CN116583608A - 用于中和靶标的信号增强型检测的方法、组合物、试剂盒和系统 - Google Patents

用于中和靶标的信号增强型检测的方法、组合物、试剂盒和系统 Download PDF

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Abstract

本文提供了用于检测中和靶标(如中和抗体)的方法、组合物、试剂盒和系统。

Description

用于中和靶标的信号增强型检测的方法、组合物、试剂盒和 系统
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2020年10月6日提交的美国临时申请No.63/087,960和2021年4月9日提交的美国临时申请No.63/173,039以及2021年10月5日提交的美国临时申请No.63/252,545的权益，通过引用的方式将它们各自的内容以其整体并入本文。
技术领域
本公开涉及用于检测靶标(如中和抗体)的方法、组合物、试剂盒和系统。
背景技术
中和抗体代表了抗体治疗剂的一个重要类别，旨在通过形成抗原-抗体复合物来改变靶标组分的生物活性。在免疫原性测试中，中和抗体或抗药物抗体(ADA)的存在往往会引起相应药物的异常PK行为或功效损失。另一方面，能够中和有害物质(即病毒和细胞因子)的抗体可具有巨大的治疗潜力。中和抗体也是疫苗评价方面对病毒的抗性和免疫力的重要指标。中和抗体对许多病毒(如登革热、黄热病和日本脑炎)的保护水平已被建立。目前现有的方法(包括基于功能细胞的测定和竞争性配体结合测定)在敏感性上都具有有限的性能。因此，本领域仍然需要用于检测靶标(如中和抗体)的方法和组合物。
发明内容
本文提供了用于检测靶标(例如来自样品(如生物样品)的中和抗体)的方法、组合物和试剂盒。在一个方面，本文提供了敏感地检测(针对病毒、细胞因子、白细胞介素或其它蛋白质)中和抗体的通用方法。该方法包括用专门设计的核酸探针标记重组蛋白和抗体，所述核酸探针仅响应于中和抗体并生成可扩增的核酸分子。原则上，本文所述的方法、组合物和试剂盒消除或抑制来自结合抗体的信号，并且可通过qPCR或高通量测序来定量中和抗体浓度。
图1中示意性地示出了对核酸延伸进行编程以区分中和结合事件与非中和结合事件的原理。一对结合分子(例如受体-配体对)与专门设计的核酸分子缀合。当该对中的一个成员与靶标结合时(例如，一个成员通过结合至靶标(例如抗体或其它生物分子)而被中和)，通常阻止缀合至结合对的核酸分子彼此结合。与结合到靶标的结合对成员(A)缀合的核酸分子可在末端以同一核酸分子的部分序列(a*)延伸两次或多次，从而生成核酸记录体(record)(例如“靶标”序列c*)。相反，在没有靶标的情况下，结合对成员A没有被“中和”，并且仍然可结合至结合对成员B。在这种情况下，由于缀合在B上的核酸序列的“干扰”，只有中间序列(b*)可延伸至a*。因此，只有当结合对相互作用(例如，受体-配体相互作用)因靶标(例如，中和抗体)的存在而被破坏时，才会生成独特序列，并且在一些实施方式中，在不同的实验步骤中，可通过qPCR或下一代测序对生成的序列进行扩增和定量。不能破坏结合对相互作用(例如，破坏受体-配体相互作用)的靶标(例如，结合抗体)不会生成此类独特的核酸序列。
图16中示意性地示出了对核酸延伸进行编程以区分中和结合事件与非中和结合事件的另一原理。一对结合分子(例如受体-配体对)与专门设计的核酸分子缀合。当该对中的一个成员与靶标结合(例如，一个成员通过结合至靶标(例如抗体或其它生物分子)而被中和)时，通常阻止缀合至结合对的核酸分子彼此结合。在靶标存在的情况下，结合对成员A被“中和”，而不能结合至结合对成员B。在这种情况下，由于缀合在B上的核酸序列的“干扰”，a*通常被阻止延伸，或者只有中间序列(b*)通常可延伸至a*。相反，在不存在靶标的情况下，缀合至结合对成员(A)的核酸分子可在末端以同一核酸分子的部分序列(a*)延伸两次或多次，从而生成核酸记录体(例如“靶标”序列c*)。因此，只有当结合对相互作用(例如，受体-配体相互作用)未因靶标(例如，中和抗体)的存在而被破坏时，才会生成独特的序列，并且在一些实施方式中，在不同的实验步骤中，可通过qPCR或下一代测序对生成的序列进行扩增和定量。不能破坏结合对相互作用(例如，破坏受体-配体相互作用)的靶标(例如，结合抗体)生成此类独特的核酸序列。
在一些实施方式中，本公开的方法使用结合和非结合部分之间的相互作用时间的差异，以仅在成对报告探针识别相同的靶标时生成核酸记录分子(图4和图11)。
在一些其它实施方式中，本公开的方法使用结合部分和非结合部分之间的相互作用时间的差异，以仅在不存在靶标的情况下生成核酸记录分子(图17)。
在一些实施方式中，本文公开的方法仅在第一和第二报告探针在靶标存在的情况下彼此紧密邻近时，才利用链置换机制来生成核酸记录分子。例如，参见图4、图11和图16。“链置换”是指如下的机制，通过该机制，具有相同序列的两条核酸链在邻近单个互补核酸链(或链的片段)时，经历针对该互补链的相对快速(例如时间尺度<1s)的竞争，可能通过“随机行走”机制从补体“置换”彼此(参见，例如Yurke等，Nature 406：605-608，2000；以及Zhang等，Nature Chemistry 3：103-113，2011，以引用的方式将它们各自的内容并入本文)。
仅在靶标存在的情况下生成核酸记录分子可消除来自报告探针的信号，并可通过qPCR或高通量测序来对靶标浓度定量。通常，该方法包括使样品与一对报告探针接触，所述报告探针缀合有专门设计的核酸。来自两个报告探针的核酸在靶标存在的情况下相互作用，生成可被检测(例如扩增)的核酸记录体。参见图4和图11。
在一些其它实施方式中，该方法包括使样品与一对报告探针及封闭探针接触，所述报告探针及封闭探针缀合有专门设计的核酸。来自报告探针和封闭探针的核酸在靶标不存在的情况下相互作用，生成可被检测(例如扩增)的核酸记录体。参见图16和图17。
所述方法、组合物和试剂盒至少包括第一报告探针和封闭探针，以及可选的第二报告探针。
在任一方面的一些实施方式中，第一报告探针包含能够与靶标结合的第一靶标结合配体。该第一靶标结合配体连接至专门设计的双链核酸，该双链核酸在两端包含单链toehold和/或配对结构域。例如，双链核酸的每条链在其至少一个末端上包含至少一个单链toehold和/或配对结构域。此外，每条链都包含能够阻止通过聚合酶合成互补链的分子或修饰。
在任一方面的一些实施方式中，第二报告探针包含能够与靶标结合的靶标结合配体。第二报告探针包含第二核酸，所述第二核酸连接至第二靶标结合配体，并且包含与第一报告探针的第一核酸的单链toehold/配对结构域中的一个实质上互补的区域或结构域。在任一方面的一些实施方式中，第二报告探针的第二核酸进一步包含引物结合结构域。
在任一方面的一些实施方式中，第二报告探针包含双链核酸，所述双链核酸在两端包含单链toehold和/或配对结构域，其中，toehold和/或配对结构域中的一个与第一报告探针的双链核酸的单链toehold/配对结构域中的一个实质上互补，并且toehold和/或配对结构域中的另一个与第一报告探针的双链核酸的单链toehold/配对结构域中的另一个实质上相同。在一些进一步的实施方式中，所述双链核酸的链中的一条包含引物结合结构域。
在任一方面的一些实施方式中，封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与第一报告探针的第一靶标结合配体和/或第二报告探针的第二靶标结合配体结合或形成复合物。换而言之，封闭探针能够通过第一和/或第二靶标结合配体与封闭配体之间的相互作用与第一报告探针和/或第二报告探针形成复合物。靶标对第一报告探针的结合抑制第一报告探针与封闭探针之间复合物的形成。类似地，靶标对第二报告探针的结合抑制第二报告探针与封闭探针之间复合物的形成。
与报告探针一样，封闭探针包含特别设计的封闭探针核酸，所述封闭探针核酸连接至封闭配体，并包含与第一报告探针的第一核酸的单链toehold/配对结构域中的一个实质上互补的区域或结构域。在一些实施方式中，封闭探针的封闭探针核酸可进一步包含第二toehold或配对结构域。第二toehold或配对结构域可包含与第一报告探针的第一核酸的另一个单链toehold/配对结构域实质上相同的核苷酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，第一报告探针的第一靶标结合配体和第二报告探针的第二靶标结合配体是相同的，即相同的分子/部分，但连接至不同的核酸。
第一报告探针的第一靶标结合配体和第二报告探针的靶标结合配体可结合至同一靶标。例如，靶标包含针对第一报告探针的第一靶标结合配体和第二报告探针的第二靶标结合配体的结合位点。换而言之，第一报告探针和第二报告探针可同时结合至相同的靶标。
在任一方面的一些实施方式中，第一报告探针的第一靶标结合配体和第二报告探针的第二靶标结合配体是不同的。
在任一方面的一些实施方式中，第二报告探针的第二靶标结合配体为抗体。例如，第二报告探针的第二靶标结合配体为类别特异性抗体(class specific antibody)。
在任一方面的一些实施方式中，第一报告探针的第一核酸的单链toehold/配对结构域中的一个与封闭探针的封闭探针核酸的单链toehold/配对结构域互补，并且第一报告探针的第一核酸的单链toehold/配对结构域中第二个与第二报告探针的第二核酸链的单链toehold/配对结构域互补。
设计1
在任一方面的一些实施方式中，第一报告探针的双链核酸包含：(1)连接至第一靶标结合配体的第一核酸第一链，以及(2)与第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与第一链形成双链区(双链体区)。第一链包含：连接至第一亚结构域的引物结合结构域(c*)，所述第一亚结构域连接至终止分子(stopper molecule)(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)。第二核酸链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至第一toehold结构域(b)，所述第一toehold结构域(b)连接至第二toehold结构域(x)。第一链的引物结合结构域(c*)和第二链的引物结构域(c)实质上彼此互补。第一链的第一亚结构域和第二链的第二亚结构域实质上彼此互补。第一链的第二亚结构域(b)和第二链的第一亚结构域(b*)实质上彼此互补。此外，第二链的第一亚结构域(b*)和第一toehold结构域(b)实质上彼此互补。第一链的引物结合结构域(c*)、第一亚结构域和第二亚结构域(b)与第二链的引物结构域(c)、第二亚结构域和第一亚结构域(b*)杂交，形成包含终止分子(·)的双链(双链体)区。
在任一方面的一些实施方式中，封闭探针的封闭探针核酸包含连接至第二toehold结构域(x*)的第一toehold结构域(a)。该toehold结构域(x*)与第一报告探针的双链核酸的第二toehold结构域(x)实质上互补。第一toehold结构域(a)与第一报告探针的双链核酸的toehold结构域(a)实质上相同。
在任一方面的一些实施方式中，第二报告探针的第二核酸包含连接至toehold结构域(a*)的引物结合结构域(d*)。该toehold结构域(a*)与第一报告探针的双链核酸链的toehold结构域(a)和/或与封闭探针的封闭探针核酸的第一toehold结构域(a)实质上互补。
设计2
在任一方面的一些实施方式中，第一报告探针的双链核酸包含：(1)连接至第一靶标结合配体的第一核酸第一链，以及(2)与第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与第一链形成双链区(双链体区)。第一链包含：连接至第一亚结构域的引物结合结构域(c*)，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)。第二核酸链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至第一toehold结构域(b)，所述第一toehold结构域(b)连接至第二toehold结构域(x)。第一链的引物结合结构域(c*)和第二链的引物结构域(c)实质上彼此互补。第一链的第一亚结构域和第二链的第二亚结构域实质上彼此互补。第一链的第二亚结构域(b)和第二链的第一亚结构域(b*)实质上彼此互补。此外，第二链的第一亚结构域(b*)和第一toehold结构域(b)实质上彼此互补。第一链的引物结合结构域(c*)、第一亚结构域和第二亚结构域(b)与第二链的引物结构域(c)、第二亚结构域和第一亚结构域(b*)杂交，形成包含终止分子(·)的双链(双链体)区。
在任一方面的一些实施方式中，封闭探针的封闭探针核酸包含toehold结构域(x*)。该toehold结构域(x*)与第一报告探针的双链核酸的第二toehold结构域(x)实质上互补。封闭探针的封闭探针核酸不包含与第一报告探针的第一核酸的toehold结构域(a)实质上相同的结构域或区域。
在任一方面的一些实施方式中，第二报告探针包含：(1)连接至靶标结合配体的第二核酸第一链，以及(b)与第一链实质上互补的第二核酸第二链，所述第二核酸第二链与第一链形成双链区(双链体区)。所述第一链包含toehold结构域(x)。该toehold结构域(x)与第一报告探针的双链核酸的第二toehold结构域(x)实质上相同。值得注意的是，toehold结构域(x)与封闭探针的toehold结构域(x*)实质上互补。第二报告探针进一步包含(2)第二链，所述第二链包含连接至toehold结构域(a*)的引物结合结构域(d*)。该toehold结构域(a*)与第一报告探针的双链核酸的toehold结构域(a)实质上互补。
设计3
在任一方面的一些实施方式中，第一报告探针包含在一端与连接链杂交的双链核酸，所述连接链连接至第一靶标结合配体。连接至第一靶标结合配体的连接链包含用于与双链核酸杂交的第一核酸第一杂交结构域以及连接至第一核酸第一杂交结构域的toehold结构域(x)。双链核酸包含：(1)第一核酸第一链和(2)与第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与第一链形成双链区(双链体区)。第一链包含：连接至第一亚结构域的引物结合结构域(c*)，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)。第二链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至toehold结构域(b)。第一链的引物结合结构域(c*)和第二链的引物结构域(c)实质上彼此互补。第一链的第一亚结构域和第二链的第二亚结构域实质上彼此互补。第一链的第二亚结构域(b)和第二链的第一亚结构域(b*)实质上彼此互补。此外，第二链的第一亚结构域(b*)和toehold结构域(b)实质上彼此互补。第一链的引物结合结构域(c*)、第一亚结构域和第二亚结构域(b)与第二链的引物结构域(c)、第二亚结构域和第一亚结构域(b*)杂交，形成包含终止分子(·)的双链(双链体)区。引物结合结构域(c*)连接至第一核酸第二杂交结构域，用于与连接链的第一核酸第一杂交结构域杂交，所述连接链连接至能够与靶标结合的分子/部分(靶标结合配体)。
在任一方面的一些实施方式中，封闭探针的封闭探针核酸包含toehold结构域(x*)。该toehold结构域(x)与连接至靶标结合配体的核酸链的toehold结构域(x*)实质上互补。封闭探针的封闭探针核酸不包含与第一报告探针的核酸的toehold结构域(a)实质上相同的结构域或区域。
在任一方面的一些实施方式中，第二报告探针的第二核酸包含：(1)连接至能够与靶标结合的分子/部分(第二靶标结合配体)的第二核酸第一链；以及(2)与第一链实质上互补的第二核酸第二链，所述第二核酸第二链与第一链形成双链区(双链体区)。所述第一链包含toehold结构域(x)。该toehold结构域(x)与第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同。值得注意的是，该toehold结构域(x)与封闭探针的toehold结构域(x*)实质上互补。第二链包含连接至toehold结构域(a*)的引物结合结构域(d*)。该toehold结构域(a*)与第一报告探针的双链核酸的toehold结构域(a)实质上互补。
设计4(信号减弱型(Signal off))
在任一方面的一些实施方式中，第一报告探针的双链核酸包含：(1)连接至靶标结合配体的第一核酸第一链，以及(2)与第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与第一链形成双链区(双链体区)。第一链包含：连接至第一亚结构域的引物结合结构域(c*)，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)。第二链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至toehold结构域(b)。第一链的引物结合结构域(c*)和第二链的引物结构域(c)实质上彼此互补。第一链的第一亚结构域和第二链的第二亚结构域实质上彼此互补。第一链的第二亚结构域(b)和第二链的第一亚结构域(b*)实质上彼此互补。此外，第二链的第一亚结构域(b*)和toehold结构域(b)实质上彼此互补。第一链的引物结合结构域(c*)、第一亚结构域和第二亚结构域(b)与第二链的引物结构域(c)、第二亚结构域和第一亚结构域(b*)杂交，形成包含终止分子(·)的双链(双链体)区。
在任一方面的一些实施方式中，封闭探针的封闭探针核酸包含连接至toehold结构域(a*)的引物结合结构域(d*)。该toehold结构域(a*)与第一报告探针的双链核酸的toehold结构域(a)实质上互补。
方法
在另一个方面，本公开提供了用于检测样品中的靶标的方法。通常，该方法包括使样品至少与本文所述的第一报告探针和封闭探针接触。在一些实施方式中，该方法包括使样品与本文所述的第一报告探针、第二报告探针和封闭探针接触。如本文所公开的，仅在靶标存在的情况下产生信号，即核酸记录体。因此，检测处于信号增强型(signal-on)模式。
值得注意的是，第一报告探针和封闭探针可在与样品接触之前形成复合物。或者，或除此之外，第一报告探针和封闭探针可分别与样品接触。例如，样品可与第一报告探针接触，随后与封闭探针接触。
类似地，第二报告探针和封闭探针可在与样品接触之前形成复合物。或者，或除此之外，第二报告探针和封闭探针可分别与样品接触。例如，样品可与第二报告探针接触，然后与封闭探针接触。
在一些实施方式中，样品在与封闭探针接触之前与第一报告探针和第二报告探针接触。
用于检测靶标的一个示例性策略描绘于图4和图11中。当第一报告探针和第二报告探针共同结合至靶标时，第一报告探针的第一核酸中的toehold/配对结构域与第二报告探针的第二核酸中的互补的toehold/配对结构域杂交。聚合酶(例如链置换聚合酶)将杂交的链延伸，直至到达终止分子。这种延伸产生新形成的区域或结构域，所述区域或结构域附加至第二报告探针的第二核酸。双链核酸经历链置换，由此附加至第二报告探针的第二核酸的新形成的区域或结构域与双链区的另一端上的互补区杂交。聚合酶(例如链置换聚合酶)将新杂交的链进行延伸，直至到达第二终止分子。所得到的核酸在一端包含与第一报告探针的双链核酸中的序列的一部分实质上相同的序列，并在另一端包含与第二报告探针中的链的一部分实质上相同的序列。
在图4中，在不存在靶标的情况下，第一报告探针和第二报告探针各自保持结合至封闭探针。聚合酶沿着链延伸，直到到达终止分子。延伸的核酸链可彼此分离。然而，来自第一报告探针和第二报告探针的分离的延伸链彼此不杂交。这使得报告探针失活，因为其不再可用于检测。因此，仅在靶标存在的情况下，通过杂交、延伸和链置换机制，产生第一报告探针和第二报告探针的核酸之间的相互作用的记录体。
在图11中，在不存在靶标的情况下，聚合酶沿着连接至封闭配体的链延伸。这从第一报告探针和第二报告探针释放相互作用的链。然而，从第一报告探针和第二报告探针释放的链不彼此杂交。这使得报告探针失活，因为其不再可用于检测。因此，仅在靶标存在的情况下，通过杂交、延伸和链置换机制，产生第一报告探针和第二报告探针的核酸之间的相互作用的记录体。
在另一个方面，本文提供了组合物。通常，所述组合物包含本文所述的第一报告探针、第二报告探针和封闭探针中的至少一种。在任一方面的一些实施方式中，所述组合物包含本文所述的第一报告探针、第二报告探针和封闭探针中的至少两种。
在又一个方面，本文提供了用于检测靶标的试剂盒。所述试剂盒包含本文所述的第一报告探针、第二报告探针和封闭探针中的至少一种。在任一方面的一些实施方式中，所述组合物包含本文所述的第一报告探针、第二报告探针和封闭探针中的至少两种。
用于检测靶标的另一示例性策略描绘于图17中。在不存在靶标的情况下，报告探针和封闭探针相互结合。第一和/或第二报告探针的核酸中的toehold/配对结构域与封闭探针的封闭探针核酸中的互补的toehold/配对结构域杂交。聚合酶(例如链置换聚合酶)将杂交的链延伸，直至到达终止分子。这种延伸产生新形成的区域或结构域，所述区域或结构域附加至封闭探针的封闭探针核酸。双链核酸经历链置换，由此附加至封闭探针的核酸的新形成的区域或结构域与双链区的另一端上的互补区杂交。聚合酶(例如链置换聚合酶)将新杂交的链进行延伸，直至到达第二终止分子。所得到的核酸在一端包含与第一报告探针的双链核酸中的序列的一部分实质上相同的序列，并在另一端包含与封闭探针核酸的一部分实质上相同的序列。在存在靶标的情况下，报告探针和封闭探针不会彼此结合。这使得报告探针失活，因为其不再可用于检测。因此，仅在不存在靶标的情况下，通过杂交、延伸和链置换机制，产生第一报告探针和封闭探针的核酸之间的相互作用记录体，即核酸记录体。
设计5
图31A和图31B示意性地示出了对核酸延伸进行编程以通过非酶链置换区分中和结合事件与非中和结合事件的实例。在图31A中，允许中和靶标(例如中和抗体)与缀合有专门设计的核酸分子的一对报告探针(例如RBD)在平衡态下孵育，并且它们的结合使报告探针邻近。序贯加入缀合有另一种专门设计的核酸分子的封闭探针(例如ACE2)，从而与报告探针(例如RBD)结合。然而，与靶标(如中和抗体)在报告探针(如RBD)上相同位置可选地以较低亲和力结合的封闭探针(如ACE2)通常无法与已经结合至靶标的报告探针(例如RBD)共定位。两个报告探针的邻近得到保持，并允许通过添加聚合酶，进行包含toehold结构域(a*)和引物结构域(d*)的核酸链的双重延伸以生成包含结构域(d*)、(a*)、(b*)和(c*)的核酸报告探针。相反，如图31B所示，对于非中和靶标，报告探针没有被“中和”，并且仍然可结合封闭探针。报告探针与封闭探针的共定位使封闭探针的toehold结构域(x*)能够结合报告探针的连接链的互补的toehold结构域(x)。这通过封闭探针的杂交结构域(Lk1)对第一报告探针的杂交结构域(Lk1*)的杂交和/或封闭探针的杂交结构域(Lk2)对第二报告探针的杂交结构域(Lk2*)的杂交，触发了toehold介导的链置换反应。这使得核酸从报告探针解离，并通常阻止由双重延伸生成核酸记录体。因此，只有当靶标(例如中和抗体)的存在破坏了报告探针和封闭探针之间的结合(例如RBD-ACE2相互作用)时，才会生成核酸记录体。
在任一方面的一些实施方式中，该方法包括：(A)使样品与第一报告探针和第二报告探针接触；(B)使样品与第一封闭探针和第二封闭探针接触；(C)提供聚合酶，从而产生第一核酸和第二核酸之间的相互作用的核酸记录体，如果所述相互作用存在的话；以及(D)检测所述核酸记录体的存在或不存在，并且其中，所述核酸纪录体的存在指示所述靶标存在于所述样品中，其中：(i)第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体，并且其中，第一核酸包含：连接链以及与连接链杂交的双链核酸，所述连接链连接至第一靶标结合配体，并且包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)；其中，所述双链核酸包含：(1)第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至第一靶标结合配体的连接链杂交，并包含连接至单链toehold结构域(a)的杂交结构域(Lk1)，其中，所述toehold结构域(a)处于所述杂交结构域(Lk1)的远端，并且其中，杂交结构域(Lk1)与所述杂交结构域(Lk1*)实质上互补；以及(2)第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与第一核酸第一链实质上互补，与第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并在双链核酸的第二末端包含toehold结构域(b)，并且其中，双链核酸包含双链体区中的第一核酸第一链中的第一终止分子和第一核酸第二链中的第二终止分子；(ii)第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，其中，第二核酸包含第二核酸第一链、第二核酸第二链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)，所述toehold结构域(x)与第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；所述第二核酸第二链与第二核酸第一链杂交，并包含与第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)实质上互补的第二核酸第二杂交结构域(Lk2)，所述第二核酸第二杂交结构域(Lk2)连接至与第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补的toehold结构域(a*)，其中，在靶标存在的情况下，第一核酸的一部分和第二核酸的一部分能够杂交；(iii)第一封闭探针包含第一封闭配体，所述第一封闭配体能够直接或间接地与第一靶标结合配体形成复合物，并连接至第一封闭探针核酸，并且其中，第一封闭探针核酸包含连接至杂交结构域(Lk1)的toehold结构域(x*)，其中，该toehold结构域(x*)与第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，其中，杂交结构域(Lk1)与第一报告探针的杂交结构域(Lk1*)实质上互补，并且其中，靶标对第一报告探针的结合抑制第一报告探针与第一封闭探针形成复合物；以及(iv)第二封闭探针包含第二封闭配体，所述第二封闭配体能够直接或间接地与第二靶标结合配体形成复合物，并连接至第二封闭探针核酸，其中，第二封闭探针核酸包含连接至杂交结构域(Lk2)的toehold结构域(x*)，其中，该toehold结构域(x*)与第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，其中，杂交结构域(Lk2)与第二报告探针的杂交结构域(Lk2*)实质上互补，并且其中，靶标对第二报告探针的结合抑制第二报告探针和第二封闭探针形成复合物。
值得注意的是，(A)使样品与第一报告探针和第二报告探针接触的步骤以及(B)使样品与第一封闭探针和第二封闭探针接触的步骤可为序贯的或同时的。例如，样品可首先与第一报告探针和第二报告探针接触，随后与第一封闭探针和第二封闭探针接触。换言之，可将第一报告探针和第二报告探针添加到样品中，并且在一段时间后(例如5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟或更久后)，可将第一封闭探针和第二封闭探针添加至样品。
在任一方面的一些实施方式中，第一报告探针包含双链核酸，所述双链核酸在一端与连接链杂交，所述连接链连接至能够与靶标结合的分子/部分(例如，第一靶标结合配体)。连接至第一靶标结合配体的连接链包含用于与双链核酸杂交的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)和连接至第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)的toehold结构域(x)。所述双链核酸包含：(1)第一核酸第一链以及(2)与第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与第一链形成双链区(双链体区)。所述第一链包含：连接至第一亚结构域的引物结合结构域(c*)，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)。所述第二链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至toehold结构域(b)。第一链的引物结合结构域(c*)和第二链的引物结构域(c)实质上彼此互补。第一链的第一亚结构域和第二链的第二亚结构域实质上彼此互补。第一链的第二亚结构域(b)和第二链的第一亚结构域(b*)实质上彼此互补。此外，第二链的第一亚结构域(b*)和toehold结构域(b)实质上彼此互补。第一链的引物结合结构域(c*)、第一亚结构域和第二亚结构域(b)与第二链的引物结构域(c)、第二亚结构域和第一亚结构域(b*)杂交，形成包含终止分子(·)的双链(双链体)区。引物结合结构域(c*)连接至第一核酸第二杂交结构域(Lk1)，用于与连接第一靶标结合配体的连接链的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)杂交。
在任一方面的一些实施方式中，第一封闭探针包含封闭配体(例如，第一封闭配体)，所述封闭配体能够直接或间接地与第一报告探针的靶标结合配体形成复合物，并连接至第一封闭探针核酸。第一封闭探针核酸包含连接至第一封闭探针杂交结构域(Lk1)的toehold结构域(x*)。第一封闭探针核酸的toehold结构域(x*)与第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补。第一封闭探针杂交结构域(Lk1)与第一报告探针的杂交结构域(Lk1*)实质上互补。靶标对第一报告探针的结合抑制第一报告探针与封闭探针形成复合物。
在任一方面的一些实施方式中，第二报告探针包含核酸，其中，所述核酸包含：(1)第二核酸第一链，所述第二核酸第一链连接至能够与靶标结合的分子/部分(例如，第二靶标结合配体)，以及(2)第二核酸第二链，所述第二核酸第二链与第一链实质上互补，与第一股形成双链区(双链体区)。第一链包含连接至toehold结构域(x)的杂交结构域(Lk2*)。该toehold结构域(x)与第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同。第二链包含连接至toehold结构域(a*)的引物结合结构域(d*)。该toehold结构域(a*)与第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补。
在任一方面的一些实施方式中，第二封闭探针包含封闭配体(例如第二封闭配体)，所述封闭配体能够直接或间接地与第二报告探针的靶标结合配体形成复合物。封闭配体连接至封闭探针核酸。封闭探针核酸包含连接至杂交结构域(Lk2)的toehold结构域(x*)。该toehold结构域(x*)与第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补。所述杂交结构域(Lk2)与第二报告探针的杂交结构域(Lk2*)实质上互补。靶标对第二报告探针的结合抑制第二报告探针和封闭探针形成复合物。
设计6
图34A和图34B示意性地示出了对核酸延伸进行编程以通过非酶链置换区分中和结合事件与非中和结合事件的另一个实例。在图34A中，允许中和靶标(例如中和抗体)与缀合有专门设计的核酸分子的一对报告探针(例如RBD)在平衡态下孵育，并且它们的结合使得报告探针邻近。然而，与靶标(如中和抗体)在报告探针(如RBD)上相同位置可选地以较低亲和力结合的封闭探针(如ACE2)通常无法与已经结合至靶标的报告探针(例如RBD)共定位。两个报告探针的邻近得到保持，并允许通过添加聚合酶，进行包含toehold结构域(a*)和引物结构域(d*)的核酸链的双重延伸以生成包含结构域(d*)、(a*)、(b*)和(c*)的核酸报告探针。相反，如图34B所示，对于非中和靶标，报告探针没有被“中和”，并且仍然可结合封闭探针。报告探针与封闭探针的共定位使封闭探针的toehold结构域(x*)能够结合报告探针的连接链的互补的toehold结构域(x)。在dNTP混合物存在的情况下，通过聚合酶使封闭探针上的核酸延伸，该dNTP混合物实质上不含与如下核苷酸互补的dNTP，所述核苷酸存在于第一报告探针的toehold结构域(a)或(b)中但不存在于第一报告探针的杂交结构域(Lk1)和第二探针的杂交结构域(Lk2)中。这种延伸使核酸与报告探针解离。值得注意的是，在该酶促步骤中，报告探针中的核酸的聚合酶延伸被禁止，这需要不在dNTP混合物之中的dNTP。随着报告探针核酸的邻近被破坏，在添加缺失的dNTP之后，报告核酸链的聚合酶延伸不利于发生，并且通常阻止由双重延伸生成核酸记录体。在中和靶标存在的情况下，报告探针保持紧密邻近，并通过如下的两步延伸生成包含结构域(d*)、(a*)、(b*)和(c*)的核酸记录体：在存在如下的dNTP混合物的情况下的延伸，该dNTP混合物实质上不含与如下核苷酸互补的dNTP，所述核苷酸存在于第一报告探针的toehold结构域(a)或(b)中，但不存在于第一报告探针的杂交结构域(Lk1)和第二探针的杂交结构域(Lk2)中；随后的在存在如下的dNTP混合物的情况下的延伸，所述dNTP混合物包含与如下核苷酸互补的dNTP，所述核苷酸存在于第一报告探针的toehold结构域(a)或(b)中，但不存在于第一报告探针的杂交结构域(Lk1)和第二探针的杂交结构域(Lk2)中。因此，只有当靶标(例如中和抗体)的存在破坏了报告探针和封闭探针之间的结合(例如RBD-ACE2相互作用)时，才会生成独特序列。
在任一方面的一些实施方式中，该方法包括：(A)使样品与第一报告探针和第二报告探针接触；(B)使样品与第一封闭探针和第二封闭探针接触；(C)提供聚合酶和第一dNTP混合物；(D)在一段时间后(例如，5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟或更久)，提供第二dNTP混合物和可选的聚合酶，从而产生第一核酸和第二核酸之间的相互作用的核酸记录体，如果所述相互作用存在的话；以及(E)检测所述核酸记录体的存在或不存在，并且其中，所述核酸纪录体的存在指示所述靶标存在于所述样品中，其中：(i)第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体，并且其中，第一核酸包含：连接链以及与连接链杂交的双链核酸，所述连接链连接至第一靶标结合配体，并且包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)；其中，所述双链核酸包含：(1)第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至第一靶标结合配体的连接链杂交，并包含连接至单链toehold结构域(a)的杂交结构域(Lk1)，其中，所述toehold结构域(a)处于所述杂交结构域(Lk1)的远端，并且其中，杂交结构域(Lk1)与所述杂交结构域(Lk1*)实质上互补；以及(2)第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与第一核酸第一链实质上互补，与第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并在双链核酸的第二末端包含toehold结构域(b)，并且其中，双链核酸包含双链体区中的第一核酸第一链中的第一终止分子和第一核酸第二链中的第二终止分子；(ii)第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，其中，第二核酸包含第二核酸第一链、第二核酸第二链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)，所述toehold结构域(x)与第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；所述第二核酸第二链与第二核酸第一链杂交，并包含与第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)实质上互补的第二核酸第二杂交结构域(Lk2)，所述第二核酸第二杂交结构域(Lk2)连接至引物结合结构域(d*)，所述引物结合结构域(d*)连接至与第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补的toehold结构域(a*)，其中，在靶标存在的情况下，第一核酸的一部分和第二核酸的一部分能够杂交；(iii)第一封闭探针包含第一封闭配体，所述第一封闭配体能够直接或间接地与第一靶标结合配体形成复合物，并连接至第一封闭探针核酸，并且其中，第一封闭探针核酸包含与第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)，并且其中，靶标对第一报告探针的结合抑制第一报告探针和第一封闭探针形成复合物；以及(iv)第二封闭探针包含第二封闭配体，所述第二封闭配体能够直接或间接地与第二靶标结合配体形成复合物，并连接至第二封闭探针核酸，其中，第二封闭探针核酸包含与第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)，并且其中，靶标对第二报告探针的结合抑制第二报告探针和第二封闭探针形成复合物；以及(iv)其中，第一报告探针的toehold结构域(b)包含如下的核苷酸，所述核苷酸不存在于第一报告探针的杂交结构域(Lk1)和第二报告探针的杂交结构域(Lk2)中；其中，所述第一dNTP混合物实质上不含与如下的核苷酸互补的dNTP，所述核苷酸存在于第一报告探针的toehold结构域(a)或(b)中，但不存在于第一报告探针的杂交结构域(Lk1)和/或第二探针的杂交结构域(Lk2)中；并且其中，所述第二dNTP混合物包含与如下的核苷酸互补的dTNP，所述核苷酸存在于第一报告探针的toehold结构域(a)或(b)中，但不存在于第一报告探针的杂交结构域(Lk1)和/或第二探针的杂交结构域(Lk2)中。
在任一方面的一些实施方式中，第一报告探针包含双链核酸，所述双链核酸在一端与连接链杂交，所述连接链连接至能够与靶标结合的分子/部分(例如第一靶标结合配体)。连接至第一靶标结合配体的连接链包含用于与双链核酸杂交的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)以及连接至第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)的toehold结构域(x)。双链核酸包含：(1)第一核酸第一链，和(2)与第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与第一链形成双链区(双链体区)。所述第一链包含：连接至第一亚结构域的引物结合结构域(c*)，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)。所述第二链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至toehold结构域(b)。第一链的引物结合结构域(c*)和第二链的引物结构域(c)实质上彼此互补。第一链的第一亚结构域和第二链的第二亚结构域实质上彼此互补。第一链的第二亚结构域(b)和第二链的第一亚结构域(b*)实质上彼此互补。此外，第二链的第一亚结构域(b*)和toehold结构域(b)实质上彼此互补。第一链的引物结合结构域(c*)、第一亚结构域和第二亚结构域(b)与第二链的引物结构域(c)、第二亚结构域和第一亚结构域(b*)杂交，形成包含终止分子(·)的双链(双链体)区。引物结合结构域(c*)连接至第一核酸第二杂交结构域(Lk1)，用于与连接第一靶标结合配体的连接链的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)杂交。在一些实施方式中，杂交结构域(Lk1)使用2字母或3字母编码。例如，在2字母的编码中，杂交结构域(Lk1)的核苷酸序列中省略了4个核苷酸中的2个(例如A、G、C和T中的2个)。在3字母的编码中，杂交结构域(Lk1)的核苷酸序列中省略了4个核苷酸中的一个(例如A、G、C和T中的一个)。通常，存在于toehold结构域(a)或(b)中的核苷酸在杂交结构域(Lk1)中被省略。
在任一方面的一些实施方式中，第一封闭探针包含封闭配体(例如，第一封闭配体)，所述封闭配体能够直接或间接地与第一报告探针的靶标结合配体形成复合物，并连接至第一封闭探针核酸。第一封闭探针核酸包含toehold结构域(x*)。第一封闭探针核酸的toehold结构域(x*)与第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补。靶标对第一报告探针的结合抑制第一报告探针和第一封闭探针形成复合物。
在任一方面的一些实施方式中，第二报告探针包含核酸，其中，所述核酸包含：(1)第二核酸第一链，所述第二核酸第一链连接至能够与靶标结合的分子/部分(例如，第二靶标结合配体)，以及(2)第二核酸第二链，所述第二核酸第二链与所述第一链实质上互补，与第一链形成双链区(双链体区)。第一链包含连接至toehold结构域(x)的杂交结构域(Lk2*)。该toehold结构域(x)与第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同。第二链包含连接至toehold结构域(a*)的引物结合结构域(d*)。该toehold结构域(a*)与第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补。在一些实施方式中，杂交结构域(Lk2)使用2字母或3字母编码。例如，在2字母的编码中，杂交结构域(Lk2)的核苷酸序列中省略了4个核苷酸中的2个(例如A、G、C和T中的2个)。在3字母的编码中，杂交结构域(Lk2)的核苷酸序列中省略了4个核苷酸中的一个(例如A、G、C和T中的一个)。通常，存在于toehold结构域(a)或(b)中的核苷酸在杂交结构域(Lk1)中被省略。
