CN116585524A - 一种皮瓣粘合用制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种皮瓣粘合用制剂及其制备方法，属于皮瓣粘合剂技术领域。该制剂包括组分1和2，该方法为从S/D预处理后猪血浆中，通过醇沉方式，提取活性成分纤维蛋白原沉淀和滤液Ⅰ；用纤维蛋白原复溶液对沉淀物Ⅰ进行溶解后，再用纤维蛋白原稀释液进行稀释，灌装制得组分1纤维蛋白原溶液；将醇沉后的得到的滤液Ⅰ，加入钙离子以激活凝血酶原，将蔗糖和右旋糖酐40溶于水中，得到凝血酶原液稀释液，用稀释液稀释至目标浓度，灌装至西林瓶中制得组分2凝血酶溶液。该制剂经双联混药器喷涂，可以应用于皮瓣粘合，如烧伤皮肤移植，抽脂手术修复等。添加的脂肪细胞基质成分具有良好的促血管再生特点，显著提高皮瓣成活率。

Description

一种皮瓣粘合用制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于皮瓣粘合剂技术领域，具体涉及一种皮瓣粘合用制剂及其制备方法。

背景技术

基于纤维蛋白原的组织粘合剂可用于无缝和/或有缝支撑性结合人或动物的组织或器官部分，用以封闭所覆盖的组织，以达止血、粘合、封闭，促进伤口愈合等作用。主要由纤维蛋白原和凝血酶组成。纤维蛋白原经凝血酶激活形成纤维蛋白单体，进一步在Ca²⁺、凝血ⅩⅢ因子等凝血因子的参与下，因子XIII被活化为因子XIIIa，使得所形成的纤维蛋白发生交联以便形成可提高组织粘合剂有效性的高分子量聚合物，即稳定的纤维蛋白多聚体。目前市售纤维蛋白胶主要为人源、动物源。

美国专利5962405公开了呈冻干粉或由冷冻溶液形式储存的稳定性纤维蛋白原制剂，上述形式可快速且以简单方式复原并液化，以便形成即用型纤维蛋白原和/或组织粘合剂溶液。这种制剂由巴克斯特医疗保健公司(美国)于1998年得到批准上市的，商品名为纤维蛋白封闭剂。/>是一种纤维蛋白密封剂，用于在常规手术技术(如缝合、结扎和烧灼)控制出血无效或不切实际的情况下进行手术的成人和儿童患者(1个月以上)的止血辅助。对肝素化患者有效。其是一种纤维蛋白密封剂，作为标准手术技术(如缝合和结扎)的辅助手段，用于防止临时结肠造口术后结肠吻合口泄漏。

由巴克斯特医疗保健公司(美国)于2008年得到批准上市的，商品名为纤维蛋白密封剂，是TISSEEL衍生产品，其适用于在大于或等于1岁的成人和儿童人群中，将自体皮肤移植物粘附到手术准备的伤口床上。如烧伤皮肤移植、在面部除皱手术(面部除皱术)中粘附组织瓣等。ARTISS产品说明书介绍，喷洒产品后，立即将皮瓣或移植物连接到伤口床上。在接触产品之前，用生理盐水湿润手套，以防止粘附。在聚合之前，外科医生有60秒的时间来操作和定位皮瓣或移植物，给医生充裕时间进行手术操作。轻轻按压皮瓣或移植物至少3分钟，将其固定在所需位置，以确保ARTISS正确固定，并将皮肤移植物或移植物牢固地粘附在下层组织上。固化的纤维蛋白密封剂在施用后约2小时内达到其最终强度。

传统纤维蛋白原的组织粘合剂成胶时间小于10秒，成胶时间太短，不方便医生手术操作等皮瓣组织手术。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明要解决的一个技术问题在于提供一种皮瓣粘合用制剂。本发明要解决的另一个技术问题在于提供一种皮瓣粘合用制剂的制备方法。采用本发明方法制备得到的制剂相对于传统纤维蛋白原的组织粘合剂，具有成胶时间相对长(大于60秒)，方便医生操作等皮瓣组织手术。且具有良好的促血管再生特点，显著提高皮瓣成活率。，

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种皮瓣粘合用制剂，由组分1和组分2组成，组分1纤维蛋白原溶液，含有脂肪细胞基质、L-赖氨酸、枸橼酸钠和氯化钠；组分2凝血酶溶液，含有蔗糖和右旋糖酐40。

