CN116585488B - 一种罗哌卡因纳米载药材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种罗哌卡因纳米载药材料及其制备方法，按以下步骤进行制备：S1：称取聚乳酸‑羟基乙酸共聚物和罗哌卡因溶解于二氯甲烷中，得到混合溶液；S2：将混合溶液缓慢加入到聚乙烯醇溶液中，将所得乳液在室温下搅拌至二氯甲烷完全挥发；S3：将步骤S2得到的乳液7500rpm离心15分钟，无菌无酶水洗涤两到三次，样品冷冻干燥后得到罗哌卡因纳米载药材料，为固体粉末状。该制备方法工艺简单，且制得的罗哌卡因纳米载药材料粒径小、稳定性强、分散度好，其与药物结合效果好，在细胞实验中抑制细胞效果眀显。
Description
技术领域
本发明涉及纳米复合材料技术领域，特别涉及一种罗哌卡因纳米载药材料及其制备方法。
背景技术
罗哌卡因化学名称：S-(-)-1-丙基-N-(2，6-二甲苯基)-2-哌啶甲酰胺，是瑞典Astra公司研发并于1996年上市。罗哌卡因是第一个纯左旋长效酰胺类局麻药，有麻醉和镇痛双重效应，大剂量可产生外科麻醉，小剂量时可产生感觉阻滞(镇痛)仅伴有局限的非进行性运动阻滞。
罗哌卡因主要应用于全身麻醉和局部麻醉。但临床上所用的罗哌卡因原药注射剂型半衰期段，一般一次给药后仅能维持4～6h疗效，难以满足长期镇痛需要。为此，申请号为CN201410427391.5的专利提供了一种罗哌卡因纳米粒及其制备方法以及效果的优化实验方法，该罗哌卡因纳米粒的制备方法制得的罗哌卡因纳米粒96h内的释放率为73％左右，缓释效果较好，一次给药就能满足术后疼痛等急性疼痛的镇痛要求。然而，该制备方法仍然存在一些缺陷：一方面是其制备的步骤较为繁琐，涉及的工艺复杂，制备耗时和耗能均较高；另一方面是其制得的罗哌卡因纳米粒尺寸仍然较大，粒径达到210～370nm，在载药效果上仍然不够理想，在药物释放、生物利用度和疗效方面仍然存在改进的空间。因此，有必要研究一种可以制得粒径更小的罗哌卡因纳米颗粒。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供一种罗哌卡因纳米载药材料的制备方法，该制备方法工艺简单，且制得的罗哌卡因纳米载药材料粒径小、稳定性强、分散度好，其与药物结合效果好，在细胞实验中抑制细胞效果眀显。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种罗哌卡因纳米载药材料的制备方法，包括以下步骤：
S1：称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物和罗哌卡因溶解于二氯甲烷中，得到混合溶液；
S2：将混合溶液缓慢加入到聚乙烯醇溶液中，将所得乳液在室温下搅拌至二氯甲烷完全挥发；
S3：将步骤S2得到的乳液7500rpm离心15分钟，无菌无酶水洗涤两到三次，样品冷冻干燥后得到罗哌卡因纳米载药材料PLGA-PVA-RPV，其为固体粉末状。
相比于现有技术，本发明的制备方法步骤简单，操作方便，采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)作为载体，聚乙烯醇(PVA)作为修饰物，将二者与药物罗哌卡因(RPV)经过化学反应进行结合，形成罗哌卡因纳米载药材料PLGA-PVA-RPV，其颗粒粒径远小于现有技术，且稳定性强、分散度好，载体与药物结合效果良好，同时在细胞实验中抑制细胞效果眀显。
进一步地，步骤S1中，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物和罗哌卡因的质量比为3:7。
进一步地，步骤S2中，聚乙烯醇溶液的质量百分比浓度为5％，溶剂为水。
进一步地，步骤S2中，所得乳液中聚乳酸-羟基乙酸共聚物、罗哌卡因和聚乙烯醇的质量比为3:7:250。
进一步地，所述二氯甲烷和所述聚乙烯醇溶液的体积比为1:100。
