CN116577398A - 电化学发光和比色双模式检测4-cec的电化学发光适配体传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于电化学发光检测领域，涉及一种用于检测合成卡西酮4‑CEC的电化学发光适配体传感器及其制备方法和应用，传感器能够通过电化学发光和比色对4‑CEC进行双模式检测。电化学发光适配体传感器由适配体apt负载于复合材料PCN‑224/SIOPCs修饰的导电玻璃FTO的表面而成；SIOPCs是以PS微球为模板和正硅酸乙酯为原料合成的SiO2反蛋白石光子晶体。电化学发光检测方法为apt/PCN‑224/SIOPCs/FTO修饰电极、Ag/AgCl电极、铂电极组成传统的三电极体系，比色检测以罗丹明B的紫外吸收峰值进行计算。本发明中适配体传感器对4‑CEC检测的灵敏度高，选择性好，线性范围宽。
Description
技术领域
本发明属于电化学发光检测领域，涉及一种电化学发光和比色双模式检测合成卡西酮4-CEC的电化学发光适配体传感器及其制备方法和应用，传感器能够通过电化学发光和比色对4-CEC进行双模式检测。
背景技术
合成卡西酮类(SCs)是一类基于卡西酮结构开发的人工合成毒品，属于新精神活性物质(NPS)中的一种，当其作用与人体时，会产生与苯丙胺类兴奋剂相似的作用。联合国毒品与犯罪问题办公室(UNODC)的报告指出，目前发现的NPS已经超过1000种，合成卡西酮约占其中的20％，是除合成大麻素之外的第二大类NPS。合成卡西酮类因外形与为白色晶体，故其经常以“浴盐”的标签被不法销售。过度强烈的兴奋作用使滥用者出现狂暴、幻觉、心悸等症状，严重时还会造成器官衰竭甚至死亡。随着此类“策划药”的滥用问题逐渐显现，各国的禁毒执法工作也面临更严峻的挑战。
目前检测合成卡西酮的方法主要有色谱质谱联用法(C-MS)和荧光光谱法(FL)等，但上述方法会受到仪器及测试条件的限制，因此简便快捷，高灵敏的检测方法成为大家关注的重点。近几年，电化学发光法(ECL)凭借低背景干扰，高灵敏度和宽检测范围等优点在痕量检测领域占据越来越重要的地位。现在，检测合成卡西酮4-CEC用三电极体系，电化学发光方法的报道还很少。
电化学发光(ECL)由于其低背景信号，高灵敏度和宽检测范围而在痕量分析领域占有重要地位。“signal-off”和“signal-on”都是ECL主要的检测模式，但单一信号检测受实验条件影响较大，会导致假阳性或假阴性效应。目前，多模式检测已经被成功开发用于对检测结果进行自校准，如电化学-比色、光电化学-电化学、电化学发光-比色等。现在，检测4-CEC用三电极体系，电化学发光方法和比色的报道还很少。
核酸适配体apt是适配体是单链DNA或RNA分子，具有与特定靶标结合的能力，具有非常高的亲和力和选择性。利用apt对特异性识别物质和其他物质间的结合力差异可以实现检测物的替换，将apt与ECL结合也是现在生物分析检测领域的重点。
发明内容
针对现有技术中检测合成卡西酮4-CEC的不足，本发明提供了一种电化学发光和比色双模式检测合成卡西酮4-CEC的电化学发光适配体传感器及其制备方法和应用，传感器能够通过电化学发光和比色对4-CEC进行双模式检测。
本发明利用静电结合作用依次将SIOPCs、PCN-224、适配体apt固定在导电玻璃FTO表面，获得apt/PCN-224/SIOPCs/FTO修饰电极，使得电化学发光的灵敏度和稳定性显著提高。发光体PCN-224为以Zr为中金属离子，中-四(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)和苯甲酸为有机配体合成的金属有机框架；SIOPCs是以PS微球为模板和正硅酸乙酯为原料合成的SiO2反蛋白石光子晶体。SIOPCs一方面利用独特的反蛋白石空腔结构能够有效的固定PCN-224，实现ECL信号的稳定性，另一方面利用光子晶体的光子带隙反射与PCN-224相同波长的光，实现ECL信号的增强。将适配体apt负载于PCN-224/SIOPCs/FTO修饰电极的表面，制得电化学发光适配体传感器。再加入检测物合成卡西酮4-CEC后，电化学发光适配体传感器的ECL信号值出现明显猝灭，能够实现对4-CEC的检测。加入其他干扰物后发现该适配体传感器具有良好的特异性。除此之外，利用apt对SRB和4-CEC的结合力不同，通过SRB和4-CEC的置换成功实现对4-CEC的比色检测。
