CN116589534A - 青稞来源的抗氧化肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供抗氧化肽及其制备方法和应用,所述抗氧化肽具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列;所述制备方法包括:对青稞进行处理,得到所述抗氧化肽。本发明的抗氧化肽具有较高的自由基清除活性,抗氧化活性强,无细胞毒性,安全性好,可增强神经细胞的活力,对神经细胞的氧化损伤具有显著的保护作用。由此,本发明的抗氧化肽可用于提高样本的抗氧化活性,利用该抗氧化肽制备的抗氧化制品具有抗氧化活性,可进一步应用于药物、细胞培养物或化妆品的开发。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种抗氧化肽及其制备方法和应用。
背景技术
氧化应激是指机体正常的氧化还原失衡,过量的活性氧自由基攻击体内生物大分子,如蛋白质、脂质、DNA等,进而导致细胞和组织出现损伤。流行病学研究表明,神经性疾病、心血管疾病、类风湿性关节炎、糖尿病等一系列疾病都与机体氧化应激密切相关。因此,拮抗机体的氧化应激,恢复机体内氧化系统与抗氧化系统的平衡状态,是当前研究热点。
抗氧化肽是指具有清除自由基、抑制脂质过氧化、螯合过渡金属离子、降低细胞自氧化速率的一类生物活性物质。与市售常见抗氧化剂相比,抗氧化肽能够有效维持机体氧化系统平衡,具有结构简单、安全高效、易吸收、稳定性好等优势。
青稞亦称裸大麦,属禾本科大麦属,是一种重要的高原谷类作物。青稞中蛋白质含量丰富,氨基酸比例均衡,可作为优质的植物蛋白肽来源。国内外研究证实,青稞蛋白肽具有降血糖、降血压、抗菌、抗炎等多方面的药理作用。然而,尚未有青稞蛋白肽抗氧化的相关报道。因此,如何利用青稞开发新的抗氧化产品、为深度利用青稞资源提供新途径是当下亟需解决的问题。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此,本发明提供了一种抗氧化肽及其制备方法和应用,本发明的抗氧化肽具有较高的自由基清除活性,抗氧化活性强,无细胞毒性,安全性好,可增强神经细胞的活力,对神经细胞的氧化损伤具有显著的保护作用;该抗氧化肽可用于提高样本的抗氧化活性,利用该抗氧化肽制备的抗氧化制品具有抗氧化活性,可进一步应用于药物、细胞培养物或化妆品的开发。
在研究过程中,发明人创造性地将青稞蛋白用胃蛋白酶、胰蛋白酶进行酶解处理,得到青稞蛋白酶解物,进一步纯化鉴定该酶解物,得到了一条抗氧化活性强的、新的抗氧化肽Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Pro-Pro-Pro-Pro(VAPGRPPPP)(SEQ ID NO:1)。进一步试验结果显示,该抗氧化肽可增强神经细胞的活力,对神经细胞的氧化损伤具有显著的保护作用。
因此,在本发明的一个方面,本发明提出了一种抗氧化肽。根据本发明的实施例,所述抗氧化肽具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列。
VAPGRPPPP(SEQ ID NO:1)。
根据本发明实施例的抗氧化肽具有较高的自由基清除活性,抗氧化活性强,对DPPH和ABTS自由基清除率高;无细胞毒性,安全性好;进一步细胞实验结果显示,该抗氧化肽可增强神经细胞的活力,对神经细胞的氧化损伤具有显著的保护作用。由此,本发明的抗氧化肽可用于提高样本的抗氧化活性,利用该抗氧化肽制备的抗氧化制品具有抗氧化活性,可进一步应用于药物、细胞培养物、化妆品的开发。
在本发明的第二方面,本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例,所述核酸分子编码上述的抗氧化肽。
根据本发明的实施例,所述核酸编码的上述抗氧化肽具有较高的自由基清除活性,对DPPH和ABTS自由基清除率高,抗氧化活性强。进一步地,所述核酸编码的抗氧化肽可用于提高样本的抗氧化活性或制备抗氧化制品,由此可进一步应用于药物、细胞培养物或化妆品的开发。
在本发明的第三方面,本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例,所述构建体含有上述核酸分子。由此,利用构建得到的构建体,比如载体或转化子,可有效表达上述的抗氧化肽。
在本发明的第四方面,本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例,所述重组细胞含有上述核酸分子或上述构建体。根据本发明的实施例,所述细胞在合适条件下可高效表达上述的抗氧化肽,进一步地,获得的抗氧化肽抗氧化活性强,对DPPH和ABTS自由基清除率高;无细胞毒性,安全性好;可增强神经细胞的活力,对神经细胞的氧化损伤具有显著的保护作用。