所述皮瓣粘合用制剂，组分1中纤维蛋白原含量为35～45mg/ml；组分2中凝血酶效价50～100IU/ml；优选，组分1中纤维蛋白原含量为40mg/ml；组分2中凝血酶效价80IU/ml。

上述皮瓣粘合用制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)猪血浆的S/D病毒灭活；

(2)低温乙醇沉淀：对步骤(1)处理后的猪血浆采用低温醇沉方法，收集沉淀物Ⅰ和滤液Ⅰ；

(3)组分1纤维蛋白原溶液：用纤维蛋白原复溶液对沉淀物Ⅰ进行溶解后，再用纤维蛋白原稀释液进行稀释，灌装制得；

(4)组分2凝血酶溶液：将醇沉后的得到的滤液Ⅰ，加入钙离子以激活凝血酶原，将蔗糖和右旋糖酐40溶于水中，得到凝血酶原液稀释液，用稀释液稀释至目标浓度，灌装至西林瓶中制得；

(5)组分1和组分2混合得到皮瓣粘合用制剂。

所述皮瓣粘合用制剂的制备方法，猪血浆的S/D病毒灭活，指有机溶剂/去污剂处理法，处理方式为：先用1μm滤器除去血浆中存在的颗粒，防止颗粒可能藏匿病毒，从而影响病毒灭活效果；然后采用终质量浓度0.3％TNBP和1％聚山梨酯80，在24℃处理7小时，进行病毒灭活。

所述皮瓣粘合用制剂的制备方法，低温乙醇沉淀指对过滤后血浆进行预冷处理，降至0～10℃，加入50％、-30℃的低温乙醇至乙醇的终含量为10％～15％。控制温度为-2～0℃，保温1～4小时，进行离心，转速12000转/分钟，收集沉淀物Ⅰ。

所述皮瓣粘合用制剂的制备方法，组分1纤维蛋白原溶液的制备，具体为将枸橼酸钠、氯化钠和L-赖氨酸溶于水中，得到纤维蛋白原复溶液；将得到的活性成分沉淀物Ⅰ，至复溶液中复溶，即得纤维蛋白原原液；将脂肪细胞基质、L-赖氨酸和枸橼酸钠溶于水中，得到纤维蛋白原原液稀释液，将得到的原液，用稀释液稀释至目标浓度，灌装至西林瓶中制得。

所述皮瓣粘合用制剂的制备方法，组分1纤维蛋白原溶液的制备：将枸橼酸钠、氯化钠和L-赖氨酸溶于水中，得到终质量浓度为0.3％～3％枸橼酸钠，0.2％～2％氯化钠，3％～5％ L-赖氨酸的纤维蛋白原复溶液；然后用沉淀物Ⅰ的10倍～15倍重量的纤维蛋白原复溶液对沉淀物Ⅰ在20℃～25℃搅拌溶解1小时，观察外观至无明显沉淀，即得纤维蛋白原原液；将脂肪细胞基质、L-赖氨酸和枸橼酸钠溶于水中，得到终质量浓度为1％～3％脂肪细胞基质，1％～2％L-赖氨酸，0.3％～0.5％枸橼酸钠的纤维蛋白原原液稀释液；用纤维蛋白原稀释液对纤维蛋白原原液进行稀释至纤维蛋白原含量为35～45mg/ml，灌装至西林瓶，即得。

所述皮瓣粘合用制剂的制备方法，钙离子激活，指向滤液Ⅰ中加入钙离子以激活凝血酶原，钙离子在溶液中的终浓度为0.03～0.1mol/L，钙离子以氯化钙或碳酸钙加入，优选浓度为0.06mol/L；激活pH为7.2～7.6，激活温度分别为20～30℃，激活时间为6～8小时，激活凝血酶原液效价至大于600IU/ml。

所述皮瓣粘合用制剂的制备方法，凝血酶原液稀释液，指配制终质量浓度为0.1％～0.3％蔗糖，0.1％～0.2％右旋糖酐40溶液，即得；用稀释液稀释至凝血酶效价50～100IU/ml，灌装至西林瓶中制得。

所述皮瓣粘合用制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)猪血浆的S/D病毒灭活：先用1μm滤器除去血浆中存在的颗粒，根据血浆的质量，按质量百分比，以终浓度0.3％的TNBP和1％的聚山梨酯80加入灭活试剂，在24℃保温7小时；