一种用于电化学发光-比色双模式检测合成卡西酮4-CEC的电化学发光适配体传感器，所述电化学发光适配体传感器是由适配体apt负载于复合材料PCN-224/SIOPCs/FTO修饰电极的表面而成；PCN-224为以Zr为中金属离子，TCPP和苯甲酸为有机配体合成的金属有机框架；SIOPCs是以PS微球为模板和正硅酸乙酯为原料合成的SiO2反蛋白石光子晶体；适配体apt是含有5'-GGCACTTACGACCTTAAGTGGGGTTCGGGTGGAGTTTATGGGGTCGTAAG-3'碱基序列的适配体。
进一步的，电化学发光-比色双模式检测合成卡西酮4-CEC的电化学发光适配体传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)PS模板的制备：将预处理过的亲水性FTO垂直放置在含有PS光子晶体乙醇悬浮液中，置于60℃的恒温烤箱中静置约3d，无振动，待悬浮液完全干燥后，将PS模板在80℃下加热1h以增强紧密堆积，；其中PS光子晶体的粒径为300nm；乙醇溶剂的质量分数为75％。
进一步的，PS光子晶体乙醇悬浮液中PS光子晶体的质量浓度为0.1～0.5wt％；优选0.3wt％。
进一步的，亲水性FTO电极的预处理步骤包括：将FTO玻璃切割成4cm×1cm的薄片，依次用水、乙醇、丙酮超声清洗除去表面的油脂和杂质，室温下吹干。将清洗好的FTO浸入碱式H2O2稀溶液来进行亲水处理，洗涤和干燥即得亲水性FTO电极。
进一步的，碱式H2O2稀溶液的具体要求为H2O2的质量分数为3wt％，pH＝12；亲水处理的温度条件为80℃下加热1h。
(2)SIOPCS的制备：先将硅溶胶滴在PS模板上，然后将所得PS模板/二氧化硅复合材料在空气中静置使充分浸润后去除多余的硅溶胶，随后自然晾干，然后在90℃下加热1h；接着将所得样品以500℃煅烧2h以刻蚀PS模板。用去离子水彻底洗涤干燥后，得到具有三维有序大孔结构的SIOPCs基底的SIOPCs/FTO修饰电极；
进一步的，硅溶胶的主要成分包括：0.1M HCl、正硅酸乙酯(TEOS)和无水乙醇，质量比为m:m:m＝1:1.5:1；
进一步的，为保证硅溶胶能够充分浸润PS微球，硅溶胶是过量滴涂的，多余的硅溶胶会进行去除，优选的硅溶胶的滴涂量为60-100μL，多余的硅溶胶于500rpm下旋转去除。
(3)PCN-224的制备：先将中-四(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)、ZrCl4和苯甲酸溶于DMF，之后在高压反应釜中115～125℃反应23～25h。自然冷却后离心并用DMF和丙酮分别清洗3次。最后，将所得沉淀冷冻干燥数小时形成良好的结晶形态，将最后得到的暗红色粉末称为PCN-224；其中TCPP、ZrCl4和苯甲酸的质量比20:60:1。
(4)将PCN-224分散于DMF中，超声使其分散均匀，得到PCN-224分散液；将PCN-224分散液滴涂在制备好的SIOPCs/FTO修饰电极表面，自然晾干，得PCN-224/SIOPCs/FTO电极；将apt修饰在PCN-224/SIOPCs/FTO表面，于室温下进行孵育，即得电化学发光适配体传感器apt/PCN-224/SIOPCs/FTO。
进一步的，PCN-224分散液的浓度为0.5～2mg/mL，优选1mg/mL，修饰量为40μL/cm2。
进一步的，适配体apt的修饰方法：将30μL apt浓度为3μmol/L的Tris-HCl缓冲溶液滴涂在PCN-224/SIOPCs/FTO表面，孵育6～8h。
本发明还提供了基于电化学发光适配体传感器检测合成卡西酮的方法，包括如下步骤：
电化学发光法检测：以如上所述的电化学发光适配体传感器(apt/PCN-224/SIOPCs/FTO)作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极组成三电极体系，待测样品中的4-CEC被固定到传感器的表面，通过检测待测样品结合前后发光信号的变化实现4-CEC的检测。
在电化学发光检测中：以含K2S2O8的PBS缓冲溶液为电解液，在-1.8～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录发光强度-时间曲线，建立电化学发光传感器结合4-CEC前后的发光强度差值，再根据线性回归方程计算出样品中合成卡西酮4-CEC的浓度；所述含K2S2O8的PBS缓冲溶液是用pH为7.4的0.1mol/L的PBS缓冲溶液配制的含0.05mol/LK2S2O8的PBS缓冲溶液。