在本发明的第五方面,本发明提出了一种制备上述抗氧化肽的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:对青稞进行处理,得到所述抗氧化肽。
根据本发明的实施例,发明人创造性地发现,利用胃蛋白酶和胰蛋白酶对青稞蛋白进行酶解处理,采用超滤、色谱等纯化方法,可分离得到本发明的抗氧化肽。其中,采用胃蛋白酶和胰蛋白酶对青稞蛋白进行酶解处理,对于从青稞中得到本发明的抗氧化肽是必不可少的步骤。由此,获得天然植物来源的抗氧化肽,为利用青稞资源提供新途径。
在本发明的第六方面,本发明提出了一种来源于青稞的抗氧化肽的筛选方法。根据本发明的实施例,所述方法包括如下步骤:
将青稞蛋白用胃蛋白酶和胰蛋白酶进行酶解处理,得到青稞蛋白酶解物;
将所述青稞蛋白酶解物进行纯化处理,得到具有抗氧化活性的纯化组分;
将所述纯化组分中的多肽进行序列分析,得到具有潜在抗氧化活性的多肽序列组;
人工合成或分离纯化所述具有潜在抗氧化活性的多肽序列组中的至少一个多肽;
将所述至少一个多肽进行抗氧化活性检测,筛选获得目标抗氧化肽。
根据本发明的实施例,所述筛选方法可用于开发新的、高抗氧化活性的、青稞来源抗氧化肽,为深度利用青稞资源提供新途径。发明人创造性地发现,利用胃蛋白酶和胰蛋白酶对青稞蛋白进行酶解处理,采用超滤、色谱等纯化手段得到具有抗氧化活性的组分,进一步明确该组分中各多肽的序列并进行抗氧化活性验证,可从青稞中筛选得到新的、抗氧化活性高的抗氧化肽。其中,采用胃蛋白酶和胰蛋白酶对青稞蛋白进行酶解处理,是从青稞中筛选得到新的抗氧化肽的重要步骤。
在本发明的第七方面,本发明提出了一种抗氧化制品。根据本发明的实施例,所述抗氧化制品包括:上述肽、上述核酸分子、上述构建体、上述重组细胞或根据上述方法制得的肽。
根据本发明的实施例,所述抗氧化制品具有抗氧化性能,可进一步用于开发抗氧化产品,为深度利用青稞资源提供新途径。
在本发明的第八方面,本发明提出了一种提高样本抗氧化活性的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:将样本与上述肽、上述核酸分子、上述构建体、上述重组细胞、根据上述方法制得的肽或上述的抗氧化制品接触。
需要说明的是,本发明的“样本”指含有或可能产生自由基的样本、可能与含有或可能产生自由基的物质接触的样品。示例性的,所述样本可以是药品、化妆品、培养基及其制备过程中的中间品、所需缓冲液等。
根据本发明的实施例,利用上述抗氧化肽的抗氧化活性,可提高样本的抗氧化活性。进一步地,可提高生物体内的拮抗机体的氧化应激,恢复机体内氧化系统与抗氧化系统的平衡状态。
在本发明的第九方面,本发明提出了上述肽、上述核酸分子、上述构建体、上述重组细胞、根据上述方法制得的肽或上述的抗氧化制品在制备产品中的应用,所述产品用于抗氧化。
本领域技术人员能够理解的是,前面针对抗氧化肽、核酸分子、构建体、重组细胞和抗氧化制品所描述的特征和优点,同样适用于该用途,在此不再赘述。
有益效果:
(1)发明人从青稞蛋白中筛选得到了一条新型抗氧化肽Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Pro-Pro-Pro-Pro(VAPGRPPPP),该抗氧化肽具有较高的自由基清除活性,抗氧化活性强。
(2)神经细胞毒性实验结果显示:该抗氧化肽无细胞毒性,安全性好;可增强神经细胞的活力,具有潜在的脑部神经保护作用。上述结果提示,本发明的抗氧化肽,可进一步用于预防或治疗神经损伤性疾病。
(3)神经细胞氧化损伤结果显示:该肽具有良好的抗氧化活性和细胞氧化损伤保护作用。上述结果提示,本发明的抗氧化肽,可进一步用于制备抗氧化制品或细胞氧化损伤保护剂,用于药物、细胞培养物或化妆品等产品的开发,具有广阔的应用前景。
本发明的抗氧化肽及其制备和筛选方法,为深度利用青稞资源提供了新途径,大大提高了高原谷类作物青稞的经济价值,应用前景广阔。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1为实施例1 C18制备型液相色谱柱各组分(洗脱峰)的DPPH自由基清除率检测结果图,不同字母表示平均值具有显著性差异(P<0.05);
图2为实施例1 C18制备型液相色谱柱各组分(洗脱峰)的ABTS自由基清除率检测结果图,不同字母表示平均值具有显著性差异(P<0.05);