(2)低温乙醇沉淀：将处理后血浆进行预冷处理，冷却至4℃，加入50％，-30℃的低温乙醇至乙醇的终含量为12％，搅拌均匀，转速为400转/分钟；将温度控制在0℃，保温2小时后，以转速12000转/分钟进行离心，收集沉淀物Ⅰ；

(3)组分1纤维蛋白原溶液：配制纤维蛋白原复溶液，其中含1％枸橼酸钠，1.1％氯化钠，4％ L-赖氨酸；用沉淀物Ⅰ的13倍重量的纤维蛋白原复溶液对沉淀物Ⅰ进行溶解，溶解条件为20℃，搅拌1小时进行溶解即得纤维蛋白原原液；配制纤维蛋白原稀释液，其中含2％脂肪细胞基质，1％ L-赖氨酸和0.4％枸橼酸钠；用纤维蛋白原稀释液对纤维蛋白原原液进行稀释至纤维蛋白原含量为40mg/ml，灌装2.5ml至西林瓶，即得；

(4)组分2凝血酶溶液：向滤液Ⅰ中加入氯化钙以激活凝血酶原，钙离子在溶液中的终浓度为0.06mol/L，激活pH为7.4，激活温度分别为25℃，激活时间为8小时，激活凝血酶原液效价为1100IU/ml；配制凝血酶稀释液，其中含0.2％蔗糖和0.2％右旋糖酐40；用凝血酶稀释液稀释至凝血酶效价80IU/ml，灌装至西林瓶中，制得；

(5)将组分1纤维蛋白原溶液和组分2凝血酶溶液，分别注入双联混药器中，将三通接头固定在双联混药器的两个注射器锥头上，并将扣带扣紧，将喷嘴安装在三通接头的锥头上，检查无松动，推动联动推杆喷涂于患处。

有益效果：与现有的技术相比，本发明的优点包括：

本发明方法制备得到的制剂相对于传统纤维蛋白原的组织粘合剂，具有成胶时间相对长(大于60秒；传统纤维蛋白原的组织粘合剂成胶时间小于10秒)，方便医生操作等皮瓣组织手术；粘合力应不低于90g/cm²，符合开发需求。该制剂可以广泛应用于皮瓣粘合，如烧伤皮肤移植，抽脂手术修复等；且具有良好的促血管再生特点，显著提高皮瓣成活率。

附图说明

图1为小鼠背部皮瓣和皮床间的粘合情况图；

图2为小鼠背部皮瓣和皮床间粘合成功图；

图3为猪背部皮瓣与皮床的粘合情况图；

图4为猪背部皮瓣与皮床粘合成功图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

实施例1

皮瓣粘合用制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)猪血浆的S/D病毒灭活：先用1μm滤器除去血浆中可能存在的颗粒，防止颗粒可能藏匿病毒，从而影响病毒灭活效果。根据血浆的质量，按质量百分比，以终质量浓度0.3％的TNBP和1％的聚山梨酯80加入灭活试剂，在24℃保温7小时；

(2)低温乙醇沉淀：将处理后血浆进行预冷处理，冷却至4℃，加入50％，-30℃的低温乙醇至乙醇的终含量为12％，搅拌均匀，转速为400转/分钟。将温度控制在0℃，保温2小时后，以转速12000转/分钟进行离心，收集沉淀物Ⅰ；

(3)组分1纤维蛋白原溶液：配制纤维蛋白原复溶液，其中含1％枸橼酸钠，1.1％氯化钠，4％ L-赖氨酸(均以质量浓度计)；

用沉淀物Ⅰ的13倍重量的纤维蛋白原复溶液对沉淀物Ⅰ进行溶解，溶解条件为20℃，搅拌1小时进行溶解即得纤维蛋白原原液。并采用凯氏定氮方法对原液中纤维蛋白原含量进行测定；

配制纤维蛋白原稀释液，其中含2％脂肪细胞基质，1％ L-赖氨酸和0.4％枸橼酸钠(均以质量浓度计)；

用纤维蛋白原稀释液对纤维蛋白原原液进行稀释至纤维蛋白原含量为40mg/ml，灌装2.5ml至西林瓶，即得；

(4)组分2凝血酶溶液：向滤液Ⅰ中加入氯化钙以激活凝血酶原，钙离子在溶液中的终浓度为0.06mol/L，激活pH为7.4，激活温度分别为25℃，激活时间为8小时，激活凝血酶原液效价为1100IU/ml；