比色检测法，以如上所述的电化学发光适配体传感器(apt/PCN-224/SIOPCs/FTO)作为捕获单元先结合磺酰罗丹明B(SRB)，然后在待测样品溶液中浸泡使4-CEC与SRB发生置换反应，通过检测反应前后紫外可见吸光度值的变化实现对4-CEC的检测。紫外检测波长为200-800nm。
进一步的，电化学发光中样品结合反应时间为15min，比色测试中置换反应时间为30min。
进一步的，具体步骤为：
步骤1，含K2S2O8的PBS缓冲溶液的配制：
用pH为7.4的0.1mol/L的PBS缓冲溶液配制含0.05mol/L K2S2O8的PBS缓冲溶液；
步骤2，不同浓度合成卡西酮4-CEC标准溶液和SRB溶液的配制：
配制合成卡西酮4-CEC母液，然后将合成卡西酮4-CEC母液用Tris-HCl缓冲溶液进行梯度稀释，得到一系列不同浓度的4-CEC标准溶液，该标准溶液中4-CEC的浓度范围为1.0×10-14～1.0×10-5g/L；配置浓度为1mg/mL的SRB溶液；
步骤3，标准曲线的绘制：
在电化学发光检测中：将上述适配体传感器浸泡在按照步骤2配制的不同浓度的合成卡西酮4-CEC标准溶液中并反应相同时间(15min)，使电化学发光适配体传感器结合所述合成卡西酮4-CEC，得4-CEC/apt/PCN-224/SIOPCs/FTO，然后以其作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，组成三电极体系，以步骤1中的含K2S2O8的PBS缓冲溶液为电解液，在-1.8～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录发光强度-时间曲线，建立电化学发光传感器结合4-CEC前后的发光强度差值(ΔECL)与4-CEC标准溶液中的4-CEC浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程；
在比色检测中，将上述适配体传感器浸泡在按照步骤2配制的浓度为1mg/mL的SRB水溶液中并反应30min使适配体与SRB充分结合得到SRB/apt/PCN-224/SIOPCs/FTO，之后将修饰电极浸入不同浓度的4-CEC标准溶液中使4-CEC和SRB充分进行置换，置换后的溶液在波长200-800nm范围内进行UV-vis测试并记录吸光度，建立吸光度与4-CEC浓度的线性关系，得到相应的线性回归方程；
步骤4，样品中合成卡西酮4-CEC的检测
所述样品先经过预处理，进行加标回收测试，按照步骤3将电化学发光适配体传感器浸泡在预处理过的电子烟液中，使适配体传感器结合合成卡西酮4-CEC，然后以其作为工作电极，再采用步骤3方法检测发光强度，再根据线性回归方程计算出样品中合成卡西酮4-CEC的浓度；
进一步的，电子烟的预处理过程为将所述电子烟样品先进行离心除去不溶性杂质，接着采用真空抽滤的方法进一步进行过滤得到上清液并在0-4℃保存待用。
本发明的有益效果有：
本发明设计了一种基于SiO2反蛋白石光子晶体SIOPCs与锆基卟啉金属有机框架PCN-224复合材料的电化学发光适配体传感器，两种材料在合成时通过静电相互作用结合，可以获得高效且稳定的电化学发光性能。SIOPCs一方面利用独特的反蛋白石空腔结构能够有效的固定PCN-224，实现ECL信号的稳定性，另一方面利用光子晶体的光子带隙反射与发光体PCN-224相同波长的光，实现ECL信号的增强。将适配体apt负载于PCN-224/SIOPCs/FTO修饰电极的表面，制得电化学发光适配体传感器。在加入检测物合成卡西酮4-CEC后，电化学发光适配体传感器的ECL信号值出现明显猝灭，能够实现对4-CEC的检测。加入其他干扰物后发现该适配体传感器具有良好的特异性。除此之外，利用apt对SRB和4-CEC的结合力不同，通过SRB和4-CEC的置换成功实现对4-CEC的比色检测。本发明检测4-CEC的操作简单、选择性好、灵敏度高、检测范围宽，对推广适配体传感器在实际检测方面的应用具有重要的意义。
附图说明
图1为本发明中的电化学发光适配体传感器的制备及对4-CEC的检测的简要流程图；
图2为实施例1中所构建的电化学发光适配体传感器在与不同浓度的4-CEC结合后的ECL响应图，其中4-CEC的浓度从a到g依次为：(a)1.0×10-12g/L；(b)1.0×10-11g/L；(c)1.0×10-10g/L；(d)1.0×10-9g/L；(e)1.0×10-8g/L；(f)1.0×10-7g/L；(g)1.0×10-6g/L；