图3为实施例1抗氧化肽SEQ ID NO:1的二级拟合MS图谱(质量图谱);
图4为实施例2抗氧化肽SEQ ID NO:1对PC12细胞毒性的考察结果图,不同字母表示平均值具有显著性差异(P<0.05);
图5为实施例3抗氧化肽SEQ ID NO:1对H2O2诱导PC12细胞氧化损伤的影响,不同字母表示平均值具有显著性差异(P<0.05)。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地,在本发明的描述中,除非另有说明,“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
实施例中的质量检测指标数据均为平均值。
术语及定义
在文本中,术语“DPPH,2-2 diphenyl hydrazy”是一种稳定的自由基,分子内部存在有非共有电子(N·),当与电子以及自由基反应,会转化为稳定的结构(N-H)。DPPH在水溶液中显紫色,但是当自由基被清除,成为共价键结构后,颜色会转化为淡黄色。此时,利用分光光度计,在515~517nm区间,进行测定,以此来对DPPH自由基清除能力进行判定。该法称为DPPH法,广泛用于定量测定生物试样、分类药物和食品的抗氧化能力。
在文本中,术语“ABTS,S(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid))”是一种具有两个氮原子和两个硫原子的有机分子。当它与二硫酸钾反应,可以生成绿色的ABTS·+自由基。该自由基在734nm有最大吸收,所以通过检测734nmn的吸光度,可以测定其浓度。一个物质加入到ABTS·+自由基工作液后,如果734nmn的吸光度降低,则说明该物质具有自由基清除活性,属于抗氧化剂。该法称为ABTS自由基清除法,可以用来评价物质的抗氧化能力。
在文本中,术语“PC12细胞”是一种常用的神经细胞株。PC12细胞株来源于成年褐家鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤的细胞系,在未分化状态下可以传代培养;在生理水平的神经因子诱导下,PC12细胞会停止分裂,分化为具有神经内分泌细胞的一般特性的细胞。该细胞系可用于细胞动力学、神经生理学、神经药理学、神经毒理学、代谢组学等领域的研究。
在文本中,术语“保守修饰形式的氨基酸序列”是指这样的氨基酸修饰,所述修饰不显著影响或改变包含该氨基酸序列的多肽的生物活性,该修饰包括氨基酸置换、增加和缺失。修饰可通过例如定点诱变和PCR介导的诱变等标准技术引入本发明的抗氧化肽中。保守氨基酸置换系其中的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。在本领域中已经确定具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸),具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸),具有不带电的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸),具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸),具有β-支化侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、和具有芳香侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
本发明提出了一种抗氧化肽、核酸分子、构建体、重组细胞、制备方法、筛选方法、抗氧化制品及其应用,下面将分别对其进行详细描述。
抗氧化肽
本发明提出了一种抗氧化肽。根据本发明的实施例,所述抗氧化肽具有如SEQ IDNO:1所示或其保守修饰形式的氨基酸序列。
VAPGRPPPP(SEQ ID NO:1)。
根据本发明实施例的抗氧化肽,其具有较高的自由基清除活性,抗氧化活性强,对DPPH和ABTS自由基清除率高;无细胞毒性,安全性好;进一步细胞实验结果显示,该抗氧化肽可增强神经细胞的活力,对神经细胞的氧化损伤具有显著的保护作用。由此,本发明的抗氧化肽可用于提高样本的抗氧化活性,利用该抗氧化肽制备的抗氧化制品具有抗氧化活性,可进一步应用于药物、细胞培养物或化妆品的开发。
需要说明的是,在不实质性影响本发明抗氧化肽的抗氧化活性(保留至少90%的活性)的前提下,本发明抗氧化肽的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替代,并且其可用本文中说明的功能测定方法对经改变的抗氧化肽的保留功能进行测试。优选地,保守修饰在数目上不超过1个或2个。