在任一方面的一些实施方式中，第二封闭探针包含封闭配体(例如，第二封闭配体)，所述封闭配体能够直接或间接地与第二报告探针的靶标结合配体形成复合物。封闭配体连接至封闭探针核酸。封闭探针核酸包含toehold结构域(x*)。该toehold结构域(x*)与第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补。靶标对第二报告探针的结合抑制第二报告探针和第二封闭探针形成复合物。
通过相对于对照或参考样品(例如没有靶标的样品)对核酸记录体的量进行比较，可确定靶标的存在或不存在。例如，相对于对照或参考样品(例如没有靶标的样品)，小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于65％、小于60％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、或小于5％的量表明靶标存在于样品中。
附图说明
此申请文件包含至少一幅以彩色执行的附图。经请求并支付必要费用后，专利局将提供带有彩色附图的本专利申请公开的副本。
图1为对核酸延伸进行编程以区分中和结合事件与非中和结合事件的原理的示意图。当A被抗体或其它生物分子“中和”并且通常被阻止与B结合时，序列a*可被延伸两次或多次，从而产生“靶标”序列c*。另一方面，当A未被“中和”并且仍可结合至B时，由于缀合在B上的核酸序列的“干扰”，只有中间序列(b*)可延伸至a*。
图2为用于中和抗体测定的示例性探针设计的示意图，所述中和抗体测定对抗体类别不是特异性的。A1和A2为缀合至不同的DNA探针的相同的受体蛋白。B结合至A1和A2，形成受体-配体复合物。具有相同颜色的DNA结构域彼此互补。
图3为通过受体-配体相互作用形成探针复合物的示意图。
图4是以qPCR读出为例的检测机制的实施方式的示意图。中和抗体的存在引起具有结构域a*、b*、c*和d*的序列的DNA链的生成。可通过经设计的一对PCR引物对该DNA序列进行特异性扩增。非中和抗体的存在引起探针的“失活”，并且只能产生具有结构域a*、b*和d*的序列。
图5是根据该方法的示例性实施方式的用于SARS-COV-2中和抗体测定的探针设计的示意图。
图6是根据示例性实施方式的用于类别特异性中和抗体检测系统的探针设计和反应过程的示意图。
图7是用于中和抗体测定的另一个示例性探针设计的示意图，所述中和抗体测定对抗体类别不是特异性的。A1和A2为缀合至不同的DNA探针的相同受体蛋白。B结合至A1和A2，形成受体-配体复合物。具有相同颜色的DNA结构域彼此互补。
图8为图7中描绘的探针设计的未经复合的格式的示意图。
图9是用于中和抗体测定的又一个示例性探针设计的示意图，所述中和抗体测定对抗体类别不是特异性的。A1和A2为缀合至不同的DNA探针的相同受体蛋白。B结合至A1和A2，形成受体-配体复合物。具有相同颜色的DNA结构域彼此互补。
图10为图9中描绘的探针设计的未经复合的格式的示意图。
图11是以qPCR读出为例的检测机制的实施方式的示意图。中和抗体的存在引起具有结构域a*、b*、c*和d*的序列的DNA链的生成。可通过经设计的一对PCR引物对该DNA序列进行特异性扩增。非中和抗体的存在引起先前共定位的DNA探针的“邻近破坏”，并且只能产生具有结构域a*、b*和d*的序列。
图12是根据该方法的示例性实施方式的用于单克隆抗体药物的中和抗体的检测的示意图。
图13示出了由单克隆抗体R2B17证实的抗SARS-COV-2-RBD抗体测定。其中两个RBD缀合物结合至抗RBD mAb的测定的基本构建体产生PCR可扩增序列d*a*b*c*。与使用相同的RBD蛋白作为捕获抗原的传统ELISA测定相比，SPEAR(连续邻近延伸扩增反应)测定以仅1％的样品体积实现了高1000倍的敏感性。特别是，该结合测定显示出五个数量级的线性范围和重复之间的最小变化。
图14是示出了通过14种单克隆抗体进行的抗SARS-COV-2-RBD抗体测定测试的条形图。只有一种抗体由于测定中使用的RBD重组蛋白序列而没有响应。
图15是示出了在室温下孵育2h后，在人ACE2缀合物(50nM)和SARS-COV-2RBD缀合物(5pM/10pM)之间可实现高结合产率的条形图。
图16是对核酸延伸进行编程以区分中和结合事件与非中和结合事件的另一原理的示意图。当A被抗体或其它生物分子“中和”并通常被阻止与B结合时，序列a*通常被阻止延伸，或者通常只有中间序列(b*)可延伸至a*。另一方面，当A没有被“中和”并且仍然可结合至B时，序列a*可被延伸两次或多次，从而产生“靶标”序列c*。
图17是以SARS-COV-2中和抗体测定的探针设计和检测机制为例的检测机制的实施方式的示意图。刺突蛋白结合人ACE2受体，形成配体-受体复合物。具有相同颜色的DNA结构域彼此互补。中和抗体的存在有助于ACE2从刺突蛋白解离，并不会引起ACE2上的a*的延伸。非中和抗体的存在不破坏配体-受体复合物以及缀合的DNA探针的邻近，促进连续的聚合酶延伸反应，从而生成具有结构域a*、b*、c*和d*的序列的DNA链。
图18是示出了对针对SARS-Cov-2刺突蛋白的各种中和抗体和非中和抗体的示例性测定响应的条形图。具体而言，将1nM单克隆抗体用于与ACE2蛋白竞争，以结合SAR-Cov-2S1蛋白。对照样品中未添加抗体。ΔCq是指含有抗体的样品和对照样品之间的qPCR循环差异。该测定在区分各种抗体的中和能力方面显示出高特异性。
图19A是示出了在不同浓度下两种抗SARS-Cov2单克隆抗体的中和能力的测量的线形图。R2B17为中和抗体，而R2B12为非中和抗体。将抗体从1nM稀释至244fM，并且对照样品不含抗体。ΔCt是指含有抗体的样品和对照样品之间的qPCR循环差异。
图19B是示出了对于收集自未接种疫苗的健康供体(即阴性)、从SARS-Cov2感染中康复的患者和经接种疫苗的患者(Moderna，两剂)的干血斑样品的根据本公开的实施方式的测定性能的点图。对于每个干血斑样品，打孔6mm的斑，并使用500μL洗脱缓冲液进行洗脱。该测定被证明能够从所有康复的患者样品和经接种疫苗的供体样品中检测到中和抗体。
图20为SPEAR-NAb的示意图，所述SPEAR-NAb为抗SARS-COV2抗体的中和测定(竞争性结合测定)。SPEAR-NAb采用与SPEAR测定类似的亲和探针构建体，其中S探针和P探针分别缀合至S1和Ace2蛋白。测定以将样品与S1缀合物孵育开始，随后为Ace2孵育。然后，混合物将在qPCR扩增之前经历聚合酶反应。中和抗体在相同表位上结合S1方面表现出比Ace2更高的亲和力，抑制Ace2与S1结合和共定位以进行DNA延伸。相反，在不存在抗体或存在非中和抗体的条件下，抗体在S1的不同表位上的结合不会阻止Ace2与S1结合。Ace2能够与S1共定位，并进行双重延伸以生成完整的报告序列。
图21A-图21C是示出了对于抗SARS COV2中和抗体检测的SPEAR-NAb特异性和敏感性的线形图。(图21A)在ELISA上测试了具有不同中和能力的六种抗SARS COV2单克隆抗体，并显示出与S1的良好和相似的结合亲和力。从250nM以4倍稀释对这些抗体进行SPEAR-NAb测试，并能够区分具有不同中和能力的抗SARS COV2抗体。(图21B)具有高的经报道的中和能力的抗体(R2B12、R2B17和5B7D7)显示出比非中和对应物(9B1E8、R1B8和R2B12)显著更高的信号抑制。(图21C)与可商购的CPASS测定相比，SPEAR的敏感性增加了两个等级。
图22是用于SPEAR-NAb测试的DBS样品采集的实验工作流程的示意图。在DBS卡上采集用手指针刺抽取的血液并使其干燥过夜。打孔出6mm圆片，并37℃下在500μL DBS洗脱缓冲液中洗脱1.5hr。
图23A-图23C是示出了SPEAR-NAb与CPASS、PsVNA在阴性、经感染患者和经接种疫苗的供体的DBS样品的中和测量方面的比较的线形图。
图23A和图23B证明了SPEAR-NAb在明确区分经接种疫苗和经感染的患者样品与阴性样品(未感染且未接种疫苗)方面的优异敏感性(100％)和特异性(100％)，所有经接种疫苗的样品(n＝21)高于患者样品的总平均值(n＝19)，并且患者样品高于阴性受试者的总平均值(n＝22)；而CPASS和PsVNA通过DBS样品不良地区分疫苗与患者样品，以及区分疫苗/患者样品与阴性受试者。
图23C是对10个经接种疫苗的DBS样品以2倍稀释进行的中和滴度测量。SPEAR-Nab对所有疫苗样品的跨滴度变化测量很敏感(高达256×)，并且能够定量跨疫苗样品的NT50。相比之下，CPass和PsVNA在2×稀释下显示出低得多的抑制，并且在8×稀释下无法从所有DBS样品中检测到中和抗体。
图24是示出了SPEAR-NAb对血清、血浆和DBS样品的一致性测量的线形图。通过SPEAR-Nab在DBS和血清/血浆样品之间观察到优异的一致性(R2＝0.9788)。阴影区域示出了简单线性回归的90％置信区间。
图25是示出SPEAR-NAb从单个DBS样品测量经接种疫苗的供体(n＝37)针对SARS-COV-2野生型(WT)和从英国(UK)、南非(SA)和巴西(BZ)鉴定的不同变体的中和滴度方面的点图和线形图。50％抑制处的中和滴度(NT50)是从每个样品的8×2倍稀释进行插值而得出的。红色条/线示出几何平均滴度(GMT)。左子图显示，与WT相比，变体的NT50较低(UK(B.1.1.7)>SA(B.1.351)>BZ(P.1))。右子图上示出了每个个体的变体测量，并观察到S1变体的NT50的类似下降。统计显著性检验是Friedman检验和随后的Dunn's多重比较。
图26是显示通过SPEAR进行的SARS-COV2 Pan-IgG测定的线形图和点图。SPEAR在宽动态范围内以低fM通过S1缀合的SPEAR探针在定量抗SARS COV2单克隆抗体(R2B17)方面表现出高敏感性，与ELISA相比敏感性提高了四个等级(左子图)。来自疫苗受试者和康复患者的DBS样品与阴性DBS样品(未感染和未接种疫苗的供体)被完全区分(100％敏感性和100％特异性)。
图27是示出通过SPEAR进行的S蛋白表达测定的点图。SPEAR使用与不同S1结合表位的两种抗SARS COV2单克隆抗体缀合的探针，在宽动态范围内以低fM在定量S蛋白方面良好地运行。SPEAR能够以优异的特异性从经接种疫苗的供体(第一剂后第2天或第3天)的DBS样品中检测S1的fM拷贝。
图28是示出了可对单个DBS样品进行多种测定的一系列点图。通过SPEAR/SPEAR-Nab进行关于S蛋白、Pan-IgG和中和抗体测量的经接种疫苗的受试者(Moderna/Pfizer)的纵向研究。在第一次和第二次接种之前和之后，对四名经接种疫苗的受试者的DBS样品进行随时间进程的测量。SPEAR显示了S1随时间的不同谱图，其中对于所有四个个体，在第一剂后大约3天观察到初始的峰，并且当Pan-IgG和中和抗体出现上升时，峰变平。对Pan-IgG和中和抗体观察到类似的谱图，在第一次注射后第14天观察到第一个峰，并随着时间的推移逐渐降低，在第二剂后大约9天观察到第二个峰。
图29A和图29B是示出了SPEAR-NAb对血清、血浆/血清(图29A)和DBS(图29B)样品的测量的线形图。对于血清/血浆样品，蚀斑减少中和试验(PRNT)和SPEAR-Nab之间观察到优异的一致性(R2＝0.9390)。PRNT血清/血浆样品和SPEAR-Nab DBS样品之间观察到优异的一致性(R2＝0.9175)。阴影区域示出了简单线性回归的90％置信区间。
图30是用于基于DNA链置换方法的中和抗体测定的示例性探针设计的示意图。封闭探针(A，ACE2)上的核酸被设计为与报告探针(R，RBD)上的连接链的一部分互补。封闭探针(A，ACE2)和报告探针(R，RBD)的共定位启动toehold介导的链置换反应，从而从邻近反应所需的报告探针解离核酸。将封闭探针ACE2和报告探针RBD标记为A和R。
图31A和图31B是根据本公开的实施方式的用于检测中和靶标(例如中和抗体)(图31A)与非中和靶标(图31B)的非酶链置换方法的反应工作流程的示意图。(图31A)中和抗体的反应流程。允许中和抗体与一对DNA缀合的RBD在平衡态下孵育，并且它们的结合使探针邻近。序贯加入另一种DNA缀合的ACE2以与RBD结合。然而，以较低亲和力共享与中和抗体相同的与RBD的结合基序的ACE2通常不能与结合位点已经被中和抗体占据的RBD共定位。报告探针的核酸的邻近得到保持，并且允许通过添加聚合酶，进行引物探针的双重延伸以生成核酸记录体。(图31B)非中和抗体的反应工作流程。非中和抗体在不同的表位与RBD结合的同时，ACE2能够与RBD结合。共定位使结构域x*能结合在RBD上的连接链的互补toehold上，并触发toehold介导的链置换反应，这使探针由邻近解离。从双重延伸产生报告序列通常是被阻止的。
图32是示出了根据图31A和图31B中所示的示例性实施方式的中和抗体和非中和抗体的检测的条形图。
图33是用于基于酶促和DNA链置换方法的中和抗体测定的示例性探针设计的示意图。反应DNA链由2字母或3字母的编码组成，从而允许聚合酶以序贯的方式延伸。初始聚合酶延伸被编程为在封闭探针(A，ACE2)和报告探针(R，RBD)共定位时延伸其上的2字母编码的连接链(在Lk1/1*和Lk2/2*上呈现为棕色和粉色)。该延伸破坏了报告探针的核酸的邻近，并抑制了由a*结构域的双重延伸生成核酸记录体。将封闭探针ACE2和报告探针RBD标记为A和R。
图34A和图34B是根据本公开的实施方式的用于检测中和靶标(例如中和抗体)(图34A)与非中和靶标(图34B)的非酶链置换方法的反应工作流程的示意图。(图34A)中和抗体的反应流程。允许中和抗体与一对DNA缀合的RBD在平衡态下孵育，并且它们的结合使报告探针邻近。序贯加入另一种DNA缀合的ACE2来与RBD结合。然而，以较低亲和力共享与中和抗体相同的与RBD的结合基序的ACE2通常不能与结合位点已经被中和抗体占据的RBD共定位。两个报告探针的核酸的邻近得到保持，并允许在三种类型的dNTP存在下进行引物探针的双重延伸，以生成核酸记录体。(图34B)非中和抗体的反应工作流程。非中和抗体在不同的表位与RBD结合的同时，ACE2能够与RBD结合。共定位允许x*(绿色结构域)结合在RBD上连接链的互补toehold(x)上。通过添加两种类型的dNTP(即dTTP和dCTP)，使得x*能够通过复制RBD上连接区的2字母编码序列(Lk1和Lk2*)进行延伸，并从RBD置换DNA探针。值得注意的是，在这个酶促步骤中，引物探针的聚合酶延伸通常是被禁止的，这需要3字母编码以开始。随着报告探针的邻近被破坏，在添加3字母编码后，引物链的聚合酶延伸不利于发生，并且通常阻止由双重延伸产生报告序列。
具体实施方式
图4中描绘了用于检测靶标的示例性实施方式。当第一报告探针的第一靶标结合配体和第二报告探针的第二靶标结合配体共结合至靶标时，第一报告探针的双链核酸的第一核酸第一链中的toehold结构域(a)可与第二报告探针的第二核酸的toehold结构域(a*)杂交。聚合酶(例如链置换聚合酶)将杂交的链延伸，直至到达终止分子。这种延伸引起新形成的亚结构域(b*)附加到第二报告探针的toehold结构域(a*)。报告探针的靶标结合配体保持结合至靶标，这允许核酸链进行重排。这种重排允许新形成的亚结构域(b*)与第一报告探针的第一核酸第二链的互补亚结构域(b)结合。链置换聚合酶将经重排的杂交链进行延伸，直至到达终止分子。该第二延伸将第二引物结合结构域(c*)附加到新形成的亚结构域(b*)上。所得核酸按顺序包含例如结构域d*、a*、b*和c*，并提供第一报告探针的第一核酸和第二报告探针的第二核酸之间的相互作用的记录体。
探针
在任一方面的一些实施方式中，封闭配体和靶标是靶标结合配体的竞争性结合伴侣。例如，靶标和封闭配体可结合至靶标结合配体的相同部分。或者，或除此之外，靶标对靶标结合配体的结合改变了封闭配体的结合位点，从而抑制靶标结合配体和封闭配体彼此的结合。
值得注意的是，靶标结合配体和封闭配体可直接或间接地形成复合物。例如，靶标结合配体和封闭配体可相互结合以直接形成复合物。或者，靶标结合配体和封闭配体可同时与另一分子结合以间接形成复合物。无论复合物如何形成，靶标对靶标结合配体的结合都会抑制靶标结合配体与封闭配体之间复合物的形成。
可相互结合且其中一对成员与靶标是竞争性结合伴侣的任何成对分子可用于本文所述的报告探针和封闭探针。在任何方面的一些实施方式中，所述成对分子是结合对的成员。如本文所用，术语“结合对”是指通常在低微摩尔至皮摩尔范围内以高亲和力彼此特异性结合的成对的部分。当结合对的一个成员缀合至第一元件，而所述对的另一成员又缀合至第二元件时，第一和第二元件将通过结合对的成员的相互作用而在一起。结合对的非限制性实例包括抗原:抗体(包括抗原结合片段或其衍生物)、生物素:亲和素、生物素:链霉亲和素、生物素:中性亲和素(neutravidin)(或结合此类生物素的亲和素的其它变体)、受体:配体等。用于结合对的额外分子可以包括：中性亲和素，strep-标签，strep-tactin和衍生物，以及其它肽、半抗原、基于染料的标签-抗标签的组合，例如SpyCatcher-Spy标签、His标签、Fc标签、毛地黄皂苷、GFP、FAM、半抗原、SNAP标签、HRP、FLAG、HA、myc、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、小分子等。一些示例性的成对分子包括但不限于受体与配体、核酸与核酸结合蛋白、抗体与抗原、抗体的抗原结合片段与抗原、抗体与Fc受体、抗体与蛋白A、适体与其结合靶标、药物与其靶标等。
在一些实施方式中，靶标结合配体为受体，而封闭配体为所述受体的配体，反之亦然。
在一些实施方式中，靶标结合配体可为抗体，例如类别特异性抗体。
在一些实施方式中，靶标结合配体可为DNA或RNA结合蛋白，而封闭配体为核酸，反之亦然。
核酸链
如本文所述，探针包含连接至靶标结合配体或封闭配体的核酸链。值得注意的是，核酸链可共价或非共价地连接至配体(例如靶标结合配体或封闭配体)。所述链可通过其5'-末端或通过其3'-末端进行连接。在一些优选的实施方式中，所述链通过其5'-末端连接至配体(例如，靶标结合配体或封闭配体)。在任一方面的一些实施方式中，连接链在连接端的远端包含单链toehold结构域或配对结构域。
如本文所用，“toehold结构域”和“配对结构域”是指用于与第二链杂交的具有互补性的链的一部分。toehold和/或配对结构域可具有任何期望的长度或序列。例如，toehold和/或配对结构域的长度可独立地为至少4个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个或更多个核苷酸。在一些实施方式中，toehold和/或配对结构域的长度为100个以下的核苷酸、95个以下的核苷酸、90个以下的核苷酸、85个以下的核苷酸、80个以下的核苷酸、75个以下的核苷酸、70个以下的核苷酸、65个以下的核苷酸、60个以下的核苷酸、55个以下的核苷酸、50个以下的核苷酸、45个以下的核苷酸、40个以下的核苷酸、35个以下的核苷酸或30个以下的核苷酸。在一些实施方式中，toehold和/或配对结构域的长度可为约4个核苷酸至约50个核苷酸。例如，toehold和/或配对结构域可具有4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个核苷酸的长度。在一些实施方式中，toehold和/或配对结构域的长度为4个至10个、4个至15个、4个至20个、4个至25个、4个至30个、4至35个、4个至40个、4个至45个、或4个至50个核苷酸。在一些实施方式中，toehold和/或配对结构域长于40个核苷酸。例如，toehold和/或配对结构域可具有4个至100个核苷酸的长度。在一些实施方式中，toehold和/或配对结构域的长度为4个至90个、4个至80个、4个至70个、4个至60个或4个至50个核苷酸
在一些实施方式中，第一报告探针包含连接至第一靶标结合配体的双链核酸，其中双链核酸的第一报告探针第一链连接至靶标结合配体，并且在连接端的远端包含单链toehold结构域(a)。双链核酸的第一报告探针第二链在第一链的toehold结构域(a)的远端包含连接至配对结构域(x)的亚结构域(b)，其中配对结构域(x)更靠近第二链的末端。两条链彼此互补，并形成在每一端具有单链区的双链区(双链体区)。例如，双链分子包含第一单链区和第二单链区，所述第一单链区包含处于双链体区的一端的第一链的toehold结构域(a)，所述第二单链区包含处于双链体区的相对端的第二链的亚结构域(b)和配对结构域(x)。
在一些实施方式中，第一报告探针包含双链核酸，该双链核酸包含第一报告探针第一链和第一报告探针第二链，其中，所述双链核酸的第一链与连接至第一靶标结合配体的连接链杂交。连接至第一靶标结合配体的连接链包含连接至配对结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域，其中，配对结构域(x)位于连接第一靶标结合配体的末端的远端。所述双链核酸的第一链在一端包含第一核酸第二杂交结构域，并在第一核酸第二杂交结构域的远端包含单链toehold结构域(a)。所述双链核酸的第二链在第一链的toehold结构域(a)的远端包含亚结构域(b)。两条链彼此互补，并形成在每一端具有单链区的双链区(双链体区)。例如，双链分子包含第一单链区和第二单链区，所述第一单链区包含处于双链体区的一端的第一链的toehold结构域(a)，所述第二单链区包含处于双链体区的相对端的第二链的亚结构域(b)。连接链的杂交结构域和第一链的杂交结构域彼此杂交。
在本文所述任一方面的一些实施方式中，第一报告探针的双链核酸的双链体区包含第一链中的终止分子或修饰(·)和第二链中的终止分子或修饰(·)。如本文所用，“终止分子或修饰”是指使通过聚合酶进行的模板导向的聚合终止的分子或修饰。换而言之，终止分子或修饰能够防止聚合酶(例如链置换聚合酶)延伸通过双链体区。
在一些实施方式中，终止分子或修饰可为天然核苷酸。例如，终止分子可为天然核苷酸，并且通过聚合酶进行的延伸可在不存在与终止核苷酸互补的核苷酸的情况下进行。例如，“C-终止物(C-stopper)”包含至少一个C核苷酸，所述C核苷酸可在不存在dGTP的情况下终止聚合。在一些实施方式中，终止物为至少一个C核苷酸。在一些实施方式中，终止物为至少一个G核苷酸。在一些实施方式中，终止物为至少一个A核苷酸。在一些实施方式中，终止物为至少一个T核苷酸。
在一些实施方式中，终止聚合的分子是单个或配对的非天然核苷酸序列，例如iso-dG和iso-dC(IDT)，它们分别是胞嘧啶和鸟嘌呤的化学变体。Iso-dC将与iso-dG进行碱基配对(氢键)，但不与dG进行碱基配对。类似地，iso-dG将与iso-dC进行碱基配对，但不与dC进行碱基配对。通过在终止物位置将这些核苷酸成对并入发夹的相对侧，聚合酶将被停止，因为溶液中没有其互补核苷酸可在该位置添加。
在一些实施方式中，RNA碱基和/或甲基化RNA碱基可用作发夹引物内的终止序列。例如，2'-O-甲基化的RNA可用作终止聚合的分子。
在一些实施方式中，终止聚合的分子为反向核苷酸。例如，通过5'->5'或3'->3'连接进行连接的核苷酸。
在一些实施方式中，终止聚合的分子为合成的非DNA连接子，例如三乙二醇间隔子，例如Int间隔子9(iSp9)或间隔子18(Integrated DNA Technologies(IDT))。应当理解，任何使通过聚合酶进行的聚合终止的非天然连接子都可如本文所提供的那样使用。此类分子和修饰的其它非限制性实例包括三碳连接(/iSpC3/)(IDT)、ACRYDITETM(IDT)、腺苷酸化、叠氮化物、地高辛(NHS酯)、胆固醇基TEG(IDT)、I-LINKERTM(IDT)和3-氰基乙烯基咔唑(CNVK)以及它们的变体。通常，但并非总是，短连接子(例如iSp9)引起更快的反应时间。
包含终止聚合的分子或修饰通常会在双链体区产生“凸起”，因为分子或修饰没有配对。因此，在一些实施方式中，双链体区被设计为包含与终止分子或修饰相对的单核苷酸(例如，胸腺嘧啶)、至少两个相同核苷酸(例如，胸腺嘧啶二聚体(TT)或三聚体(TTT))或非天然修饰。
值得注意的是，终止分子可处于互补位置或非互补位置。例如，第一和第二终止分子可被定位为相距1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个核苷酸(或碱基对)。当终止分子处于非互补位置时，一个终止分子可更靠近具有第一链的toehold结构域(a)的双链体的末端，并且第二终止分子可更加靠近具有第二链的toehold结构域(x)的双链体的末端。在一些实施方式中，第一链中的终止分子比第二链中的终止分子更靠近具有第一链的toehold结构域(a)的双链体末端。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的核酸包含引物结合结构域(d)。引物结合结构域可为配对的(即双链体区的一部分)，也可为非配对的(即单链)。核酸的“引物结合结构域”是互补引物结合的核苷酸序列。引物结合结构域可具有任何期望的长度或序列。例如，引物结合结构域的长度可为至少4个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个或更多个核苷酸。在一些实施方式中，引物结合结构域的长度为100个以下的核苷酸、95个以下的核苷酸、90个以下的核苷酸、85个以下的核苷酸、80个以下的核苷酸、75个以下的核苷酸、70个以下的核苷酸、65个以下的核苷酸、60个以下的核苷酸、55个以下的核苷酸、50个以下的核苷酸、45个以下的核苷酸、40个以下的核苷酸、35个以下的核苷酸或30个以下的核苷酸。在一些实施方式中，引物结合结构域的长度可为约4个核苷酸至约50个核苷酸。例如，引物结合结构域可具有4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个核苷酸的长度。在一些实施方式中，引物结合结构域的长度为4个至10个、4个至15个、4个至20个、4个至25个、4个至30个、4个至35个、4个至40个、4个至45个、或4个至50个核苷酸。在一些实施方式中，引物结合结构域长于40个核苷酸。例如，引物结合结构域可具有4个至100个核苷酸的长度。在一些实施方式中，引物结合结构域具有4个至90个、4个至80个、4个至70个、4个至60个、或4个至50个核苷酸的长度。引物结合结构域可被设计为适应多于一种(例如，2种或3种不同)引物的结合。
在任一方面的一些实施方式中，第一报告探针的双链核酸的第一链包含引物结合结构域(c*)，所述引物结合结构域(c*)靠近具有toehold结构域(a)的末端或位于具有toehold结构域(a)的末端的远端。
在任一方面的一些实施方式中，第一报告探针的双链核酸的第一链可包含通过终止分子或修饰(·)分离的分为第一亚结构域和第二亚结构域(b)的结构域。例如，引物结合结构域(c*)可连接至第一亚结构域，而第二亚结构域(b)可连接至toehold结构域(a)。因此，在一些实施方式中，第一链包含连接至第一亚结构域的引物结合结构域(c*)，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)。
当存在时，第一链的第一亚结构域和/或第二亚结构域(b)可具有任何期望的长度或序列。此外，第一链的第一亚结构域和/或第二亚结构域(b)可具有相同的长度或不同的长度。例如，第一亚结构域和/或第二亚结构域(b)的长度可独立地为至少4个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个或更多个核苷酸。在一些实施方式中，第一亚结构域和/或第二亚结构域(b)长度为100个以下的核苷酸、95个以下的核苷酸、90个以下的核苷酸、85个以下的核苷酸、80个以下的核苷酸、75个以下的核苷酸、70个以下的核苷酸、65个以下的核苷酸、60个以下的核苷酸、55个以下的核苷酸、50个以下的核苷酸、45个以下的核苷酸、40个以下的核苷酸、35个以下的核苷酸或30个以下的核苷酸。在一些实施方式中，第一亚结构域和/或第二亚结构域(b)的长度可为约4个核苷酸至约50个核苷酸。例如，第一亚结构域和/或第二亚结构域(b)可具有4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个核苷酸的长度。在一些实施方式中，第一亚结构域和/或第二亚结构域(b)的长度为4个至10个、4个至15个、4个至20个、4个至25个、4个至30个、4个至35个、4个至40个、4个至45个、或4个至50个核苷酸。在一些实施方式中，第一亚结构域和/或第二亚结构域(b)长于40个核苷酸。例如，第一亚结构域和/或第二亚结构域(b)可具有4个至100个核苷酸的长度。在一些实施方式中，第一亚结构域和/或第二亚结构域(b)具有4个至90个、4个至80个、4个至70个、4个至60个、或4个至50个核苷酸的长度。
在一些实施方式中，第一链的第一亚结构域和/或第二亚结构域(b)可为条形码或唯一分子标识符(UMI)结构域。例如，第一链的第二亚结构域(b)可为条形码或唯一分子标识符(UMI)结构域。
“条形码”结构域或亚结构域是唯一识别特定分子的核苷酸序列。条形码在本领域中也可称为“唯一分子标识符”(UMI)。UMI将不同的序列与核酸分子相关联，并可用于唯一识别扩增的核酸分子。在一些实施方式中，条形码结构域可包含仅包含四个核苷酸中的三个的核苷酸序列。例如，条形码结构域或亚结构域可(a)仅包含A、T和C，(b)仅包含A、T和G，(c)仅包含G、T和C，或(d)仅包含A、G和C。因此，条形码结构域或亚结构域可缺少(可不包含)A、T、C或G中的一个。条形码结构域或亚结构域的长度可不同。
双链体的第二链包含与第一链互补的核苷酸以形成双链体区。因此，在一些实施方式中，第二链包含与第一链的第二亚结构域(b)实质上互补的第一亚结构域(b*)。
在一些实施方式中，第一报告探针的双链核酸的第二链包含与第一链的第一亚结构域互补的第二亚结构域。终止分子(·)可存在于第二链的第一亚结构域(b*)和第二亚结构域之间。在一些实施方式中，第二链还包含与第一链的引物结合结构域(c*)实质上互补的“引物结构域”(c)。
在一些实施方式中，第一报告探针的双链核酸的第二链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至第三亚结构域(b)，所述第三亚结构域(b)连接至toehold结构域(x)。例如，第二链在一端包含第一亚结构域(b*)，并在另一端包含toehold结构域(x)。
在一些实施方式中，第一报告探针的双链核酸的第二链不包含toehold结构域。换言之，第二链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至第三亚结构域(b)。例如，第二链在一端包含第一亚结构域(b*)，并在另一端包含引物结构域(c)。
在任一方面的一些实施方式中，封闭探针包含封闭配体和与其连接的封闭探针核酸。值得注意的是，封闭探针核酸可共价或非共价地连接至封闭配体。所述链可通过其5'-末端或通过其3'-末端进行连接。在一些优选的实施方式中，所述链通过其5'-末端连接至封闭配体。
通常，连接至封闭配体的封闭探针核酸在连接端的远端包含配对结构域(x*)。所述配对结构域(x*)与第一报告探针的配对结构域(x)实质上互补。在一些实施方式中，第一报告探针的配对结构域(x)和封闭探针的配对结构域(x*)彼此杂交。
在任一方面的一些实施方式中，连接至封闭配体的封闭探针核酸包含连接至配对结构域(x*)的toehold结构域(a)，其中配对结构域(x*)处于连接端的远端。连接链的toehold结构域(a)和第一报告探针的toehold结构域(a)可包含实质上相同的核苷酸序列。换而言之，封闭探针的toehold结构域(a)和第一报告探针的toehold结构域(a)实质上彼此相同。
在一些实施方式中，本文所述的方法、组合物和试剂盒可包含第二报告探针。通常，第二报告探针包含第二靶标结合配体和与其连接的第二核酸。值得注意的是，第二核酸可共价或非共价地连接至第二靶标结合配体。所述链可通过其5'-末端或通过其3'-末端进行连接。在一些优选的实施方式中，第二核酸通过其5'-末端连接至靶标结合配体。通常，连接链第二核酸包含连接至toehold结构域(a*)的引物结合结构域(d*)。在一些实施方式中，toehold结构域(a*)位于与靶标结合配体连接的末端的远端。第二报告探针的toehold结构域(a*)与第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补。
在任一方面的一些实施方式中，第二报告探针包含第二靶标结合配体以及连接至第二靶标结合配体的第二核酸。第二核酸包含连接至第二靶标结合配体的第二核酸第一链以及与第一链杂交的第二核酸第二链。值得注意的是，第一链可共价或非共价地连接至第二靶标结合配体。第一链可通过其5'-末端或通过其3'-末端进行连接。在一些优选的实施方式中，第一链通过其5'-末端连接至靶标结合配体。通常，第一链包含第二核酸第一杂交结构域，所述第二核酸第一杂交结构域在连接端的远端连接至配对结构域(x)。该配对结构域(x)与第一报告探针的配对结构域(x)实质上相同。第二链包含连接至引物结合结构域(d*)的第二核酸第二杂交结构域，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)。第二链和第一链(即连接链)的杂交结构域实质上互补，并且彼此杂交。在一些实施方式中，toehold结构域(a*)位于与连接链杂交的末端的远端。第二报告探针的toehold结构域(a*)与第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补。
在一些实施方式中，第二报告探针的第二靶标结合配体为类别特异性抗体。
核酸链结构域
本文所述的各种核酸包含一个或多个结构域。如本文所用，“结构域”是指核苷酸或核苷酸碱基对的离散的、连续的序列，这分别取决于该结构域是未配对的(未结合至互补核苷酸的核苷酸的连续的伸长段)还是经配对的(核苷酸碱基对--结合至互补核苷酸的核苷酸的连续的伸长段)。在一些实施方式中，为了定义分子内(在相同的分子种类内)和分子间(在两个分离的分子种类之间)的互补性，将结构域描述为具有多个亚结构域。如果一个结构域包含与另一结构域的核苷酸碱基配对(通过Watson-Crick核苷酸碱基配对杂交/结合)的核苷酸，使得两个结构域形成配对(双链)或部分配对的分子种类/结构，则一个结构域(或一个亚结构域)与另一个结构域(或另一亚结构域)“互补”。尽管在一些实施方式中提供了完全互补，互补结构域不需要完全(100％)互补来形成配对结构。应该理解的是，“结构域a”、“结构域b”和“结构域c”等是指具有彼此不同的核苷酸序列的结构域。因此，“结构域a”具有与“结构域b”的核苷酸序列不同的核苷酸序列。还应理解的是，“结构域a”和“结构域a*”是指具有彼此互补(部分或完全互补)的核苷酸序列以使两个结构域能够相互杂交(结合)的结构域。
如果结构域或其它离散核苷酸序列彼此是连续的(没有核苷酸将两个结构域分开)，或者如果它们彼此在50个核苷酸(例如1个至50个、1个至40个、1个至30个、1个至20个、1个至10个、1个至5个)内，则它们被认为是“相邻的”。也就是说，在一些实施方式中，如果两个结构域彼此分离1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个核苷酸，则这两个结构域可被认为是相邻的。
根据相对于彼此的3'和/或5'位置或相对于核酸链的整个长度来描述核苷酸结构域和亚结构域。
需要注意的是，本文所述的结构域可具有任何期望的长度或序列。例如，本文所述的结构域的长度可为至少4个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个或更多个核苷酸。在一些实施方式中，本文所述的结构域的长度为100个以下的核苷酸、95个以下的核苷酸、90个以下的核苷酸、85个以下的核苷酸、80个以下的核苷酸、75个以下的核苷酸、70个以下的核苷酸、65个以下的核苷酸、60个以下的核苷酸、55个以下的核苷酸、50个以下的核苷酸、45个以下的核苷酸、40个以下的核苷酸、35个以下的核苷酸或30个以下的核苷酸。在一些实施方式中，本文所述的结构域的长度可为约4个核苷酸至约50个核苷酸。例如，本文所述的结构域可具有4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个核苷酸的长度。在一些实施方式中，本文所述的结构域具有4个至10个、4个至15个、4个至20个、4个至25个、4个至30个、4个至35个、4个至40个、4个至45个、或4个至50个核苷酸的长度。在一些实施方式中，本文所述的结构域长于40个核苷酸。例如，本文所述的结构域可具有4个至100个核苷酸的长度。在一些实施方式中，本文所述的结构域具有4个至90个、4个至80个、4个至70个、4个至60个、或4个至50个核苷酸的长度。
本文所述的方法、组合物、试剂盒和系统可用于检测单个靶标或多个靶标。例如，可检测至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个不同的靶标，例如在单个反应中。
有利地，本文所述的方法、组合物、试剂盒和系统可用于检测反应中存在的具有低拷贝数的靶标。例如，可使用本文所述的方法、组合物、试剂盒和系统来检测10-100(例如，10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100)的拷贝数。
核酸修饰
本文提供的至少一种核酸链可以独立地包含本领域已知的一个或多个核酸修饰。例如，核酸链可以独立地包含非天然存在的核酸和/或非天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物和/或化学修饰。非天然存在的核酸可以包括例如天然存在和非天然存在的核苷酸的混合物。非天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物可以在核糖、磷酸酯和/或碱基部分进行修饰。
示例性核酸修饰包括但不限于：核碱基修饰、糖修饰、糖间连接修饰、缀合物(例如配体)以及它们的组合。在一个实施方式中，修饰不包括用如存在于脱氧核糖核酸中的脱氧核糖来替代核糖。本领域已知核酸修饰，参见例如US20160367702、US20190060458、美国专利号8,710,200、和美国专利号7,423,142，通过引用的方式以其整体并入本文。
示例性的经修饰的核碱基包括但不限于肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、异鸟苷(isoguanisine)、杀结核菌素(tubercidine)；以及腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶的取代或修饰的类似物，例如2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫脲嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-(2-氨丙基)尿嘧啶、5-氨基烯丙基尿嘧啶，8-卤代、氨基、巯基、硫代烷基、羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、5-取代嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤(包括2-氨丙基腺嘌呤)，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶、二氢尿嘧啶、3-去氮杂-5-氮杂胞嘧啶、2-氨基嘌呤、5-烷基尿嘧啶、7-烷基鸟嘌呤、5-烷基胞嘧啶、7-去氮杂腺嘌呤、N6,N6-二甲基腺嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、5-氨基-烯丙基-尿嘧啶、N3-甲基尿嘧啶、取代的1,2,4-三唑、2-吡啶酮、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、5-甲氧基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲氧羰基甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲氨基甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3羧丙基)尿嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N4-乙酰基胞嘧啶、2-硫胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊基腺嘌呤、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、N-甲基鸟嘌呤或O-烷基化碱基。进一步，嘌呤和嘧啶包括在以下中公开的那些嘌呤和嘧啶：美国专利号3,687,808；Concise Encyclopedia ofPolymer Science and Engineering，第858-859页，Kroschwitz,J.I.编著，John Wiley&Sons，1990；以及Englisch等，Angewandte Chemie，国际版，1991，30，613。
示例性糖修饰包括但不限于：2'-氟、3'-氟、2'-OMe、3'-OMe和无环核苷酸，例如肽核酸(PNA)、解锁核酸(unlocked nucleic acid，UNA)或乙二醇核酸(GNA)。