图3为实施例1加入4-CEC前后发光强度的差值(ΔECL)与4-CEC浓度对数值的标准曲线；
图4为实施例1具有不同浓度SRB的紫外-可见吸收曲线，(a-g代表适配体置换时4-CEC的浓度(10、100、200、400、600、800、1000ng/mL)；
图5为实施例1吸光度值与4-CEC浓度之间的线性关系；
图6为是实施例1中制备的PS微球(A)、SIOPCs(B)、PCN-224(C)、PCN-224/SIOPCs(D)的SEM图像；
图7为PCN-224/FTO(a)和PCN-224/SIOPCs/FTO(b)的ECL-时间图像。
具体实施方式
本发明不局限于下列具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明将结合实施例作进一步详述：以下实施例中，apt为含有5'-AGATGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3'碱基序列的适配体，通过静电结合作用固定在PCN-224/SIOPCs/FTO修饰电极表面。
以下实施例中不同浓度的4-CEC标准溶液的配制方法为：配制4-CEC母液，然后用Tris-HCl缓冲溶液依次进行梯度稀释并得到一系列不同浓度4-CEC的标准溶液，本实施例中4-CEC标准溶液中4-CEC的浓度分别为(a)1.0×10-12g/L；(b)1.0×10-11g/L；(c)1.0×10-10g/L；(d)1.0×10-9g/L；(e)1.0×10-8g/L；(f)1.0×10-7g/L；(g)1.0×10-6g/L；
实施例1：
(一)组装apt/PCN-224/SIOPCs/FTO传感器
(1)SIOPCs与PCN-224材料的制备：
将FTO玻璃切割成4cm×1cm的薄片，然后依次使用水、乙醇、丙酮超声波除去表面的油脂及杂质。通过将FTO浸入碱式H2O2稀溶液(3wt％,pH 12)并在80℃下加热1h来进行亲水处理。洗涤和干燥后，将每个亲水性FTO垂直放置在含有0.3wt％PS光子晶体(300nm)(购自上海译元生物科技有限公司)悬浮液的小瓶中，溶剂为75％乙醇(浸入面积为1cm×1cm)。将所有小瓶置于60℃的恒温烤箱中约3d，无振动。悬浮液完全干燥后，将模板在80℃下加热1h以增强紧密堆积。
将含有0.1M HCl、正硅酸乙酯(TEOS)和乙醇的混合溶液(m:m:m＝1:1.5:1)作为硅溶胶前驱体。先将100μL硅溶胶滴在蛋白石模板上，硅溶胶很容易通过毛细管力渗入PS微球之间的空隙中，然后将所得模板/二氧化硅复合材料在空气中静置1min后于500rpm下旋转去除多余的硅溶胶，随后在空气中干燥12h，并在90℃下加热1h。接下来将所得样品放入500℃的马弗炉中煅烧2h以刻蚀除去PS微球。用去离子水彻底洗涤干燥后，得到具有三维有序大孔结构的SIOPCs基底。
准确称量20mg TCPP、60mg ZrCl4和1mg苯甲酸溶于6mL DMF，之后在高压反应釜中反应24h(120℃)。自然冷却后离心并用DMF和丙酮分别清洗3次。最后，将所得沉淀冷冻干燥数小时形成良好的结晶形态，将最后得到的暗红色粉末称为PCN-224。将一部分制备好的PCN-224超声分散于DMF溶液中，形成浓度为1mg/mL的PCN-224分散液。
(2)检测4-CEC的电化学发光适配体传感器的制备
将PCN-224分散液滴涂在制备好的SIOPCs/FTO表面，待自然晾干后，再修饰30μL含适配体apt的Tris-HCl缓冲溶液，自然晾干8h后，得到apt/PCN-224/SIOPCs/FTO电化学发光适配体传感器。
其中，PCN-224分散液的修饰量为40μL，适配体apt的浓度为3μM。
(二)基于电化学发光适配体传感器检测4-CEC的方法
(1)标准曲线的绘制
在电化学发光检测中：将上述适配体传感器浸泡在一系列不同浓度的合成卡西酮4-CEC标准溶液中并反应15min，使电化学发光适配体传感器结合所述合成卡西酮4-CEC，得4-CEC/apt/PCN-224/SIOPCs/FTO，然后以其作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，组成三电极体系，用pH为7.4的0.1mol/L的PBS缓冲溶液配制含0.05mol/LK2S2O8的PBS缓冲溶液为电解液，在-1.8～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录发光强度-时间曲线，建立电化学发光传感器结合4-CEC前后的发光强度差值(ΔECL)与4-CEC标准溶液中的4-CEC浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程，ΔECL＝19116.65+1507.23lg C(g/L)，检测范围为1.0×10-12～1.0×10-6g/L，检测限为2.6×10-13g/L；
