果。
2.本申请所述的海洋土曲霉发酵培养基采用去离子水为溶剂，不额外添加任何表面活性剂和离子盐。
3.本申请所述的利用海洋土曲霉发酵生产BTL-I的工艺中，通过培养基成分、初始pH、发酵温度、发酵时间等条件进行了优化和调整，大幅提高了BTL-I的产量，实现了BTL-I的规模化制备。
附图说明
图1土曲霉H768的生长曲线。
图2碳源种类对BTL-I产量的影响。
图3蔗糖添加浓度对BTL-I产量的影响。
图4可溶性淀粉添加浓度对BTL-I产量的影响。
图5氮源种类对BTL-I产量的影响。
图6花生饼粉添加浓度对BTL-I产量的影响。
图7谷氨酸钠添加浓度对BTL-I产量的影响。
图8磷酸盐种类对BTL-I产量的影响。
图9表面活性剂种类对BTL-I产量的影响。
图10镁盐添加浓度对BTL-I产量的影响。
图11前体种类及添加浓度对BTL-I产量的影响。
图12温度、初始pH两因素对土曲霉H768摇瓶发酵生产BTL-I浓度影响的响应曲面三维图。
图13蔗糖-酵母提取物、蔗糖-花生饼粉对土曲霉H768摇瓶发酵生产BTL-I浓度影响的响应曲面三维图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请中说明书和权利要求所涉及的术语“包括”以及与其等同的其他描述方式，均在于覆盖不排他的包含，既包含了已明确在说明书和权利要求书中描述的内容，也可以包含未在说明书和权利要求书中描述，但为产品、方法或结构中所固有的步骤或单元。
在本申请中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
本申请实施例提供一种海洋土曲霉发酵培养基，包含蔗糖28～40g/L、可溶性淀粉5～15g/L、酵母提取物2～6g/L、花生饼粉8～18g/L、谷氨酸钠10～18g/L、苯丙氨酸5～10g/L、K2HPO4·3H2O0.1～1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.1～1.0g/L。在上述方案中，通过蔗糖为主，可溶性淀粉为辅作为发酵时的碳源，替代了传统以葡萄糖作为单一碳源的培养液，避免微生物快速利用速效碳源从而大量繁殖导致发酵过程不可控；采用花生饼粉作为主要氮源，酵母提取物作为补充氮源，具有经济、高效的特点。
作为进一步优选的方案，本申请实施例中所述的海洋土曲霉发酵培养基采用去离子水作为溶剂。
作为进一步优选的方案，本申请实施例中，所述的海洋土曲霉发酵培养基包含蔗糖20～35g/L、可溶性淀粉10～15g/L、酵母提取物3～5g/L、花生饼粉10～15g/L、谷氨酸钠12～15g/L、苯丙氨酸5～8g/L、K2HPO4·3H2O 0.2～0.6g/L、MgSO4·7H2O 0.2～0.6g/L。
本申请所述的海洋土曲霉发酵培养基在利用海洋土曲霉发酵生产BTL-I中的应用。
本申请还提供了一种利用海洋土曲霉发酵生产BTL-I的工艺，在该工艺中，通过对发酵培养基的组成和配比进行优化设计，并调整培养条件以实现BTL-I产量的大幅提高，为BTL-I大规模生产提供条件。
所述工艺包括菌种培养：配制活化培养基，接入土曲霉以获得发酵菌种；
配置发酵液：按照权利要求1～3任一项所述的发酵培养基组成将蔗糖、可溶性淀粉、酵母提取物、花生饼粉、谷氨酸钠、苯丙氨酸、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O混合后加入去离子水，得到发酵培养基；
发酵：去上述培养基，调节pH为6.5～6.9，灭菌后接入二代菌种，摇床发酵；
发酵液处理：将发酵液经抽滤分离菌体和上清液，菌体干燥后经甲醇超声破碎，上清液经乙酸乙酯萃取，提取纯化后得到目标代谢产物。
作为进一步优选的方案，本申请实施例中，上述工艺所述的菌种培养过程中，所采用的土曲霉为土曲霉H768，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017121，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2017年3月15日。
作为进一步优选的方案，本申请实施例中，上述工艺所述的发酵过程中，二代菌种的接种量为0.2～0.8ml(1％,v/v)。
作为进一步优选的方案，本申请实施例中，上述工艺摇床发酵时摇床转速为100～300rpm，发酵时间为5～10天。
实施例1
为了进一步优化发酵培养基的配方，采用以下方法对进行优化设计：