在一些实施方式中，核酸修饰可包括糖间连接的替代或修饰。示例性糖间连接修饰包括但不限于磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、亚甲基甲基亚氨基、硫代二酯、硫代氨基甲酸酯、硅氧烷、N,N'-二甲基肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)、酰胺-3(3'-CH2-C(＝O)-N(H)-5')和酰胺-4(3'-CH2-N(H)-C(＝O)-5')、羟氨基、硅氧烷(二烷基硅氧烷)、羧酰胺、碳酸酯/盐、羧甲基、氨基甲酸酯、羧酸酯、硫醚、环氧乙烷连接子、硫化物、磺酸盐/酯、磺酰胺、磺酸酯、硫代甲缩醛(3'-S-CH2-O-5')、甲缩醛(3'-O-CH2-O-5')、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基羰基氨基、亚甲基甲基亚氨基(MMI、3'-CH2-N(CH3)-O-5')、亚甲基亚肼基、亚甲基二甲基亚肼基、亚甲基氧基甲基亚氨基、醚(C3'-O-C5')、硫醚(C3'-S-C5')、硫代乙酰胺基(C3'-N(H)-C(＝O)-CH2-S-C5')、C3'-O-P(O)-O-SS-C5'、C3'-CH2-NH-NH-C5'、3'-NHP(O)(OCH3)-O-5'和3'-NHP(O)(OCH3)-O-5'。
在任何方面的一些实施方式中，2'-修饰的核苷包括选自于由以下所组成的组的修饰：2'-卤代(例如，2'-氟代)、2'-烷氧基(例如，2'-O-甲基、2'-O-甲基甲氧基和2'-O-甲基乙氧基)、2'-芳基氧基、2'-O-胺或2'-O-烷基胺(胺NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基、乙二胺或多氨基)、O-CH2CH2(NCH2CH2NMe2)2、亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')LNA、亚乙基氧基(4'-(CH2)2-O-2')ENA、2'-氨基(例如，2'-NH2、2'-烷基氨基、2'-二烷基氨基、2'-杂环氨基、2'-芳基氨基、2'-二芳基氨基、2'-杂芳基氨基、2'-二杂芳基氨基和2'-氨基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINE(AMINE＝NH2、烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基)、-NHC(O)R(R＝烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、2'-氰基、2'-巯基、2'-烷基-硫代-烷基、2'-硫代烷氧基、2'-硫代烷基、2'-烷基、2'-环烷基、2'-芳基、2'-烯基和2'-炔基。
在任何方面的一些实施方式中，反向核苷为dT。
在任何方面的一些实施方式中，5'-修饰的核苷酸包含选自于由以下所组成的组的5'修饰：5'-单硫代磷酸酯(硫逐磷酸酯)、5'-二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯)、5'-硫代磷酸酯(5'-phosphorothiolate)、5'-α-硫代三磷酸酯、5'-β-硫代三磷酸酯、5'-γ-硫代三磷酸酯、5'-氨基磷酸酯、5'-烷基膦酸酯、5'-烷基醚膦酸酯、可检测标记和配体；或者3'-修饰的核苷酸包含选自于由以下所组成的组的3'修饰：3'-单硫代磷酸酯(硫逐磷酸酯)、3'-二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯)、3'-硫代磷酸酯、3'-α-硫代三磷酸酯、3'-β-硫代三磷酸酯、3'-γ-硫代三磷酸酯、3'-氨基磷酸酯、3'-烷基膦酸酯、3'-烷基醚膦酸酯和可检测标记。
在一些实施方式中，核酸修饰可包括肽核酸(PNA)、桥接核酸(BNA)、morpholinos、锁核酸(LNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、或本领域中描述的其它异种核酸(xenonucleic acids，XNA)。
对于本领域技术人员来说将显而易见的是，可进行各种修饰和变化来提高核酸链的稳定性。
延伸反应
本文所述方法的实施方式包括使用聚合酶对核酸链进行延伸。由核酸模板合成核酸的方法是本领域公知的，并且对于本领域的普通技术人员是可用的。参见例如US20050277146A1、US20100035303A1和WO2006030455A1，通过引用将其全部内容以其整体并入本文。
通常，在聚合酶和核苷三磷酸存在的情况下进行延伸步骤。可在反应缓冲液中提供反应的所有组分。聚合酶反应组合物、方法或试剂盒中的组分的浓度可根据例如特定应用和该特定应用所需的动力学而变化。
值得注意的是，可通过例如改变温度、时间、缓冲液/盐条件和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)浓度来控制聚合动力学。聚合酶与大多数酶一样，对许多缓冲条件敏感，包括离子强度、pH和存在的金属离子类型(例如钠离子与镁离子)。因此，进行延伸步骤的温度可在例如4℃到65℃之间变化(例如，4℃、25℃、37℃、42℃或65℃)。在各个方面的一些实施方式中，进行延伸步骤的温度为4-25℃、4-30℃、4-35℃、4-40℃、4-45℃、4-50℃、4-55℃、4-60℃、10-25℃、10-30℃、10-35℃、10-40℃、10-45℃、10-50℃、10-55℃、10-60℃、25-30℃、25-35℃、25-40℃、25-45℃、25-50℃、25-55℃、25-60℃、25-65℃、35-40℃、35-45℃、35-50℃、35-55℃、35-60℃或35-65℃。在各个方面的一些实施方式中，在室温下进行延伸步骤。在一些其它实施方式中，在37℃下进行延伸步骤。
延伸步骤可进行(孵育)约30分钟至约24小时。在任何方面的一些实施方式中，延伸步骤可进行约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟，约55分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约18小时或约24小时。
在本文所述各个方面的一些实施方式中，dNTP的浓度可为，例如2-1000mM。例如，dNTP的浓度可为2-10pM、2-15pM、2-20pM、2-25pM、2-30pM、2-35pM、2-40pM、2-45pM、2-50pM、2-55pM、2-60pM、2-65pM、2-70pM、2-75pM、2-80pM、2-85pM、2-90pM、2-95pM、2-100pM、2-110pM、2-120pM、2-130pM、2-140pM、2-150pM、2-160pM、2-170pM、2-180pM、2-190pM、2-200pM、2-250pM、2-300pM、2-350pM、2-400pM、2-450pM、2-500pM、2-600pM、2-700pM、2-800pM、2-900pM或2-1000pM。例如，dNTP的浓度可为2pM、5pM、10pM、15pM、20pM、25pM、30pM、35pM、40pM、45pM、50pM、55pM、60pM、65pM、70pM、75pM、80pM、85pM、90pM、95pM、100pM、105pM、110pM、115pM、120pM、125pM、130pM、135pM、140pM、145pM、150pM、155pM、160pM、165pM、170pM、175pM、180pM、185pM、190pM、195pM或200pM。在任何方面的一些实施方式中，dNTP的浓度可为10-20pM、10-30pM、10-40pM、10-50pM、10-60pM、10-70pM、10-80pM、10-90pM或10-100pM。注意，也可使用dNTP变体。
在本文所述各个方面的一些实施方式中，延伸步骤包括将反应在引起核酸聚合、链置换和退火的条件下孵育足以产生合成链的时间。
在任何方面的一些实施方式中，聚合酶为DNA聚合酶(DNAP)，例如具有DNA链置换活性的DNA聚合酶(链置换聚合酶)。“链置换”描述了在合成过程中置换所遇到的下游DNA的能力。可如本文所提供地进行使用的具有DNA链置换活性的聚合酶的实例包括但不限于phi29 DNA聚合酶(例如，NEB#M0269)、Bst DNA聚合酶、大片段(例如，NEB#M0275)或Bsu DNA聚合酶、大片段(例如，NEB#M0330)。可使用具有链置换活性的其它聚合酶。
在本文所述各个方面的一些实施方式中，聚合酶为phi29 DNA聚合酶。在这样的实施方式中，反应条件可为如下：补充有纯化牛血清白蛋白(BSA)的反应缓冲液(例如，50mMTris-HCl、10mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、4mM DTT)，pH7.5，在30℃下孵育。
在任何方面的一些实施方式中，聚合酶为Bst DNA聚合酶、大片段。在这样的实施方式中，反应条件可为如下：IX反应缓冲液(例如，20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mMKC1、2mM MgSO4、0.1％X-100)，pH8.8，在65℃下孵育。
在任何方面的一些实施方式中，聚合酶为Bsu DNA聚合酶。在这样的实施方式中，反应条件可为如下：反应缓冲液(例如，50mM NaCl、10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT)，pH7.9，在37℃下孵育。
在一些实施方式中，聚合酶为Bst DNA聚合酶Bsu、Bst 2.0、Bst 3.0、Bsu、phi29、SD聚合酶、它们的任何组合或片段。
可用于本文提供的方法的其它示例性反应条件包括但不限于：缓冲液；/>缓冲液1、2、3、4；/>缓冲液；恒温扩增缓冲液；等。定制缓冲液可用以下制成：0.5×至2×PBS；5mM至200mM的Tris-HCl；5-200mM乙酸钾；5-200mM乙酸镁；5-200mMTris乙酸盐；或者5-200mM Bis-Tris-丙烷-HCl可与一种或所有这些添加剂的添加一起使用，以调节酶活性(例如，1-50mM KCl、1-20mM MgSO4、1-20mm MgCl2、1-5mM DTT、0-500μg/mLBSA、1-500NaCl、0.01％至0.5％ Triton X-100，pH值为6-9.5)。缓冲液还可包括dNTP(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP)。当仅使用2-3种的dNTP时，所省略的核苷酸充当聚合酶作用的终止物，任选地具有功能修饰。
核酸记录体的检测
可使用检测核酸链的任何方法来检测由第一报告探针中的核酸链和第二报告探针的核酸链之间的相互作用产生的核酸记录体。检测核酸的方法是本领域公知的，并且对于本领域的普通技术人员是可用的。检测核酸的示例性方法包括但不限于DNA测序、基于PCR的技术和基于杂交的方法。
可使用DNA结合染料检测核酸记录体。示例性的DNA结合染料包括但不限于吖啶(例如吖啶橙和吖啶黄)、放线菌素D(Jain等，J.Mol.Biol.68:21(1972)，通过引用的方式将其整体并入本文)、氨茴霉素、B0B0TM-1、BOBOTM-3、B0-PR0TM-1、色霉素、DAPI(Kapuseinski等，Nucl.Acids Res.6(112):3519(1979)，通过引用的方式将其整体并入本文)、柔红霉素(daunomycin)、偏端霉素(例如偏端霉素D)、美国专利号7,387,887中描述的染料，通过引用的方式将其整体并入本文，玫瑰树碱、乙锭盐(例如溴化乙锭)、fluorcoumanin、美国专利号4,257,774中所述的荧光嵌入剂，通过引用的方式将其整体并入本文，(CambrexBio Science Rockland Inc.，Rockland.，Me.)、Hoechst 33258(Searle和Embrey，Nucl.Acids Res.18:3753-3762(1990)，通过引用的方式将其整体并入本文)，Hoechst33342、乙菲啶、JO-PROTM-1，LIZ染料、LO-PROTM-l、阿的平、光神霉素、NED染料、纺锤菌素、4',6-二脒基-a-苯基吲哚、普罗黄素(proflavine)、POPOTM-l、POPOTM-3，PO-PROTM-l、碘化丙锭、多吡啶钌、S5、/>Gold、/>Green I(美国专利号5,436,134和5,658,751)、Green II、SYTOX blue、SYTOX green、/>43、/>44、/>45、Blue、/>11、/>13、/>15、/>16、20、/>23、噻唑橙(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，Wis)、TOTOTM-3、和/>(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)等。例如，/>Green I(参见例如美国专利号5,436,134；5,658,751；和/或6,569,927，通过引用的方式将其整体并入本文)已被用于监测PCR反应。如本领域技术人员所理解的，其它DNA结合染料也可以是合适的。例如，参见美国专利号4,883,867；5,658,751；8,865,904；8,883,415；9,040,561；和9,115,397，通过引用的方式将其整体并入本文。可选地，所述DNA结合染料为OliGreen或PicoGreen。参见例如美国专利号5,436,134，通过引用的方式将其整体并入本文。
在一些实施方式中，核酸记录体可使用测序方法。测序方法是已知的，并可通过多种平台执行，所述平台包括但不限于Ulumina,Inc.(La Jolla，CA)或Life Technologies(Carlsbad，CA)提供的平台。参见，例如，Wang等，Nat Rev Genet.10(l):57-63(2009)；和Martin，Nat Rev Genet.12(10):671-82(2011)，通过引用的方式将其整体并入本文。可选地，检测核酸记录体的方法包括微阵列方法，该方法是已知的，并可通过多种平台执行，包括但不限于Ambion,Inc.(Austin,TX)和Life Technologies(Carlsbad，CA)提供的平台。
核酸记录体的扩增
在一些实施方式中，所述方法还包括例如在检测核酸记录体之前对核酸记录体进行扩增的步骤。如本文所用，术语“扩增”是指如果反应的所有组分都是完整的，将核酸链置于足以允许多核苷酸扩增的条件下的步骤。扩增反应的组分包括例如引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。术语“扩增”通常是指靶核酸的“指数”增加。然而，如本文所用的“扩增”还可指核酸的选定靶序列的数量的线性增加，例如用循环测序获得的。扩增和合成核酸序列的方法为本领域所已知。例如，参见美国专利号7,906,282、8,367,328、5,518,900、7,378,262、5,476,774和6,638,722，以引用的方式将其全部内容以其整体并入本文。此类方法包括但不限于恒温扩增、聚合酶链式反应(PCR)和PCR变体，例如cDNA末端快速扩增(RACE)、连接酶链式反应(LCR)、多重RT-PCR、免疫PCR、SSIPA、qPCR、实时RT-qPCR和纳米流体数字PCR。因此，本文所述的方法包括使样品与DNA聚合酶和引物组接触的步骤。在任何方面的一些实施方式中，除非另有说明，引物组包括至少2个引物，并且包括扩增约50个碱基对(bp)至约50,000bp的靶标的正向引物和反向引物。
在任何方面的一些实施方式中，扩增步骤包括恒温扩增。如本文所用，“恒温扩增”是指在单一温度下发生的扩增。例如，扩增过程是在单一温度下进行或者其中的扩增过程的主要方面在单一温度下进行的。一般而言，恒温扩增依赖于聚合酶复制被扩增的模板链以形成结合的双链体的能力。恒温扩增允许靶核酸在恒定温度下的快速且特异的扩增。通常，恒温扩增包括(i)引物与靶核酸内的序列的序列特异性杂交，以及(ii)涉及多轮引物退火、延伸和链置换的后续扩增(作为非限制性实例，使用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶的组合)。恒温扩增中使用的引物是具有足够长度和适当序列以提供聚合的启动的寡核苷酸，即每个引物都是专门设计用以与待扩增的靶核酸的链互补。
恒温扩增的非限制性实例包括：环介导的恒温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、解旋酶依赖性恒温DNA扩增(HDA)、滚环扩增(RCA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、切口酶扩增反应(NEAR)、和聚合酶螺旋反应(PSR)。参见例如Yan等，Isothermal amplified detection of DNA and RNA，2014年3月，Molecular BioSystems10(5)，DOI：10.1039/c3mb70304e，通过引用将其内容以其整体并入本文。
在任何方面的一些实施方式中，恒温扩增反应是环介导的恒温扩增(LAMP)，即，扩增靶核酸的步骤包括环介导的恒温扩增。LAMP是用于DNA扩增的单管技术；LAMP使用4-6个引物，这些引物形成环状结构以便于后续轮次的扩增。因此，在这些方面的一些实施方式中，扩增步骤包括将样品与DNA聚合酶和引物组接触，其中该组引物包括4个、5个或6个成环引物。
在任何方面的一些实施方式中，恒温扩增反应是重组酶聚合酶扩增(RPA)，即，扩增靶核酸的步骤包括重组酶聚合酶扩增。RPA是低温DNA和RNA扩增技术。RPA过程使用三种核心酶--重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换聚合酶。重组酶能够将寡核苷酸引物与双链体DNA中的同源序列配对。SSB与DNA的置换的链结合，并防止引物被置换。最后，链置换聚合酶在引物与靶标DNA结合处开始DNA合成。通过使用两个相对着的引物，就像PCR一样，如果靶序列确实存在，就会启动指数DNA扩增反应。启动扩增不需要其它样品操作，如热熔解或化学熔解。在最佳温度下(例如，37℃-42℃)，RPA反应进展迅速，并引起从仅有的几个靶标拷贝到可检测水平的特异性DNA扩增，通常在10分钟内，用于快速检测靶核酸。在任何方面的一些实施方式中，单链DNA结合蛋白是gp32 SSB蛋白。在任何方面的一些实施方式中，重组酶是uvsX重组酶。例如，参见US专利7,666,598，其内容通过引用的方式以其整体并入本文。在任何方面的一些实施方式中，RPA也可以称为重组酶辅助的扩增(RAA)。因此，在任何方面的一些实施方式中，扩增步骤包括将样品与重组酶和单链DNA结合蛋白接触。在任何方面的一些实施方式中，扩增步骤包括将样品与DNA聚合酶、引物组、重组酶和单链DNA结合蛋白接触。
在任何方面的一些实施方式中，恒温扩增反应是解旋酶依赖性恒温DNA扩增(HDA)。HDA利用解旋酶的双链DNA解链活性来将链分离，以便在恒温下进行体外DNA扩增。在任何方面的一些实施方式中，解旋酶是热稳定的解旋酶，它可以提高HDA的特异性和性能；因此，恒温扩增反应可以是嗜热解旋酶依赖性扩增(tHDA)。作为非限制性实例，解旋酶是热稳定的UvrD解旋酶(Tte-UvrD)，其在45℃至65℃保持稳定和活性。因此，在这些方面的一些实施方式中，扩增步骤包括将样品与DNA聚合酶、引物组和解旋酶接触，其中解旋酶可选地是热稳定的解旋酶。
在任何方面的一些实施方式中，恒温扩增反应是滚环扩增(RCA)。RCA从圆形的DNA模板和短的DNA或RNA引物开始形成长的单链分子。因此，在这些方面的一些实施方式中，扩增步骤包括将样品(例如，环状DNA)与DNA聚合酶和引物组接触，其中第二引物组包含单个引物。
在任何方面的一些实施方式中，恒温扩增反应是基于核酸序列的扩增(NASBA)，也称为转录介导扩增(TMA)。NASBA是恒温技术，主要用于通过互补DNA的成环和原始RNA序列的破坏(例如，使用RNase H)来扩增RNA。NASBA反应混合物包含三种酶--逆转录酶(RT)、RNase H和T7 RNA聚合酶--以及两个引物。T7 RNA聚合酶是来自T7噬菌体的RNA聚合酶，其催化以5'→3'的方向从DNA形成RNA。引物1(P1)包含与靶核酸上的序列互补的3'末端序列和由T7 RNA聚合酶识别的启动子的5'末端(+)有义序列。引物2(P2)包含与P1引发的DNA链互补的序列。NASBA酶和引物协同操作，从而以指数方式扩增特定核酸序列。NASBA引起靶RNA至cDNA至RNA至cDNA等的扩增，交替进行逆转录(如RNA到DNA)和转录步骤(如DNA到RNA)，并且每次转录后RNA都会被降解。因此，在这些方面的一些实施方式中，扩增步骤包括将样品(例如，cDNA)与RNA聚合酶、逆转录酶、RNaseH和引物组接触，其中该引物组包括由RNA聚合酶识别的5'序列。
在任何方面的一些实施方式中，恒温扩增反应是链置换扩增(SDA)。SDA是恒温的、体外核酸扩增的技术，该技术基于限制性核酸内切酶HincII切割其识别位点的半硫代磷酸酯形式的未修饰链的能力、以及核酸外切酶缺陷型klenow(exo-klenow)DNA聚合酶在缺口处延伸3'-末端并置换下游DNA链的能力。指数扩增是由耦合有义和反义反应产生的，其中从有义反应中置换的链用作反义反应的靶标，反之亦然。因此，在这些方面的一些实施方式中，扩增步骤包括将样品与DNA聚合酶(例如exo-klenow)、引物组和限制性核酸内切酶(例如HincII)接触。
在任何方面的一些实施方式中，恒温扩增反应是切口酶扩增反应(NEAR)，这是与SDA类似的策略。在NEAR中，使用聚合酶和切口酶在恒定温度(例如，55℃至59℃)下扩增DNA。以各聚合酶置换步骤使切口位点再生，从而引起指数扩增。因此，在这些方面的一些实施方式中，扩增步骤包括将样品与DNA聚合酶(例如exo-klenow)、引物组和切口酶(例如N.BstNBI)接触。
在任何方面的一些实施方式中，恒温扩增反应是聚合酶螺旋反应(PSR)。PSR方法使用DNA聚合酶(例如Bst)和一对引物。正向和反向引物序列在其5'末端彼此相反，而其3'末端序列与其各自的靶核酸序列互补。PSR方法在恒定温度61℃-65℃下进行，生成复杂的螺旋结构。因此，在这些方面的一些实施方式中，扩增步骤包括将样品与DNA聚合酶(例如exo-klenow)和一组在其5'末端彼此相反的引物接触。
在任何方面的一些实施方式中，恒温扩增反应是聚合酶交联螺旋反应(PCLSR)。PCLSR使用三个引物(例如，两个外螺旋引物和一个交联引物)来产生三个独立的必要的螺旋产物，它们可以交联成最终的螺旋扩增产物。因此，在这些方面的一些实施方式中，扩增步骤包括将样品与DNA聚合酶和引物组(例如，两个外螺旋引物和交联引物)接触。
因此，本文提供的方法、组合物和试剂盒可包含扩增核酸记录体的引物或引物组，从而产生记录体的多个拷贝。
靶标
本文所述的方法、组合物、试剂盒和/或系统可用于检测任何期望的分子。例如，可使用本文所述的方法、组合物、试剂盒和/或系统检测任何感兴趣的靶标，条件是靶标具有至少两个结合位点，用于结合第一报告探针的成员和第二报告探针的成员。本公开中包括的描述中和抗体检测的实施例是为了说明的目的，并不旨在限制本发明的范围。
靶标的实例包括但不限于蛋白质、糖(例如多糖)、脂质、核酸(例如DNA、RNA、microRNA)、小分子和抗原。在一些实施方式中，靶标为生物分子。如本文所用，“生物分子”是指由活的生物体产生的任何分子，包括大分子以及小分子，大分子例如蛋白质(如抗体)、多糖、脂质和核酸(如DNA和RNA(如mRNA))，小分子例如初级代谢产物、次级代谢产物和天然产物。在一些实施方式中，靶标为抗体。在一些实施方式中，靶标为小分子。
在一个实施方式中，靶标为抗原。抗原是存在于病原体外表面的分子或分子结构；通过抗原特异性抗体或受体结合抗原可引发免疫应答。抗原可为蛋白质、肽和/或多糖。示例性抗原包括外源性抗原、内源性抗原、自身抗原、同种抗原、嗜异性抗原、超抗原、免疫原(完全抗原)和半抗原(不完全抗原)。在一个实施方式中，抗原包含在疫苗中和/或在疫苗中编码。在一个实施方式中，抗原由RNA疫苗编码。在一个实施方式中，抗原由DNA疫苗编码。
在一个实施方式中，抗原为刺突蛋白，即病毒包膜向外突出的蛋白结构。刺突蛋白也被称为S-糖蛋白。
靶标可为受试者响应于感染而产生的分子。例如，靶标可为中和抗体。术语“中和抗体”是指能够通过中和或抑制感染性试剂(通常为病毒)的生物效应(例如通过阻断细胞或病毒上的受体)来阻止其感染细胞的抗体。当抗体结合特定的病毒抗原，阻止病原体进入其宿主细胞时，可发生中和。
靶标的额外实例包括但不限于DNA、RNA、cDNA或经逆转录的RNA的DNA产物、A23187(卡西霉素、钙离子载体)、阿维菌素、松香酸、乙酸、乙酰胆碱、肌动蛋白、放线菌素D、腺苷、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)、三磷酸腺苷(ATP)、腺苷酸环化酶、侧金盏花醇、肾上腺素(Adrenaline)、肾上腺素(epinephrine)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、水母发光蛋白(Aequorin)、黄曲霉毒素(Aflatoxin)、琼脂、丙甲甘肽(Alamethicin)、丙氨酸、白蛋白、醛固酮、麦粉蛋白(Aleurone)、α-鹅膏蕈碱、尿囊素、烯丙菊酯、a-Amanatin、氨基酸、淀粉酶、合成代谢类固醇、茴香脑、血管紧张素原、茴香霉素、抗利尿激素(ADH)、阿拉伯糖、精氨酸、子囊霉素(Ascomycin)、抗坏血酸(维生素C)、天冬酰胺、天冬氨酸、不对称二甲基精氨酸、心房钠尿肽(ANP)、植物生长素、亲和素、印楝素A-C35H44O16、细菌素、白僵菌素、荷包牡丹碱、胆红素、生物聚合物、生物素(维生素H)、布雷菲德菌素A、芸苔甾内酯(Brassinolide)、番木鳖碱、尸胺、咖啡因、钙化醇(维生素D)、降钙素、钙调蛋白、钙调蛋白、钙网蛋白、樟脑-(C10H16O)、大麻酚、辣椒素、碳水化合物分解酶、碳水化合物、肉毒碱、卡拉胶、酪蛋白、半胱天冬酶、纤维素酶、纤维素-(C6H10O5)、浅蓝菌素(Cerulenin)、西曲溴铵(溴棕三甲铵)-C19H42BrN、白屈菜季铵碱、色霉素A3、Chaparonin、几丁质、-氯醛糖、叶绿素、胆囊收缩素(CCK)、胆固醇、胆碱、硫酸软骨素、肉桂醛、柠檬醛、柠檬酸、桔霉素、香茅醛、香茅醇、瓜氨酸、钴胺素(维生素B12)、辅酶、辅酶Q、秋水仙碱、胶原蛋白、毒芹碱、皮质类固醇、皮质酮、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、皮质醇、肌酸、肌酸激酶、晶体蛋白、a-环糊精、环糊精糖基转移酶、环巴胺、环匹阿尼酸(Cyclopiazonic acid)、半胱氨酸、胱氨酸、胞苷、细胞松弛素、细胞松弛素E、细胞色素、细胞色素C、细胞色素c氧化酶、细胞色素c过氧化物酶、细胞因子、胞嘧啶-C4H5N3O、脱氧胆酸、DON(脱氧雪腐镰刀菌烯醇)、脱氧呋喃核糖、脱氧核糖、脱氧核糖核酸(DNA)、右旋糖酐、糊精、DNA、多巴胺、酶、麻黄碱、肾上腺素(Epinephrine)-C9H13NO3、芥酸-CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)11COOH、赤藓糖醇、促红细胞生成素(EPO)、雌二醇、丁香酚(Eugenol)、脂肪酸、纤维蛋白、纤连蛋白、叶酸(维生素M)、卵泡刺激素(FSH)、甲醛、甲酸、Formnoci、果糖、伏马菌素B1、γ球蛋白、半乳糖、γ球蛋白、γ-氨基丁酸、γ-丁内酯、γ-羟基丁酸盐/酯(GHB)、胃泌素、明胶、香叶醇、球蛋白、胰高血糖素、氨基葡萄糖、葡萄糖-C6H12O6、葡萄糖氧化酶、谷蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、谷胱甘肽、谷蛋白、甘油(丙三醇)、甘氨酸、糖原、乙醇酸、糖蛋白(例如，糖蛋白酶，如前列腺特异性抗原(PSA))、促性腺激素释放激素(GnRH)、颗粒酶、绿色荧光蛋白、生长激素、生长激素释放激素(GHRH)、GTPase、鸟嘌呤、鸟苷、三磷酸鸟苷(+GTP)、结合珠蛋白、苏木精、血红素、蚯蚓血红蛋白、血蓝蛋白、血红蛋白、血红素蛋白(Hemoprotein)、硫酸乙酰肝素、高密度脂蛋白、HDL、组胺、组氨酸、组蛋白、组蛋白甲基转移酶、HLA抗原、同型半胱氨酸、激素、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、人生长激素、透明质酸盐/酯、透明质酸酶、过氧化氢、5-羟甲基胞嘧啶、羟脯氨酸、5-羟色胺、靛蓝染料、吲哚、肌苷、肌醇、胰岛素、胰岛素样生长因子、内在膜蛋白、整合酶、整合素、Intein、干扰素、菊粉、离子霉素、紫罗酮、异亮氨酸、铁硫簇、K252a、K252b、KT5720、KT5823、角蛋白、激酶、乳糖酶、乳酸、乳糖、羊毛脂、月桂酸、瘦素、来普霉素B、亮氨酸、木质素、柠檬烯、芳樟醇、亚油酸、亚麻酸、脂肪酶、脂质、脂锚定蛋白、硫辛酰胺(Lipoamide)、脂蛋白、低密度脂蛋白、LDL、促黄体生成素(LH)、番茄红素、赖氨酸、溶菌酶、苹果酸、麦芽糖、褪黑激素、膜蛋白、金属蛋白、金属硫蛋白、甲硫氨酸、含羞草素(Mimosine)、光神霉素A、丝裂霉素C、单体、霉酚酸、肌红蛋白、肌球蛋白、天然酚、核酸、赭曲霉毒素A、雌激素、寡肽、寡霉素、苔黑酚(Orcin)、食欲素(Orexin)、鸟氨酸、草酸、氧化酶、催产素、p53、PABA、紫杉醇、棕榈酸、泛酸(维生素B5)、甲状旁腺激素(PTH)、副蛋白、Pardaxin、小白菊内酯(Parthenolide)、棒曲霉素(Patulin)、Paxilline、青霉酸、青霉素、青霉震颤素A(Penitrem A)、肽酶、胃蛋白酶、肽、表霉素、外周膜蛋白、Perosamine、苯乙胺、苯丙氨酸、磷酸肌酸、磷酸酶、磷脂、苯丙氨酸、植酸、植物激素、多肽、多酚、多糖、卟啉、朊病毒、黄体酮、催乳素(PRL)、脯氨酸、丙酸、鱼精蛋白、蛋白酶、蛋白质、类蛋白、腐胺、除虫菊素、吡哆醇或吡哆胺(维生素B6)、吡咯赖氨酸、丙酮酸、醌、根赤壳菌素、棉子糖、肾素、视黄醛(Retinene)、视黄醇(维生素A)、视紫红质(视紫质)、核黄素(维生素B2)、呋喃核糖、核糖、核酶、蓖麻毒蛋白、RNA-核糖核酸、RuBisCO、黄樟素、水杨醛、水杨酸、Salvinorin A-C23H28O8、皂素、胰泌素、硒代半胱氨酸、硒代甲硫氨酸、硒蛋白、丝氨酸、丝氨酸激酶、血清素、粪臭素、信号识别颗粒、生长抑素、山梨酸、角鲨烯、星形孢菌素、硬脂酸、杂色曲霉素、甾醇、士的宁、蔗糖(糖)、糖(统称)、超氧化物、tau蛋白、T2毒素、单宁酸、单宁、酒石酸、牛磺酸、河豚毒素、奇异果甜蛋白(Thaumatin)、拓扑异构酶、酪氨酸激酶、牛磺酸、睾酮、四氢大麻酚(THC)、河豚毒素、毒胡萝卜素(Thapsigargin)、奇异果甜蛋白、硫胺素(维生素B1)-C12H17ClN4OS.HCl、苏氨酸、血小板生成素、胸苷、胸腺嘧啶、三氮菌素C(Triacsin C)、甲状腺刺激激素(TSH)、促甲状腺素释放激素(TRH)、甲状腺素(T4)、生育酚(维生素E)、拓扑异构酶、三碘甲状腺原氨酸(T3)、跨膜受体、曲古抑菌素A(TrichostatinA)、促激素、胰蛋白酶、色氨酸、微管蛋白、衣霉素、酪氨酸、泛素、尿嘧啶、尿素、脲酶、尿酸-C5H4N4O3、尿苷、缬氨酸、缬氨霉素、Vanabins、加压素、疣孢青霉原(Verruculogen)、维生素(统称)、维生素A(视黄醇)、维生素B、维生素B1(硫胺素)、维生素B2(核黄素)、维生素B3(尼克酸或烟酸)、维生素B4(腺嘌呤)、维生素B5(泛酸)、维生素B6(吡哆醇或吡哆胺)、维生素B12(钴胺素)、维生素C(抗坏血酸)、维生素D(钙化醇)、维生素E(生育酚)、维生素F、维生素H(生物素)、维生素K(萘醌)、维生素M(叶酸)、渥曼青霉素和木糖。
在一些实施方式中，靶标为蛋白质，例如细胞环境的蛋白质(例如细胞内蛋白或膜蛋白)。蛋白质的实例包括但不限于纤维状蛋白，例如细胞骨架蛋白(例如肌动蛋白、arp2/3、冠蛋白(coronin)、抗肌萎缩蛋白、FtsZ、角蛋白、肌球蛋白、伴肌动蛋白(nebulin)、血影蛋白、tau、肌联蛋白、原肌球蛋白、微管蛋白和胶原)和细胞外基质蛋白(例如胶原、弹性蛋白、f-spontin、皮卡丘素(pikachurin)和纤连蛋白)；球状蛋白，例如血浆蛋白(例如血清淀粉样蛋白P组分和血清白蛋白)、凝血因子(例如补体蛋白、C1抑制剂和C3转化酶、因子VIII、因子XIII、纤维蛋白、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂、凝血酶、血管性血友病因子(Von Willebrand Factor))和急性期蛋白，例如C反应蛋白；血红素蛋白；细胞粘附蛋白(例如钙粘蛋白、室管膜蛋白(ependymin)、整合素、Ncam和选择素)；跨膜转运蛋白(例如，CFTR、血型糖蛋白D和混杂酶(scramblase))，如离子通道(例如，配体门控离子通道，如烟碱乙酰胆碱受体和GABAa受体；以及电压门控离子通道，如钾、钙和钠通道)、synport/antiport蛋白(如葡萄糖转运体)；激素和生长因子(例如，表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)，肽激素，如胰岛素、胰岛素样生长因子和催产素，以及类固醇激素，如雄激素、雌激素和黄体酮)；受体，例如跨膜受体(例如G蛋白偶联受体、视紫红质)和细胞内受体(例如雌激素受体)；DNA结合蛋白(例如组蛋白、鱼精蛋白、CI蛋白)；转录调节因子(例如c-myc、FOXP2、FOXP3、MyoD和P53)；免疫系统蛋白(例如免疫球蛋白、主要组织相容性抗原和T细胞受体)；营养储存/转运蛋白(例如铁蛋白)；伴侣蛋白；以及酶。
样品/试样
本文描述了用于检测样品中的靶标的方法、组合物、试剂盒和系统。本文中使用的术语“样品”或“测试样品”可表示从生物有机体(例如需要测试的受试者)提取或分离的样品。
示例性生物样品包括组织样品，例如肝、脾、肾、肺、肠、胸腺、结肠、扁桃体、睾丸、皮肤、脑、心脏、肌肉和胰腺组织。其它示例性生物样品包括但不限于活检、骨髓样品、器官样品、皮肤碎片和生物体。从临床或法医环境中获得的材料也在术语生物样品的预期含义范围内。在一个实施方式中，样品来源于人、动物或植物。在一个实施方式中，生物样品为组织样品，优选为器官组织样品。在一个实施方式中，样品为人。例如，可从尸检、活检、肌肉打孔或手术中获得样品。其可为实体组织或实体瘤，如实质(parenchyme)、结缔组织或脂肪组织、心脏或骨骼肌、平滑肌、皮肤、脑、神经、肾、肝、脾、乳腺、癌(carcinoma，例如肠、鼻咽、乳腺、肺、胃等)、软骨、淋巴瘤、脑膜瘤、胎盘、前列腺、胸腺、扁桃体、脐带或子宫。所述组织可为肿瘤(良性或恶性)、癌性或癌前组织。样品可获取自受疾病或其它病理影响、或者怀疑受疾病或其它病理影响(正常或患病)、或者被认为是正常或健康的动物或人类受试者。
在任何方面的一些实施方式中，生物样品为痰样品、咽样品或鼻样品。在任何方面的一些实施方式中，生物样品为细胞、或组织、或外周血、或体液。在一些实施方式中，生物样品为活检、肿瘤样品、生物流体样品；血液；血清；血浆；尿；精液；粘液；组织活检；器官活检；滑液；胆汁；脑脊液；粘膜分泌物；积液；汗液；唾液；组织间液；或组织样品。该术语还包括上述样品的混合物。术语“测试样品”还包括未经处理或经预处理(或经预加工)的生物样品。
在一个实施方式中，血液样品为干血斑样品。获得干血斑的方法是本领域已知的，并且通常包括将至少5微升、10微升、15微升或更多微升的血液点到Whatman 31ETF卡纸上，并使其风干至少0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时或更多小时。在例如美国专利号8,093,062；9,110,053；9,207,151；10,531,821；11,000,850中进一步描述了用于获得干血斑样品的方法，通过引用的方式将其整体并入本文。
在各种实施方式中，当使用干血斑时，通过在溶液(例如洗脱缓冲液)中使干血斑圆片复溶，来制备样品液滴。在一个实施方式中，洗脱缓冲液由以下组成：
在某些情况下，圆片的直径小于约10mm，并在如下的溶液内复溶：小于约1000μL的溶液；或小于约750μL的溶液；或小于约500μL的溶液；或小于约250μL的溶液；或在约25μL至约750μL的范围内；或在约25μL至约500μL的范围内；或在约25μL至约250μL的范围内；或在约25μL至约150μL的范围内。
在某些情况下，样品包括至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个干血斑样品。
在某些情况下，干血斑圆片的直径范围为约1mm至约15mm；或约1mm至约8mm；或约1mm至约6mm；或约1mm至约4mm。通过在基质上沉积血液来制备圆片。在一个实施方式中，使用小于约10mL的血液或小于约1mL的血液或者小于约100μL的血液来制备干血斑。
在一个实施方式中，本文所述的测定是在单个容器基质中包含的样品上进行的。在一个实施方式中，本文所述的测定是在多容器基质(例如，24孔板、96孔板、384孔板或更多孔的板)中包含的样品上进行的。
在任何方面的一些实施方式中，测试样品可以是未经处理的测试样品。如本文所用，短语“未经处理的测试样品”是指除稀释和/或悬浮在溶液中外，未进行任何在先的样品预处理的测试样品。处理测试样品的示例性方法包括但不限于离心、过滤、超声、均质、加热、冷冻和解冻以及它们的组合。在任何方面的一些实施方式中，测试样品可以是经冷冻的测试样品。在采用本文所述的方法、测定和系统之前，可将经冷冻的样品解冻。解冻后，可将经冷冻的样品进行离心，然后使之经受本文所述的方法、测定和系统。在任何方面的一些实施方式中，测试样品是澄清的测试样品，例如，通过离心和收集包含澄清的测试样品的上清液。在任何方面的一些实施方式中，测试样品可以是预加工的测试样品，例如从选自于由如下所组成的组中的处理产生的上清液或滤液：离心、均质、超声、过滤、解冻、纯化以及它们的任何组合。在任何方面的一些实施方式中，可用化学和/或生物试剂处理测试样品。例如，可以使用化学和/或生物试剂在加工过程中保护和/或维持样品(包括其中的生物分子(例如核酸和蛋白质))的稳定性。本领域技术人员充分了解适用于检测本文所述靶标(例如中和抗体)所需的生物样品的预加工的方法和过程。
组合物和试剂盒
本文还提供了用于使用本文所述方法检测靶标的组合物、试剂盒和系统。
在一些实施方式中，所述组合物包含本文所述的第一报告探针、第二报告探针和封闭探针中的至少一种。
本文所述的组合物可进一步包含用于核酸聚合和/或连接的一种或多种试剂/组分。因此，在本文所述的各个方面的一些实施方式中，所述组合物进一步包含聚合酶。例如，DNA聚合酶。在任何方面的一些实施方式中，聚合酶为具有链置换活性的聚合酶。
在任何方面的一些实施方式中，所述组合物进一步包含用于核酸聚合和/或扩增的一种或多种试剂，例如脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、盐和/或缓冲液。
在一些实施方式中，所述组合物为干燥组合物。
在一些实施方式中，所述组合物进一步包含靶标，例如参考靶标。
在一个方面，本文提供了用于检测样品中的靶标的试剂盒。所述试剂盒可包含本文提供的组合物中的任一种及其包装和材料。因此，在一些实施方式中，所述试剂盒包含本文所述的第一报告探针、第二报告探针和封闭探针中的至少一种。
在一些实施方式中，所述试剂盒可进一步包含用于核酸聚合和/或扩增的一种或多种试剂/组分。例如，试剂盒可进一步包含聚合酶，例如DNA聚合酶，例如具有链置换活性的聚合酶。
在任何方面的一些实施方式中，所述试剂盒进一步包含用于核酸聚合和/或扩增的一种或多种试剂，例如脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、盐和/或缓冲液。
在一些实施方式中，所述试剂盒可进一步包含靶标，例如参考靶标。
本文还提供了包含本文所述的第一报告探针和第二报告探针中的至少一种的反应混合物。在一些实施方式中，反应混合物进一步包含用于核酸聚合和/或扩增的一种或多种试剂，例如聚合酶(例如，具有链置换活性的聚合酶)、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、盐和/或缓冲液。
在另一个方面，本文提供了用于检测靶标的系统。所述系统包含本文所述的第一报告探针和第二报告探针中的至少一种。在一些实施方式中，所述系统进一步包含用于核酸聚合和/或扩增的一种或多种试剂，例如聚合酶(例如，具有链置换活性的聚合酶)、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、盐和/或缓冲液。
本文所述各个方面的一些实施方式由以下编号的实施方式表示：
实施方式1)一种检测样品中的靶标分子的方法，所述方法包括：
a.使所述样品与第一报告探针和封闭探针接触，其中：
i.所述第一报告探针包含连接至第一核酸的靶标结合配体；
ii.所述封闭探针包含配体，所述配体能够直接或间接地与所述第一探针的靶标结合配体形成复合物，并连接至第二核酸，
其中，第一核酸的一部分和第二核酸的一部分能够在不存在靶标分子的情况下杂交，
其中，所述靶标分子对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一核酸的一部分能够在存在所述靶标分子的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在所述靶标分子的情况下延伸不超过一次；
b.产生第一报告探针和靶标分子之间的相互作用的核酸记录体；以及
c.检测所述核酸记录体。
实施方式2)如实施方式1所述的方法，所述方法包括：
a.使所述样品与第一报告探针、第二报告探针和封闭探针接触，其中：
i.所述第一报告探针包含连接至双链核酸分子的第一靶标结合配体，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸链，所述第一核酸链连接至所述第一靶标结合分子并且包含位于所述双链核酸的第一末端的单链toehold结构域(a)；以及
2.与所述第一链实质上互补的第二核酸链，所述第二核酸链与所述第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(x和b)，并且
其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的第一链中的第一终止分子以及第二链中的第二终止分子；