根据本发明的实施例,所述抗氧化肽来源于青稞。由此,获得天然植物来源的抗氧化肽。
核酸分子
本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例,所述核酸分子编码上述的抗氧化肽。
根据本发明的实施例,所述核酸编码的上述抗氧化肽具有较高的自由基清除活性,对DPPH和ABTS自由基清除率高,抗氧化活性强。进一步地,所述核酸编码的抗氧化肽可用于提高样本的抗氧化活性或制备抗氧化制品,由此进一步应用于药物、细胞培养物或化妆品的开发。
需要说明的是,对于本文中所提及的核酸分子,本领域技术人员应当理解,实际包括互补双链的任意一条,或者两条。为了方便,在本文中,虽然多数情况下只给出了一条链,但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外,本发明中的分子序列包括DNA形式或RNA形式,公开其中一种,意味着另一种也被公开。
构建体
本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例,所述构建体含有上述核酸分子。由此,利用构建得到的构建体,比如载体或转化子,可有效表达上述的抗氧化肽。
根据本发明的实施例,所述构建体,可以是载体或转化子。
根据本发明的实施例,所述构建体(比如载体或转化子)可包括可选的控制序列,所述控制序列与所述核酸分子可操作地连接。其中,所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列。由此构建得到的构建体(比如载体或转化子),可有效表达上述抗氧化肽。
在将上述核酸分子连接到所述构建体(比如载体或转化子)上,比如表达载体上时,可以将所述核酸分子与表达载体上的控制元件直接或者间接相连,只要这些控制元件能够控制所述核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身,也可以是外源性的,即并非来自于载体本身。所述核酸分子与控制元件进行可操作地连接即可。
根据本发明的实施例,所述载体可以指克隆载体,也可以指表达载体,可以通过将所述核酸与商购的载体(如质粒或病毒载体)可操作地连接而获得。本发明中的载体不受特别限制,常用的质粒均可使用,如pSeTag2、PEE14、pMH3等。
在本文中,术语“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上,使得载体内的控制元件,例如转录控制序列和翻译控制序列等等,能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。常用的载体例如可以为病毒载体、质粒、噬菌体等等。根据本发明的一些具体实施例的表达载体导入合适的受体细胞后,可在调控系统的介导下,有效实现前面所述的核酸分子的表达,进而实现所述核酸分子编码的多肽的体外大量获得。
根据本发明的实施例,所述载体为真核载体或原核载体。
重组细胞
本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例,所述重组细胞含有上述核酸分子或上述构建体。根据本发明的实施例,所述细胞在合适条件下可高效表达上述的抗氧化肽,进一步地,获得的抗氧化肽抗氧化活性强,对DPPH和ABTS自由基清除率高;无细胞毒性,安全性好;可增强神经细胞的活力,对神经细胞的氧化损伤具有显著的保护作用。
根据本发明的实施例,所述细胞为原核细胞、真核细胞或噬菌体。
根据本发明的实施例,所述原核细胞为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌。
根据本发明的实施例,所述真核细胞为真菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
根据本发明的实施例,所述真菌为巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母或木霉。
根据本发明的实施例,所述昆虫细胞为草地粘虫细胞;根据本发明的实施例,所述植物细胞是烟草植物细胞;根据本发明的实施例,所述哺乳动物细胞为BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞或人胚肾293细胞;且不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
根据本发明的实施例,所述细胞是哺乳动物细胞。