孢子悬浮液制备：配置活化培养基(PDA)，接入土曲霉H768菌种，置于恒温培养箱内，28℃培养7d，取已培养好的土曲霉H768斜面菌种一支，加入10mL无菌水，将琼脂表面的孢子洗下，将该孢子悬浮液置于50mL无菌离心管中；管中预先放置数粒无菌玻璃球，充分振摇后用灭菌的8层纱布进行过滤，并用少量无菌水冲洗滤渣2～3次，制得孢子悬浮液。使用血球计数板测定孢子浓度，并调整浓度至108～109/ml，得到接种用孢子悬浮液。
初始发酵培养基的配制：始发酵培养基的组成(g/L)：葡萄糖50，酵母提取物25，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.3，去离子水定容，调整pH＝7。
进一步的，为了了解土曲霉H768的生长，在上述实施例1基础上绘制生长曲线，具体如下：以1％的接种量向装有50ml初始培养基的250mL三角瓶中接入制备好的土曲霉H768孢子悬浮液，28℃，200rpm震荡培养12d，每24h取样一次，测定发酵产物的pH、还原糖浓度、总BTL-I浓度、生物量浓度。土曲霉H768的生长曲线见图1，BTL-I浓度在第8天达到最高(179mg/L)，并保持稳定。
进一步的，为了优化发酵培养基的配方，在上述实施例1的基础上，对碳源种类的选择进行筛选，具体如下：在初始发酵培养中，加入5％的不同糖类替代葡萄糖作为单一碳源，包括：甘油、蔗糖、甘露醇、乳糖、可溶性淀粉、葡萄糖，以及不添加碳源的对照组。以1％的接种量向装有50ml发酵培养基的250mL三角瓶中接入制备好的土曲霉H768孢子悬浮液，28℃，200rpm震荡培养7d，测定生物量浓度、发酵产物中总BTL-I的含量。
不同碳源所对应的生物量和BTL-I产量见图2，从图中可以看出：碳源为和可溶性淀粉时，效果相对其他碳源有明显优势。
进一步的，为了优化发酵培养基的配方，在上述实施例1的基础上，对碳源添加浓度进行爬坡实验：分别以蔗糖和可溶性淀粉作为碳源，以不同的浓度加入初始发酵培养基，蔗糖添加量为：0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3.5％、5％；可溶性淀粉添加量为：0.5％、1％、1.5％、2％；以及不添加碳源的对照组。以1％的接种量向装有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中接入制备好的土曲霉H768孢子悬浮液，28℃，200rpm震荡培养7d，测定生物量浓度、发酵产物中总BTL-I的含量。
不同浓度的碳源所对应的生物量和BTL-I产量见图3、图4，图中可以初步看出效果较好的碳源添加浓度的范围为蔗糖20-35g/L，可溶性淀粉10-15g/L。
为了进一步优化为了优化发酵培养基的配方，在上述实施例1的基础上，对氮源进行筛选，具体如下：在初始发酵培养中，加入2.5％的不同氮源替代酵母提取物作为单一氮源，包括：蛋白胨、(NH4)2SO4、酵母提取物、花生饼粉、黄豆饼粉，以及不添加氮源的对照组。以1％的接种量向装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中接入制备好的土曲霉H768孢子悬浮液，28℃，200rpm震荡培养7d，测定生物量浓度、发酵产物中总BTL-I的含量。
不同氮源所对应的生物量和BTL-I产量见图5，从图中可以看出：最佳氮源为酵母提取物和花生饼粉。
为了进一步了解氮源浓度对BTL-I产量的影响，在上述实施例1的基础上，考虑到经济因素，以花生饼粉作为主要氮源，对其添加浓度进行爬坡实验，添加量为：1％、1.5％、2％、3％、5％，以及不添加氮源的对照组。以1％的接种量向装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中接入制备好的土曲霉H768孢子悬浮液，28℃，200rpm震荡培养7d，测定生物量浓度、发酵产物中总BTL-I的含量。
不同花生饼粉浓度所对应的生物量和BTL-I产量见图6，从图中可以看出：效果较好的添加浓度的范围为13～30g/L。
为了进一步了解谷氨酸钠添加浓度对BTL-I产量的影响，在上述实施例1的基础上，在初始发酵培养中，以不同的浓度加入谷氨酸钠，添加浓度为(g/L)：0.5、0.7、1、5、7、12、20，以及不添加谷氨酸钠的对照组。以1％的接种量向装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中接入制备好的土曲霉H768孢子悬浮液，28℃，200rpm震荡培养7d，测定生物量浓度、发酵产物中总BTL-I的含量。