ii.所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标分子，并连接至核酸，所述核酸包含与所述第一报告探针的双链核酸的toehold结构域(a)实质上互补的toehold结构域(a*)，并且其中，靶标分子可同时与第一报告探针和第二报告探针结合；
iii.所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与第一和/或第二靶向配体形成复合物，并连接至核酸链，其中，所述核酸链包含：与所述第一报告探针的核酸的toehold结构域(a)实质上相同的第一toehold结构域(a)以及与所述第一报告探针的核酸的toehold结构域(x)实质上互补的第二toehold结构域(x*)，并且其中，靶标分子对第一报告探针的结合抑制第一报告探针和封闭探针形成复合物和/或靶标分子对第二报告探针的结合抑制第二报告探针和封闭探针形成复合物；
b.产生第一探针的核酸与第二探针的核酸之间的相互作用的核酸记录体；以及
c.检测所述核酸记录体。
实施方式3)如实施方式1所述的方法，所述方法包括：
a.使所述样品与第一报告探针、第二报告探针和封闭探针接触，其中：
i.所述第一报告探针包含第一靶标结合配体，所述第一靶标结合配体能够结合靶标分子，并连接至双链核酸分子，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸链，所述第一核酸链连接至第一靶标结合配体并包含位于所述双链核酸的第一末端的单链toehold结构域(a)；以及
2.与所述第一链实质上互补的第二核酸链，所述第二核酸链与所述第一链形成双链区(双链体区)并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(x和b)，并且
其中，所述双链核酸包含双链体区中的第一链中的第一终止分子以及第二链中的第二终止分子；
ii.所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合靶标分子，并连接至第一核酸链，所述第一核酸链包含连接至toehold结构域(x)的杂交结构域，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的核酸的配对结构域(x)实质上相同；第二链，所述第二链与第一链杂交，并且包含与第一链的杂交结构域实质上互补的杂交结构域，所述杂交结构域连接至引物结合结构域(d*)，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与第一报告探针的核酸的toehold结构域(a)实质上互补；
iii.所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一和/或第二靶标结合配体形成复合物，并连接至核酸链，其中，所述核酸链包含与所述第一报告探针的核酸的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标分子与对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针和所述封闭探针形成复合物，和/或所述靶标分子对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针和所述封闭探针形成复合物；
b.产生第一探针的核酸与第二探针的核酸之间的相互作用的核酸记录体；以及
c.检测所述核酸记录体。
实施方式4)如实施方式1所述的方法，所述方法包括：
a.使所述样品与第一报告探针、第二报告探针和封闭探针接触，其中：
i.所述第一报告探针包含第一靶标结合配体，所述第一靶标结合配体能够结合所述靶标分子，并连接至核酸链，所述核酸链包含连接至toehold结构域(x)的杂交结构域、与第一链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸链，所述第一核酸链与连接至所述靶标结合配体的核酸链杂交，并且包含位于toehold结构域(x)的远端的单链toehold结构域(a)；以及
2.与第一链实质上互补的第二核酸链，所述第二核酸链与所述第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含双链体区中的第一链中的第一终止分子和第二链中的第二终止分子；
ii.所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合靶标分子，并连接至第一核酸链，所述第一核酸链包含连接至toehold结构域(x)的杂交结构域，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的核酸的配对结构域(x)实质上相同；第二链，所述第二链与第一链杂交，并且包含与所述第一链的杂交结构域实质上互补的杂交结构域，所述杂交结构域连接至引物结合结构域(d*)，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与第一报告探针的核酸的toehold结构域(a)实质上互补；
iii.所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与第一和/或第二靶向配体形成复合物，并连接至核酸链，其中，所述核酸链包含与第一报告探针的核酸的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标分子对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针和所述封闭探针形成复合物，和/或所述靶标分子对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针和所述封闭探针形成复合物；
b.产生所述第一探针的核酸与所述第二探针的核酸之间的相互作用的核酸记录体；以及
c.检测所述核酸记录体。
实施方式5)一种检测样品中的靶标分子的方法，所述方法包括：
a.使所述样品与第一报告探针和封闭探针接触，其中：
i.所述第一报告探针包含连接至第一核酸的靶标结合配体；
ii.所述封闭探针包含配体，所述配体能够直接或间接地与第一探针的靶标结合配体形成复合物，并连接至第二核酸，
其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够在不存在靶标分子的情况下杂交，
其中，所述靶标分子对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一核酸的一部分能够在不存在靶标分子的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在存在所述靶标分子的情况下延伸不超过一次；
b.产生所述第一核酸和所述第二核酸之间的相互作用的核酸记录体；以及
c.检测所述核酸记录体，并且其中，核酸记录体不存在指示所述靶标分子存在于所述样品中。
实施方式6)如实施方式1所述的方法，所述方法包括：
a.使所述样品与第一报告探针和封闭探针接触，其中：
i.所述第一报告探针包含连接至双链核酸分子的第一靶标结合配体，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸链，所述第一核酸链连接至第一靶标结合分子，并且包含位于所述双链核酸的第一末端的单链toehold结构域(a)；以及
2.与第一链实质上互补的第二核酸链，所述第二核酸链与所述第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且
其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的第一链中的第一终止分子以及第二链中的第二终止分子；
ii.所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与第一和/或第二靶向配体形成复合物，并连接至核酸链，其中，所述核酸链包含第一toehold结构域(a)和引物结合结构域(d*)，所述第一toehold结构域(a)与所述第一报告探针的核酸的toehold结构域(a)实质上相同，并且其中，所述靶标分子对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针和所述封闭探针形成复合物，和/或所述靶标分子对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针和所述封闭探针形成复合物；
b.产生所述第一核酸和所述第二核酸之间的相互作用的核酸记录体；以及
c.检测所述核酸记录体，并且其中，所述核酸记录体不存在指示所述靶标分子存在于所述样品中。
实施方式7)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述第一报告探针和所述封闭探针在与所述样品接触之前形成复合物，和/或所述第二报告探针和所述封闭探针与所述样品接触之前形成复合物。
实施方式8)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述第一报告探针和所述封闭探针在与所述样品接触之前不处于复合物中，和/或所述第二报告探针和所述封闭探针与所述样品接触之前不处于复合物中。
实施方式9)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，产生记录体核酸的步骤包括通过聚合酶进行延伸。
实施方式10)如实施方式7所述的方法，其中，所述聚合酶为链置换聚合酶。
实施方式11)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括在检测所述核酸记录体之前扩增所述核酸记录体。
实施方式12)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述第一靶向配体和所述封闭配体是结合对。
实施方式13)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述第二靶向配体和所述封闭配体是结合对。
实施方式14)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述靶标结合配体与所述封闭配体为受体与配体、核酸与核酸结合蛋白、抗体与抗原、抗体的抗原结合片段与抗原、抗体与Fc受体、抗体与蛋白A、适体与其结合靶标、或药物与其结合靶标。
实施方式15)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述第一靶标结合配体和所述第二靶标结合配体是相同的。
实施方式16)如实施方式1-14中任一项所述的方法，其中，所述第一靶标结合配体和所述第二靶标结合配体是不同的。
实施方式17)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述第二靶标结合配体为类别特异性抗体。
实施方式18)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述靶标分子为生物分子。
实施方式19)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述靶标分子为抗体、核酸、小分子或抗原。
实施方式20)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述靶标分子为中和抗体。
实施方式21)如实施方式1-20中任一项所述的方法，其中，所述靶标分子为核酸。
实施方式22)如实施方式1-20中任一项所述的方法，其中，所述靶标分子为小分子。
实施方式23)如实施方式1-20中任一项所述的方法，其中，所述靶标分子为抗原。
实施方式24)如实施方式19或23所述的方法，其中，所述抗原为刺突蛋白。
实施方式25)如实施方式19或23所述的方法，其中，所述抗原由RNA疫苗编码。
实施方式26)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述样品为生物样品。
组合物实施方式
实施方式27)一种组合物，所述组合物包含：
a.第一报告探针，所述第一报告探针包含连接至第一核酸的靶标结合配体；以及
b.封闭探针，所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一探针的靶标结合配体形成复合物，并连接至第二核酸，并且
其中，所述第一报告探针的核酸的一部分和所述封闭探针的核酸的一部分能够在不存在靶标分子的情况下杂交，
其中，所述靶标分子对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一报告探针的核酸的一部分能够在存在靶标分子的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在靶标分子的情况下延伸不超过一次。
实施方式28)一种组合物，所述组合物包含：
a.第一报告探针，所述第一报告探针包含连接至第一核酸的靶标结合配体；
b.第二报告探针，所述第二报告探针包含连接至第二核酸的靶标结合配体，其中，所述第一报告探针的核酸的一部分和所述封闭探针的核酸的一部分能够杂交；
c.封闭探针，所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一探针的靶标结合配体形成复合物，并连接至第三核酸，
其中，所述第一报告探针的核酸的一部分和所述封闭探针的核酸的一部分能够在不存在所述靶标分子的情况下杂交，
其中，所述第二报告探针的核酸的一部分和所述封闭探针的核酸的一部分能够在不存在所述靶标分子的情况下杂交，
其中，所述靶标分子对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一报告探针的核酸的一部分能够在存在靶标分子的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在靶标分子的情况下延伸不超过一次。
实施方式29)如实施方式24或25所述的组合物，其中，所述第一报告探针包含连接至靶标结合配体的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
a.第一核酸链，所述第一核酸链连接至靶标结合配体，并且包含位于所述双链核酸的第一末端的单链toehold结构域(a)；以及
b.与所述第一链实质上互补的第二核酸链，所述第二核酸链与第一链形成双链区(双链体区)并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(x和b)，并且
其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的第一链中的第一终止分子以及第二链中的第二终止分子。
实施方式30)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第一报告探针包含核酸链，所述核酸链连接至靶标结合配体，并包含连接至toehold结构域(x)的杂交结构域；与连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
a.第一核酸链，所述第一核酸链与连接至靶标结合配体的核酸链杂交，并且包含连接至位于所述杂交结构域的远端的单链toehold结构域(a)的杂交结构域；以及
b.与第一链实质上互补的第二核酸链，所述第二核酸链与所述第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的第一链中的第一终止分子以及第二链中的第二终止分子。
实施方式31)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第一链包含连接至第一亚结构域的引物结合结构域(c*)，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)。
实施方式32)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第一链包含连接至引物结合结构域(c*)的杂交结构域，所述引物结合结构域(c*)连接至第一亚结构域，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)，其中，所述杂交结构域与连接至靶标结合配体的链的杂交结构域实质上互补。
实施方式33)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第二链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至toehold结构域(b)。
实施方式34)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第二链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至toehold结构域(b)，所述toehold结构域(b)连接至toehold结构域(x)。
实施方式35)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第二报告探针包含连接至靶标结合配体的核酸链，并且包含与第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补的toehold结构域(a*)。
实施方式36)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第二报告探针包含连接至靶标结合配体的核酸链，并包含连接至toehold结构域(a*)的引物结合结构域(d*)，其中，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补。
实施方式37)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第二报告探针包含第一核酸链，所述第一核酸链连接至靶标结合配体，并包含连接至toehold结构域(x)的杂交结构域，其中，所述toehold结构域(x)位于连接所述靶标结合配体的末端的远端；以及第二核酸链，所述第二核酸链包含连接至toehold结构域(a*)的杂交结构域，其中，第一链和第二链的杂交结构域实质上彼此互补。
实施方式38)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第二报告探针包含第一核酸链，所述第一核酸链连接至靶标结合配体，并包含连接至toehold结构域(x)的杂交结构域，其中，所述toehold结构域(x)位于连接所述靶标结合配体的末端的远端；以及第二核酸链，所述第二核酸链包含连接至引物结合结构域(d*)的杂交结构域，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)。
实施方式39)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述封闭探针包含核酸链，所述核酸链包含位于连接所述封闭配体的末端的远端的toehold结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补。
实施方式40)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述封闭探针包含核酸链，所述核酸链包含连接至第二toehold结构域(x*)的第一toehold结构域(a*)，其中，所述toehold结构域(x*)位于连接所述封闭配体的末端的远端，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第一和/或第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，并且所述toehold结构域(a*)与所述第一探针的toehold结构域(a)实质上相同。
实施方式41)一种组合物，所述组合物包含：
a.第一报告探针，所述第一报告探针包含连接至第一核酸的靶标结合配体；以及
b.封闭探针，所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一探针的靶标结合配体形成复合物，并连接至第二核酸，并且
其中，所述第一报告探针的核酸的一部分和所述封闭探针的核酸的一部分能够在不存在所述靶标分子的情况下杂交，
其中，所述靶标分子对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一报告探针的核酸的一部分能够在不存在所述靶标分子的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在存在所述靶标分子的情况下延伸不超过一次。
实施方式42)如实施方式38所述的组合物，其中，所述第一报告探针包含连接至所述靶标结合配体的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
a.第一核酸链，所述第一核酸链连接至所述靶标结合配体，并且包含位于所述双链核酸的第一末端的单链toehold结构域(a)；以及
b.与第一链实质上互补的第二核酸链，所述第二核酸链与所述第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且
其中，所述双链核酸包含双链体区中的第一链中的第一终止分子以及第二链中的第二终止分子。
实施方式43)如实施方式41或42所述的组合物，其中，所述第一链包含连接至第一亚结构域的引物结合结构域(c*)，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)。
实施方式44)如实施方式41-43中任一项所述的组合物，其中，所述第一链包含连接至引物结合结构域(c*)的杂交结构域，所述引物结合结构域(c*)连接至第一亚结构域，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)。
实施方式45)如实施方式41-44中任一项所述的组合物，其中，所述第二链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至toehold结构域(b)，其中所述toehold结构域与第一亚结构域(b*)实质上互补。
实施方式46)如实施方式41-45中任一项所述的组合物，其中，所述封闭探针包含核酸链，所述核酸链包含位于连接所述封闭配体的末端的远端的toehold结构域(a*)，其中，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补。
实施方式47)如实施方式41-46中任一项所述的组合物，其中，所述封闭探针包含核酸链，所述核酸链包含连接至toehold结构域(a*)的引物结合结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(a*)位于连接所述封闭配体的末端的远端，其中，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补。
实施方式48)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第一靶向配体和所述封闭配体是结合对。
实施方式49)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第二靶向配体和所述封闭配体是结合对。
实施方式50)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述靶标结合配体与所述封闭配体为受体与配体、核酸与核酸结合蛋白、抗体与抗原、抗体的抗原结合片段与抗原、抗体与Fc受体、抗体与蛋白A、适体与其结合靶标、或药物与其结合靶标。
实施方式51)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第一靶标结合配体和所述第二靶标结合配体是相同的。
实施方式52)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第一靶标结合配体和所述第二靶标结合配体是不同的。
实施方式53)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第一靶标结合配体为受体。
实施方式54)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第一靶标结合配体为受体，并且所述封闭配体为所述受体的配体。
实施方式55)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第二靶标结合配体为类别特异性抗体。
实施方式56)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第一报告探针的toehold结构域(x)和所述封闭探针的toehold结构域(x*)彼此杂交。
实施方式57)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第二报告探针的toehold结构域(a*)和所述封闭探针的toehold结构域(a)彼此杂交。
实施方式58)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第二报告探针的toehold结构域(x)和所述封闭探针的toehold结构域(x*)彼此杂交。
实施方式59)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第一报告探针的toehold结构域(x)和第一封闭探针的toehold结构域(x*)彼此杂交，并且所述第二报告探针的toehold结构域(x)和第二封闭探针的toehold结构域(x*)彼此杂交。
实施方式60)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含用于核酸扩增的一种或多种组分。
实施方式61)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含聚合酶。
实施方式62)如实施方式61所述的组合物，其中，所述聚合酶为链置换聚合酶。
实施方式63)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含dNTP。
实施方式64)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含盐。
实施方式65)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含缓冲液。
实施方式66)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含靶标分子。
试剂盒实施方式
实施方式67)一种试剂盒，所述试剂盒包含：
a.第一报告探针，所述第一报告探针包含连接至第一核酸的靶标结合配体；以及
b.封闭探针，所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一探针的靶标结合配体形成复合物，并连接至第二核酸，并且
其中，所述第一报告探针的核酸的一部分和所述封闭探针的核酸的一部分能够在不存在靶标分子的情况下杂交，
其中，所述靶标分子对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一报告探针的核酸的一部分能够在存在靶标分子的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在靶标分子的情况下延伸不超过一次。
实施方式68)一种试剂盒，所述试剂盒包含：
a.第一报告探针，所述第一报告探针包含连接至第一核酸的靶标结合配体；
b.第二报告探针，所述第二报告探针包含连接至第二核酸的靶标结合配体，其中，所述第一报告探针的核酸的一部分和所述封闭探针的核酸的一部分能够杂交；
c.封闭探针，所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一探针的靶标结合配体形成复合物，并连接至第三核酸，
其中，所述第一报告探针的核酸的一部分和所述封闭探针的核酸的一部分能够在不存在所述靶标分子的情况下杂交，
其中，所述第二报告探针的核酸的一部分和所述封闭探针的核酸的一部分能够在不存在所述靶标分子的情况下杂交，
其中，所述靶标分子对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一报告探针的核酸的一部分能够在存在靶标分子的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在靶标分子的情况下延伸不超过一次。
实施方式69)如实施方式63或64所述的试剂盒，其中，所述第一报告探针包含连接至靶标结合配体的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
a.第一核酸链，所述第一核酸链连接至靶标结合配体，并且包含位于所述双链核酸的第一末端的单链toehold结构域(a)；以及
b.与所述第一链实质上互补的第二核酸链，所述第二核酸链与第一链形成双链区(双链体区)并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(x和b)，并且
其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的第一链中的第一终止分子以及第二链中的第二终止分子。
实施方式70)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一报告探针包含核酸链，所述核酸链连接至靶标结合配体，并包含连接至toehold结构域(x)的杂交结构域；与连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
a.第一核酸链，所述第一核酸链与连接至靶标结合配体的核酸链杂交，并且包含连接至位于所述杂交结构域的远端的单链toehold结构域(a)的杂交结构域；以及
b.与第一链实质上互补的第二核酸链，所述第二核酸链与所述第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的第一链中的第一终止分子以及第二链中的第二终止分子。
实施方式71)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一链包含连接至第一亚结构域的引物结合结构域(c*)，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)。
实施方式72)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一链包含连接至引物结合结构域(c*)的杂交结构域，所述引物结合结构域(c*)连接至第一亚结构域，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)，其中，所述杂交结构域与连接至靶标结合配体的链的杂交结构域实质上互补。
实施方式73)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至toehold结构域(b)。
实施方式74)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至toehold结构域(b)，所述toehold结构域(b)连接至toehold结构域(x)。
实施方式75)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二报告探针包含连接至靶标结合配体的核酸链，并且包含与第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补的toehold结构域(a*)。
实施方式76)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二报告探针包含连接至靶标结合配体的核酸链，并包含连接至toehold结构域(a*)的引物结合结构域(d*)，其中，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补。
实施方式77)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二报告探针包含第一核酸链，所述第一核酸链连接至靶标结合配体，并包含连接至toehold结构域(x)的杂交结构域，其中，所述toehold结构域(x)位于连接所述靶标结合配体的末端的远端；以及第二核酸链，所述第二核酸链包含连接至toehold结构域(a*)的杂交结构域，其中，第一链和第二链的杂交结构域实质上彼此互补。
实施方式78)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二报告探针包含第一核酸链，所述第一核酸链连接至靶标结合配体，并包含连接至toehold结构域(x)的杂交结构域，其中，所述toehold结构域(x)位于连接所述靶标结合配体的末端的远端；以及第二核酸链，所述第二核酸链包含连接至引物结合结构域(d*)的杂交结构域，所述杂交结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)。
实施方式79)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述封闭探针包含核酸链，所述核酸链包含位于连接所述封闭配体的末端的远端的toehold结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补。
实施方式80)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述封闭探针包含核酸链，所述核酸链包含连接至第二toehold结构域(x*)的第一toehold结构域(a*)，其中，所述toehold结构域(x*)位于连接所述封闭配体的末端的远端，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第一和/或第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，并且所述toehold结构域(a*)与所述第一探针的toehold结构域(a)实质上相同。
实施方式81)一种试剂盒，所述试剂盒包含：
a.第一报告探针，所述第一报告探针包含连接至第一核酸的靶标结合配体；以及
b.封闭探针，所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一探针的靶标结合配体形成复合物，并连接至第二核酸，并且
其中，所述第一报告探针的核酸的一部分和所述封闭探针的核酸的一部分能够在不存在所述靶标分子的情况下杂交，
其中，所述靶标分子对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一报告探针的核酸的一部分能够在不存在所述靶标分子的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在存在所述靶标分子的情况下延伸不超过一次。
实施方式82)如实施方式81所述的试剂盒，其中，所述第一报告探针包含连接至所述靶标结合配体的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
a.第一核酸链，所述第一核酸链连接至所述靶标结合配体，并且包含位于所述双链核酸的第一末端的单链toehold结构域(a)；以及
b.与第一链实质上互补的第二核酸链，所述第二核酸链与所述第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且
其中，所述双链核酸包含双链体区中的第一链中的第一终止分子以及第二链中的第二终止分子。
实施方式83)如实施方式81或82所述的试剂盒，其中，所述第一链包含连接至第一亚结构域的引物结合结构域(c*)，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)。
实施方式84)如实施方式81-83中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一链包含连接至引物结合结构域(c*)的杂交结构域，所述引物结合结构域(c*)连接至第一亚结构域，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)。
实施方式85)如实施方式81-84中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚结构域(b*)连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至toehold结构域(b)，其中所述toehold结构域与第一亚结构域(b*)实质上互补。
实施方式86)如实施方式81-85中任一项所述的试剂盒，其中，所述封闭探针包含核酸链，所述核酸链包含位于连接所述封闭配体的末端的远端的toehold结构域(a*)，其中，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补。
实施方式87)如实施方式81-86中任一项所述的试剂盒，其中，所述封闭探针包含核酸链，所述核酸链包含连接至toehold结构域(a*)的引物结合结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(a*)位于连接所述封闭配体的末端的远端，其中，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补。
实施方式88)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一向靶配体和所述封闭配体是结合对。
实施方式89)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二向靶配体和所述封闭配体是结合对。
实施方式90)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述靶标结合配体与所述封闭配体为受体与配体、核酸与核酸结合蛋白、抗体与抗原、抗体的抗原结合片段与抗原、抗体与Fc受体、抗体与蛋白A、适体与其结合靶标、或药物与其结合靶标。
实施方式91)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一靶标结合配体和所述第二靶标结合配体是相同的。
实施方式92)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一靶标结合配体和所述第二靶标结合配体是不同的。
实施方式93)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一靶标结合配体为受体。
实施方式94)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一靶标结合配体为受体，并且所述封闭配体为所述受体的配体。
实施方式95)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二靶标结合配体为类别特异性抗体。
实施方式96)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一报告探针的toehold结构域(x)和所述封闭探针的toehold结构域(x*)彼此杂交。
实施方式97)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二报告探针的toehold结构域(a*)和所述封闭探针的toehold结构域(a)彼此杂交。
实施方式98)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二报告探针的toehold结构域(x)和所述封闭探针的toehold结构域(x*)彼此杂交。
实施方式99)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一报告探针的toehold结构域(x)和第一封闭探针的toehold结构域(x*)彼此杂交，并且所述第二报告探针的toehold结构域(x)和第二封闭探针的toehold结构域(x*)彼此杂交。
实施方式100)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含用于核酸扩增的一种或多种组分。
实施方式101)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含聚合酶。
实施方式102)如实施方式101所述的试剂盒，其中，所述聚合酶为链置换聚合酶。
实施方式103)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含dNTP。
实施方式104)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含盐。
实施方式105)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含缓冲液。
实施方式106)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含靶标分子。
本文所述各个方面的一些实施方式由以下编号的实施方式表示：
实施方式1：一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
a.使所述样品与第一报告探针和封闭探针接触，其中：
i.所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体；
ii.所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并连接至封闭探针核酸，