根据本发明的实施例,所述细胞是BHK细胞、CHO细胞、COS细胞或NSO细胞。
要说明的是,本申请说明书中所述的“适合条件”,是指适合本申请所述抗氧化肽表达的条件。本领域技术人员容易理解的是,适合抗氧化肽的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转染条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制,本领域技术人员可根据实验室的具体环境,优化形成最适的所述抗氧化肽表达的条件。
制备方法
本发明提出了一种制备上述抗氧化肽的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:对青稞进行处理,得到所述抗氧化肽。由此,获得天然植物来源的抗氧化肽,为利用青稞资源提供新途径。
根据本发明的实施例,包括如下步骤:
(1)将青稞蛋白用胃蛋白酶、胰蛋白酶进行酶解处理,得到青稞蛋白酶解物;
(2)将所述青稞蛋白酶解物进行纯化处理,得到所述抗氧化肽;
其中,所述青稞蛋白是青稞总蛋白提取物。
根据本发明的实施例,所述青稞蛋白通过如下方法得到,包括:
(1)将青稞进行粉碎,得到青稞粉;
(2)将所述青稞粉制成悬液;
(3)将所述悬液pH值调节至10.5-11.5,30℃搅拌1h,离心取上清液;
(4)将所述上清液pH值调节至4-5,离心取沉淀,得到所述青稞蛋白。
根据本发明的实施例,用水或生理盐水或缓冲溶液,将所述青稞粉配制成悬液。
根据本发明的实施例,将所述青稞粉按照1:25(g/mL)的料液比制成悬液。
根据本发明的实施例,发明人创造性地发现,利用胃蛋白酶和胰蛋白酶对青稞蛋白进行酶解处理,采用超滤、色谱等纯化方法,可分离得到本发明的抗氧化肽。其中,采用胃蛋白酶和胰蛋白酶对青稞蛋白进行酶解处理,对于从青稞中得到本发明的抗氧化肽是必不可少的步骤。
根据本发明的实施例,所述步骤(1)包括:
将青稞蛋白和胃蛋白酶接触,进行第一酶解处理,得到初始酶解物;
将所述初始酶解物和胰蛋白酶接触,进行第二酶解处理,得到青稞蛋白酶解物。
根据本发明的实施例,所述第一酶解处理的温度为32-42℃,时间为1.5-2.5h,反应液的pH值为1.8-2.2;所述第二酶解处理的温度为32-42℃,时间为3.5-4.5h,反应液的pH值为6.8-7.2;所述胃蛋白酶或胰蛋白酶与所述青稞蛋白的质量比为1:(10-30)。
在上述较适宜的酶解条件下,可以得到酶解充分、所述抗氧化肽含量丰富的青稞蛋白酶解物。由此,采用超滤、色谱等分离纯化技术,可得到的本发明抗氧化多肽。
根据本发明的实施例,所述纯化处理包括:
将所述青稞蛋白酶解物进行离心处理,收集上清液;
将所述上清液进行超滤处理,收集滤液;
将所述滤液进行液相色谱纯化处理,收集流出液;
其中,所述超滤处理采用的滤膜的孔径为1~5kDa;
所述液相色谱纯化处理所采用的流动相包括流动相A和流动相B,所述流动相A选自含有0.05~0.15体积%的三氟乙酸水溶液,所述流动相B选自含有0.05~0.15体积%三氟乙酸的甲醇水溶液;
所述液相色谱纯化处理所采用的洗脱条件如下:6~15%流动相B洗脱20min,15~25%流动相B洗脱20min,25~50%流动相B洗脱20min,50~90%流动相B洗脱5min,90%流动相B洗脱10min,90~6%流动相B洗脱10min。
由此,在上述较适宜的超滤或色谱纯化处理下,得到具有抗氧化活性的组分,进一步对抗氧化活性的组分进行分离纯化,可得到本发明的抗氧化肽。
筛选方法
本发明提出了一种来源于青稞的抗氧化肽的筛选方法。根据本发明的实施例,所述方法包括如下步骤:
将青稞蛋白用胃蛋白酶和胰蛋白酶进行酶解处理,得到青稞蛋白酶解物;
将所述青稞蛋白酶解物进行纯化处理,得到具有抗氧化活性的纯化组分;
将所述纯化组分中的多肽进行序列分析,得到具有潜在抗氧化活性的多肽序列组;
人工合成或分离纯化所述具有潜在抗氧化活性的多肽序列组中的至少一个多肽;
将所述至少一个多肽进行抗氧化活性检测,筛选获得目标抗氧化肽。
根据本发明的实施例,所述筛选方法可用于开发新的、高抗氧化活性的、青稞来源抗氧化肽,为深度利用青稞资源提供新途径。发明人创造性地发现,利用胃蛋白酶和胰蛋白酶对青稞蛋白进行酶解处理,采用超滤、色谱等纯化手段得到具有抗氧化活性的组分,进一步明确该组分中各多肽的序列并进行抗氧化活性验证,可从青稞中筛选得到新的、抗氧化活性高的抗氧化肽。其中,采用胃蛋白酶和胰蛋白酶对青稞蛋白进行酶解处理,是从青稞中筛选得到新的抗氧化肽的重要步骤。
根据本发明的实施例,所述序列分析可以采用液相色谱质谱联用仪分离和分析所述纯化组分中的多肽。