配制凝血酶稀释液，其中含0.2％蔗糖和0.2％右旋糖酐40(均以质量浓度计)；

用凝血酶稀释液稀释至凝血酶效价80IU/ml，灌装至西林瓶中，制得；

(5)组分1和组分2混合得到皮瓣粘合用制剂。

经研究皮瓣手术，需注意纤维蛋白原涂层厚度问题，需薄涂一层，以避免形成多余的肉芽组织，并确保纤维蛋白多逐渐被吸收。而过厚的凝块可能会延迟伤口的自然愈合过程，甚者造成皮瓣死亡，凋落。

脂肪细胞基质，研究表明，脱细胞基质富含大量生长趋化因子，具有良好的血管再生作用。脂肪细胞基质，指脂肪经洗涤，粉碎，灭菌后制得。

本发明可以应用于皮瓣粘合，如烧伤皮肤移植，抽脂手术修复等。具有成胶时间长(相对于传统粘合剂)，促进血管再生，提高皮瓣成活率等特点。

实施例2

皮瓣粘合用制剂评估试验及试验结果

1.成胶时间(体外)

将组分1纤维蛋白原溶液和组分2凝血酶溶液，分别注入双联混药器中，将三通接头固定在双联混药器的两个注射器锥头上，并将扣带扣紧，将喷嘴安装在三通接头的锥头上，检查无松动，推动联动推杆喷涂于表面皿表面。以液体不流动作为观察终点记录成胶时间。成胶时间大于60秒，符合开发需求。

2.粘合力(体外)

取4块2cm²新鲜猪皮，用小刀细心刮去脂肪。将组分1纤维蛋白原溶液和组分2凝血酶溶液，分别注入双联混药器中，将三通接头固定在双联混药器的两个注射器锥头上，并将扣带扣紧，将喷嘴安装在三通接头的锥头上，检查无松动，推动联动推杆喷涂于去脂猪皮上，将另一片2cm²去脂猪皮粘合其上，30分钟后小袋放砝码至两片猪皮不分离的最大砝码质量，即为粘合力。测得粘合力应不低于90g/cm²。符合开发需求。

3.体内试验(模拟临床应用)

图1显示在小鼠背部剪开面积大约为1cm²的U形皮瓣，再将样品喷涂在皮瓣皮下进行粘合，分别观察皮瓣与皮床的粘合情况，及使用拉力计检测等待时间后皮瓣和皮床间的粘合力大小。图2显示皮瓣成功粘合，粘合时间约70秒，皮瓣粘合力约130g/cm²。

图3显示在猪背部剪开面积大约为2cm²的长方形皮瓣，再将样品喷涂在皮瓣皮下进行粘合，分别观察皮瓣与皮床的粘合情况。图4显示皮瓣成功粘合并成活，粘合时间约85秒，皮瓣粘合力约200g/cm²。

4.血管再生效果

体内试验组动物皮瓣，观察期内，无明显肿块，且皮瓣成活，说明有良好的血管再生能力。

5.安全性评估结果

按照用法进行安全性试验，含单次给药毒性试验，重复给药毒性试验等，均未出现不良反应，显示该制剂安全性。

5.1腹腔注射对SD大鼠中枢神经系统的影响

本试验采用20只SD大鼠，雌雄各半，随机分成2个组，每组10只，各组分别单次腹腔注射给予0(赋形剂)、50mg/kg(分别为临床剂量的2倍)的皮瓣粘合用制剂。分别于给药前、给药后0.5h、4h，测量动物前肢握力和体温。

试验结果显示与赋形剂对照组相比，制剂剂量组给药后前肢握力和体温未见明显异常。因此，SD大鼠单次腹腔注射设定浓度的皮瓣粘合用制剂后，均未见明显中枢神经系统毒性反应。

5.2腹腔注射对SD大鼠呼吸系统的影响

本试验采用20只SD大鼠，雌雄各半，随机分成2个组，每组10只，各组分别单次腹腔注射给予0(赋形剂)、50mg/kg(分别为临床剂量的2倍)的皮瓣粘合用制剂。采用全身体积标记系统分别于给药前、给药后0.5h、4h记录并分析呼吸系统指标(呼吸频率，RR；潮气量，TV；每分通气量，MV)。