其中，所述第一核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在靶标的情况下杂交，
其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在所述靶标的情况下延伸不超过一次；
b.提供聚合酶，从而产生所述第一报告探针和所述靶标之间的相互作用的核酸记录体；以及
c.检测所述核酸记录体。
实施方式2：如实施方式1所述的方法，其中，
a.使所述样品与所述第一报告探针和所述封闭探针接触包括使所述样品与所述第一报告探针、第二报告探针和所述封闭探针接触，其中：
i.所述第一核酸包含双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链连接至所述第一靶标结合配体并且包含位于所述双链核酸的第一末端的单链toehold结构域(a)；以及
2.与所述第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(x和b)，并且
其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，所述第二核酸包含与所述第一报告探针的双链核酸的toehold结构域(a)实质上互补的toehold结构域(a*)，并且其中，所述靶标能与所述第一报告探针和第二报告探针同时结合；
iii.所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体和/或所述第二靶标结合配体形成复合物，并且连接至所述封闭探针核酸，其中，所述封闭探针核酸包含与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上相同的第一toehold结构域(a)，以及与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的第二toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针与所述封闭探针形成复合物，和/或其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针与所述封闭探针形成复合物。
实施方式3：如实施方式1所述的方法，其中：
a.使所述样品与所述第一报告探针和所述封闭探针接触包括使所述样品与所述第一报告探针、第二报告探针以及所述封闭探针接触，其中：
i.所述第一核酸包含双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链连接至所述第一靶标结合配体，并且包含位于所述双链核酸的第一末端的单链toehold结构域(a)；以及
2.与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(x和b)，并且
其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子和所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸第一链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；第二核酸第二链，所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交并包含第二核酸第二杂交结构域，所述第二核酸第二杂交结构域与所述第二核酸第一杂交结构域实质上互补，并连接至引物结合结构域(d*)，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补；
iii.所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体和/或所述第二靶标结合配体形成复合物，并连接至所述封闭探针核酸，其中，所述封闭探针核酸包含与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针与所述封闭探针形成复合物，和/或其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针与所述封闭探针形成复合物。
实施方式4：如实施方式1所述的方法，其中：
a.使所述样品与所述第一报告探针和所述封闭探针接触包括使所述样品与所述第一报告探针、第二报告探针和所述封闭探针接触，其中：
i.所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含位于所述toehold结构域(x)的远端的单链toehold结构域(a)；以及
2.与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子和所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸第一链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的配对结构域(x)实质上相同的；第二核酸第二链，所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含与所述第二核酸第一杂交结构域实质上互补的第二核酸第二杂交结构域，所述第二核酸第二杂交结构域连接至引物结合结构域(d*)，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补；
iii.所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体和/或第二靶标结合配体形成复合物，并连接至所述封闭探针核酸，其中，所述封闭探针核酸包含与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针与所述封闭探针形成复合物，和/或其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针与所述封闭探针形成复合物。
实施方式5：一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
a.使所述样品与第一报告探针接触，其中：
i.所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体；
b.使所述样品与封闭探针接触，其中：
i.所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并连接至封闭探针核酸，
其中，所述第一核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在靶标的情况下杂交，
其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一核酸的一部分能够在不存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在存在所述靶标的情况下延伸不超过一次；
c.提供聚合酶，从而产生所述第一核酸和所述封闭探针核酸之间的相互作用的核酸记录体，如果所述相互作用存在的话；以及
d.检测所述核酸记录体的存在或不存在，并且其中，所述核酸记录体的不存在指示所述靶标存在于所述样品中。
实施方式6：如实施方式5所述的方法，其中
i.所述第一核酸包含双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链连接至所述第一靶标结合配体，并且包含位于所述双链核酸的第一末端的单链toehold结构域(a)；以及
2.与所述第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，以及
其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述封闭探针核酸包含：与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上相同的第一toehold结构域(a)；以及引物结合结构域(d*)。
实施方式7：如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述第一报告探针和所述封闭探针在与所述样品接触之前形成复合物，和/或所述第二报告探针和所述封闭探针在与所述样品接触之前形成复合物。
实施方式8：如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述第一报告探针和所述封闭探针在与所述样品接触之前不处于复合物中，和/或所述第二报告探针和所述封闭探针在与所述样品接触之前不处于复合物中。
实施方式9：一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
a.使所述样品与第一报告探针和第二报告探针接触，其中：
i.所述第一报告探针包含第一靶标结合配体，所述第一靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第一核酸，其中，所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含连接至单链toehold结构域(a)的第一核酸第二杂交结构域(Lk1)，其中，所述toehold结构域(a)处于所述杂交结构域(Lk1)的远端，并且其中，所述杂交结构域(Lk1)与杂交结构域(Lk1*)实质上互补；以及
2.与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，其中，所述第二核酸包含第二核酸第一链、第二核酸第二链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含与所述第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)实质上互补的第二核酸第二杂交结构域(Lk2)，所述第二核酸第二杂交结构域(Lk2)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补，
其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够在靶标存在的情况下杂交；
b.使所述样品与第一封闭探针和第二封闭探针接触，其中：
i.所述第一封闭探针包含第一封闭配体，所述第一封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并且连接至第一封闭探针核酸，其中，所述第一封闭探针核酸包含连接至第一封闭探针杂交结构域(Lk1)的toehold结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，其中，所述杂交结构域(Lk1)与所述第一报告探针的杂交结构域(Lk1*)实质上互补，并且其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针与所述第一封闭探针形成复合物；以及
ii.所述第二封闭探针包含第二封闭配体，所述第二封闭配体能够直接或间接地与所述第二靶标结合配体形成复合物，并且连接至第二封闭探针核酸，其中，所述第二封闭探针核酸包含连接至第二封闭探针杂交结构域(Lk2)的toehold结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，其中，所述杂交结构域(Lk2)与所述第二报告探针的杂交结构域的(Lk2*)实质上互补，并且其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针与所述第二封闭探针形成复合物；
c.提供聚合酶，从而产生所述第一核酸和所述第二核酸之间的相互作用的核酸记录体，如果所述相互作用存在的话；以及
d.检测所述核酸记录体的存在或不存在，并且其中，所述核酸纪录体的存在指示所述靶标存在于所述样品中。
实施方式10：一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
a.使所述样品与第一报告探针和第二报告探针接触，其中：
i.所述第一报告探针包含第一靶标结合配体，所述第一靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第一核酸，其中，所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含连接至单链toehold结构域(a)的第一核酸第二杂交结构域(Lk1)，其中，所述toehold结构域(a)处于所述杂交结构域(Lk1)的远端，并且其中，所述杂交结构域(Lk1)与杂交结构域(Lk1*)实质上互补；以及
2.与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，其中，所述第二核酸包含第二核酸第一链、第二核酸第二链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含与所述第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)实质上互补的第二核酸第二杂交结构域(Lk2)，所述第二核酸第二杂交结构域(Lk2)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补，
其中，所述第一报告探针的toehold结构域(b)包含不存在于所述第一报告探针的杂交结构域(Lk1)和所述第二探针的杂交结构域(Lk2)中的核苷酸，并且
其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够在靶标存在的情况下杂交；
b.使所述样品与第一封闭探针和第二封闭探针接触，其中：
i.所述第一封闭探针包含第一封闭配体，所述第一封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并且连接至第一封闭探针核酸，其中，所述第一封闭探针核酸包含与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针与所述第一封闭探针形成复合物；以及
ii.所述第二封闭探针包含第二封闭配体，所述第二封闭配体能够直接或间接地与所述第二靶标结合配体形成复合物，并连接至第二封闭探针核酸，其中，所述第二封闭探针核酸包含与所述第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针和所述第二封闭探针形成复合物；
c.提供聚合酶和第一dNTP混合物，其中，所述第一dNTP混合物实质上不含与如下的核苷酸互补的dNTP，所述核苷酸存在于所述第一报告探针的toehold结构域(b)中，但不存在于所述第一报告探针的杂交结构域(Lk1)和所述第二报告探针的杂交结构域(Lk2)中；
d.提供第二dNTP混合物以及可选的聚合酶，其中，所述第二dNTP混合物包含与如下的核苷酸互补的dTNP，所述核苷酸存在于所述第一报告探针的toehold结构域(a)或(b)中，但不存在于所述第一报告探针的杂交结构域(Lk1)和所述第二报告探针的杂交结构域(Lk2)中，从而产生所述第一核酸和所述第二核酸之间的相互作用的核酸记录体，如果所述相互作用存在的话；以及
e.检测所述核酸记录体的存在或不存在，并且其中，所述核酸纪录体的存在指示所述靶标存在于所述样品中。
实施方式11：如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，提供所述聚合酶使所述核酸中的一种或多种延伸。
实施方式12：如实施方式11所述的方法，其中，所述聚合酶为链置换聚合酶。
实施方式13：如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括在检测核酸记录体的存在或不存在之前扩增所述核酸记录体，如果所述核酸记录体存在的话。
实施方式14：如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述第一靶标结合配体和所述封闭配体是结合对。
实施方式15：如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述第二靶标结合配体和所述封闭配体是结合对。
实施方式16：如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述第一靶标结合配体和/或所述第二靶标结合配体与所述封闭配体为受体与配体、核酸与核酸结合蛋白、抗体与抗原、抗体的抗原结合片段与抗原、抗体与Fc受体、抗体与蛋白A、适体与其结合靶标、或药物与其结合靶标。
实施方式17：如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述第一靶标结合配体和所述第二靶标结合配体相同。
实施方式18：如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述第一靶标结合配体和所述第二靶标结合配体不同。
实施方式19：如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述第二靶标结合配体为类别特异性抗体。
实施方式20：如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述靶标为生物分子。
实施方式21：如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述靶标为抗体、核酸、小分子或抗原。
实施方式22：如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述靶标为中和抗体。
实施方式23：如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述靶标为核酸。
实施方式24：如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述靶标为小分子。
实施方式25：如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述靶标为抗原。
实施方式26：如实施方式21或25所述的方法，其中，所述抗原为刺突蛋白。
实施方式27：如实施方式21或25所述的方法，其中，所述抗原包含在疫苗中，或者其中，所述抗原由疫苗编码。
实施方式28：如实施方式27所述的方法，其中，所述抗原由DNA疫苗编码。
实施方式29：如实施方式27所述的方法，其中，所述抗原由RNA疫苗编码。
实施方式30：如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述样品为生物样品。
实施方式31：一种用于检测样品中的靶标的组合物，所述组合物包含：
a.第一报告探针，所述第一报告探针包含连接至第一核酸的靶标结合配体；以及
b.封闭探针，所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一报告探针的靶标结合配体形成复合物，并连接至封闭探针核酸，并且
其中，所述第一核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在靶标的情况下杂交，
其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
实施方式32：如实施方式31所述的组合物，所述组合物进一步包含：
第二报告探针，所述第二报告探针包含连接至第二核酸的第二靶标结合配体，
其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够杂交，并且
其中，所述第二核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在靶标的情况下杂交。
实施方式33：如实施方式31或32所述的组合物，其中，所述第一报告探针包含连接至所述第一靶标结合配体的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
a.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链连接至所述第一靶标结合配体并且包含位于所述双链核酸的第一末端的单链toehold结构域(a)；以及
b.与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(x和b)，并且
其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
实施方式34：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
a.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含第一核酸第二杂交结构域，所述第一核酸第二杂交结构域连接至处于第一核酸第二杂交结构域的远端的单链toehold结构域(a)；以及
b.与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子和所述第一核酸第二链中的第二终止分子。
实施方式35：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第一核酸第一链包含连接至第一亚结构域的引物结合结构域(c*)，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)。
实施方式36：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第一核酸第一链包含连接至引物结合结构域(c*)的第一核酸第二杂交结构域，所述引物结合结构域(c*)连接至第一亚结构域，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)，其中，所述第一核酸第二杂交结构域与连接至所述第一靶标结合配体的连接链的第一核酸第一杂交结构域实质上互补。
实施方式37：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第二链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至toehold结构域(b)。
实施方式38：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第一核酸第二链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至toehold结构域(b)，所述toehold结构域(b)连接至toehold结构域(x)。
实施方式39：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第二报告探针包含连接至所述第二靶标结合配体的第二核酸，并包含与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补的toehold结构域(a*)。
实施方式40：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第二报告探针包含连接至所述第二靶标结合配体的第二核酸，并包含连接至toehold结构域(a*)的引物结合结构域(d*)，其中，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补。
实施方式41：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第二报告探针包含第二核酸第一链，所述第二核酸第一链连接至所述第二靶标结合配体，并且包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域，其中，所述toehold结构域(x)位于连接所述第二靶标结合配体的末端的远端；以及第二核酸第二链，所述第二核酸第二链包含连接至toehold结构域(a*)的第二核酸第二杂交结构域，其中，所述第二核酸第一杂交结构域和所述第二核酸第二杂交结构域实质上彼此互补。
实施方式42：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第二报告探针包含第二核酸第一链，所述第二核酸第一链连接至所述第二靶标结合配体，并包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域，其中，所述toehold结构域(x)位于连接所述第二靶标结合配体的末端的远端；以及第二核酸第二链，所述第二核酸第二链包含连接至引物结合结构域(d*)的第二核酸第二杂交结构域，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)。
实施方式43：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述封闭探针核酸包含位于连接所述封闭配体的末端的远端的toehold结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补。
实施方式44：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述封闭探针核酸包含连接至第二toehold结构域(x*)的第一toehold结构域(a)，其中，所述第二toehold结构域(x*)位于连接所述封闭配体的末端的远端，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第一报告探针和/或所述第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，并且其中，所述第一toehold结构域(a)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上相同。
实施方式45：一种用于检测样品中的靶标的组合物，所述组合物包含：
a.第一报告探针，所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体；以及
b.封闭探针，所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并连接至封闭探针核酸，并且
其中，所述第一核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在靶标的情况下杂交，
其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一核酸的一部分能够在不存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
实施方式46：如实施方式45所述的组合物，其中，所述第一核酸包含连接至所述第一靶标结合配体的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
a.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链连接至所述第一靶标结合配体，并且包含位于所述双链核酸的第一末端的单链toehold结构域(a)；以及
b.与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且
其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子和所述第一核酸第二链中的第二终止分子。
实施方式47：如实施方式41或42所述的组合物，其中，所述第一核酸第一链包含连接至第一亚结构域的引物结合结构域(c*)，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)。
实施方式48：如实施方式41-43中任一项所述的组合物，其中，所述第一核酸第一链包含连接至引物结合结构域(c*)的第一核酸第二杂交结构域，所述引物结合结构域(c*)连接至第一亚结构域，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)。
实施方式49：如实施方式41-44中任一项所述的组合物，其中，所述第一核酸第二链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至toehold结构域(b)，其中，所述toehold结构域与所述第一亚结构域(b*)实质上互补。
实施方式50：如实施方式41-45中任一项所述的组合物，其中，所述封闭探针核酸包含处于连接所述封闭配体的末端的远端的toehold结构域(a*)，其中，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补。
实施方式51：如实施方式41-46中任一项所述的组合物，其中，所述封闭探针核酸包含连接至toehold结构域(a*)的引物结合结构域(d*)，其中，所述toehold结构域(a*)位于连接所述封闭配体的末端的远端，其中，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补。
实施方式52：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第一靶标结合配体和所述封闭配体是结合对。
实施方式53：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第二靶标结合配体和所述封闭配体是结合对。
实施方式54：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第一靶标结合配体和/或所述第二靶标结合配体与封闭配体是受体与配体、核酸与核酸结合蛋白、抗体与抗原、抗体的抗原结合片段与抗原、抗体与Fc受体、抗体与蛋白A、适体与其结合靶标、或药物与其结合靶标。
实施方式55：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第一靶标结合配体和所述第二靶标结合配体相同。
实施方式56：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第一靶标结合配体和所述第二靶标结合配体不同。
实施方式57：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第一靶标结合配体为受体。
实施方式58：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第一靶标结合配体为受体，并且所述封闭配体为所述受体的配体。
实施方式59：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第二靶标结合配体是类别特异性抗体。
实施方式60：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第一报告探针的toehold结构域(x)和所述封闭探针的toehold结构域(x*)彼此杂交。
实施方式61：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第二报告探针的toehold结构域(a*)和所述封闭探针的toehold结构域(a)彼此杂交。
实施方式62：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第二报告探针的toehold结构域(x)和所述封闭探针的toehold结构域(x*)彼此杂交。
实施方式63：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述第一报告探针的toehold结构域(x)和所述封闭探针的toehold结构域(x*)彼此杂交，和/或其中，所述第二报告探针的toehold结构域(x)和所述封闭探针的toehold结构域(x*)彼此杂交。
实施方式64：一种用于检测样品中的靶标的组合物，所述组合物包含第一报告探针和第一封闭探针，其中：
i.所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体，其中，所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含连接至单链toehold结构域(a)的第一核酸第二杂交结构域(Lk1)，其中，所述toehold结构域(a)处于所述toehold结构域(x)的远端，并且其中，所述杂交结构域(Lk1)与杂交结构域(Lk1*)实质上互补；以及
2.与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；并且
ii.所述第一封闭探针包含第一封闭配体，所述第一封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并且连接至第一封闭探针核酸，其中，所述第一封闭探针核酸包含连接至第一封闭探针杂交结构域(Lk1)的toehold结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，其中，所述杂交结构域(Lk1)与所述第一报告探针的杂交结构域(Lk1*)实质上互补，并且其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针与所述第一封闭探针形成复合物；并且
其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
实施方式65：如实施方式64所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含第二报告探针，并且其中：
所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，其中，所述第二核酸包含第二核酸第一链、第二核酸第二链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含与所述第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)实质上互补的第二核酸第二杂交结构域(Lk2)，所述第二核酸第二杂交结构域(Lk2)连接至引物结合结构域(d*)，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补，并且其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够在所述靶标存在的情况下杂交。
实施方式66：如实施方式65所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含第二封闭探针，并且其中：
所述第二封闭探针包含第二封闭配体，所述第二封闭配体能够直接或间接地与所述第二靶标结合配体形成复合物，并且连接至第二封闭探针核酸，其中，所述第二封闭探针核酸包含连接至第二封闭配体杂交结构域(Lk2)的toehold结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，其中，所述杂交结构域(Lk2)与所述第二报告探针的杂交结构域(Lk2*)实质上互补，并且其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针与所述第二封闭探针形成复合物。
实施方式67：一种用于检测样品中的靶标的组合物，所述组合物包含第一报告探针和第一封闭探针，其中：
i.所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体，其中，所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含连接至单链toehold结构域(a)的第一核酸第二杂交结构域(Lk1)，其中，所述toehold结构域(a)处于杂交结构域(Lk1)的远端，并且其中，所述杂交结构域(Lk1)与杂交结构域(Lk1*)实质上互补；以及
2.与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述第一封闭探针包含第一封闭配体，所述第一封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并且连接至第一封闭探针核酸，其中，所述第一封闭探针核酸包含与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)；并且
其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
实施方式68：如实施方式67所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含第二报告探针，并且其中：
所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，其中，所述第二核酸包含第二核酸第一链、第二核酸第二链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含与所述第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)实质上互补的第二核酸第二杂交结构域(Lk2)，所述第二核酸第二杂交结构域(Lk2)连接至引物结合结构域(d*)，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补，并且其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够在所述靶标存在的情况下杂交。
实施方式69：如实施方式68所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含第二封闭探针，并且其中：
所述第二封闭探针包含第二封闭配体，所述第二封闭配体能够直接或间接地与所述第二靶标结合配体形成复合物，并连接至第二封闭探针核酸，其中，所述第二封闭探针核酸包含与所述第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针和所述第二封闭探针形成复合物。
实施方式70：如实施方式64-69中任一项所述的组合物，其中，所述第一核酸第一链包含连接至第一亚结构域的引物结合结构域(c*)，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)。
实施方式71：如实施方式64-70中任一项所述的组合物，其中，所述第一核酸第一链包含连接至引物结合结构域(c*)的杂交结构域(Lk1)，所述引物结合结构域(c*)连接至第一亚结构域，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)，其中，所述杂交结构域(Lk1)与连接至所述靶标结合配体的连接链的杂交结构域(Lk1*)实质上互补。
实施方式72：如实施方式64-71中任一项所述的组合物，其中，所述第一核酸第二链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至toehold结构域(b)。
实施方式73：如实施方式64-72中任一项所述的组合物，其中，所述第一核酸第二链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至toehold结构域(b)，所述toehold结构域(b)连接至toehold结构域(x)。
实施方式74：如实施方式64-73中任一项所述的组合物，其中，所述第二核酸第二链包含连接至引物结合结构域(d*)的第二核酸第二杂交结构域(Lk2)，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)。
实施方式75：如实施方式64-74中任一项所述的组合物，其中，所述第一靶标结合配体和所述第一封闭配体是结合对。
实施方式76：如实施方式64-75中任一项所述的组合物，其中，所述第二靶标结合配体和所述第二封闭配体是结合对。
实施方式77：如实施方式64-76中任一项所述的组合物，其中，所述第一靶标结合配体与所述第一封闭配体、和/或所述第二靶标结合配体与所述第二封闭配体为受体与配体、核酸与核酸结合蛋白、抗体与抗原、抗体的抗原结合片段与抗原、抗体与Fc受体、抗体与蛋白A、适体与其结合靶标、或药物与其结合靶标。
实施方式78：如实施方式64-77中任一项所述的组合物，其中，所述第一靶标结合配体和所述第二靶标结合配体相同。
实施方式79：如实施方式64-77中任一项所述的组合物，其中，所述第一靶标结合配体和所述第二靶标结合配体不同。
实施方式80：如实施方式64-79中任一项所述的组合物，其中，所述第一靶标结合配体为受体。
实施方式81：如实施方式64-80中任一项所述的组合物，其中，所述第一靶标结合配体为受体，并且所述第一封闭配体为所述受体的配体。
实施方式82：如实施方式64-81中任一项所述的组合物，其中，所述第二靶标结合配体为受体，并且所述第二封闭配体为所述受体的配体。
实施方式83：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含用于核酸扩增的一种或多种组分。
实施方式84：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含聚合酶。
实施方式85：如实施方式84所述的组合物，其中，所述聚合酶为链置换聚合酶。
实施方式86：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含dNTP。
实施方式87：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含盐。
实施方式88：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含缓冲液。
实施方式89：如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含所述靶标。
实施方式90：一种用于检测样品中的靶标的试剂盒，所述试剂盒包含：