在比色检测中，将上述适配体传感器浸泡在浓度为1mg/mL的SRB水溶液中并反应30min使适配体与SRB充分结合得到SRB/apt/PCN-224/SIOPCs/FTO，之后将修饰电极浸入一系列不同浓度的4-CEC标准溶液中30min使4-CEC和SRB充分进行置换，置换后的溶液在波长200-800nm范围内进行UV-vis测试并记录吸光度，建立吸光度与4-CEC浓度的线性关系，得到相应的线性回归方程，Abs.＝0.065+0.00034c(ng/L)，检测范围为10～1000ng/L，检测限为6.5ng/L。
(2)样品的检测
取某品牌电子烟的烟液样品先进行离心除去不溶性杂质，接着采用真空抽滤的方法进一步进行过滤得到上清液并在0-4℃保存待用。按标准曲线的绘制中所示方法进行电化学发光测试并用所得的线性回归方程计算出待检测样品中4-CEC的浓度，其结果列于表1中。
本实施例以PCN-224/SIOPCs/FTO为基底材料(各材料形貌如图6)，利用PCN-224和SIOPCs两者之间的静电相互作用稳定结合，SIOPCs一方面利用独特的反蛋白石空腔结构能够有效的固定PCN-224，实现ECL信号的稳定性，另一方面利用光子晶体的光子带隙反射与发光体PCN-224相同波长的光，实现ECL信号的增强。本传感器能够大幅度提高单独材料的电化学发光强度，导电性良好，稳定性好，且传感器选择性好。
实施例2：
本实施例的操作方法参照实施例1，区别是PCN-224分散液的浓度为0.5mg/mL。ECL检测得到的线性回归方程为ΔECL＝4817.75+1170.17lg C(g/L)，检测范围为1.0×10-12～1.0×10-7g/L，检测限为1.6×10-12g/L；比色检测得到的线性回归方程与实施例1相同，即Abs.＝0.00045c-0.01410(ng/L)，检测范围为100～1000ng/L，检测限为20ng/L。
实施例3：
本实施例的操作方法参照实施例1，区别是PCN-224分散液的浓度为2mg/mL。ECL检测得到的线性回归方程为ΔECL＝4312.71+1114.32lg C(g/L)，检测范围为1.0×10-12～1.0×10-6g/L，检测限为8.3×10-13g/L；比色检测得到的线性回归方程与实施例1相同，即Abs.＝0.000357c+0.01605(ng/L)，检测范围为100～1000ng/L，检测限为18ng/L。
实施例4:
本实施例的操作方法参照实施例1，区别是PS光子晶体的浓度为0.1wt％。ECL检测得到的线性回归方程为ΔECL＝3026.04+996.26lg C(g/L)，检测范围为1.0×10-11～1.0×10-6g/L，检测限为2.7×10-12g/L；比色检测得到的线性回归方程与实施例1相同，即Abs.＝0.00046c-0.00761(ng/L)，检测范围为100～1000ng/L，检测限为18ng/L。
实施例5:
本实施例的操作方法参照实施例1，区别是PS光子晶体的浓度为0.5wt％。ECL检测得到的线性回归方程为ΔECL＝1621.60+810.00lg C(g/L)，检测范围为1.0×10-10～1.0×10-6g/L，检测限为1.3×10-11g/L；比色检测得到的线性回归方程与实施例1相同，即Abs.＝0.00060c-0.00186(ng/L)，检测范围为10～1000ng/L，检测限为19ng/L。
对比例1：
(1)apt/SIOPCs/FTO传感器的制备
用微样注射器移取30μL 3μM的apt溶液，滴涂到制备好的SIOPCs/FTO修饰电极表面，得到apt/SIOPCs/FTO化学修饰电极，自然晾干后作为电化学发光测试的传感元件。(单体测试修饰量与样品浓度与实施例保持单一变量)
(2)标准曲线的绘制