呼吸指标检测结果显示：与给药前相比，两组给药后各时间点均未见给药相关的TV、MV、RR异常。在本试验条件下，单SD大鼠单次腹腔注射设定浓度的皮瓣粘合用制剂后，对清醒非束缚SD大鼠呼吸系统无影响。

5.3急性毒性研究试验

本试验选取SD大鼠20只，随机分为2组，雌雄各半。分别单次经腹腔注射给予0.9％氯化钠注射液和皮瓣粘合用制剂(500mg/kg，为临床剂量的20倍)。给药后连续观察期28天。观察期间，死亡/濒死情况每天观察1次，临床征状给药当天给药前观察1次，给药后密切观察6小时，此后每天1次，体重于适应期、给药第7、14、21及28天分别称量1次。所有动物观察期结束后进行大体解剖。采集异常组织进行病理组织学检查。

结果显示：SD大鼠急性毒性试验中各组动物均未见死亡或濒死。所有动物观察期间临床观察未见异常。与阴性对照组相比，制剂组动物的平均体重及体重增长均未见明显差异。

5.4长期毒性研究试验

本试验选取SD大鼠20只，随机分为2组，雌雄各半。各组分别为阴性对照组(0.9％氯化钠注射液)和皮瓣粘合用制剂组(25mg/kg)，腹腔注射给药2周一次，共2次，并设4周恢复期。给药期末解剖10只/组，恢复期末解剖10只/组。毒性评价终点包括：临床症状观察指标死亡和濒死情况、临床观察、体重、摄食量。

结果显示：SD大鼠长期毒性研究试验中各组动物均未见死亡或濒死。所有动物观察期间临床观察未见异常。与阴性对照组相比，制剂组动物的摄食量均未见明显差异。

综上所述，该制剂可以广泛应用于皮瓣粘合，如烧伤皮肤移植，抽脂手术修复等。且试验证明，该制剂具有良好的促血管再生特点，可显著提高皮瓣成活率。

Claims (10)

1.一种皮瓣粘合用制剂，其特征在于，由组分1和组分2组成，组分1纤维蛋白原溶液，含有脂肪细胞基质、L-赖氨酸、枸橼酸钠和氯化钠；组分2凝血酶溶液，含有蔗糖和右旋糖酐40。

2.根据权利要求1所述皮瓣粘合用制剂，其特征在于，组分1中纤维蛋白原含量为35～45mg/ml；组分2中凝血酶效价50～100IU/ml。

3.权利要求1或2所述皮瓣粘合用制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)猪血浆的S/D病毒灭活；

(2)低温乙醇沉淀：对步骤(1)处理后的猪血浆采用低温醇沉方法，收集沉淀物Ⅰ和滤液Ⅰ；

(3)组分1纤维蛋白原溶液：是指用纤维蛋白原复溶液对沉淀物Ⅰ进行溶解后，再用纤维蛋白原稀释液进行稀释，灌装制得；

(4)组分2凝血酶溶液：将醇沉后的得到的滤液Ⅰ，加入钙离子以激活凝血酶原，将蔗糖和右旋糖酐40溶于水中，得到凝血酶原液稀释液，用稀释液稀释至目标浓度，灌装至西林瓶中制得；

(5)组分1和组分2混合得到皮瓣粘合用制剂。

4.根据权利要求3所述皮瓣粘合用制剂的制备方法，其特征在于，猪血浆的S/D病毒灭活，先用1μm滤器除去血浆中可能存在的颗粒；然后采用0.3％TNBP和1％聚山梨酯80，在24℃处理7小时，进行病毒灭活。

5.根据权利要求3所述皮瓣粘合用制剂的制备方法，其特征在于，低温乙醇沉淀指对过滤后血浆进行预冷处理，降至0～10℃，加入50％，-30℃的低温乙醇至乙醇的终含量为10％～15％；控制温度为-2～0℃，保温1～4h，进行离心，转速12000转/分钟，收集沉淀物Ⅰ。