根据本发明的实施例,所述液相色谱用来分离所述纯化组分中的多肽,所述液相色谱采用的流动相包括流动相A和流动相B,所述流动相A选自含有0.05~0.15体积%的三氟乙酸水溶液,所述流动相B选自含有0.05~0.15体积%三氟乙酸的甲醇水溶液;所述分离采用的洗脱条件如下:3%流动相B洗脱80min,32%流动相B洗脱15min,100%流动相B洗脱25min。
根据本发明的实施例,所述质谱用来分析所述多肽,所述质谱的MS扫描范围为355-1700 m/z,离子注入时间100ms;MS/MS扫描范围200-2000 m/z,离子注入时间75ms。
根据本发明的实施例,所述质谱检测结果的解析软件为Peaks Studio软件。
根据本发明的实施例,所述酶解处理和纯化处理是上述制备所述抗氧化肽的方法中所限定的。
抗氧化制品
本发明提出了一种抗氧化制品。根据本发明的实施例,所述抗氧化制品包括:上述肽、上述核酸分子、上述构建体、上述重组细胞或根据上述方法制得的肽。
根据本发明的实施例,所述抗氧化制品具有抗氧化性能,可进一步用于开发抗氧化产品,为深度利用青稞资源提供新途径。
提高样本抗氧化活性的方法
本发明提出了一种提高样本抗氧化活性的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:将样本与上述肽、上述核酸分子、上述构建体、上述重组细胞、根据上述方法制得的肽或上述的抗氧化制品接触。
根据本发明的实施例,利用上述抗氧化肽的抗氧化活性,可提高样本的抗氧化活性。进一步地,可提高生物体内的拮抗机体的氧化应激,恢复机体内氧化系统与抗氧化系统的平衡状态。
应用
本发明提出了上述肽、上述核酸分子、上述构建体、上述重组细胞、根据上述方法制得的肽或上述的抗氧化制品在制备产品中的应用,所述产品用于抗氧化。
本领域技术人员能够理解的是,前面针对抗氧化肽、核酸分子、构建体、重组细胞和抗氧化制品所描述的特征和优点,同样适用于该用途,在此不再赘述。
根据本发明的实施例,所述产品包括:药物、细胞培养物或化妆品。
根据本发明的实施例,所述产品选自药物,所述药物用于预防或治疗神经损伤性疾病。
根据本发明的实施例,所述神经损伤性疾病为嗅神经损伤,视神经损伤、动眼、滑车、外展及三叉神经眼支损伤,面、听神经损伤,舌咽、迷走、副、舌下神经损伤中的至少一种。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
在下列实施例中,抗氧化肽或包含抗氧化肽的组合物(比如洗脱样品等)的抗氧化性能,通过测定其DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率来评估。具体测定方法如下:
1)DPPH自由基清除率测定方法
将100μL样品溶液加入到100μL DPPH溶液中混匀,然后将混合物在室温下避光放置30min,使用酶标仪在517nm处测定吸光度值并计算DPPH自由基清除率。
DPPH自由基清除率按公式1计算:
公式1:A0为去离子水和DPPH溶液吸光度值,A1为样品和DPPH溶液吸光度值,A2为样品和甲醇溶液吸光度值。
2)ABTS自由基清除活性测定方法
配置7mM的ABTS溶液和2.45mM的K2S2O8溶液,等体积混合后在黑暗中放置16h以生成ABTS储备液。将100μL ABTS储备液与100μL样品溶液混合,在37℃反应10min后,使用酶标仪在734nm测定吸光度值并计算ABTS自由基清除率。
ABTS自由基清除率按公式2计算:
公式2中:A0为去离子水和ABTS储备液吸光度值,A1为样品和ABTS储备液吸光度值,A2为样品和去离子水吸光度值。
实施例1:青稞抗氧化肽的制备及分离鉴定
蛋白提取:将青稞打碎成粉,用去离子水将青稞粉按照1:25(g/mL)的料液比制成悬液,用2mol/L的NaOH调节溶液pH至11,在30℃水浴搅拌1h后,将悬浮液以5000×g离心15min。取上清液,用2mol/L的HCl调节溶液pH至4.5,并将溶液以5000×g离心15 min。取沉淀,用去离子水洗至中性后,-80℃冷冻干燥48h,得到青稞蛋白提取物(以下简称青稞蛋白)。
酶解过滤:配置10mg/mL的青稞蛋白溶液,用2mol/L的HCl调节溶液pH至2,添加0.5mg/mL胃蛋白酶,在37℃下水解青稞蛋白2h。随后用1mol/L的NaOH调节溶液pH至7,添加0.5mg/mL胰蛋白酶,在37℃下继续水解4h。酶解结束后于95℃水浴锅中灭酶10min。冷却至室温后,将溶液以4000×g离心20min,取上清液并用3 kDa的超滤膜进行超滤,收集滤过液-20℃保存备用。