不同浓度的谷氨酸钠所对应的生物量和BTL-I产量见图7，图中可以初步看出谷氨酸钠添加浓度的范围为7～20g/L。
为了进一步了解磷酸盐种类对BTL-I产量的影响，在上述实施例1的基础上，在初始发酵培养中，加入0.5g/L的不同磷酸盐替代K3PO4，包括：NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4、KH2PO4、K2HPO4·3H2O，以及不添加磷酸盐的对照组。以1％的接种量向装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中接入制备好的土曲霉H768孢子悬浮液，28℃，200rpm震荡培养7d，测定生物量浓度、发酵产物中总BTL-I的含量。
不同磷酸盐所对应的生物量和BTL-I产量见图8,从图中可以看出：最佳磷酸盐为K2HPO4·3H2O。在以后的培养基优化中，均使用K2HPO4·3H2O做磷酸盐。
为了进一步了表面活性剂种类对BTL-I产量的影响，在上述实施例1的基础上，在初始发酵培养中，加入0.5％的不同表面活性剂，包括：吐温20、吐温40、吐温60、吐温80，以及不添加表面活性剂的对照组。以1％的接种量向装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中接入制备好的土曲霉H768孢子悬浮液，28℃，200rpm震荡培养7d，测定生物量浓度、发酵产物中总BTL-I的含量。
不同表面活性剂所对应的生物量和BTL-I产量见图9，从图中可以看出：最佳表面活性剂为吐温40或不添加。出于经济性和简化实验考虑，在以后的培养基优化中，不添加表面活性剂。
为了进一步了解镁盐添加浓度对BTL-I产量的影响，在上述实施例1的基础上，以不同的浓度的MgSO4·7H2O加入初始发酵培养基，添加浓度为(g/L)：0.25、0.5、1；以及不添加镁盐的对照组。以1％的接种量向装有50ml发酵培养基的250mL三角瓶中接入制备好的土曲霉H768孢子悬浮液，28℃，200rpm震荡培养7d，测定生物量浓度、发酵产物中总BTL-I的含量。
不同添加浓度镁盐所对应的生物量和BTL-I产量见图10，从图中可以看出：镁盐的较佳的添加浓度范围为0.25～1g/L，其中最佳的为0.5g/L。
为了进一步了解前体的种类对BTL-I产量的影响，在上述实施例1的基础上，分别以苯丙氨酸和酪氨酸作为前体，考虑溶解度，以不同的浓度加入初始发酵培养基，添加量为：0.1％、0.3％、0.5％、0.7％；以及不添加前体的对照组。以1％的接种量向装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中接入制备好的土曲霉H768孢子悬浮液，28℃，200rpm震荡培养7d，测定生物量浓度、发酵产物中总BTL-I的含量。
不同前体以及添加浓度所对应的生物量和BTL-I产量见图11，从图中可以看出：最佳前体为苯丙氨酸，较佳的添加量为0.5％-0.7％，考虑溶解度，最佳添加量为0.7％，在以后的培养基优化中，添加0.7％的苯丙氨酸作为前体。
为了进一步了发酵温度和pH对BTL-I产量的影响，在上述实施例1的基础上，采用两因子的中心复合实验设计(CDD)来确定发酵的最佳温度和初始pH。本实验中采用DesignExpert V.8.6.0.1进行了两因子五水平的实验设计，共进行13组试验，实验设计各因素水平见表1，具体实验设计及结果见表2。所有的试验均进行了3组平行试验，并以他们的BTL-I产量平均值作为响应值。
表1：温度、初始pH中心复合实验设计各因素水平
为确定发酵的最佳温度和初始pH，设计了一个两因素五水平的中心复合试验，该试验总共进行13次试验，试验设计及结果见表1。
表1：温度、初始pH中心复合实验(CCD)试验设计及BTL-I产量结果