以步骤(1)制得的apt/SIOPCs/FTO传感器作为传感元件，将上述适配体传感器浸泡在一系列不同浓度的合成卡西酮4-CEC标准溶液中并反应15min，使电化学发光适配体传感器结合所述合成卡西酮4-CEC，得4-CEC/apt/PCN-224/SIOPCs/FTO，然后以其作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，组成三电极体系，以含K2S2O8的PBS缓冲溶液为电解液，在-1.8～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录发光强度-时间曲线，建立电化学发光传感器结合4-CEC前后的发光强度差值(ΔECL)与4-CEC标准溶液中的4-CEC浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程，ΔECL＝193.32+47.31lg C(g/L)，检测范围为1.0×10-12～1.0×10-7g/L，检测限为6.7×10-13g/L；
在比色检测中，将上述适配体传感器浸泡在浓度为1mg/mL的SRB水溶液中并反应30min使适配体与SRB充分结合得到SRB/apt/PCN-224/SIOPCs/FTO，之后将修饰电极浸入一系列不同浓度的4-CEC标准溶液中30min使4-CEC和SRB充分进行置换，置换后的溶液在波长200-800nm范围内进行UV-vis测试并记录吸光度，建立吸光度与4-CEC浓度的线性关系，得到相应的线性回归方程，Abs.＝0.1072+0.01412c(ng/L)，检测范围为10～1000ng/L，检测限为6.5ng/L。
(3)样品的检测
取某品牌电子烟的烟液样品先进行离心除去不溶性杂质，接着采用真空抽滤的方法进一步进行过滤得到上清液并在0-4℃保存待用。按步骤(2)所示进行电化学发光测试并用所得的线性回归方程计算出待检测样品中4-CEC的浓度，其结果列于表1中。
对比例2：
(1)apt/PCN-224/FTO传感器的制备
用微量注射器移取40μL 1mg/mL的PCN-224的DMF分散液，滴涂到前处理过的FTO电极(前处理方法同实施例1)表面，得到PCN-224/FTO修饰电极，自然晾干后待用，在PCN-224/FTO修饰电极表面再滴涂移取30μL 3μM的apt溶液，自然晾干后得到apt/PCN-224/FTO传感器，作为电化学发光测试的传感元件。(单体测试修饰量与样品浓度与实施例保持单一变量)
(2)标准曲线的绘制
以步骤(1)制得的apt/SIOPCs/FTO传感器作为传感元件，将上述适配体传感器浸泡在一系列不同浓度的合成卡西酮4-CEC标准溶液中并反应15min，使电化学发光适配体传感器结合所述合成卡西酮4-CEC，得4-CEC/apt/PCN-224/SIOPCs/FTO，然后以其作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，组成三电极体系，以含K2S2O8的PBS缓冲溶液为电解液，在-1.8～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录发光强度-时间曲线，建立电化学发光传感器结合4-CEC前后的发光强度差值(ΔECL)与4-CEC标准溶液中的4-CEC浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程，ΔECL＝3995.43+1012.64lg C(g/L)，检测范围为1.0×10-12～1.0×10-6g/L，检测限为6.3×10- 13g/L；
在比色检测中，将上述适配体传感器浸泡在浓度为1mg/mL的SRB水溶液中并反应30min使适配体与SRB充分结合得到SRB/apt/PCN-224/SIOPCs/FTO，之后将修饰电极浸入一系列不同浓度的4-CEC标准溶液中30min使4-CEC和SRB充分进行置换，置换后的溶液在波长200-800nm范围内进行UV-vis测试并记录吸光度，建立吸光度与4-CEC浓度的线性关系，得到相应的线性回归方程，Abs.＝0.1082+0.01421c(ng/L)，检测范围为10～1000ng/L，检测限为7.2ng/L。
(3)样品的检测
取某品牌电子烟的烟液样品先进行离心除去不溶性杂质，接着采用真空抽滤的方法进一步进行过滤得到上清液并在0-4℃保存待用。按步骤(2)所示进行电化学发光测试并用所得的线性回归方程计算出待检测样品中4-CEC的浓度，其结果列于表1中。
对比例3：
(1)PCN-224/SIOPCs/FTO传感器的制备
用微量注射器移取40μL 1mg/mL的PCN-224的DMF分散液，滴涂到制备好的SIOPCs/FTO(前处理方法同实施例1)表面，得到PCN-224/SIOPCs/FTO修饰电极，自然晾干后得到电化学发光测试的传感元件。(单体测试修饰量与样品浓度与实施例保持单一变量)