进一步地，步骤S3中，冷冻干燥温度为-80℃。
本发明还提供如上所述制备方法制备得到的罗哌卡因纳米载药材料。
进一步地，所述罗哌卡因纳米载药材料的结构为聚乙烯醇修饰在聚乳酸-羟基乙酸共聚物外部，罗哌卡因均匀附着在所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物外表面上。
进一步地，所述罗哌卡因纳米载药材料的粒径小于15nm。
进一步地，所述罗哌卡因纳米载药材料的粒径大小为7～15nm。
进一步地，所述罗哌卡因纳米载药材料的载药率为8.13％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明制得的罗哌卡因纳米载药材料的颗粒尺寸远远小于现有罗哌卡因纳米粒，粒径小于10nm，且颗粒分散度好，稳定性强，载药效果出色，有利于在微量给药上的应用，在细胞实验中抑制细胞效果眀显。
(2)本发明的制备方法步骤简便，涉及工艺较为简单，操作难度低，有利于大规模批量生产。
附图说明
图1为本发明的罗哌卡因纳米载药材料合成原理示意图；
图2为实施例1制得的PLGA-PVA-RPV的TEM图；
图3为实施例1制得的PLGA-PVA-RPV的SEM图；
图4为测试例2的细胞毒性实验测试数据柱状图；
图5为测试例3得到的荧光图；
图6为测试例4得到的迁移实验显微镜图像；
图7为测试例4得到的迁移实验数据柱状图。
现结合附图与具体实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
以下实施例所用到的原料及试剂的纯度及厂商如表1所示：
表1原料及试剂的纯度及厂商
| 原料/试剂 | 纯度 | 厂商 |
| PLGA | >＝99％ | MACKLIN |
| 罗哌卡因 | >＝98％ | MACKLIN |
| PVA | / | MACKLIN |
| 二氯甲烷 | >＝99.5％ | 天津市大茂化学试剂厂 |
| 无酶无菌水 | / | Solarbio |
下面通过具体实施例以及附图对本发明作进一步阐释，但是本发明的技术方案不以具体实施例为限。
实施例1罗哌卡因纳米载药材料的制备
称量30mg PLGA和70mg罗哌卡因于20mL烧杯中，加入500μL二氯甲烷使其完全溶解。然后将溶液缓慢加入到50ml 5％(w/v)的PVA水溶液中，所得乳液在室温下以400转/分的转数搅拌至二氯甲烷完全挥发(24h)，然后以7500rpm离心15分钟，再用无菌无酶水洗涤两到三次，最后将得到的样品在-80℃条件下冷冻干燥，得到固体粉末，即纳米材料PLGA-PVA-RPV。
请参阅图1，本发明采用PLGA作为载体，PVA作为修饰物，将二者与药物罗哌卡因(RPV)经过化学反应进行结合，合成罗哌卡因纳米载药材料PLGA-PVA-RPV，形成的结构为PVA修饰在载体PLGA外部，罗哌卡因均匀附着在载体PLGA外表面上。罗哌卡因由于静电键作用附着在载体PLGA上，且罗哌卡因表面带正离子，可以与细胞表面的负离子相互吸附，由于扩散和生物侵蚀/降解机制逐渐从载体上释放出来。另外，由于PLGA-PVA-RPV表面修饰亲水物质，其可以在血液中达到隐形效果，不会被免疫细胞识别清除到体外。
测试例1罗哌卡因纳米载药材料的表征
请参阅图2，其为实施例1制得的PLGA-PVA-RPV的TEM图。从图中可以看出，制得的PLGA-PVA-RPV颗粒均匀，分散度好，且粒径小，均小于20nm。图3为实施例1制得的PLGA-PVA-RPV的SEM图，从图中可以看出，制得的PLGA-PVA-RPV分散性好。
为了得到更准确的粒径分布和电位数据，利用纳米粒度电位仪(Nano-ZS)检测罗哌卡因纳米载药材料的粒径及电位。
表2PLGA-PVA-RPV粒径分布表
| 颗粒编号 | 粒径/nm |
| 1 | 10.27 |
| 2 | 8.44 |
| 3 | 13.08 |
| 4 | 9.7 |
| 5 | 10.76 |
| 6 | 13.14 |