6.根据权利要求3所述皮瓣粘合用制剂的制备方法，其特征在于，组分1纤维蛋白原溶液的制备，具体为将枸橼酸钠、氯化钠和L-赖氨酸溶于水中，得到纤维蛋白原复溶液；将得到的活性成分沉淀物Ⅰ，至复溶液中复溶，即得纤维蛋白原原液；将脂肪细胞基质、L-赖氨酸和枸橼酸钠溶于水中，得到纤维蛋白原原液稀释液，将得到的原液，用稀释液稀释至目标浓度，灌装至西林瓶中制得。

7.根据权利要求3所述皮瓣粘合用制剂的制备方法，其特征在于，组分1纤维蛋白原溶液的制备：将枸橼酸钠、氯化钠和L-赖氨酸溶于水中，得到终质量浓度为0.3％～3％枸橼酸钠，0.2％～2％氯化钠，3％～5％L-赖氨酸的纤维蛋白原复溶液；然后用沉淀物Ⅰ的10倍～15倍重量的纤维蛋白原复溶液对沉淀物Ⅰ在20℃～25℃搅拌溶解，1小时，观察外观至无明显沉淀，即得纤维蛋白原原液；将脂肪细胞基质、L-赖氨酸和枸橼酸钠溶于水中，得到终质量浓度为1％～3％脂肪细胞基质，1％～2％L-赖氨酸，0.3％～0.5％枸橼酸钠的纤维蛋白原原液稀释液；用纤维蛋白原稀释液对纤维蛋白原原液进行稀释至纤维蛋白原含量为35～45mg/ml，灌装至西林瓶，即得。

8.根据权利要求3所述皮瓣粘合用制剂的制备方法，其特征在于，钙离子激活，指向滤液Ⅰ中加入钙离子以激活凝血酶原，钙离子在溶液中的终浓度为0.03～0.1mol/L，钙离子以氯化钙或碳酸钙加入；激活pH为7.2～7.6，激活温度为20～30℃，激活时间为6～8小时，激活凝血酶原液效价至大于600IU/ml。

9.根据权利要求9所述皮瓣粘合用制剂的制备方法，其特征在于，凝血酶原液稀释液，指配制终浓度为0.1％～0.3％蔗糖，0.1％～0.2％右旋糖酐40溶液，即得；用稀释液稀释至凝血酶效价为50～100IU/ml，灌装至西林瓶中制得。

10.根据权利要求3所述皮瓣粘合用制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)猪血浆的S/D病毒灭活：先用1μm滤器除去血浆中存在的颗粒，根据血浆的质量，按质量百分比，以终浓度0.3％的TNBP和1％的聚山梨酯80加入灭活试剂，在24℃保温7小时；

(2)低温乙醇沉淀：将处理后血浆进行预冷处理，冷却至4℃，加入50％，-30℃的低温乙醇至乙醇的终含量为12％，搅拌均匀，转速为400转/分钟；将温度控制在0℃，保温2小时后，以转速12000转/分钟进行离心，收集沉淀物Ⅰ；

(3)组分1纤维蛋白原溶液：配制纤维蛋白原复溶液，其中含1％枸橼酸钠，1.1％氯化钠，4％L-赖氨酸；用沉淀物Ⅰ的13倍重量的纤维蛋白原复溶液对沉淀物Ⅰ进行溶解，溶解条件为20℃，搅拌1小时进行溶解即得纤维蛋白原原液；配制纤维蛋白原稀释液，其中含2％脂肪细胞基质，1％L-赖氨酸和0.4％枸橼酸钠；用纤维蛋白原稀释液对纤维蛋白原原液进行稀释至纤维蛋白原含量为40mg/ml，灌装2.5ml至西林瓶，即得；

(4)组分2凝血酶溶液：向滤液Ⅰ中加入氯化钙以激活凝血酶原，钙离子在溶液中的终浓度为0.06mol/L，激活pH为7.4，激活温度分别为25℃，激活时间为8小时，激活凝血酶原液效价为1100IU/ml；配制凝血酶稀释液，其中含0.2％蔗糖和0.2％右旋糖酐40；用凝血酶稀释液稀释至凝血酶效价80IU/ml，灌装至西林瓶中，制得；

(5)将组分1纤维蛋白原溶液和组分2凝血酶溶液，分别注入双联混药器中，将三通接头固定在双联混药器的两个注射器锥头上，并将扣带扣紧，将喷嘴安装在三通接头的锥头上，检查无松动，推动联动推杆喷涂于患处。