(2)标准曲线的绘制
以步骤(1)制得的apt/SIOPCs/FTO传感器作为传感元件，将上述适配体传感器浸泡在一系列不同浓度的合成卡西酮4-CEC标准溶液中并反应15min，使电化学发光适配体传感器结合所述合成卡西酮4-CEC，得4-CEC/apt/PCN-224/SIOPCs/FTO，然后以其作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，组成三电极体系，以含K2S2O8的PBS缓冲溶液为电解液，在-1.8～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录发光强度-时间曲线，建立电化学发光传感器结合4-CEC前后的发光强度差值(ΔECL)与4-CEC标准溶液中的4-CEC浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程，ΔECL＝362.86+108.57lg C(g/L)，检测范围为1.0×10-9～1.0×10-3g/L，检测限为8.0×10-10g/L，线性相关系数为0.66，几乎不成线性；
在比色检测中，将上述适配体传感器浸泡在浓度为1mg/mL的SRB水溶液中并反应30min使适配体与SRB充分结合得到SRB/apt/PCN-224/SIOPCs/FTO，之后将修饰电极浸入一系列不同浓度的4-CEC标准溶液中30min使4-CEC和SRB充分进行置换，置换后的溶液在波长200-800nm范围内进行UV-vis测试并记录吸光度，建立吸光度与4-CEC浓度的线性关系，得到相应的线性回归方程，因无适配体，故无法得到相应的线性回归方程。
(3)样品的检测
取某品牌电子烟的烟液样品先进行离心除去不溶性杂质，接着采用真空抽滤的方法进一步进行过滤得到上清液并在0-4℃保存待用。按步骤(2)所示进行电化学发光测试并用所得的线性回归方程计算出待检测样品中4-CEC的浓度，其结果列于表1中。
表1某电子烟样品的测定结果
备注：a为三次测定的平均值
如表1所示，样品平行测定3次，实施例1检测的加标回收率在97％～101％之间，相对标准偏差小于5％，表明回收效果较好。上述实验结果说明，不用apt/PCN-224/SIOPCs复合材料修饰而单独用其中的任意两者修饰FTO电极后进一步组装传感元件均无法检测出4-CEC，因此本发明的传感器是可用于检测电子烟中的4-CEC。
基于以上验证可知本发明基于4-CEC对apt/PCN-224/SIOPCs/FTO体系的电化学发光猝灭效应，构建了一种能够快速、灵敏检测4-CEC的新方法。各种材料在组装电极时通过静电相互作用结合，可以获得高效且稳定的电化学发光性能。SIOPCs一方面利用独特的反蛋白石空腔结构能够有效的固定PCN-224，实现ECL信号的稳定性，另一方面利用光子晶体的光子带隙反射与发光体PCN-224相同波长的光，实现ECL信号的增强。在加入检测物合成卡西酮4-CEC后，电化学发光适配体传感器的ECL信号值出现明显猝灭，ΔECL与4-CEC浓度的对数值呈现良好的线性关系，能够实现对4-CEC的检测。适配体apt的引入可以加大的提升适配体传感器检测的特异性。除此之外，利用apt对SRB和4-CEC的结合力不同，通过SRB和4-CEC置换时所带来紫外可见吸光强度的变化成功实现对4-CEC的比色检测。本发明使用的电化学发光法不仅具有灵敏度高、检测速度快、选择性好和线性范围宽等优点，而且对电子烟中4-CEC的定量分析具有很大的应用潜力。
以上实施例仅用于本发明说明使用，并非对本发明的限制，有关领域的技术人员可在不脱离本发明的范围内，还可以作出相应的各种变化，因此所有等同替换或等效变型的方式形成的技术方案均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于检测合成卡西酮4-CEC的电化学发光适配体传感器，其特征在于：所述电化学发光适配体传感器由适配体apt负载于复合材料PCN-224/SIOPCs修饰的导电玻璃FTO的表面而成；PCN-224为以Zr为中金属离子，中-四(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)和苯甲酸为有机配体合成的金属有机框架；SIOPCs是以聚苯乙烯微球为模板和正硅酸乙酯为原料合成的SiO2反蛋白石光子晶体；适配体apt为含有5'-GGCACTTACGACCTTAAGTGGGGTTCGGGTGGAGTTTATGGGGTCGTAAG-3'碱基序列的适配体。