温度、初始pH的两因子五水平的CCD实验设计回归方程方差分析见表3，通过对中心组合实验所得BTL-I浓度的数据进行回归分析，获得主要因子编码方程为：Log10(Y)＝-0.49+0.18A+0.27B-0.14AB-0.13A2-0.13B2，其中，A代表温度，B代表初始pH，Y代表BTL-I浓度。该模型的变异系数CV为6.42％，小于10％，属于弱变异，这进一步表明实验数据的可靠性。缺失拟合项值(表示回归方程未能拟合的部分)为5.13(P>0.05)，说明所建立的回归方程拟合度高。回归方程的方差分析结果表明多重相关系数R2＝0.9893，说明只有1.07％试验没有被所建立模型检验。调整方差值Adj-R2＝0.9817再次确认了所建立模型的意义。以上分析表明，该回归模型可以用于描述发酵培养温度和初始pH对土曲霉H768菌株所生产的BTL-I浓度的影响。图12为温度、初始pH两因素对土曲霉H768摇瓶发酵生产BTL-I浓度影响的响应曲面三维图。根据上述得到的二阶多元方程求得两因素的最优值，分别是温度27.6℃，初始pH 6.6，在此条件下，BTL-I产量达到428.5mg/L。基于此，我们得到最佳发酵温度为27.6℃，初始pH 6.6。
表3：温度、初始pH中心组合实验(CCD)回归方程方差分析
进一步的，在上述实施例的基础上，为了确定最佳培养基成分，将S4、S6中表现最佳的碳源(蔗糖和可溶性淀粉)和氮源(酵母提取物和花生饼粉)以及谷氨酸钠进行五因子五水平的中心复合试验，碳源添加浓度的高低水平由S5确定，花生饼粉添加浓度的高低水平由S7确定，并根据文献报道和CCD实验的α值设定酵母提取物添加浓度的高低水平为4.5～10g/L，谷氨酸钠添加浓度的高低水平由S8确定。本实验中采用Design ExpertV.8.6.0.1进行了五因子五水平的实验设计，共进行50组试验，实验设计各因素水平见表4，具体实验设计及结果见表5。所有的试验均进行了3组平行试验，并以他们的BTL-I产量平均值作为响应值。
表4：培养基成分中心复合实验设计各因素水平
为确定发酵的最佳培养基成分，设计了一个五因素五水平的中心复合试验，该试验总共进行50次试验，试验设计及结果见表5。
表5：发酵培养基成分中心复合实验(CCD)试验设计及BTL-I产量结果
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培养基成分的五因子五水平的CCD实验设计回归方程方差分析见表6，通过对中心组合实验所得BTL-I浓度的数据进行回归分析，获得主要因子编码方程为：Sqrt(Y)＝0.3673+0.1164A+0.0175B-0.0145C-0.0046D-0.0015E-0.0046AB-0.0104AC-0.0162AD-0.0041AE-0.0097BC-0.0077BD+0.0011BE+0.0041CD+0.0020CE+0.0001DE-0.0031A2-0.0043B2-0.0088C2+0.0121D2-0.0016E2，其中，A代表蔗糖，B代表可溶性淀粉，C代表酵母提取物，D代表花生饼粉，E代表谷氨酸钠，Y代表BTL-I浓度。该模型的变异系数CV为7.45％，小于10％，属于弱变异，这进一步表明实验数据的可靠性。缺失拟合项值(表示回归方程未能拟合的部分)为1.75(P>0.05)，说明所建立的回归方程拟合度高。回归方程的方差分析结果表明多重相关系数R2＝0.9683，说明只有4.04％试验没有被所建立模型检验。调整方差值Adj-R2＝0.9464再次确认了所建立模型的意义以上分析表明，该回归模型可以用于描述发酵培养基对土曲霉H768菌株所生产的BTL-I浓度的影响，其中，蔗糖浓度(A)、可溶性淀粉浓度(B)和酵母提取物(C)对土曲霉H768生产BTL-I有显著性影响(P<0.05)，蔗糖和酵母提取物的交互作用(AC)、蔗糖和花生饼粉的交互作用(AD)对BTL-I产量影响明显(P＜0.05)。
表6：发酵培养基成分中心组合实验(CCD)回归方程方差分析
图13为蔗糖-酵母提取物(a)、花生饼粉蔗糖-花生饼粉(b)两因素对土曲霉H768摇瓶发酵生产BTL-I浓度影响的响应曲面三维图。根据上述得到的二阶多元方程求得五因素的最优值，分别是蔗糖34.9g/L、可溶性淀粉9.94g/L、酵母提取物4.58g/L、花生饼粉13.0g/L、谷氨酸钠14.25g/L。在此条件下，BTL-I产量达到310mg/L。
基于S9、S10、S11、S12、S13、S14我们得到最佳发酵培养基组成为(g/L)：蔗糖34.9、可溶性淀粉9.94、酵母提取物4.58、花生饼粉13.0、谷氨酸钠14.25、苯丙氨酸7.0、K2HPO4·3H2O 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g，最佳培养温度为27.6℃，初始pH 6.6。
为进一步验证培养基优化结果，用实验所确定得最佳培养条件和培养基组成进行发酵，200rpm摇瓶震荡培养8d，发酵结束测得BTL-I浓度约为510mg/L，较优化前提升了约2.9倍。