分离纯化:采用C18制备型液相色谱柱对滤过液进行洗脱。色谱条件:流动相A(去离子水+0.1%三氟乙酸),流动相B(甲醇+0.1%三氟乙酸)。洗脱条件:6-15%流动相B洗脱20min,15-25%流动相B洗脱20min,25-50%流动相B洗脱20min,50-90%流动相B洗脱5min,90%流动相B洗脱10min,90-6%流动相B洗脱10min。将洗脱出来的4个峰分别命名为F-1、F-2、F-3和F-4,检测并比较其DPPH、ABTS自由基清除活性。
各组分(洗脱峰)DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率的检测结果如图1和图2所示。
与未洗脱的原液(对照组)相比,F-2组分表现出提高的抗氧化活性。F-2组分的DPPH自由基清除率较原液提高了10.82%,ABTS自由基清除率较原液提高了11.47%。
进一步地,对F-2组分包含的肽及其氨基酸序列进行了分析检定。
序列分析:采用液相色谱质谱联用仪对活性最强的组分鉴定。液相条件:流动相A(去离子水+0.1%甲酸),流动相B(80%的乙腈+0.1%甲酸)。洗脱条件:3%流动相B洗脱80min,32%流动相B洗脱15min,100%流动相B洗脱25min。质谱条件:MS扫描范围355-1700(m/z),离子注入时间100ms;MS/MS扫描范围200-2000(m/z),离子注入时间75ms。
通过Peaks Studio软件解析多肽序列,按照软件所得可信度与峰面积筛选出5条多肽,其氨基酸序列分别为VAPGRPPPP(SEQ ID NO:1)、MMLPFR(SEQ ID NO:2)、FAFDLDK(SEQID NO:3)、FGQVMAK(SEQ ID NO:4)和QPVLPLTLFVK(SEQ ID NO:5)。
多肽的抗氧化活性与疏水性氨基酸密切相关,根据疏水性氨基酸的比例,选择多肽VAPGRPPPP(SEQ ID NO:1)以进一步考察其细胞毒性和对H2O2诱导PC12细胞氧化损伤的保护作用。该肽段的二级质谱图见图3。
在发明实施例中,多肽VAPGRPPPP(SEQ ID NO:1)通过人工合成,以进一步用于抗氧化活性及细胞毒性鉴定。
实施例2 抗氧化肽对PC12细胞毒性的影响
取对数生长期的PC12细胞进行细胞计数,按照1×104/孔接种到96孔板,37℃恒温培养箱(5% CO2)中培养至细胞贴壁。用完全培养基稀释实施例1的多肽VAPGRPPPP(SEQ IDNO:1),每孔加入100μL上述稀释液,使其在培养基中的终浓度分别为50、100、200、400、800、1000μg/mL(样品组)。孵育24小时,随后每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)并孵育4小时,570nm下测定吸光度值,计算各组细胞存活率。
以不加多肽溶液的完全培养基为空白对照,细胞存活率按公式3计算:
公式3中:A1为样品组吸光度值,A2为空白组吸光度值。
实验结果如图4所示。当多肽VAPGRPPPP(SEQ ID NO:1)的溶液浓度为50、100、200、400、800、1000μg/mL时,PC12细胞的存活率分别为102.93%、110.80%、107.42%、107.07%、109.75%、108.48%。
上述实验结果显示:1)PC12细胞在不同浓度的多肽溶液中均具有较高的存活率。2)本发明的多肽溶液一定程度上增加了PC12细胞的活力,表明该多肽具有潜在的神经保护作用。
实施例3 抗氧化肽对H2O2诱导PC12细胞氧化损伤的保护作用
取对数生长期的PC12细胞进行细胞计数,按照1×104/孔接种到96孔板,37℃恒温培养箱(5% CO2)中培养至细胞贴壁。空白组细胞一直使用完全培养基培养。对照组和样品组细胞先用200μM的H2O2溶液处理12小时以诱导氧化损伤,随后更换培养液。对照组细胞使用完全培养基培养24h,样品组细胞使用含实施例1的多肽VAPGRPPPP(SEQ ID NO:1)溶液的完全培养基培养24h,随后每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)并孵育4小时, 570nm下测定吸光度值,计算各组细胞存活率。
以不加多肽溶液的完全培养基为空白对照(空白组),细胞存活率按公式4计算:
公式4中:A3为样品组或对照组吸光度值,A4为空白组吸光度值。
实验结果如图5所示。1)与空白组相比,使用H2O2溶液处理的对照组细胞存活率仅为47.15%,表明氧化剂H2O2导致细胞结构破坏,细胞凋亡发生。2)与对照组相比,加入本发明多肽溶液的样品组细胞存活率显著增加(P<0.05),且在100~1000μg/mL范围内具有剂量依赖性。尤其当本发明多肽溶液浓度为1000μg/mL时,样品组的细胞存活率达到93.31%。