2.权利要求1所述的用于检测合成卡西酮4-CEC的电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)PS模板的制备：将预处理过的亲水性FTO垂直放置在含有PS光子晶体乙醇悬浮液中，于60℃恒温静置至悬浮液完全干燥，80℃下加热1h，制得紧密堆积的PS模板；
(2)SIOPCS的制备：将硅溶胶滴在PS模板上，待充分浸润后去除多余的硅溶胶，自然晾干后于90℃下加热1h，以500℃煅烧2h以刻蚀PS模板，洗涤干燥后，得到具有三维有序大孔结构的SIOPCs基底的SIOPCs/FTO修饰电极；其中，硅溶胶的主要成分包括质量比为1:1.5:1的0.1mol/LHCl、正硅酸乙酯和无水乙醇；
(3)PCN-224的制备：将TCPP、ZrCl4和苯甲酸溶于DMF，在115～125℃反应23～25h，自然冷却后离心、洗涤、冷冻干燥，得到暗红色粉末PCN-224；
(4)将PCN-224分散于DMF中，超声使其分散均匀，得到PCN-224分散液；将PCN-224分散液滴涂在制备好的SIOPCs/FTO修饰电极表面，自然晾干，得PCN-224/SIOPCs/FTO电极；将apt修饰在PCN-224/SIOPCs/FTO表面，于室温下进行孵育，即得电化学发光适配体传感器apt/PCN-224/SIOPCs/FTO。
3.根据权利要求2所述的用于检测合成卡西酮4-CEC的电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于：步骤(一)的PS光子晶体乙醇悬浮液中PS光子晶体的质量浓度为0.1～0.5wt％。
4.根据权利要求2所述的用于检测合成卡西酮4-CEC的电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于：步骤(1)中亲水性FTO电极的预处理步骤包括：将FTO玻璃依次用水、乙醇、丙酮超声清洗除去表面的油脂和杂质，室温下吹干；将清洗好的FTO浸入碱式H2O2稀溶液来进行亲水处理，洗涤和干燥即得亲水性FTO电极；其中，碱式H2O2稀溶液的质量分数为3wt％，pH＝12；亲水处理的温度条件为80℃下加热1h。
5.根据权利要求2所述的用于检测合成卡西酮4-CEC的电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于：步骤(4)中PCN-224分散液的浓度为0.5～2mg/mL，修饰量为40μL/cm2。
6.根据权利要求2所述的用于检测合成卡西酮4-CEC的电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于：适配体apt的修饰方法：将30μLapt浓度为3μmol/L的Tris-HCl缓冲溶液滴涂在PCN-224/SIOPCs/FTO表面，孵育6～8h。
7.一种合成卡西酮4-CEC的检测方法，其特征在于：采用电化学发光检测法，以权利要求1所述的用于检测合成卡西酮4-CEC的电化学发光适配体传感器作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极组成三电极体系，通过检测待测样品结合前后发光信号的变化实现4-CEC的检测。
8.根据权利要求7所述的合成卡西酮4-CEC的检测方法，其特征在于：在电化学发光检测中：以含K2S2O8的PBS缓冲溶液为电解液，在-1.8～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录发光强度-时间曲线，建立电化学发光传感器结合4-CEC前后的发光强度差值，再根据线性回归方程计算出样品中合成卡西酮4-CEC的浓度；所述含K2S2O8的PBS缓冲溶液是用pH为7.4的0.1mol/L的PBS缓冲溶液配制的含0.05mol/LK2S2O8的PBS缓冲溶液。
9.一种合成卡西酮4-CEC的检测方法，其特征在于：采用比色检测法，以权利要求1所述的用于检测合成卡西酮4-CEC的电化学发光适配体传感器作为捕获单元先结合磺酰罗丹明B，然后在待测样品溶液中浸泡使4-CEC与磺酰罗丹明B发生置换反应，通过检测反应前后紫外可见吸光度值的变化实现对4-CEC的检测。
10.根据权利要求9所述的合成卡西酮4-CEC的检测方法，其特征在于：紫外检测波长为200-800nm。
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