实施例2
本实施例提供一种利用土曲霉H768发酵生产丁烯酸内酯-I(BTL-I)工艺，具体步骤如下：
菌种培养：配制活化培养基(PDA)，接入土曲霉H768(Aspergillus terreus H768保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M 2017121，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2017年3月15日),以获得发酵菌种；
配制发酵培养基：称取蔗糖34.9g、可溶性淀粉9.94g、酵母提取物4.58g、花生饼粉13.0g、谷氨酸钠14.25g、苯丙氨酸7.0g、K2HPO4·3H2O 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g，加入去离子水定容1L，得到发酵培养基；
发酵：量取上述发酵培养基于三角瓶中，调节pH 6.6，灭菌后接入二代菌种0.5ml(1％，v/v)，于27.6℃，摇床转速200rpm，经8天发酵完成发酵过程；
发酵液处理：将发酵液经抽滤分离菌体和上清液，菌体干燥后经甲醇超声破碎，上清液经乙酸乙酯萃取，提取纯化后得到目标代谢产物。
BTL-I浓度检测：BTL-1产量的测定采用HPLC法：分析柱为Welch Ultimate XB-C18(5μm,4.6mm×250mm)，流动相为(甲醇-1‰甲酸水)，甲醇80％～100％，梯度洗脱15min，流速0.8mL/min，检测波长：310nm，出峰时间：7.5min。得到BTL-I产量达到310mg/L。
对本领域的技术人员来说，可如以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本申请权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种海洋土曲霉发酵培养基，其特征在于，包含蔗糖28～40g/L、可溶性淀粉5～15g/L、酵母提取物2～6g/L、花生饼粉8～18g/L、谷氨酸钠10～18g/L、苯丙氨酸5～10g/L、K2HPO4·3H2O 0.1～1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.1～1.0g/L。
2.根据权利要求1所述的海洋土曲霉发酵培养基，其特征在于，其采用去离子水作为溶剂。
3.根据权利要求1所述的海洋土曲霉发酵培养基，其特征在于，包含蔗糖20～35g/L、可溶性淀粉10～15g/L、酵母提取物3～5g/L、花生饼粉10～15g/L、谷氨酸钠12～15g/L、苯丙氨酸5～8g/L、K2HPO4·3H2O 0.2～0.6g/L、MgSO4·7H2O 0.2～0.6g/L。
4.如权利要求1～3任一项所述的海洋土曲霉发酵培养基在利用海洋土曲霉发酵生产丁内酯-I中的应用。
5.利用海洋土曲霉发酵生产丁内酯-I的工艺，其特征在于，包括
菌种培养：配制活化培养基，接入土曲霉以获得发酵菌种；
配置发酵液：按照权利要求1～3任一项所述的发酵培养基组成将蔗糖、可溶性淀粉、酵母提取物、花生饼粉、谷氨酸钠、苯丙氨酸、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O混合后加入去离子水，得到发酵培养基；
发酵：上述培养基，调节pH为6.5～6.9，灭菌后接入二代菌种，摇床发酵；
发酵液处理：将发酵液经抽滤分离菌体和上清液，菌体干燥后经甲醇超声破碎，上清液经乙酸乙酯萃取，提取纯化后得到目标代谢产物。
6.根据权利要求5所述的工艺，其特征在于，所述菌种培养过程中，所采用的土曲霉为土曲霉H768，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M 2017121，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2017年3月15日。
7.根据权利要求5所述的工艺，其特征在于，所述发酵过程中，二代菌种的接种量为0.2～0.8mL(1％，v/v)。
8.根据权利要求7所述的工艺，其特征在于，所述摇床发酵时，温度为27～28℃，摇床转速为100～300rpm，发酵时间为5～10天。
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