a.第一报告探针，所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体；以及
b.封闭探针，所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并连接至封闭探针核酸，并且
其中，所述第一核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在靶标的情况下杂交，
其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
实施方式91：如实施方式82所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含：
第二报告探针，所述第二报告探针包含连接至第二核酸的第二靶标结合配体，其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够杂交，
其中，所述第二核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在靶标的情况下杂交。
实施方式92：如实施方式82或83所述的试剂盒，其中，所述第一核酸包含连接至所述靶标结合配体的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
a.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链连接至所述第一靶标结合配体，并且包含位于所述双链核酸的第一末端的单链toehold结构域(a)；以及
b.与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(x和b)，并且
其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子。
实施方式93：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体，并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
a.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含连接至位于所述第一核酸第二杂交结构域的远端的单链toehold结构域(a)的第一核酸第二杂交结构域；以及
b.与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子。
实施方式94：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一核酸第一链包含连接至第一亚结构域的引物结合结构域(c*)，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)。
实施方式95：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一核酸第一链包含连接至引物结合结构域(c*)的第一核酸第二杂交结构域，所述引物结合结构域(c*)连接至第一亚结构域，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)，其中，所述第一核酸第二杂交结构域与连接至所述第一靶标结合配体的连接链的第一核酸第一杂交结构域实质上互补。
实施方式96：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一核酸第二链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至toehold结构域(b)。
实施方式97：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一核酸第二链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至toehold结构域(b)，所述toehold结构域(b)连接至toehold结构域(x)。
实施方式98：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二报告探针包含连接至所述第二靶标结合配体的第二核酸，并且包含与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补的toehold结构域(a*)。
实施方式99：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二报告探针包含连接至所述第二靶标结合配体的第二核酸第一链，并包含连接至toehold结构域(a*)的引物结合结构域(d*)，其中，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补。
实施方式100：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二报告探针包含第二核酸第一链，所述第二核酸第一链连接至所述第二靶标结合配体，并包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域，其中，所述toehold结构域(x)位于连接所述第二靶标结合配体的末端的远端；以及第二核酸第二链，所述第二核酸第二链包含连接至toehold结构域(a*)的第二核酸第二杂交结构域，其中，所述第二核酸第一杂交结构域和所述第二核酸第二杂交结构域实质上彼此互补。
实施方式101：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二报告探针包含第二核酸第一链，所述第二核酸第一链连接至所述第二靶标结合配体，并包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域，其中，所述toehold结构域(x)位于连接所述第二靶标结合配体的末端的远端；以及第二核酸第二链，所述第二核酸第二链包含连接至引物结合结构域(d*)的第二核酸第二杂交结构域，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)。
实施方式102：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述封闭探针包含封闭探针核酸，所述封闭探针核酸包含位于连接所述封闭配体的末端的远端的toehold结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补。
实施方式103：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述封闭探针包含封闭探针核酸，所述封闭探针核酸包含连接至第二toehold结构域(x*)的第一toehold结构域(a)，其中，所述第二toehold结构域(x*)位于连接所述封闭配体的末端的远端，其中所述第二toehold结构域(x*)与所述第一报告探针和/或所述第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，并且其中，所述第一toehold结构域(a)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上相同。
实施方式104：一种用于检测样品中的靶标的试剂盒，所述试剂盒包含：
a.第一报告探针，所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体；以及
b.封闭探针，所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并连接至封闭探针核酸，并且
其中，所述第一核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在靶标的情况下杂交，
其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一核酸的一部分能够在不存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
实施方式105：如实施方式96所述的试剂盒，其中，所述第一核酸包含连接至所述第一靶标结合配体的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
a.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链连接至所述第一靶标结合配体，并且包含位于所述双链核酸的第一末端的单链toehold结构域(a)；以及
b.与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且
其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子。
实施方式106：如实施方式96或97所述的试剂盒，其中，所述第一核酸第一链包含连接至第一亚结构域的引物结合结构域(c*)，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)。
实施方式107：如实施方式96-98中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一核酸第一链包含连接至引物结合结构域(c*)的第一核酸第二杂交结构域，所述引物结合结构域(c*)连接至第一亚结构域，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)。
实施方式108：如实施方式96-99中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一核酸第二链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚区域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至toehold结构域(b)，其中，所述toehold结构域与所述第一亚结构域(b*)实质上互补。
实施方式109：如实施方式96-100中任一项所述的试剂盒，其中，所述封闭探针核酸包含位于连接所述封闭配体的末端的远端的toehold结构域(a*)，其中，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补。
实施方式110：如实施方式96-101中任一项所述的试剂盒，其中，所述封闭探针核酸包含连接至toehold结构域(a*)的引物结合结构域(d*)，其中，所述toehold结构域(a*)位于连接所述封闭配体的末端的远端，其中，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补。
实施方式111：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一靶标结合配体和所述封闭配体是结合对。
实施方式112：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二靶标结合配体和所述封闭配体是结合对。
实施方式113：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一靶标结合配体和/或所述第二靶标结合配体与所述封闭配体为受体与配体、核酸与核酸结合蛋白、抗体与抗原、抗体的抗原结合片段与抗原、抗体与Fc受体、抗体与蛋白A、适体与其结合靶标、或药物与其结合靶标。
实施方式114：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一靶标结合配体和所述第二靶标结合配体相同。
实施方式115：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一靶标结合配体和所述第二靶标结合配体不同。
实施方式116：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一靶标结合配体为受体。
实施方式117：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一靶标结合配体为受体，并且所述封闭配体为所述受体的配体。
实施方式118：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二靶标结合配体为类别特异性抗体。
实施方式119：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一报告探针的toehold结构域(x)和所述封闭探针的toehold结构域(x*)彼此杂交。
实施方式120：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二报告探针的toehold结构域(a*)和所述封闭探针的toehold结构域(a)彼此杂交。
实施方式121：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二报告探针的toehold结构域(x)和所述封闭探针的toehold结构域(x*)彼此杂交。
实施方式122：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一报告探针的toehold结构域(x)和所述封闭探针的toehold结构域(x*)彼此杂交，和/或其中，所述第二报告探针的toehold结构域(x)与所述封闭探针的toehold结构域(x*)彼此杂交。
实施方式123：一种用于检测样品中的靶标的试剂盒，所述试剂盒包含第一报告探针和第一封闭探针，其中：
i.所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体，其中，所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含连接至单链toehold结构域(a)的第一核酸第二杂交结构域(Lk1)，其中，所述toehold结构域(a)处于所述toehold结构域(x)的远端，并且其中，所述杂交结构域(Lk1)与杂交结构域(Lk1*)实质上互补；以及
2.与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；并且
ii.所述第一封闭探针包含第一封闭配体，所述第一封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并且连接至第一封闭探针核酸，其中，所述第一封闭探针核酸包含连接至第一封闭探针杂交结构域(Lk1)的toehold结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，其中，所述杂交结构域(Lk1)与所述第一报告探针的杂交结构域(Lk1*)实质上互补，并且其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针与所述第一封闭探针形成复合物；并且
其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
实施方式124：如实施方式123所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含第二报告探针，并且其中：
所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，其中，所述第二核酸包含第二核酸第一链、第二核酸第二链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含与所述第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)实质上互补的第二核酸第二杂交结构域(Lk2)，所述第二核酸第二杂交结构域(Lk2)连接至引物结合结构域(d*)，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补，并且其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够在所述靶标存在的情况下杂交。
实施方式125：如实施方式124所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含第二封闭探针，并且其中：
所述第二封闭探针包含第二封闭配体，所述第二封闭配体能够直接或间接地与所述第二靶标结合配体形成复合物，并且连接至第二封闭探针核酸，其中，所述第二封闭探针核酸包含连接至第二封闭探针杂交结构域(Lk2)的toehold结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，其中，所述杂交结构域(Lk2)与所述第二报告探针的杂交结构域的(Lk2*)实质上互补，并且其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针与所述第二封闭探针形成复合物。
实施方式126：一种用于检测样品中的靶标的试剂盒，所述试剂盒包含第一报告探针和第一封闭探针，其中：
i.所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体，其中，所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含连接至单链toehold结构域(a)的第一核酸第二杂交结构域(Lk1)，其中，所述toehold结构域(a)处于所述杂交结构域(Lk1)的远端，并且其中，所述杂交结构域(Lk1)与杂交结构域(Lk1*)实质上互补；以及
2.与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述第一封闭探针包含第一封闭配体，所述第一封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并且连接至第一封闭探针核酸，其中，所述第一封闭探针核酸包含与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)；并且
其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
实施方式127：如实施方式126所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含第二报告探针，并且其中：
所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，其中，所述第二核酸包含第二核酸第一链、第二核酸第二链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含与所述第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)实质上互补的第二核酸第二杂交结构域(Lk2)，所述第二核酸第二杂交结构域(Lk2)连接至引物结合结构域(d*)，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补，并且其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够在所述靶标存在的情况下杂交。
实施方式128：如实施方式127所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含第二封闭探针，并且其中：
所述第二封闭探针包含第二封闭配体，所述第二封闭配体能够直接或间接地与所述第二靶标结合配体形成复合物，并连接至第二封闭探针核酸，其中，所述第二封闭探针核酸包含与所述第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针和所述第二封闭探针形成复合物。
实施方式129：如实施方式123-129中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一核酸第一链包含连接至第一亚结构域的引物结合结构域(c*)，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)。
实施方式130：如实施方式123-129中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一核酸第一链包含连接至引物结合结构域(c*)的杂交结构域(Lk1)，所述引物结合结构域(c*)连接至第一亚结构域，所述第一亚结构域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至第二亚结构域(b)，所述第二亚结构域(b)连接至toehold结构域(a)，其中，所述杂交结构域(Lk1)与连接至所述第一靶标结合配体的连接链的杂交结构域(Lk1*)实质上互补。
实施方式131：如实施方式123-130中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一核酸第二链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚区域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至toehold结构域(b)。
实施方式132：如实施方式123-131中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一核酸第二链包含连接至第二亚结构域的第一亚结构域(b*)，所述第二亚区域连接至终止分子(·)，所述终止分子(·)连接至引物结构域(c)，所述引物结构域(c)连接至toehold结构域(b)，所述toehold结构域(b)连接至toehold结构域(x)。
实施方式133：如实施方式123-132中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二核酸第二链包含连接至引物结合结构域(d*)的第二核酸第二杂交结构域(Lk2)，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)。
实施方式134：如实施方式123-133中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一靶标结合配体和所述第一封闭配体是结合对。
实施方式135：如实施方式123-134中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二靶标结合配体和所述第二封闭配体是结合对。
实施方式136：如实施方式123-135中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一靶标结合配体与所述第一封闭配体和/或所述第二靶标结合配体与所述第二封闭配体是受体与配体、核酸与核酸结合蛋白、抗体与抗原、抗体的抗原结合片段与抗原、抗体与Fc受体、抗体与蛋白A、适体与其结合靶标、或药物与其结合靶标。
实施方式137：如实施方式123-136中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一靶标结合配体和所述第二靶标结合配体相同。
实施方式138：如实施方式123-137中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一靶标结合配体和所述第二靶标结合配体不同。
实施方式139：如实施方式123-138中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一靶标结合配体为受体。
实施方式140：如实施方式123-139中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一靶标结合配体为受体，并且所述第一封闭配体为所述受体的配体。
实施方式141：如实施方式123-140中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二靶标结合配体为受体，并且所述第二封闭配体为所述受体的配体。
实施方式142：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含用于核酸扩增的一种或多种组分。
实施方式143：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含聚合酶。
实施方式144：如实施方式143所述的试剂盒，其中，所述聚合酶为链置换聚合酶。
实施方式145：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含dNTP。
实施方式146：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含盐。
实施方式147：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包括缓冲液。
实施方式148：如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含靶标。
本文所述各个方面的一些实施方式由以下编号的实施方式表示：
实施方式1)一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
a.使所述样品与第一报告探针和封闭探针接触，其中：
i.所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体；
ii.所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并连接至封闭探针核酸，
iii.其中，所述第一核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在靶标的情况下杂交，
iv.其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
v.其中，所述第一核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在所述靶标的情况下延伸不超过一次；
b.提供聚合酶，从而产生所述第一报告探针和所述靶标之间的相互作用的核酸记录体；以及
c.检测所述核酸记录体。
实施方式2)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，
a.使所述样品与所述第一报告探针和所述封闭探针接触包括使所述样品与所述第一报告探针、第二报告探针和所述封闭探针接触，其中：
i.所述第一核酸包含双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链连接至所述第一靶标结合配体并且包含位于所述双链核酸的第一末端的单链toehold结构域(a)；以及
2.与所述第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(x和b)，并且
a.其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，所述第二核酸包含与所述第一报告探针的双链核酸的toehold结构域(a)实质上互补的toehold结构域(a*)，并且其中，所述靶标能与所述第一报告探针和第二报告探针同时结合；
iii.所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体和/或所述第二靶标结合配体形成复合物，并且连接至所述封闭探针核酸，其中，所述封闭探针核酸包含与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上相同的第一toehold结构域(a)，以及与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的第二toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针与所述封闭探针形成复合物，和/或其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针与所述封闭探针形成复合物。
实施方式3)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中：
a.使所述样品与所述第一报告探针和所述封闭探针接触包括使所述样品与所述第一报告探针、第二报告探针以及所述封闭探针接触，其中：
i.所述第一核酸包含双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链连接至所述第一靶标结合配体，并且包含位于所述双链核酸的第一末端的单链toehold结构域(a)；以及
2.与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(x和b)，并且
a.其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子和所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸第一链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；第二核酸第二链，所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含第二核酸第二杂交结构域，所述第二核酸第二杂交结构域与所述第二核酸第一杂交结构域实质上互补，并连接至引物结合结构域(d*)，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补；
iii.所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体和/或所述第二靶标结合配体形成复合物，并连接至所述封闭探针核酸，其中，所述封闭探针核酸包含与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针与所述封闭探针形成复合物，和/或其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针与所述封闭探针形成复合物。
实施方式4)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中：
a.使所述样品与所述第一报告探针和所述封闭探针接触包括使所述样品与所述第一报告探针、第二报告探针和所述封闭探针接触，其中：
i.所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含位于所述toehold结构域(x)的远端的单链toehold结构域(a)；以及
2.与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子和所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸第一链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的配对结构域(x)实质上相同的；第二核酸第二链，所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含与所述第二核酸第一杂交结构域实质上互补的第二核酸第二杂交结构域，所述第二核酸第二杂交结构域连接至引物结合结构域(d*)，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补；
iii.所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体和/或第二靶标结合配体形成复合物，并连接至所述封闭探针核酸，其中，所述封闭探针核酸包含与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针与所述封闭探针形成复合物，和/或其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针与所述封闭探针形成复合物。
实施方式5)一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
a.使所述样品与第一报告探针接触，其中：
i.所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体；
b.使所述样品与封闭探针接触，其中：
i.所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并连接至封闭探针核酸，
ii.其中，所述第一核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在靶标的情况下杂交，
iii.其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
iv.其中，所述第一核酸的一部分能够在不存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在存在所述靶标的情况下延伸不超过一次；
c.提供聚合酶，从而产生所述第一核酸和所述封闭探针核酸之间的相互作用的核酸记录体，如果所述相互作用存在的话；以及
d.检测所述核酸记录体的存在或不存在，并且其中，所述核酸记录体的不存在指示所述靶标存在于所述样品中。
实施方式6)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，
i.所述第一核酸包含双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链连接至所述第一靶标结合配体，并且包含位于所述双链核酸的第一末端的单链toehold结构域(a)；以及
2.与所述第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且
a.其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述封闭探针核酸包含：与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上相同的第一toehold结构域(a)；以及引物结合结构域(d*)。
实施方式7)一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
a.使所述样品与第一报告探针和第二报告探针接触，其中：
i.所述第一报告探针包含第一靶标结合配体，所述第一靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第一核酸，其中，所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含连接至单链toehold结构域(a)的第一核酸第二杂交结构域(Lk1)，其中，所述toehold结构域(a)处于所述杂交结构域(Lk1)的远端，并且其中，所述杂交结构域(Lk1)与杂交结构域(Lk1*)实质上互补；以及
2.与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，其中，所述第二核酸包含第二核酸第一链、第二核酸第二链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含与所述第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)实质上互补的第二核酸第二杂交结构域(Lk2)，所述第二核酸第二杂交结构域(Lk2)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补，
1.其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够在靶标存在的情况下杂交；
b.使所述样品与第一封闭探针和第二封闭探针接触，其中：
i.所述第一封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并且连接至封闭探针核酸，其中，所述第一封闭探针核酸包含连接至第一封闭探针杂交结构域(Lk1)的toehold结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，其中，所述杂交结构域(Lk1)与所述第一报告探针的杂交结构域(Lk1*)实质上互补，并且其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针与所述第一封闭探针形成复合物；以及
ii.所述第二封闭探针包含第二封闭配体，所述第二封闭配体能够直接或间接地与所述第二靶标结合配体形成复合物，并且连接至第二封闭探针核酸，其中，所述第二封闭探针核酸包含连接至第二封闭探针杂交结构域(Lk2)的toehold结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，其中，所述杂交结构域(Lk2)与所述第二报告探针的杂交结构域的(Lk2*)实质上互补，并且其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针与所述第二封闭探针形成复合物；
c.提供聚合酶，从而产生所述第一核酸和所述第二核酸之间的相互作用的核酸记录体，如果所述相互作用存在的话；以及
d.检测所述核酸记录体的存在或不存在，并且其中，所述核酸纪录体的存在指示所述靶标存在于所述样品中。
实施方式8)一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
a.使所述样品与第一报告探针和第二报告探针接触，其中：
i.所述第一报告探针包含第一靶标结合配体，所述第一靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第一核酸，其中，所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含连接至单链toehold结构域(a)的第一核酸第二杂交结构域(Lk1)，其中，所述toehold结构域(a)处于所述杂交结构域(Lk1)的远端，并且其中，所述杂交结构域(Lk1)与杂交结构域(Lk1*)实质上互补；以及
2.与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，其中，所述第二核酸包含第二核酸第一链、第二核酸第二链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含与所述第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)实质上互补的第二核酸第二杂交结构域(Lk2)，所述第二核酸第二杂交结构域(Lk2)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补，
1.其中，所述第一报告探针的toehold结构域(b)包含不存在于所述第一报告探针的杂交结构域(Lk1)和所述第二探针的杂交结构域(Lk2)中的核苷酸，并且
2.其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够在靶标存在的情况下杂交；
b.使所述样品与第一封闭探针和第二封闭探针接触，其中：
i.所述第一封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并且连接至封闭探针核酸，其中，所述封闭探针核酸包含与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针与所述第一封闭探针形成复合物，
1.；以及
ii.所述第二封闭探针包含第二封闭配体，所述第二封闭配体能够直接或间接地与所述第二靶标结合配体形成复合物，并连接至第二封闭探针核酸，其中，所述第二封闭探针核酸包含与所述第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针和所述第二封闭探针形成复合物；
c.提供聚合酶和第一dNTP混合物，其中，所述第一dNTP混合物实质上不含与如下的核苷酸互补的dNTP，所述核苷酸存在于所述第一报告探针的toehold结构域(b)中，但不存在于所述第一报告探针的杂交结构域(Lk1)和所述第二报告探针的杂交结构域(Lk2)中；
d.提供第二dNTP混合物以及可选的聚合酶，其中，所述第二dNTP混合物包含与如下的核苷酸互补的dTNP，所述核苷酸存在于所述第一报告探针的toehold结构域(a)或(b)中，但不存在于所述第一报告探针的杂交结构域(Lk1)和所述第二报告探针的杂交结构域(Lk2)中，从而产生所述第一核酸和所述第二核酸之间的相互作用的核酸记录体，如果所述相互作用存在的话；以及
e.检测所述核酸记录体的存在或不存在，并且其中，所述核酸纪录体的存在指示所述靶标存在于所述样品中。
实施方式9)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，提供所述聚合酶使所述核酸中的一种或多种延伸。
实施方式10)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括在检测核酸记录体的存在或不存在之前扩增所述核酸记录体，如果所述核酸记录体存在的话。
实施方式11)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述第一靶标结合配体和/或所述第二靶标结合配体与所述封闭配体为受体与配体、核酸与核酸结合蛋白、抗体与抗原、抗体的抗原结合片段与抗原、抗体与Fc受体、抗体与蛋白A、适体与其结合靶标、或药物与其结合靶标。
实施方式12)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述靶标为生物分子。