以上结果表明,本发明多肽具有较强的抗氧化活性,可以保护PC12细胞免受H2O2诱导的氧化损伤。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (17)
1.一种抗氧化肽,其特征在于,所述抗氧化肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的抗氧化肽,其特征在于,所述抗氧化肽来源于青稞。
3.一种核酸分子,其特征在于,所述核酸分子编码权利要求1或2所述抗氧化肽。
4.一种构建体,其特征在于,含有权利要求3所述核酸分子。
5.一种重组细胞,其特征在于,含有权利要求3所述核酸分子或权利要求4所述构建体。
6.一种制备权利要求1或2所述抗氧化肽的方法,其特征在于,包括:
对青稞进行处理,得到所述抗氧化肽。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将青稞蛋白用胃蛋白酶、胰蛋白酶进行酶解处理,得到青稞蛋白酶解物;
(2)将所述青稞蛋白酶解物进行纯化处理,得到所述抗氧化肽;
其中,所述青稞蛋白是青稞总蛋白提取物。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,步骤(1)包括:
将青稞蛋白和胃蛋白酶接触,进行第一酶解处理,得到初始酶解物;
将所述初始酶解物和胰蛋白酶接触,进行第二酶解处理,得到青稞蛋白酶解物。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,
所述第一酶解处理的温度为32-42℃,时间为1.5-2.5h,反应液的pH值为1.8-2.2;
所述第二酶解处理的温度为32-42℃,时间为3.5-4.5h,反应液的pH值为6.8-7.2;
所述胃蛋白酶或胰蛋白酶与所述青稞蛋白的质量比为1:(10-30)。
10.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述纯化处理包括:
将所述青稞蛋白酶解物进行离心处理,收集上清液;
将所述上清液进行超滤处理,收集滤液;
将所述滤液进行液相色谱纯化处理,收集流出液;
其中,所述超滤处理采用的滤膜的孔径为1~5kDa;
所述液相色谱纯化处理所采用的流动相包括流动相A和流动相B,所述流动相A选自含有0.05~0.15体积%的三氟乙酸水溶液,所述流动相B选自含有0.05~0.15体积%三氟乙酸的甲醇水溶液;
所述液相色谱纯化处理所采用的洗脱条件如下:6~15%流动相B洗脱20min,15~25%流动相B洗脱20min,25~50%流动相B洗脱20min,50~90%流动相B洗脱5min,90%流动相B洗脱10min,90~6%流动相B洗脱10min。
11.一种来源于青稞的抗氧化肽的筛选方法,其特征在于,包括如下步骤:
将青稞蛋白用胃蛋白酶和胰蛋白酶进行酶解处理,得到青稞蛋白酶解物;
将所述青稞蛋白酶解物进行纯化处理,得到具有抗氧化活性的纯化组分;
将所述纯化组分中的多肽进行序列分析,得到具有潜在抗氧化活性的多肽序列组;
人工合成或分离纯化所述具有潜在抗氧化活性的多肽序列组中的至少一个多肽;
将所述至少一个多肽进行抗氧化活性检测,筛选获得目标抗氧化肽。
12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述酶解处理和纯化处理是如权利要求7~10任一项所述方法中所限定的。
13.一种抗氧化制品,其特征在于,包括:权利要求1或2所述肽、权利要求3所述核酸分子、权利要求4所述构建体、权利要求5所述重组细胞或根据权利要求6~10任一项所述方法制得的肽。
14.一种提高样本抗氧化活性的方法,其特征在于,包括:将样本与权利要求1或2所述肽、权利要求3所述核酸分子、权利要求4所述构建体、权利要求5所述重组细胞、根据权利要求6~10任一项所述方法制得的肽或权利要求13所述的抗氧化制品接触。
15.权利要求1或2所述肽、权利要求3所述核酸分子、权利要求4所述构建体、权利要求5所述重组细胞、根据权利要求6~10任一项所述方法制得的肽或权利要求13所述抗氧化制品在制备产品中的应用,所述产品用于抗氧化。
16.根据权利要求15所述的应用,其特征在于,所述产品包括:药物、细胞培养物或化妆品。
17.根据权利要求15所述的应用,其特征在于,所述产品选自药物,所述药物用于预防或治疗神经损伤性疾病。
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