| 7 | 13.08 |
| 8 | 10.68 |
| 9 | 11.14 |
| 10 | 7.38 |
| 11 | 14.35 |
| 12 | 12.27 |
| 13 | 10.55 |
| 14 | 10.55 |
| 15 | 8.45 |
| 16 | 8.86 |
| 17 | 10.55 |
| 18 | 14.77 |
| 19 | 11.82 |
| 20 | 12.67 |
| 21 | 11.81 |
| 22 | 9.88 |
| 平均值 | 11.1 |
如表2所示，PLGA-PVA-RPV的粒径分布在7～15nm区间内，平均粒径为11.11nm，远远小于现有技术的罗哌卡因纳米粒粒径(210～370nm)。
对PLGA-PVA-RPV材料的电位测试结果表明，其颗粒zeta电位均小于±50mV，zeta电位平均值是-8.56mV，属于电中性粒子，稳定性好，可以保持较长血液循环。
测试例2罗哌卡因纳米载药材料对HaCaT细胞的毒性测定
采用CCK-8检测增殖法，使用细胞计数试剂盒(CCK-8；型号公司)测定PLGA-PVA-RPV，先取100微升细胞悬液(5X104细胞/毫升)接种于96孔板，与不同浓度的PLGA-PVA-RPV在5％ CO2、37℃条件下分别培养24h、48h，然后每孔加入CCK-8试剂(10微升)，得到的混合物在37℃条件下培养1h、0.8h。记录混合物在450nm处的吸光度并计数细胞活力。
结果如图4所示，按照CCK8数据作散点图，根据回归线方程可以得出：当PLGA-PVA-RPV浓度达到834μg/mL时，HaCaT细胞的存活率为90％；当PLGA-PVA-RPV浓度达到1834μg/mL时，HaCaT细胞的存活率为80％。
从CCK8数据可以看出，随着PLGA-PVA-RPV浓度的提升，其对细胞的抑制作用也逐渐提高，说明其有剂量依赖性细胞毒性。在1000μg/ml的高浓度下，PLGA-PVA-RPV组及RPV组对HaCaT细胞的抑制作用相对更明显。说明，PLGA-PVA-RPV作用下，细胞总体活力处于80％以上，可见其对HaCaT细胞的毒性作用小，安全性较高。
测试例3罗哌卡因纳米载药材料对HaCaT细胞的荧光测试
采用以下步骤进行荧光测试：
第一天，铺板35万/孔(6孔板)HaCaT；
第二天，加药：PLGA-PVA-RPV(浓度分别为1834μg/mL及834μg/mL)，RPV(浓度149μg/mL)，24h；
第三天，制备染色液：在10ml的PBS中加入5μL的PI Solution和5μL的Calcein-AMSolution(Meilun)，涡旋振荡混匀，此时Calcein-AM的浓度为2μM，PI的浓度为8μM。吸去培养基，pbs温和洗涤2-3次，加入染色液覆盖细胞，37℃培养细胞15-30min，pbs洗2次，置于荧光显微镜(奥林巴斯，基因生物技术国际贸易公司)下观察，激发波长495nm可观察到活细胞，激发波长545nm可观察到死细胞。
如图5所示，其中，图(a1-a3)为无加药空白组；图(b1-b3)为浓度为1834μg/ml的PLGA-PVA-RPV材料组；图(c1-c3)为浓度为834μg/ml的PLGA-PVA-RPV材料组；图(d1-d3)为浓度为149μg/ml(按载药率计算)的RPV纯药组。经过荧光测试可以进一步验证了PLGA-PVA-RPV在高浓度下对细胞有抑制作用，但与纯药组(RPV)相比，其毒性相对较小，安全性较高。
测试例4罗哌卡因纳米载药材料对HaCaT细胞的迁移实验
进一步采用以下方法进行迁移实验：具体步骤为：
第一天铺板6孔板30万/孔HaCaT；