实施方式13)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述靶标为抗体、核酸、小分子或抗原。
实施方式14)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述靶标为中和抗体、抗原、刺突蛋白、核酸或小分子。
实施方式15)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述抗原包含在疫苗中，或者其中，所述抗原由疫苗编码。
实施方式16)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述样品为生物样品。
实施方式17)一种用于检测样品中的靶标的组合物，所述组合物包含：
a.第一报告探针，所述第一报告探针包含连接至第一核酸的靶标结合配体；以及
b.封闭探针，所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一报告探针的靶标结合配体形成复合物，并连接至封闭探针核酸，并且
c.其中，所述第一核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在靶标的情况下杂交，
d.其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
e.其中，所述第一核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
实施方式18)如前述实施方式中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含：
a.第二报告探针，所述第二报告探针包含连接至第二核酸的第二靶标结合配体，
b.其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够杂交，并且
c.其中，所述第二核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在靶标的情况下杂交。
实施方式19)一种用于检测样品中的靶标的组合物，所述组合物包含：
a.第一报告探针，所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体；以及
b.封闭探针，所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并连接至封闭探针核酸，并且
c.其中，所述第一核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在靶标的情况下杂交，
d.其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
e.其中，所述第一核酸的一部分能够在不存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
实施方式20)一种用于检测样品中的靶标的组合物，所述组合物包含第一报告探针和第一封闭探针，其中：
i.所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体，其中，所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含连接至单链toehold结构域(a)的第一核酸第二杂交结构域(Lk1)，其中，所述toehold结构域(a)处于所述toehold结构域(x)的远端，并且其中，所述杂交结构域(Lk1)与杂交结构域(Lk1*)实质上互补；以及
2.与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；并且
ii.所述第一封闭探针包含第一封闭配体，所述第一封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并且连接至第一封闭探针核酸，其中，所述第一封闭探针核酸包含连接至第一封闭探针杂交结构域(Lk1)的toehold结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，其中，所述杂交结构域(Lk1)与所述第一报告探针的杂交结构域(Lk1*)实质上互补，并且其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针与所述第一封闭探针形成复合物；并且
iii.其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
iv.其中，所述第一核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
实施方式21)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含第二报告探针，并且其中：
a.所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，其中，所述第二核酸包含第二核酸第一链、第二核酸第二链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含与所述第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)实质上互补的第二核酸第二杂交结构域(Lk2)，所述第二核酸第二杂交结构域(Lk2)连接至引物结合结构域(d*)，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补，并且其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够在所述靶标存在的情况下杂交。
实施方式22)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含第二封闭探针，并且其中：
a.所述第二封闭探针包含第二封闭配体，所述第二封闭配体能够直接或间接地与所述第二靶标结合配体形成复合物，并且连接至第二封闭探针核酸，其中，所述第二封闭探针核酸包含连接至第二封闭探针杂交结构域(Lk2)的toehold结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，其中，所述杂交结构域(Lk2)与所述第二报告探针的杂交结构域(Lk2*)实质上互补，并且其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针与所述第二封闭探针形成复合物。
实施方式23)一种用于检测样品中的靶标的组合物，所述组合物包含第一报告探针和第一封闭探针，其中：
i.所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体，其中，所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含连接至单链toehold结构域(a)的第一核酸第二杂交结构域(Lk1)，其中，所述toehold结构域(a)处于杂交结构域(Lk1)的远端，并且其中，所述杂交结构域(Lk1)与杂交结构域(Lk1*)实质上互补；以及
2.与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述第一封闭探针包含第一封闭配体，所述第一封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并且连接至第一封闭探针核酸，其中，所述第一封闭探针核酸包含与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)；并且
iii.其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
iv.其中，所述第一核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
实施方式24)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含第二报告探针，并且其中：
a.所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，其中，所述第二核酸包含第二核酸第一链、第二核酸第二链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含与所述第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)实质上互补的第二核酸第二杂交结构域(Lk2)，所述第二核酸第二杂交结构域(Lk2)连接至引物结合结构域(d*)，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补，并且其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够在所述靶标存在的情况下杂交。
实施方式25)如前述实施方式中任一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含第二封闭探针，并且其中：
a.所述第二封闭探针包含第二封闭配体，所述第二封闭配体能够直接或间接地与所述第二靶标结合配体形成复合物，并连接至第二封闭探针核酸，其中，所述第二封闭探针核酸包含与所述第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针和所述第二封闭探针形成复合物。
实施方式26)一种用于检测样品中的靶标的试剂盒，所述试剂盒包含：
a.第一报告探针，所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体；以及
b.封闭探针，所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并连接至封闭探针核酸，并且
c.其中，所述第一核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在靶标的情况下杂交，
d.其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
e.其中，所述第一核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
实施方式27)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含：
a.第二报告探针，所述第二报告探针包含连接至第二核酸的第二靶标结合配体，其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够杂交，
b.其中，所述第二核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在靶标的情况下杂交。
实施方式28)一种用于检测样品中的靶标的试剂盒，所述试剂盒包含：
a.第一报告探针，所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体；以及
b.封闭探针，所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并连接至封闭探针核酸，并且
c.其中，所述第一核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在靶标的情况下杂交，
d.其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
e.其中，所述第一核酸的一部分能够在不存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
实施方式29)一种用于检测样品中的靶标的试剂盒，所述试剂盒包含第一报告探针和第一封闭探针，其中：
i.所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体，其中，所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含连接至单链toehold结构域(a)的第一核酸第二杂交结构域(Lk1)，其中，所述toehold结构域(a)处于所述toehold结构域(x)的远端，并且其中，所述杂交结构域(Lk1)与杂交结构域(Lk1*)实质上互补；以及
2.与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；并且
ii.所述第一封闭探针包含第一封闭配体，所述第一封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并且连接至第一封闭探针核酸，其中，所述第一封闭探针核酸包含连接至第一封闭探针杂交结构域(Lk1)的toehold结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，其中，所述杂交结构域(Lk1)与所述第一报告探针的杂交结构域(Lk1*)实质上互补，并且其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针与所述第一封闭探针形成复合物；并且
iii.其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
iv.其中，所述第一核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
实施方式30)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含第二报告探针，并且其中：
a.所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，其中，所述第二核酸包含第二核酸第一链、第二核酸第二链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含与所述第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)实质上互补的第二核酸第二杂交结构域(Lk2)，所述第二核酸第二杂交结构域(Lk2)连接至引物结合结构域(d*)，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补，并且其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够在所述靶标存在的情况下杂交。
实施方式31)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含第二封闭探针，并且其中：
a.所述第二封闭探针包含第二封闭配体，所述第二封闭配体能够直接或间接地与所述第二靶标结合配体形成复合物，并且连接至第二封闭探针核酸，其中，所述第二封闭探针核酸包含连接至第二封闭探针杂交结构域(Lk2)的toehold结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，其中，所述杂交结构域(Lk2)与所述第二报告探针的杂交结构域的(Lk2*)实质上互补，并且其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针与所述第二封闭探针形成复合物。
实施方式32)一种用于检测样品中的靶标的试剂盒，所述试剂盒包含第一报告探针和第一封闭探针，其中：
i.所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体，其中，所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
1.第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含连接至单链toehold结构域(a)的第一核酸第二杂交结构域(Lk1)，其中，所述toehold结构域(a)处于所述杂交结构域(Lk1)的远端，并且其中，所述杂交结构域(Lk1)与杂交结构域(Lk1*)实质上互补；以及
2.与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述第一封闭探针包含第一封闭配体，所述第一封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并且连接至第一封闭探针核酸，其中，所述第一封闭探针核酸包含与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)；并且
iii.其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
iv.其中，所述第一核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
实施方式33)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含第二报告探针，并且其中：
a.所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，其中，所述第二核酸包含第二核酸第一链、第二核酸第二链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含与所述第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)实质上互补的第二核酸第二杂交结构域(Lk2)，所述第二核酸第二杂交结构域(Lk2)连接至引物结合结构域(d*)，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补，并且其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够在所述靶标存在的情况下杂交。
实施方式34)如前述实施方式中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含第二封闭探针，并且其中：
a.所述第二封闭探针包含第二封闭配体，所述第二封闭配体能够直接或间接地与所述第二靶标结合配体形成复合物，并连接至第二封闭探针核酸，其中，所述第二封闭探针核酸包含与所述第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针和所述第二封闭探针形成复合物。
一些选定的定义
为方便起见，下文提供了在说明书、实施例和所附权利要求中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明，或从上下文中暗示，否则以下术语和短语包括以下提供的含义。除非另有明确说明，或从上下文中显而易见，否则以下术语和短语不排除该术语或短语在其所属领域中已经获得的含义。提供这些定义是为了帮助描述本文提供的方面的特定实施方式，而不旨在限制所要求保护的发明，因为本发明的范围仅由权利要求限制。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数形式，而复数术语应包括单数形式。
免疫学和分子生物学中常用术语的定义可在见于The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy，第19版，由Merck Sharp&Dohme Corp.出版，2011(ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S.Porter等(编)，The Encyclopedia of Molecular Cell Biologyand Molecular Medicine，由Blackwell Science Ltd.出版，1999-2012(ISBN9783527600908)；以及Robert A.Meyers(编)，Molecular Biology and Biotechnology:aComprehensive Desk Reference，由VCH Publishers,Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；Immunology by Werner Luttmann，由Elsevier出版，2006；Janeway's Immunobiology，Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver(编)，Taylor&Francis Limited，2014(ISBN0815345305,9780815345305)；Lewin's Genes XI，由Jones&Bartlett Publishers出版，2014(ISBN-1449659055)；Michael Richard Green和Joseph Sambrook，MolecularCloning:A Laboratory Manual，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，USA(2012)(ISBN 1936113414)；Davis等，Basic Methods inMolecular Biology，Elsevier Science Publishing,Inc.，New York，USA(2012)(ISBN044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology:DNA，Jon Lorsch(编)，Elsevier，2013(ISBN 0124199542)；Current Protocols in Molecular Biology(CPMB)，FrederickM.Ausubel(编)，John Wiley and Sons，2014(ISBN 047150338X,9780471503385)，CurrentProtocols in Protein Science(CPPS)，John E.Coligan(编)，John Wiley and Sons,Inc.，2005；以及Current Protocols in Immunology(CPI)(John E.Coligan,ADA MKruisbeek,David H Margulies,Ethan M Shevach,Warren Strobe(编)John Wiley andSons,Inc.，2003(ISBN 0471142735,9780471142737)，通过引用的方式将其内容以其整体全部并入本文。
如本文所用，“核酸”意指DNA、RNA，单链的、双链的或更高度聚集的杂交基序，以及它们的任何化学修饰。
如本文所用，术语“杂交”是指单链核酸或其区域与另一单链核酸或其区域(分子间杂交)或与同一核酸的另一单链区域(分子内杂交)形成氢键合的碱基对相互作用的现象。杂交受所涉及的碱基序列控制，互补的核碱基形成氢键，并且任何杂交体的稳定性由碱基对的身份(例如，G:C碱基对强于A:T碱基对)和连续碱基对的数量决定，互补碱基的更长的伸长段形成更稳定的杂交。
术语“实质上相同”意指两个以上的核苷酸序列具有至少65％、70％、80％、85％、90％、95％或97％相同的核苷酸。在一些实施方式中，“实质上相同”意指两个以上的核苷酸序列具有相同的核苷酸，即相同的核苷酸序列。
如本文所用，术语“互补”通常是指两组核酸之间的杂交配对或结合相互作用的潜能。按照经典的Watson-Crick碱基配对和非Watson-Crick碱基配对(如Wobble碱基配对和Hoogsteen碱基配对)，互补核酸能够通过氢键配对彼此结合。在一些实施方式中，两组核酸可以彼此100％互补。在其它实施方式中，两组核酸可以包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个不互补的核苷酸。在其它实施方式中，两组核酸可以至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％互补。在一些实施方式中，只要两组核酸能够形成稳定的或瞬时的复合物，它们就是互补的。如本文所用，“互补”序列还可以包括非Watson-Crick碱基对和/或由非天然和经修饰的核苷酸形成的碱基对，或完全由非Watson-Crick碱基对和/或由非天然和经修饰的核苷酸形成的碱基对形成，只要满足上述关于其杂交能力的要求。此类非Watson-Crick碱基对包括但不限于G:U Wobble或Hoogsteen碱基配对。
术语“实质上互补”意指两个以上的核苷酸序列至少65％、70％、80％、85％、90％、95％或97％互补。在一些实施方式中，“实质上互补”意指两个以上的核苷酸序列彼此100％互补。
当核酸被称为“双链的”时，本领域的技术人员理解的是，一对核酸链以氢键键合的螺旋排列的方式存在，例如，通常与DNA有关。除了双链寡核苷酸的100％互补形式外，本文所用的术语“双链”还意在包括那些包括诸如凸起和环形等结构特征的形式(参见Stryer，Biochemistry，第三版(1988)，出于所有目的通过引用的方式将其整体并入本文)。
“聚合酶”是指进行多核苷酸(例如DNA和/或RNA)的模板指导的合成的酶。该术语涵盖全长多肽和具有聚合酶活性的结构域两者。DNA聚合酶是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于从激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、嗜热高温球菌(Thermococcuslitoralis)和海栖热袍菌(Thermotoga maritime)分离或衍生的DNA聚合酶，或其经修饰形式。可商购的聚合酶的额外实例包括，但不限于：Klenow片段(New EnglandInc.)、Taq DNA聚合酶/>9°NTM DNA聚合酶(New England/>Inc.)、Deep VentTM DNA聚合酶(New England/>Inc.)、Manta DNA聚合酶Bst DNA聚合酶(New England/>Inc.)和phi29DNA聚合酶(NewEngland/>Inc)。聚合酶包括DNA依赖性聚合酶和RNA依赖性聚合酶(如逆转录酶)两者。已知DNA依赖性DNA聚合酶的至少五个家族，尽管大多数属于A、B和C家族。各家族之间几乎没有或没有序列相似性。大多数A家族聚合酶是单链蛋白，所述蛋白可以包含多种酶促功能，包括聚合酶、3'至5'外切核酸酶活性和5'至3'外切核酸酶活性。B家族聚合酶通常具有单个催化结构域以及辅助因子，所述催化结构域具有聚合酶和3'至5'外切核酸酶活性。C家族聚合酶通常是多亚基蛋白，具有聚合和3'至5'外切核酸酶活性。在大肠杆菌(E.coli)中，已发现三种类型的DNA聚合酶，即DNA聚合酶I(A家族)、II(B家族)和III(C家族)。在真核细胞中，三种不同的B家族聚合酶(DNA聚合酶α、δ和ε)牵涉于核复制，而A家族聚合酶(聚合酶γ)用于线粒体DNA复制。其它类型的DNA聚合酶包括噬菌体聚合酶。类似地，RNA聚合酶通常包括真核RNA聚合酶I、II和III，以及细菌RNA聚合酶以及噬菌体和病毒聚合酶。
如本文所用，术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用，以指代通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键相互连接的一系列氨基酸残基。术语“蛋白质”和“多肽”是指氨基酸的聚合物，包括经修饰的氨基酸(如磷酸化、糖化、糖基化等)和氨基酸类似物，无论其大小或功能如何。“蛋白质”和“多肽”通常用于提及相对大的多肽，而术语“肽”通常用于提及小的多肽，但这些术语在本领域的使用是重叠的。当提及基因产物及其片段时，术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。因此，示例性的多肽或蛋白质包括前述的基因产物、天然存在的蛋白质、同系物、直系同源物、旁系同源物、片段和其它等同物、变体、片段和类似物。
术语“抗体”泛指任何免疫球蛋白(Ig)分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分(即免疫特异性地结合抗原的含有抗原结合位点的分子)，由四个多肽链(两条重链(H)和两条轻链(L))或保留了Ig分子的必要表位结合特征的其任何功能性片段、突变体、变体或衍生物组成。此类突变体、变异体或衍生物的抗体形式是本领域中已知的。其非限制性的实施方式在下文中讨论，并且包括但不限于多种形式，包括全长抗体和其抗原结合部分；例如，包括免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人类抗体、人源化抗体、单链抗体、Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv抗体、由Fab表达库产生的片段、二硫键连接的Fv、scFv、单域抗体(dAb)、双价抗体(diabody)、多特异性抗体、双重特异性抗体(dual specificantibody)、抗独特型抗体(anti-idiotypic antibody)、双特异性抗体(bispecificantibody)、其功能活性表位结合片段、双功能杂交抗体(例如，Lanzavecchia等，Eur.J.Immunol.17,105(1987))和单链(例如，Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85,5879-5883(1988)以及Bird等，Science 242,423-426(1988)，通过引用的方式并入本文)和/或以上任一种的抗原结合片段(通常参见Hood等，Immunology,Benjamin,N.Y.，第二版(1984)，Harlow和Lane，Antibodies.A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory(1988)以及Hunkapiller and Hood,Nature，323,15-16(1986)，通过引用的方式并入本文)。应该理解，抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。此外，抗体可以是人类抗体和/或人源化抗体。
如本文所用，“接触”是指用于递送或暴露本文提供的至少一种组分(例如，样品、靶标等)的任何合适手段。在一些实施方式中，接触包括人类的身体活动，例如注射；分配、混合和/或倾倒的动作；和/或对递送装置或机器的操纵。
如本文所用，术语“包括”或“包含”用于指组合物、方法及其各自的成分，其对于方法或组合物是必要的，但无论必要与否，对包含未指明的要素而言是开放的。
如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施方式所需的那些要素。该术语允许不实质影响本发明的该实施方式的基础特征和新颖性特征或功能性特征的额外要素的存在。
如本文所用，术语“延伸......至少两次”、“延伸......不超过一次”或“延伸”给定次数是指复数个核酸，其中绝大多数被“延伸......至少两次”、“延伸......不超过一次”或“延伸”所述给定次数。绝大多数可以是所述复数个的至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、或至少99.9％。该术语并不要求，但可以涵盖，复数个核酸中的每一个核酸(即所述复数个的100％)都如此地进行延伸。
除非上下文另有明确指示，单数术语“一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数指示物。类似地，除非上下文另有明确指示，否则词语“或”旨在包括“和”。尽管与本文提供的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或测试，但合适的方法和材料在下文描述。缩写“例如(e.g.)”源自拉丁文exempli gratia，并在本文中用于指示非限制性实例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”是同义的。
本文所公开的本发明的替代性要素或实施方式的分组不应解释为限制。各组的成员可以单独地提及和请求保护，或与该组的其它成员或本文出现的其它要素任意组合地提及和请求保护。出于方便和/或可专利性的原因，组的一个或多个成员可被包括在组中，或从组中删除。当发生任何此类的包含或删除时，本文认为本申请文件包含经修饰的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数形式，并且复数术语应包括单数形式。
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在提供了数值范围的情况下，该范围的上限和下限之间的各个数值均在考虑之列并在本文中公开。
尽管本文已经详细描绘和描述了优选的实施方式，但对于相关领域的技术人员来说将显而易见的是，可以在不背离本发明精神的情况下进行各种修改、添加、替换等，并且这些因此被认为落入后文的权利要求中所定义的本发明的范围内。此外，在尚未指出的范围内，本领域普通技术人员将理解，本文描述和说明的各个实施方式中的任何一个可被进一步修改，以并入本文公开的任何其它实施方式中所示的特征。
对本公开的实施方式的描述并不旨在穷举或将本公开限制为所公开的精确形式。虽然本文出于说明的目的公开了本公开的具体实施方式和实例，但相关领域的技术人员将认识到，在本公开的范围内的各种等同的修改是可能的。例如，虽然方法步骤或功能以给定的顺序呈现，但替代性实施方式可以以不同的顺序执行功能，或者可以基本上同时执行功能。本文提供的公开内容的教导可以适当地应用于其它程序或方法。本文公开的各种实施方式可以组合，以提供进一步的实施方式。如有必要，可修改本公开的各个方面以采用上述参考文献和申请的组合物、功能和概念来提供本公开的再进一步的实施方式。
任何前述实施方式的特定要素可以被其它实施方式中的要素组合或替换。此外，虽然与本公开的某些实施方式相关的益处已经在这些实施方式的上下文中进行了描述，但其它实施方式也可能表现出这样的益处，而且并非所有实施方式都需要必须表现出这样的益处才落入本公开的范围内。
对于相关领域的技术人员来说将显而易见的是，可以在不改变本发明的精神或范围的情况下进行各种修改、添加、替换等，并且这种修改和变化被包括在后文的权利要求书中所定义的本发明的范围内。
实施例
提供实施例仅出于说明目的，而非限制本文提供的权利要求的范围。
以下实施例的一般方法和材料如下：
干血斑(DBS)样品制备：使用手动DBS打孔器或半自动DBS打孔器获得6mm的DBS打孔，并将其置于1.5mL的管中。打孔器在样品之间通过对空白卡纸打孔五次进行清洁。在每个管中加入500μL DBS洗脱缓冲液，并在37℃下以500rpm的晃动，将样品洗脱1小时。DBS洗脱缓冲液含有1×PBS中0.2×蛋白酶抑制剂、1％的BSA、0.2％的NP40。将DBS洗脱液在10,000×g下旋转沉降10分钟，并对各个样品收集400μL上清液。
SARS-CoV-2S1蛋白检测SPEAR测定：在实施例12和13中，将靶向S1蛋白的两种可商购的单克隆抗体与SPEAR DNA序列S和P缀合。将来自SARS-CoV-2疫苗接种者的DBS洗脱液与SPEAR探针在37℃下孵育1小时，随后进行酶促反应和qPCR扩增。酶促反应前没有添加加热步骤。
SARS-CoV-2Pan-IgG结合SPEAR测定：在实施例1、2、3、11和13中，将Fc标记的SARS-CoV-2S1蛋白与SPEAR DNA序列S或P缀合。将来自SARS-CoV-2疫苗接种者的DBS洗脱液与SPEAR探针在25℃下孵育1小时，随后如上所述地进行酶促反应和qPCR。酶促反应前没有添加加热步骤。在纵向实验中，使用DBS洗脱缓冲液将来自经接种疫苗的受试者的DBS样品进一步稀释50倍。
SARS-CoV-2中和抗体检测测定：在实施例2、5、6、7、9、10、13和14中，将缀合SPEARDNA序列S的S1蛋白与样品在4℃下孵育过夜或在室温下孵育2小时，以使样品中的抗体结合S1蛋白。然后将缀合SPEAR DNA序列P的ACE2蛋白与样品在室温下孵育30分钟，以使ACE2蛋白与抗体竞争S1蛋白的结合。随后进行酶促反应以生成SPEAR DNA信号分子。样品含有的中和抗体越多，能结合S1蛋白的ACE2蛋白就越少，从而给出较低的SPEAR信号。阳性对照样品含有1nM的R2B17抗体(单克隆SARS-CoV-2中和抗体，Genscript)，而阴性对照样品只含有样品稀释缓冲液但没有抗体，用来代表0％的抑制。使用如下等式，由样品和阴性对照样品之间的SPEAR信号差异来计算样品的抑制：
对于定量中和滴度的测量，将样品系列稀释(DBS样品按1:2稀释从2到256倍，并且血清/血浆样品按1:4稀释从10到163840倍)，并用4PL Sigmoidal拟合来绘制抑制曲线，并使用Prism 9从曲线计算出50％抑制的稀释倍数(即NT50)。全血中最终的NT50是通过将内插的NT50乘以50得出的。乘数50是通过估计6mm DBS打孔含有～10μL血液并在500μL DBS洗脱缓冲液中洗脱而得。
使用ELISA进行的抗体结合检测：在实施例1、7和11中，靶向SARS-CoV-2RBD蛋白的单克隆抗体购自Genscript。将Fc标记的RBD蛋白以1μg/mL在4℃下包被在MaxiSorpTM 96孔ELISA板上过夜。洗涤后，在室温下用测定稀释液封闭该板1小时。在SARS-CoV-2抗体阴性的DBS洗脱液中以1:4系列稀释RBD靶向抗体，从8μg/mL开始。将样品在室温下与RBD包被的板孵育1小时，然后进行洗涤并在室温下进行缀合HRP的二抗的孵育1小时(抗人1:10000，抗小鼠1:25000，抗兔1:10000)。底物反应在暗处进行15分钟，用酶标仪在450nm处测量样品的吸光度。
CPassTM SARS-CoV-2中和抗体检测测定：在实施例8中，CPassTM试剂盒购自Genscript，并遵循供应商的方案。简而言之，用封闭缓冲液(ELISA测定稀释液)在室温下封闭ACE2包被的板1小时。以1:9的体积比用样品稀释缓冲液稀释样品和对照。然后将样品与缀合HRP的RBD蛋白在37℃下孵育30分钟，随后与ACE2板在37℃下孵育15分钟。洗涤后，加入TMB溶液进行底物反应15分钟，并用酶标仪在450nm处测量样品的吸光度。
蚀斑减少中和试验(PRNT)和基于假病毒的中和测定
PRNT：在实施例9和14中，PRNT测定由Corgenix,Inc.(Broomfield，CO，USA)进行。具体而言，将Vero E6细胞维持在六孔板中，并将SARS-CoV-2病毒(WA01/2020分离株)稀释到约2000pfu/mL(在血清/血浆样品中以1:1的比例稀释后，最终病毒浓度为～1000pfu/mL)。SARS-CoV-2疫苗接种者的血清/血浆样品用BA-1培养基从1:5到1:10240以2倍进行系列稀释(即，与病毒溶液混合后1:10到1:20480)。血清/血浆样品与病毒按1:1的比例混合，并在37℃下孵育1小时。将血清/血浆-病毒混合物添加到Vero E6细胞上，并在37℃下孵育45分钟，每15分钟进行摇动以分配培养基。然后在细胞单层上覆盖细胞培养基中的1％的琼脂糖，在37℃下孵育24小时。在第一层上面形成含有1％琼脂糖和0.005％中性红的第二层，并将样品在37℃下孵育24小时。对每个孔中的蚀斑数量进行计数。对于每个测定，包括三个阴性对照样品和一个阳性对照样品。用下面的等式计算各个稀释度的抑制值，并且用4PLsigmoidal拟合对抑制与稀释倍数的曲线进行拟合来计算50％抑制(NT50)。
基于假病毒的中和测定：在实施例8中，在室内产生假病毒(SARS-CoV-2-刺突-假型HIV病毒粒)，并且如Si等中所述地完成中和测定(A human-airway-on-a-chip for therapid identification of candidate antiviral therapeutics andprophylactics.Nat Biomed Eng 5,815-829(2021))。血清/血浆样品在1×PBS中含有1％BSA的样品稀释缓冲液中以2倍系列稀释，从1:2到1:256(混合病毒和细胞后，最终稀释倍数为1:20到1:2560)。将20μL样品与80μL病毒溶液(MOI＝0.1)混合，并在37℃下孵育30分钟。然后将混合物与含有20,000个ACE2-293T细胞的100μL培养基混合，并在37℃下孵育72小时。使用Bright-GloTM荧光素酶测定系统测量反映宿主细胞中的假病毒颗粒数量的荧光素酶活性。
实施例1.抗SARS-CoV-2抗体测定(抗体R2B17)。
图13示出了由单克隆抗体R2B17证实的抗SARS-COV-2-RBD抗体测定。其中两个RBD缀合物结合至抗RBD mAb的测定的基本构建体产生PCR可扩增的序列d*a*b*c*。与使用相同的RBD蛋白作为捕获抗原的传统ELISA测定相比，SPEAR(连续邻近延伸扩增反应)测定以仅1％的样品体积实现了高1000倍的敏感性。特别是，该结合测定显示出五个数量级的线性范围以及重复之间的最小变化。
实施例2.抗SARS-CoV-2抗体测定(多种抗体)。
图14是示出通过14种单克隆抗体进行的抗SARS-COV-2-RBD抗体测定测试的条形图。只有一种抗体由于测定中使用的RBD重组蛋白序列而没有响应。
实施例3.抗SARS-CoV-2抗体测定(单一抗体)。
图15是示出了在室温下孵育2h后，人ACE2缀合物(50nM)和SARS-COV-2RBD缀合物(5pM/10pM)之间可实现高结合产率的条形图。
实施例4.抗SARS-CoV-2抗体测定(多种抗体)。
图18是示出了对针对SARS-CoV-2刺突蛋白的各种中和抗体与非中和抗体的示例性测定响应的条形图。具体而言，将1nM单克隆抗体用于与ACE2蛋白竞争，以结合SAR-Cov-2S1蛋白。对照样品中没有添加抗体。ΔCq是指含有抗体的样品和对照样品之间的qPCR循环差异。该测定在区分各种抗体的中和能力方面显示出高特异性。
实施例5.抗SARS-CoV-2抗体测定(R2B17和R2B12)。