第二天：用白色枪头划痕，PBS缓冲液清洗2-3次，加入1％血清，然后加入PLGA-PVA-RPV(材料组)，浓度为1834μg/mL；在长满的单层细胞(HaCaT)中人为制造空白区域，细胞会自动向空白区域迁移。在划痕之后不同时间点(0，6，24，48h)检测划痕宽度，比较细胞迁移效率。分别在不同时间点(0，6，24，48h)采用显微镜进行拍照，测得空白区域面积，并计算迁移率。同时设置空白组(第二天未加入PLGA-PVA-RPV或罗哌卡因)和纯药组(即第二天加入罗哌卡因纯药)采用相同方法进行迁移实验，后将三组数据进行对比。结果如表3和图6～7所示。
表3细胞迁移实验数据表
从表3和图6～7可以看出，PLGA-PVA-RPV组抑制细胞迁移效率较明显。
测试例5罗哌卡因纳米载药材料载药率测试
采用高效液相法对实施例1制得的PLGA-PVA-RPV进行载药率测试，实验条件为：
仪器：岛津LC-20AD
色谱柱：Ultimate Plus-C18 4.6*150mm 5um
磷酸缓冲液：1mol/L磷酸二氢钠溶液1.3ml与0.5mol/L磷酸氢二钠32.5ml，用水稀释至1000ml，调PH＝8.00
流动相：乙腈-缓冲液＝60-40
流速：1.0ml/min
柱温：30
检测波长：240nm
进样量：10ul
样品配置：
对照溶液：精密称取罗哌卡因对照品适量，加乙醇溶解稀释至0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml，
样品溶液：精密称取PLGA-PVA-RPV样品3.00mg，加1.0ml乙醇，超声15min，摇匀，过膜，即得。
经过测试，其载药率为8.13％，达到较高水平，结合其极小的粒径，可以达到优秀的载药量。
表4PLGA-PVA-RPV载药率数据表
相比于现有技术，本发明采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)作为载体，聚乙烯醇(PVA)作为修饰物，将二者与药物罗哌卡因(RPV)经过化学反应进行结合，形成罗哌卡因纳米载药材料PLGA-PVA-RPV，其颗粒粒径可达到小于10nm的水平，远远低于现有技术的其他罗哌卡因纳米颗粒粒径，且其稳定性强、分散度好，载体与药物结合效果良好，同时在细胞实验中抑制细胞效果眀显。同时由于其颗粒粒径大幅缩小，有利于单位体积的纳米材料载药量的提高，从而有利于在微量给药应用上的拓展。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。
Claims (5)
1.一种罗哌卡因纳米载药材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物和罗哌卡因溶解于二氯甲烷中，得到混合溶液；
S2：将混合溶液缓慢加入到聚乙烯醇溶液中，将所得乳液在室温下搅拌至二氯甲烷完全挥发；
S3：将步骤S2得到的乳液7500 rpm离心15分钟，无菌无酶水洗涤两到三次，样品冷冻干燥后得到罗哌卡因纳米载药材料，为固体粉末状；
步骤S1中，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物和罗哌卡因的质量比为3:7；
步骤S2中，聚乙烯醇溶液的质量百分比浓度为5%，溶剂为水；
步骤S2中，所得乳液中聚乳酸-羟基乙酸共聚物、罗哌卡因和聚乙烯醇的质量比为3:7:250；
所述二氯甲烷和所述聚乙烯醇溶液的体积比为1:100；
步骤S3中，冷冻干燥温度为-80℃。
2.一种根据权利要求1所述的制备方法制得的罗哌卡因纳米载药材料。
3.根据权利要求2所述罗哌卡因纳米载药材料，其特征在于：其结构为聚乙烯醇修饰在聚乳酸-羟基乙酸共聚物外部，罗哌卡因均匀附着在所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物外表面上。
4.根据权利要求2所述罗哌卡因纳米载药材料，其特征在于：所述罗哌卡因纳米载药材料的粒径小于15nm。
5.根据权利要求2所述罗哌卡因纳米载药材料，其特征在于：所述罗哌卡因纳米载药材料的载药率为8.13%。
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