图19A是示出了在不同浓度下两种抗SARS-Cov2单克隆抗体的中和能力的测量的线状图。R2B17为中和抗体，而R2B12为非中和抗体。将抗体从1nM稀释到244fM，并且对照样品不含抗体。ΔCt是指含有抗体的样品和对照样品之间的qPCR循环差异。
实施例6.SARS-CoV-2阴性供体、恢复的患者和接种疫苗的患者中的中和抗体。
图19B是示出了对于收集自未接种疫苗的健康供体(即阴性)、从SARS-Cov2感染中康复的患者和经接种疫苗的患者(Moderna，两剂)的干血斑样品的根据本公开的实施方式的测定性能的点图。对每个干血斑样品，打孔6mm的斑，并用500μL洗脱缓冲液洗脱。该测定被证明能够从所有康复的患者样品和经接种疫苗的供体样品中检测到中和抗体。
实施例7.抗SARS-CoV-2抗体测定的特异性和敏感性。
图21A-图21C是示出了对于抗SARS COV2中和抗体检测的SPEAR-NAb特异性和敏感性的线形图。(图21A)在ELISA上测试了具有不同中和能力的六种抗SARS COV2单克隆抗，并显示出与S1的良好和相似的结合亲和力。从250nM以4倍稀释对这些抗体进行SPEAR-NAb测试，并能够区分具有不同中和能力的抗SARS COV2抗体。(图21B)具有高的经报道的中和能力的抗体(R2B12、R2B17和5B7D7)显示出比非中和对应物(9B1E8、R1B8和R2B12)显著更高的信号抑制。(图21C)与可商购的CPASS测定相比，SPEAR的敏感性提高了两个等级。
实施例8.SPEAR-Nab、CPASS和PsVNA测定的比较。
图23A-图23C是示出了SPEAR-NAb与CPASS、PsVNA在阴性、经感染患者和经接种疫苗的供体的DBS样品的中和测量方面的比较的线形图。图23A和图23B证明了SPEAR-NAb在明确区分经接种疫苗和经感染的患者样品与阴性样品(未感染且未接种疫苗)方面的优异敏感性(100％)和特异性(100％)，所有经接种疫苗的样品(n＝21)高于患者样品的总平均值(n＝19)，并且患者样品高于阴性受试者的总平均值(n＝22)；而CPASS和PsVNA通过DBS样品不良地区分疫苗与患者样品，以及疫苗/患者样品与阴性受试者。图23C是对10个经接种疫苗的DBS样品以2倍稀释进行的中和滴度测量。SPEAR-Nab对所有疫苗样品的跨滴度变化测量很敏感(高达256×)，并且能够定量跨疫苗样品的NT50。相比之下，CPass和PsVNA在2×稀释下显示出低得多的抑制，并且在8×稀释下无法从所有DBS样品中检测到中和抗体。
实施例9.SPEAR-NAb对血清、血浆和DBS样品的一致性测量。
图24是示出了SPEAR-NAb对血清、血浆和DBS样品的一致性测量的线形图。通过SPEAR-Nab在DBS和血清/血浆样品之间观察到优异的一致性(R2＝0.9788)。阴影区域示出了简单线性回归的90％置信区间。
实施例10.针对各种SARS-CoV-2毒株的中和滴度。
图25是示出SPEAR-NAb从单个DBS样品测量经接种疫苗的供体(n＝37)针对SARS-COV-2野生型(WT)和从英国(UK)、南非(SA)和巴西(BZ)鉴定的不同变体的中和滴度方面的点图和线形图。50％抑制处的中和滴度(NT50)是从每个样品的8×2倍稀释进行插值而得出的。红色条/线示出了几何平均滴度(GMT)。左子图显示，与WT相比，变体的NT50较低(UK(B.1.1.7)>SA(B.1.351)>BZ(P.1))。右子图上示出了每个个体的变体测量，并观察到S1变体的NT50的类似下降。统计显著性检验是Friedman检验和随后的Dunn's多重比较。
实施例11.SPEAR-NAb相对ELISA Pan-IgG测定。
图26是显示通过SPEAR进行的SARS-COV2 Pan-IgG测定的线形图和点图。SPEAR在宽动态范围内以低fM通过S1缀合的SPEAR探针在定量抗SARS COV2单克隆抗体(R2B17)方面表现出高敏感性，与ELISA相比，敏感性提高了四个等级(左子图)。来自疫苗受试者和康复患者的DBS样品与阴性DBS样品(未感染和未接种疫苗的供体)完全区分(100％敏感性和100％特异性)。
实施例12.S蛋白的表达测试。
图27是示出通过SPEAR进行的S蛋白表达测定的点图。SPEAR使用与不同S1结合表位的两种抗SARS COV2单克隆抗体缀合的探针，在宽动态范围内以低fM在定量S蛋白方面良好地运行。SPEAR能够以优异的特异性从经接种疫苗的供体(第一剂后的第2天或第3天)的DBS样品中检测到S1的fM拷贝。
实施例13.对单个DBS样品进行的多种测定。
图28是示出了可对单个DBS样品进行多种测定的一系列点图。通过SPEAR/SPEAR-Nab进行关于S蛋白、Pan-IgG和中和抗体测量的经接种疫苗的受试者(Moderna/Pfizer)的纵向研究。在第一次和第二次接种之前和接种之后，对四名经接种疫苗的受试者的DBS样品进行随时间进程的测量。SPEAR显示了S1随时间的不同谱图，其中对于所有四个个体，在第一剂后约3天观察到初始的峰，并且当Pan-IgG和中和抗体出现上升时，峰变平。对Pan-IgG和中和抗体观察到类似的谱图，在第一次注射后第14天观察到第一个峰，并随着时间的推移逐渐降低，在第二剂后约9天观察到第二个峰。
实施例14.SPEAR-NAb对血清、血浆/血清和DBS的测量。
图29A和29B是示出了SPEAR-NAb对血清、血浆/血清(图29A)和DBS(图29B)样品的测量的线形图。对于血清/血浆样品，蚀斑减少中和试验(PRNT)和SPEAR-Nab之间观察到优异的一致性(R2＝0.9390)。PRNT血清/血浆样品和SPEAR-Nab DBS样品之间观察到优异的一致性(R2＝0.9175)。阴影区域示出了简单线性回归的90％置信区间。
实施例15：SPEAR非酶链置换法在测试中和与非中和抗体方面的表现。
图32是示出根据图31A和图31B中所示的工作流程的实施方式检测中和抗体与非中和抗体的条形图。将报告探针RBD缀合物的对与或不与SARS-CoV-2单克隆抗体(R2B17和R2B12，针对ACE2具有高和轻微中和能力)在4℃下孵育过夜，随后以0nM、50nM或200nM加入DNA缀合的ACE2或自由浮动的置换DNA链，在进行酶促反应前在室温下孵育30分钟。在不存在ACE2的情况下，中和抗体和非中和抗体表现出相当的信号。通过加入50nM和200nM ACE2，非中和抗体的循环阈值(Ct)高度地下降并几乎降至背景水平，而中和抗体的Ct却没有受到那么大的影响。在200nM ACE2时，中和抗体和非中和抗体之间观察到近5个循环的差异，或28倍的拷贝差异。这种差异主要是由ACE2和RBD的共定位引起的，这通过在相同的浓度下几乎没有观察到自由浮动链的泄漏而被证明。
出于提供和公开的目的，本申请的全文中引用的所有专利和其它出版物，包括参考文献、授权专利、已公开的专利申请和共同未决的专利申请通过引用的方式明确并入本文，例如在此类出版物中描述的可能与本文所述技术相关联使用的方法学。这些出版物仅由于其公开早于本申请的申请日而提供。这方面的任何内容都不应被理解为承认发明人没有资格借助于先前的发明或出于任何其它原因而将此类公开提前。所有关于这些文件的日期的声明或关于这些文件的内容的表述都是基于申请人可获得的信息，并不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。

Claims (34)

1.一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
a.使所述样品与第一报告探针和封闭探针接触，其中：
i.所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体；
ii.所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并连接至封闭探针核酸，
其中，所述第一核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在所述靶标的情况下杂交，
其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在所述靶标的情况下延伸不超过一次；
b.提供聚合酶，从而产生所述第一报告探针和所述靶标之间的相互作用的核酸记录体；以及
c.检测所述核酸记录体。
2.如权利要求1所述的方法，其中：
a.使所述样品与所述第一报告探针和所述封闭探针接触包括使所述样品与所述第一报告探针、第二报告探针和所述封闭探针接触，其中：
i.所述第一核酸包含双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
(1).第一核酸第一链，所述第一核酸第一链连接至所述第一靶标结合配体并且包含位于所述双链核酸的第一末端的单链toehold结构域(a)；以及
(2).与所述第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(x和b)，并且
其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，所述第二核酸包含与所述第一报告探针的双链核酸的toehold结构域(a)实质上互补的toehold结构域(a*)，并且其中，所述靶标能与所述第一报告探针和所述第二报告探针同时结合；
iii.所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体和/或所述第二靶标结合配体形成复合物，并连接至所述封闭探针核酸，其中，所述封闭探针核酸包含与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上相同的第一toehold结构域(a)，以及与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的第二toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针与所述封闭探针形成复合物，和/或其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针与所述封闭探针形成复合物。
3.如权利要求1所述的方法，其中：
a.使所述样品与所述第一报告探针和所述封闭探针接触包括使所述样品与所述第一报告探针、第二报告探针以及所述封闭探针接触，其中：
i.所述第一核酸包含双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
(1).第一核酸第一链，所述第一核酸第一链连接至所述第一靶标结合配体，并且包含位于所述双链核酸的第一末端的单链toehold结构域(a)；以及
(2).与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(x和b)，并且
其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子和所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸第一链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；第二核酸第二链，所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含第二核酸第二杂交结构域，所述第二核酸第二杂交结构域与所述第二核酸第一杂交结构域实质上互补，并连接至引物结合结构域(d*)，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补；
iii.所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体和/或所述第二靶标结合配体形成复合物，并连接至所述封闭探针核酸，其中，所述封闭探针核酸包含与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针与所述封闭探针形成复合物，和/或其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针与所述封闭探针形成复合物。
4.如权利要求1所述的方法，其中：
a.使所述样品与所述第一报告探针和所述封闭探针接触包括使所述样品与所述第一报告探针、第二报告探针和所述封闭探针接触，其中：
i.所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
(1).第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含位于所述toehold结构域(x)的远端的单链toehold结构域(a)；以及
(2).与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子和所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸第一链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的配对结构域(x)实质上相同的；第二核酸第二链，所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含与所述第二核酸第一杂交结构域实质上互补的第二核酸第二杂交结构域，所述第二核酸第二杂交结构域连接至引物结合结构域(d*)，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补；
iii.所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体和/或第二靶标结合配体形成复合物，并连接至所述封闭探针核酸，其中，所述封闭探针核酸包含与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针与所述封闭探针形成复合物，和/或其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针与所述封闭探针形成复合物。
5.一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
a.使所述样品与第一报告探针接触，其中：
i.所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体；
b.使所述样品与封闭探针接触，其中：
i.所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并连接至封闭探针核酸，
其中，所述第一核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在所述靶标的情况下杂交，
其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一核酸的一部分能够在不存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在存在所述靶标的情况下延伸不超过一次；
c.提供聚合酶，从而产生所述第一核酸和所述封闭探针核酸之间的相互作用的核酸记录体，如果所述相互作用存在的话；以及
d.检测所述核酸记录体的存在或不存在，并且其中，所述核酸记录体的不存在指示所述靶标存在于所述样品中。
6.如权利要求5所述的方法，其中：
i.所述第一核酸包含双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
(1).第一核酸第一链，所述第一核酸第一链连接至所述第一靶标结合配体，并且包含位于所述双链核酸的第一末端的单链toehold结构域(a)；以及
(2).与所述第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且
其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述封闭探针核酸包含：与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上相同的第一toehold结构域(a)；以及引物结合结构域(d*)。
7.一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
a.使所述样品与第一报告探针和第二报告探针接触，其中：
i.所述第一报告探针包含第一靶标结合配体，所述第一靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第一核酸，其中，所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
(1).第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含连接至单链toehold结构域(a)的第一核酸第二杂交结构域(Lk1)，其中，所述toehold结构域(a)处于所述杂交结构域(Lk1)的远端，并且其中，所述杂交结构域(Lk1)与所述杂交结构域(Lk1*)实质上互补；以及
(2).与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，其中，所述第二核酸包含第二核酸第一链、第二核酸第二链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含与所述第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)实质上互补的第二核酸第二杂交结构域(Lk2)，所述第二核酸第二杂交结构域(Lk2)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补，
其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够在所述靶标存在的情况下杂交；
b.使所述样品与第一封闭探针和第二封闭探针接触，其中：
i.所述第一封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并且连接至封闭探针核酸，其中，所述第一封闭探针核酸包含连接至第一封闭探针杂交结构域(Lk1)的toehold结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，其中，所述杂交结构域(Lk1)与所述第一报告探针的杂交结构域(Lk1*)实质上互补，并且其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针与所述第一封闭探针形成复合物；以及
ii.所述第二封闭探针包含第二封闭配体，所述第二封闭配体能够直接或间接地与所述第二靶标结合配体形成复合物，并且连接至第二封闭探针核酸，其中，所述第二封闭探针核酸包含连接至第二封闭探针杂交结构域(Lk2)的toehold结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，其中，所述杂交结构域(Lk2)与所述第二报告探针的杂交结构域的(Lk2*)实质上互补，并且其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针与所述第二封闭探针形成复合物；
c.提供聚合酶，从而产生所述第一核酸和所述第二核酸之间的相互作用的核酸记录体，如果所述相互作用存在的话；以及
d.检测所述核酸记录体的存在或不存在，并且其中，所述核酸纪录体的存在指示所述靶标存在于所述样品中。
8.一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
a.使所述样品与第一报告探针和第二报告探针接触，其中：
i.所述第一报告探针包含第一靶标结合配体，所述第一靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第一核酸，其中，所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
(1).第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含连接至单链toehold结构域(a)的第一核酸第二杂交结构域(Lk1)，其中，所述toehold结构域(a)处于所述杂交结构域(Lk1)的远端，并且其中，所述杂交结构域(Lk1)与所述杂交结构域(Lk1*)实质上互补；以及
(2).与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，其中，所述第二核酸包含第二核酸第一链、第二核酸第二链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含与所述第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)实质上互补的第二核酸第二杂交结构域(Lk2)，所述第二核酸第二杂交结构域(Lk2)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补，
其中，所述第一报告探针的toehold结构域(b)包含不存在于所述第一报告探针的杂交结构域(Lk1)和所述第二探针的杂交结构域(Lk2)中的核苷酸，并且
其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够在所述靶标存在的情况下杂交；
b.使所述样品与第一封闭探针和第二封闭探针接触，其中：
i.所述第一封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并且连接至封闭探针核酸，其中，所述封闭探针核酸包含与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针与所述第一封闭探针形成复合物；以及
ii.所述第二封闭探针包含第二封闭配体，所述第二封闭配体能够直接或间接地与所述第二靶标结合配体形成复合物，并连接至第二封闭探针核酸，其中，所述第二封闭探针核酸包含与所述第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针和所述第二封闭探针形成复合物；
c.提供聚合酶和第一dNTP混合物，其中，所述第一dNTP混合物实质上不含与如下的核苷酸互补的dNTP，所述核苷酸存在于所述第一报告探针的toehold结构域(b)中，但不存在于所述第一报告探针的杂交结构域(Lk1)和所述第二报告探针的杂交结构域(Lk2)中；
d.提供第二dNTP混合物以及可选的聚合酶，其中，所述第二dNTP混合物包含与如下的核苷酸互补的dTNP，所述核苷酸存在于所述第一报告探针的toehold结构域(a)或(b)中，但不存在于所述第一报告探针的杂交结构域(Lk1)和所述第二报告探针的杂交结构域(Lk2)中，从而产生所述第一核酸和所述第二核酸之间的相互作用的核酸记录体，如果所述相互作用存在的话；以及
e.检测所述核酸记录体的存在或不存在，并且其中，所述核酸纪录体的存在指示所述靶标存在于所述样品中。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，提供所述聚合酶使所述核酸中的一种或多种延伸。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括在检测核酸记录体的存在或不存在之前扩增所述核酸记录体，如果所述核酸记录体存在的话。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述第一靶标结合配体和/或所述第二靶标结合配体与所述封闭配体为受体与配体、核酸与核酸结合蛋白、抗体与抗原、抗体的抗原结合片段与抗原、抗体与Fc受体、抗体与蛋白A、适体与其结合靶标、或药物与其结合靶标。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述靶标为生物分子。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述靶标为抗体、核酸、小分子或抗原。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述靶标为中和抗体、抗原、刺突蛋白、核酸或小分子。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述抗原包含在疫苗中，或者其中，所述抗原由疫苗编码。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，所述样品为生物样品。
17.一种用于检测样品中的靶标的组合物，所述组合物包含：
a.第一报告探针，所述第一报告探针包含连接至第一核酸的靶标结合配体；以及
b.封闭探针，所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一报告探针的靶标结合配体形成复合物，并连接至封闭探针核酸，并且
其中，所述第一核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在所述靶标的情况下杂交，
其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
18.如权利要求17所述的组合物，所述组合物进一步包含：
第二报告探针，所述第二报告探针包含连接至第二核酸的第二靶标结合配体，
其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够杂交，并且
其中，所述第二核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在所述靶标的情况下杂交。
19.一种用于检测样品中的靶标的组合物，所述组合物包含：
a.第一报告探针，所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体；以及
b.封闭探针，所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并连接至封闭探针核酸，并且
其中，所述第一核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在所述靶标的情况下杂交，
其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一核酸的一部分能够在不存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
20.一种用于检测样品中的靶标的组合物，所述组合物包含第一报告探针和第一封闭探针，其中：
i.所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体，其中，所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
(1).第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含连接至单链toehold结构域(a)的第一核酸第二杂交结构域(Lk1)，其中，所述toehold结构域(a)处于所述toehold结构域(x)的远端，并且其中，所述杂交结构域(Lk1)与所述杂交结构域(Lk1*)实质上互补；以及
(2).与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；并且
ii.所述第一封闭探针包含第一封闭配体，所述第一封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并且连接至第一封闭探针核酸，其中，所述第一封闭探针核酸包含连接至第一封闭探针杂交结构域(Lk1)的toehold结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，其中，所述杂交结构域(Lk1)与所述第一报告探针的杂交结构域(Lk1*)实质上互补，并且其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针与所述第一封闭探针形成复合物；并且
其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
21.如权利要求20所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含第二报告探针，并且其中：
所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，其中，所述第二核酸包含第二核酸第一链、第二核酸第二链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含与所述第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)实质上互补的第二核酸第二杂交结构域(Lk2)，所述第二核酸第二杂交结构域(Lk2)连接至引物结合结构域(d*)，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补，并且其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下杂交。
22.如权利要求21所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含第二封闭探针，并且其中：
所述第二封闭探针包含第二封闭配体，所述第二封闭配体能够直接或间接地与所述第二靶标结合配体形成复合物，并且连接至第二封闭探针核酸，其中，所述第二封闭探针核酸包含连接至第二封闭探针杂交结构域(Lk2)的toehold结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，其中，所述杂交结构域(Lk2)与所述第二报告探针的杂交结构域(Lk2*)实质上互补，并且其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针与所述第二封闭探针形成复合物。
23.一种用于检测样品中的靶标的组合物，所述组合物包含第一报告探针和第一封闭探针，其中：
i.所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体，其中，所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
(1).第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含连接至单链toehold结构域(a)的第一核酸第二杂交结构域(Lk1)，其中，所述toehold结构域(a)处于杂交结构域(Lk1)的远端，并且其中，所述杂交结构域(Lk1)与所述杂交结构域(Lk1*)实质上互补；以及
(2).与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述第一封闭探针包含第一封闭配体，所述第一封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并且连接至第一封闭探针核酸，其中，所述第一封闭探针核酸包含与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)；并且
其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
24.如权利要求24所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含第二报告探针，并且其中：
所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，其中，所述第二核酸包含第二核酸第一链、第二核酸第二链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含与所述第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)实质上互补的第二核酸第二杂交结构域(Lk2)，所述第二核酸第二杂交结构域(Lk2)连接至引物结合结构域(d*)，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补，并且其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下杂交。
25.如权利要求25所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含第二封闭探针，并且其中：
所述第二封闭探针包含第二封闭配体，所述第二封闭配体能够直接或间接地与所述第二靶标结合配体形成复合物，并连接至第二封闭探针核酸，其中，所述第二封闭探针核酸包含与所述第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针和所述第二封闭探针形成复合物。
26.一种用于检测样品中的靶标的试剂盒，所述试剂盒包含：
a.第一报告探针，所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体；以及
b.封闭探针，所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并连接至封闭探针核酸，并且
其中，所述第一核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在所述靶标的情况下杂交，
其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
27.如权利要求27所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含：
第二报告探针，所述第二报告探针包含连接至第二核酸的第二靶标结合配体，其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够杂交，
其中，所述第二核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在所述靶标的情况下杂交。
28.一种用于检测样品中的靶标的试剂盒，所述试剂盒包含：
a.第一报告探针，所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体；以及
b.封闭探针，所述封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并连接至封闭探针核酸，并且
其中，所述第一核酸的一部分和所述封闭探针核酸的一部分能够在不存在所述靶标的情况下杂交，
其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一核酸的一部分能够在不存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
29.一种用于检测样品中的靶标的试剂盒，所述试剂盒包含第一报告探针和第一封闭探针，其中：
i.所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体，其中，所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
(1).第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含连接至单链toehold结构域(a)的第一核酸第二杂交结构域(Lk1)，其中，所述toehold结构域(a)处于所述toehold结构域(x)的远端，并且其中，所述杂交结构域(Lk1)与所述杂交结构域(Lk1*)实质上互补；以及
(2).与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；并且
ii.所述第一封闭探针包含第一封闭配体，所述第一封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并且连接至第一封闭探针核酸，其中，所述第一封闭探针核酸包含连接至第一封闭探针杂交结构域(Lk1)的toehold结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，其中，所述杂交结构域(Lk1)与所述第一报告探针的杂交结构域(Lk1*)实质上互补，并且其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述第一报告探针与所述第一封闭探针形成复合物；并且
其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
30.如权利要求29所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含第二报告探针，并且其中：
所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，其中，所述第二核酸包含第二核酸第一链、第二核酸第二链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含与所述第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)实质上互补的第二核酸第二杂交结构域(Lk2)，所述第二核酸第二杂交结构域(Lk2)连接至引物结合结构域(d*)，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补，并且其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下杂交。
31.如权利要求30所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含第二封闭探针，并且其中：
所述第二封闭探针包含第二封闭配体，所述第二封闭配体能够直接或间接地与所述第二靶标结合配体形成复合物，并且连接至第二封闭探针核酸，其中，所述第二封闭探针核酸包含连接至第二封闭探针杂交结构域(Lk2)的toehold结构域(x*)，其中，所述toehold结构域(x*)与所述第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补，其中，所述杂交结构域(Lk2)与所述第二报告探针的杂交结构域的(Lk2*)实质上互补，并且其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针与所述第二封闭探针形成复合物。
32.一种用于检测样品中的靶标的试剂盒，所述试剂盒包含第一报告探针和第一封闭探针，其中：
i.所述第一报告探针包含连接至第一核酸的第一靶标结合配体，其中，所述第一核酸包含：连接链，所述连接链连接至所述第一靶标结合配体并包含连接至toehold结构域(x)的第一核酸第一杂交结构域(Lk1*)；以及与所述连接链杂交的双链核酸，其中，所述双链核酸包含：
(1).第一核酸第一链，所述第一核酸第一链与连接至所述第一靶标结合配体的连接链杂交，并且包含连接至单链toehold结构域(a)的第一核酸第二杂交结构域(Lk1)，其中，所述toehold结构域(a)处于所述杂交结构域(Lk1)的远端，并且其中，所述杂交结构域(Lk1)与所述杂交结构域(Lk1*)实质上互补；以及
(2).与所述第一核酸第一链实质上互补的第一核酸第二链，所述第一核酸第二链与所述第一核酸第一链形成双链区(双链体区)，并包含位于所述双链核酸的第二末端的toehold结构域(b)，并且其中，所述双链核酸包含所述双链体区中的所述第一核酸第一链中的第一终止分子以及所述第一核酸第二链中的第二终止分子；
ii.所述第一封闭探针包含第一封闭配体，所述第一封闭配体能够直接或间接地与所述第一靶标结合配体形成复合物，并且连接至第一封闭探针核酸，其中，所述第一封闭探针核酸包含与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)；并且
其中，所述靶标对所述第一报告探针的结合抑制所述复合物的形成，并且
其中，所述第一核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下延伸至少两次以产生核酸记录体，并且在不存在所述靶标的情况下延伸不超过一次。
33.如权利要求32所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含第二报告探针，并且其中：
所述第二报告探针包含第二靶标结合配体，所述第二靶标结合配体能够结合所述靶标，并连接至第二核酸，其中，所述第二核酸包含第二核酸第一链、第二核酸第二链，所述第二核酸第一链包含连接至toehold结构域(x)的第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)，所述toehold结构域(x)与所述第一报告探针的toehold结构域(x)实质上相同；所述第二核酸第二链与所述第二核酸第一链杂交，并包含与所述第二核酸第一杂交结构域(Lk2*)实质上互补的第二核酸第二杂交结构域(Lk2)，所述第二核酸第二杂交结构域(Lk2)连接至引物结合结构域(d*)，所述引物结合结构域(d*)连接至toehold结构域(a*)，所述toehold结构域(a*)与所述第一报告探针的toehold结构域(a)实质上互补，并且其中，所述第一核酸的一部分和所述第二核酸的一部分能够在存在所述靶标的情况下杂交。
34.如权利要求33所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含第二封闭探针，并且其中：
所述第二封闭探针包含第二封闭配体，所述第二封闭配体能够直接或间接地与所述第二靶标结合配体形成复合物，并连接至第二封闭探针核酸，其中，所述第二封闭探针核酸包含与所述第二报告探针的toehold结构域(x)实质上互补的toehold结构域(x*)，并且其中，所述靶标对所述第二报告探针的结合抑制所述第二报告探针和所述第二封闭探针形成复合物。
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